CN104152548A - 一种检测产黄曲霉素霉菌的生物芯片、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
一种检测产黄曲霉素霉菌的生物芯片、检测试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物芯片技术领域，特别涉及一种检测产黄曲霉素霉菌的生物芯片，还涉及含有此生物芯片的检测试剂盒，及检测产黄曲霉素霉菌的检测方法。核苷酸探针碱基序列如序列表中序列1-6所示。检测产黄曲霉素霉菌的试剂盒，含有生物芯片。检测方法：提取待测样品RNA或，进行标记，或反转录成cDNA后进行标记；将标记后的片段与载有所述载有核苷酸探针的生物芯片进行杂交，扫描采集信号。仅使用3对探针，就可以对产黄曲霉素霉菌进行检测，简化了检测步骤；本发明的生物芯片，特异性强，准确率100%，能检测到低拷贝的RNA样品，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及生物芯片技术领域，特别涉及一种检测产黄曲霉素霉菌的生物芯片，还涉及含有此生物芯片的检测试剂盒，及产黄曲霉素霉菌的检测方法。
背景技术
生物芯片，又称DNA芯片或基因芯片，它们是DNA杂交探针技术与半导体工业技术相结合的结晶。该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
生物芯片是指包被在硅片、尼龙膜等固相支持物上的高密度的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以及其它生物组分的微点阵。芯片与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号即可实现对生物样品的分析。目前常见的生物芯片主要有基因芯片，蛋白质芯片、组织芯片等。基因芯片也可以叫做 reverse northern - dot blots。目前主要有检测基因突变的基因芯片和检测基因表达水平的基因表达谱芯片。基因芯片技术 主要包括芯片微阵列制备、样品制备、杂交、信号的检测和分析等。蛋白质芯片主要是蛋白质如抗原或抗体在载体上的有序排列，依据蛋白质分子、蛋白质与核酸相互作用的原理进行杂交、检测和分析。从不同的组织内进行活体解剖后取出圆柱状的组织，然后包埋在受体区组内，这样的石蜡块集成体便构成了组织芯片。
黄曲毒素（aflatoxin），也称作黄曲霉素，是一种有强烈生物毒性的化合物，常由黄曲霉及另外几种霉菌在霉变的谷物中产生，如大米、豆类、花生等，是目前为止最强的致癌物质。加热至280℃以上才开始分解，所以一般的加热不易破坏其结构。黄曲毒素主要有B1、B2、G1与G2等4种，又以B1的毒性最强。食米储存不当，极容易发霉变黄，产生黄曲毒素。黄曲毒素与肝癌有密切关系，还会引起组织失血、厌食等症状。1960年在英国发生了因喂食黄曲毒素花生粕而导致大批火鸡暴毙事件。警惕黄曲毒素的危害，要注意剔除霉变的食物颗粒，还可采用以水淘洗的办法进一步净化易沾染的食物中的霉菌。当然，用高温烧、炸至280℃以上也可以达到分解毒素和去除污染的效果。
目前，检测产黄曲霉素霉菌的传统方法主要是分离鉴定，并同时用HPLC进行黄曲霉素的检测，上述检测方法存在操作繁琐、准确度、灵敏度差的问题。
胡娜在南昌大学的博士论文《基因芯片技术在黄曲霉毒素生物合成相关基因检测中的应用研究》中探讨了建立芯片检测与黄曲霉毒素生物合成相关基因的技术平台，所用探针来源于寄生曲霉，待测样品为黄曲霉霉菌。芯片扫描结果显示荧光信号稳定，与反转录扩增结果一致，无背景干扰，结果可靠。但此论文使用了27对探针，检测误差的可能性增大，而且其中部分探针对其他产黄曲霉素的菌株并不适用。
发明内容
为了解决以上现有技术中存在的检测产黄曲霉素霉菌操作繁琐、准确度、灵敏度差的问题，本申请提供了一种检测产黄曲霉素霉菌的生物芯片。
本发明是通过以下措施实现的：
一种检测产黄曲霉素霉菌的生物芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的核苷酸探针，所述核苷酸探针碱基序列如下：
AFLo-1：5’-GCCTTGACATGGAAACCATC-3’，
AFLo-2：5’-CCAAGATGGCCTGCTCTTTA-3’；
AFLD-1：5’-ACGGATCACTTAGCCAGCAC-3’，
AFLD-2：5’-CTACCAGGGGAGTTGAGATCC-3’；
AFLp-1：5’-GCCTTGCAAACACACTTTCA-3’，
AFLp-2：5’-AGTTGTTGAACGCCCCAGT-3’。
一种检测产黄曲霉素霉菌的试剂盒，含有所述的生物芯片。
一种产黄曲霉素霉菌的检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样品RNA，进行CY3/CY5标记，或者反转录成cDNA后进行标记；
（2）将标记后的RNA片段或者cDNA片段与载有核苷酸探针的生物芯片进行杂交，扫描采集信号。
本发明的有益效果：
仅使用3对探针，就可以对产黄曲霉素霉菌进行检测，简化了检测步骤；本申请的生物芯片，特异性强，准确率100%，能检测到低拷贝的RNA样品，灵敏度高。由于产黄曲霉素的霉菌种类众多，有的在一定条件下才能产生黄曲霉素，该方法能有效鉴别区分产黄曲霉素的霉菌和产黄曲霉素的环境条件，能在早期发现产黄曲霉素的霉菌，有助于提前采取措施进行处理。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
实施例1：探针的获得
以Genebank中的序列信息为背景，设计了3对引物，碱基序列如下：
AFLo-1：5’-GCCTTGACATGGAAACCATC-3’，
AFLo-2：5’-CCAAGATGGCCTGCTCTTTA-3’；
AFLD-1：5’-ACGGATCACTTAGCCAGCAC-3’，
AFLD-2：5’-CTACCAGGGGAGTTGAGATCC-3’；
AFLp-1：5’-GCCTTGCAAACACACTTTCA-3’，
AFLp-2：5’-AGTTGTTGAACGCCCCAGT-3’。
实施例2：生物芯片检测实验
2.1试剂准备
2.1.1 芯片洗液：
根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液Ⅰ和Ⅱ。
1) 洗液I：SSC终浓度为2×，SDS终浓度为0.2%。以配制总量500 ml为例，量取440 ml蒸馏水倒入1000 ml试剂瓶中，加入50 ml 20×SSC，混匀。再加入10 ml 10 %SDS，混匀，室温存贮。或根据需求按比例配制。
2) 洗液II：SSC终浓度为0.2×。以配制总量500 ml为例，量取495 ml蒸馏水倒入1000 ml试剂瓶中，加入5 ml 20×SSC，混匀，室温存贮。或根据需求按比例配制。
提示：若10%SDS产生白色絮状沉淀，请置于42℃水浴中溶解混匀后配制洗液
2.1.2无菌水（本试剂盒不提供，请自行准备并高压灭菌后备用）
2.1.3 无水乙醇
2.1.4冰水混合物
2.2 样品准备
可直接使用无菌水冲洗样品得到带有霉菌的水样。
提示：如果不能马上进行芯片检测，可在2-8℃保存48小时，48小时后最好将肉汤冰冻保存。
2.3 仪器和材料要求
晶芯LuxScan 10K-A微阵列芯片扫描仪，
晶芯基因微阵列芯片杂交盒，
涡旋振荡器，
离心机（规格：可离心1.5 ml离心管），
微量移液器（规格：0.1-10 μl，2-20 μl，20-200 μl，200-1000 μl各一把），
PCR扩增仪，
移液器吸头（要求洁净无菌，规格：10 μl，200 μl，1 ml），
离心管（要求洁净无菌，规格：200 μl，1.5 ml），
各种规格的离心管架，
电泳仪 ，
杂交炉或杂交水浴锅（可控温42℃），
芯片洗片盒 ，
水平摇床 ，
离心机（规格：可离心50 ml离心管）；
2.4 细菌样品RNA提取
2.5 RNA进行标记，或者使用反转录试剂盒生成cDNA,并进行标记
2.6 杂交及洗片
将杂交Buffer在42℃融化，按下面体系配制杂交液，杂交液95℃变性5分钟，冰浴5分钟，备用。
表1 反应体系
打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约80 μl灭菌水。将芯片正面朝上（围栏面朝上，标签朝向操作者）放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；然后用移液器通过盖片加样孔缓慢注入15 μl变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜。注意不要震动盖片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖。放入42℃恒温水浴中，静置，杂交2小时或过夜均可。
杂交后，取出芯片放在42℃预热好的洗液I中，42℃震荡清洗4分钟，再用42℃预热好的洗液II，42℃震荡清洗4分钟（冬季洗液II可清洗两次，每次2分钟），最后用42℃预热好蒸馏水清洗一次，清洗后的芯片1500 rpm离心1分钟以去除芯片表面的液体，此芯片可避光保存，在4小时内扫描都有效。
2.7 芯片扫描及结果判读
洗净的芯片使用微阵列芯片扫描仪在晶芯??食源性致病微生物检测分析系统II（PFMicrobeII System）下进行扫描分析，该系统软件会自动对扫描结果进行判读分析，给出检测结果，3对探针同时呈阳性的均有黄曲霉素产生，对cDNA和RNA的检测结果一致。
实施例3：特异性及灵敏度试验
1、特异性试验
使用几种黄曲霉及比较接近的霉菌进行特异性试验，试验结果见表2。
黄曲霉(Aspergillusflavus)．3．2890、3．4408、3．4409、3．4410、3．3950、3．3951，
寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)：3．6155、3．6156，
赭曲霉(Aspergillusochraceus)：3．4411、3．6255、3．4520，
所有样品均购置于中科院微生物所。
表2几种霉菌检测结果
各基因的荧光信号稳定，荧光背景低，无杂信号干扰。经过对以上各种霉菌的检测，同时用HPLC进行验证，3个（对）探针同时呈阳性的均有黄曲霉素产生，检测结果表明3对探针对产黄曲霉素霉菌的检测特异性强，准确率达到100%。
2、灵敏度试验
以购自中科院微生物所的黄曲霉(Aspergillusflavus)3．2890为例，将固体样品用无菌超纯水冲洗/搅拌/浸泡30分钟，将水样用试剂盒提取RNA，标记后的RNA进行梯度浓度稀释至1*100拷贝、1*101拷贝、1*102拷贝、1*103拷贝、1*104拷贝，分别进行检测，试验证明，在1*101拷贝时，仍能检测到图像信号，荧光信号稳定，荧光背景低，无杂信号干扰，说明本申请的生物芯片可检测到低拷贝的RNA样品，灵敏度高。
同时使用标记后的反转录cDNA进行梯度稀释至1*100拷贝、1*101拷贝、1*102拷贝、1*103拷贝、1*104拷贝，分别进行检测，试验证明，在1*100拷贝时，仍能检测到图像信号，荧光信号稳定，荧光背景低，无杂信号干扰，说明本申请的生物芯片可检测到低拷贝的cDNA样品，灵敏度高.
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>山东省农业科学院生物技术研究中心
<120>一种检测产黄曲霉素霉菌的生物芯片、检测试剂盒及检测方法
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>1
GCCTTGACAT GGAAACCATC 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>2
CCAAGATGGC CTGCTCTTTA 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>3
ACGGATCACT TAGCCAGCAC 20
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>4
CTACCAGGGG AGTTGAGATC C 21
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>5
GCCTTGCAAA CACACTTTCA 20
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>6
AGTTGTTGAA CGCCCCAGT 19
Claims (3)
1.一种检测产黄曲霉素霉菌的生物芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的核苷酸探针，其特征在于所述核苷酸探针碱基序列如下：
AFLo-1：5’-GCCTTGACATGGAAACCATC-3’，
AFLo-2：5’-CCAAGATGGCCTGCTCTTTA-3’；
AFLD-1：5’-ACGGATCACTTAGCCAGCAC-3’，
AFLD-2：5’-CTACCAGGGGAGTTGAGATCC-3’；
AFLp-1：5’-GCCTTGCAAACACACTTTCA-3’，
AFLp-2：5’-AGTTGTTGAACGCCCCAGT-3’。
2.一种检测产黄曲霉素霉菌的试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的生物芯片。
3.一种产黄曲霉素霉菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取待测样品RNA，进行荧光标记，或者反转录成cDNA后进行标记；
（2）将标记后的RNA或cDNA片段与载有权利要求1所述载有核苷酸探针的生物芯片进行杂交，扫描采集信号。
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