CN114317719B - 用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的试剂盒、方法和装置 - Google Patents
用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的试剂盒、方法和装置 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的试剂盒、检测方法和装置,试剂盒包括用于扩增AXTN3基因的第一特异性引物、用于扩增AXTN2基因的第二特异性引物、用于扩增CACNA1A基因的第三特异性引物以及通用引物,各基因的特异性引物均连接有与通用引物序列相同的预设固定片段,通用引物连接有荧光基团。本发明的试剂盒创造性地将多重特异性引物和通用引物组合使用,实现同时检测AXTN3基因、AXTN2基因或CACNA1A基因中CAG重复拷贝数,提高了脊髓小脑共济失调动态突变的检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体而言,涉及一种用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的试剂盒、方法和装置。
背景技术
动态突变又称为不稳定三核苷酸重复序列突变,在基因的编码区、3’或5’-UTR、启动子区、内含子区出现三核苷酸重复,及其他长短不等的小卫星、微卫星序列的重复拷贝数,在减数分裂或体细胞的有丝分裂过程中发生扩增而造成遗传物质的不稳定状态。动态突变是导致人类遗传病的一种新的基因突变类型,涉及到神经系统的很多疾病,一般情况下重复拷贝数越多,病情越严重,发病年龄越小。
共济失调,表示了一种不协调的临床表征,也用于指一组特定的神经系统退行性疾病。在遗传性共济失调中,脊髓小脑共济失调(SCAs)为代表性的常染色体显性遗传病。遗传性脊髓小脑共济失调(SCAs)是人类最多见的神经系统退行性疾病之一,占神经系统遗传性疾病的10%~14%。家族遗传史、小脑性共济失调及小脑和脊髓的病理损害为该病的三大临床特征。SCAs具有明显的遗传异质性和致病基因剂量效应,发病年龄及临床症状多互相重叠,仅根据其症状、体征、辅助检查难以确诊。
基于人群的研究评估的SCA患病率范围为每100000人0至5.6例,平均每100000人2.7例。脊髓小脑共济失调有多个分型,其中SCA3是全球最常见的SCA,其次是SCA2和SCA6,分别占SCA疾病的20-50%,13-18%及13–15%,其致病基因分别为AXTN3、AXTN2及CACNA1A基因。对于AXTN3基因的CAG动态突变而言,93.5%的正常等位基因小于31CAG重复,而当CAG重复次数大于60为致病性变异;对于AXTN2基因的CAG动态突变而言,当CAG重复次数小于31时为正常,当CAG重复次数大于37时,表现为完全外显疾病表型;对于CACNA1A基因CAG动态突变而言,当CAG重复次数小于18时为正常,当CAG重复次数大于20时,表现为完全外显疾病表型。
目前常规的脊髓小脑共济失调动态突变检测,是针对脊髓小脑共济失调的单个致病基因分别设计引物进行PCR扩增,对PCR目标扩增进行片段分析,检测出CAG重复数量,检测效率低。
发明内容
为了解决上述问题,本发明的第一目的在于提供一种用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的试剂盒,试剂盒包括用于扩增AXTN3基因的第一特异性引物、用于扩增AXTN2基因的第二特异性引物、用于扩增CACNA1A基因的第三特异性引物以及至少一条通用引物,各基因的特异性引物均连接有和通用引物序列相同的预设固定片段,通用引物连接有荧光基团,以使得通用引物对多重特异性引物扩增AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因获得的各基因的特异性扩增片段进行扩增,以得到每个基因对应的带有荧光标记的目标扩增,从而实现对每个基因含有CAG变异的扩增片段对进行检测,提高了脊髓小脑共济失调动态突变的检测效率。
本发明的一种实现方式中,第一特异性引物包括用于扩增AXTN3基因的特异性上游引物和特异性下游引物,第二特异性引物包括用于扩增AXTN2基因的特异性上游引物和特异性下游引物,第三特异性引物包括用于扩增CACNA1A基因的特异性上游引物和特异性下游引物。
本发明的一种实现方式中,用于扩增AXTN3基因的特异性上游引物或特异性下游引物的5’端,用于扩增AXTN2基因的特异性上游引物或特异性下游引物的5’端,以及用于扩增CACNA1A基因的特异性上游引物或特异性下游引物的5’端,分别连接有与所述通用引物序列相同的预设固定片段。
本发明的一种实现方式中,用于扩增AXTN3基因的特异性上游引物如SEQ ID NO.1所示,特异性下游引物如SEQ ID NO.2所示;用于扩增AXTN2基因的特异性上游引物如SEQID NO.3所示,特异性下游引物如SEQ ID NO.4所示;用于扩增CACNA1A基因的特异性上游引物如SEQ ID NO.5所示,特异性下游引物如SEQ ID NO.6所示。
本发明的一种实现方式中,预设固定片段的序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的一种实现方式中,通用引物的序列如SEQ ID NO.7所示。
本发明的一种实现方式中,荧光基团包括FAM基团、HEX基团、TAMARA基团和ROX基团中的至少一种。
本发明的一种实现方式中,试剂盒还包括DNA提取试剂和PCR扩增试剂中的至少一种。
本发明的第二目的还在于提供一种用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的方法,方法包括:
获取待测样本的DNA,采用上述试剂盒对待测样本的DNA进行PCR扩增以得到AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A对应的目标扩增片段;
获取AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A对应的目标扩增片段长度信息;
根据AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A对应的目标扩增片段长度信息确定待测样本的AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因中各基因的CAG重复次数。
本发明的一种实现方式中,PCR扩增程序为:95℃预变性5min,进入1个循环;95℃变性15s,65℃退火15s,72℃延伸15s,然后进入25个循环;95℃变性15s,60℃退火15s,72℃延伸15s,然后进入8个循环;72℃补延伸10min,进入1个循环;PCR目标扩增于4℃保存。
本发明的第三目的在于提供一种用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的装置,包括:
片段长度信息获取模块:用于获取AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因对应的目标扩增片段长度信息;
CAG变异信息计算模块:用于根据AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因对应的目标扩增片段长度信息确定待测样本的AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因中各基因的CAG重复次数。
本发明的一种实现方式中,各基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-(该基因的特异性扩增片段保守区域长度+该基因特异性上游引物的长度+该基因特异性下游引物的长度+该基因特异性上游引物和/或特异性下游引物连接的预设固定片段长度)]/3,其中,各基因目标扩增片段包括该基因的特异性扩增片段,该基因特异性上游引物,该基因特异性下游引物片段,以及该基因特异性上游引物和/或特异性下游引物连接的预设固定片段,该基因的特异性扩增片段由该基因的特异性扩增片段保守区域和该基因的特异性扩增片段CAG可变区域组成。
本发明的一种实现方式中,AXTN3基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-459]/3;
AXTN2基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-244]/3;
CACNA1A基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-153]/3。
本发明还涉及一种计算机可读存储介质,计算机存储介质用于存储计算机指令、程序、代码集或指令集,当其在计算机上运行时,使得计算机执行以实现用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的全部步骤,全部步骤包括:
获取AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因对应的目标扩增片段长度信息;
根据AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因对应的目标扩增片段长度信息确定待测样本的AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因中各基因的CAG重复次数。
本发明还涉及一种电子设备,包括:
一个或多个处理器;以及
存储装置,存储一个或多个程序,
当一个或多个程序被一个或多个处理器执行,使得一个或多个处理器实现用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的全部步骤,全部步骤包括:
获取AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因对应的目标扩增片段长度信息;
根据AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因对应的目标扩增片段长度信息确定待测样本的AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因中各基因的CAG重复次数。
本发明通过设计多重特异性引物和通用引物扩增脊髓小脑共济失调的三个致病基因,创造性地使用连接有和通用引物序列相同的预设固定片段的特异性引物,扩增AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因,再使用带有荧光标记的通用引物对特异性扩增片段进行扩增,能够保持三个致病基因后续扩增效率的一致性,从而实现同时检测AXTN3基因、AXTN2基因或CACNA1A基因中CAG重复拷贝数,提高了脊髓小脑共济失调动态突变的检测效率。
此外,本申请创造性地将荧光标记设置于通用引物上,不需要再分别对单个基因设计荧光特异性引物,能够降低特异性引物的设计成本,避免特异性引物出现荧光猝灭的现象,提高特异性引物的稳定性,降低特异性引物的存储成本,进而也提高了试剂盒的稳定性,降低了试剂盒的制备、存储成本。
附图说明
图1为本发明实施例1待测样本的脊髓小脑共济失调动态突变检测结果示意图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
因此,旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述,而非意在限制本发明更广阔的方面。
如本文,术语“引物”指寡核苷酸,无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的,寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如,存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下),寡核苷酸能够作为合成的起始点而起作用。引物优选是单链的,以用于扩增的最大效率,但可选地也可以是双链的。如果是双链的,则在用于制备延伸产物前,首先将引物处理以分开其链。优选地,引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应足够长,以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素,包括温度、引物来源和方法的使用。例如,在一些实施方案中,引物范围为10-100或更多个核苷酸(例如10-300、15-250、15-200、15-150、15-100、15-90、20-80、20-70、20-60、20-50个核苷酸等)。
目前基因测序是遗传性脊髓小脑共济失调(SCAs)常用的检测方法,但现有检测技术常常需要针对单个致病基因设计荧光特异性引物,不仅检测效率低,还存在引物设计成本高的问题,引物易发生荧光猝灭也增加了引物的存储成本。
为了至少部分解决上述技术问题的至少一个,本发明的第一方面提供了一种用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的试剂盒,试剂盒包括用于扩增AXTN3基因的第一特异性引物、用于扩增AXTN2基因的第二特异性引物、用于扩增CACNA1A基因的第三特异性引物以及通用引物,各基因的特异性引物均连接有与所述通用引物序列相同的预设固定片段,所述通用引物连接有荧光基团,以使得通用引物能够对多重特异性引物扩增AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因获得的不同特异性扩增片段进行扩增,并得到每个基因对应的带有荧光标记的目标扩增片段,其中,目标扩增片段包括带有荧光标记的通用引物片段,也即预设固定片段,各基因的特异性扩增片段,特异性上游引物片段以及特异性下游引物片段,各基因的特异性扩增片段由该基因的特异性扩增片段保守区域和该基因的特异性扩增片段CAG可变区域组成,从而能够用于后续目标扩增片段长度信息的检测,并获取特异性扩增片段CAG可变区域的长度信息,进而计算每个基因的CAG重复次数。
本发明通过设计多重特异性引物和通用引物扩增脊髓小脑共济失调的三个致病基因,创造性地使用连接有通用引物序列的特异性引物扩增AXTN3基因、AXTN2基因或CACNA1A基因,再使用含有荧光标记的通用引物对特异性扩增片段进行扩增,能够保持三个致病基因后续扩增效率的一致性,从而实现同时检测AXTN3基因、AXTN2基因或CACNA1A基因中CAG重复拷贝数,提高了脊髓小脑共济失调动态突变的检测效率。
此外,本申请创造性地将荧光标记设置于通用引物上,不需要再分别对单个基因设计荧光特异性引物,能够降低特异性引物的设计成本,避免特异性引物出现荧光猝灭的现象,提高特异性引物的稳定性,降低特异性引物的存储成本,进而也提高了试剂盒的稳定性,降低了试剂盒的制备、存储成本。
一些实施方案中,第一特异性引物包括用于扩增AXTN3基因的特异性上游引物和特异性下游引物,第二特异性引物包括用于扩增AXTN2基因的特异性上游引物和特异性下游引物,第三特异性引物包括用于扩增CACNA1A基因的特异性上游引物和特异性下游引物,得到三个基因对应的连接有预设固定片段的特异性扩增片段,再通过通用引物对不同基因对应的特异性扩增片段进行扩增,得到三个基因对应的带有荧光标记的目标扩增片段。
一些实施方案中,用于扩增AXTN3基因的特异性上游引物或特异性下游引物的5’端,用于扩增AXTN2基因的特异性上游引物或特异性下游引物的5’端,以及用于扩增CACNA1A基因的特异性上游引物或特异性下游引物的5’端,均连接有预设固定片段,从而使得各基因的目标扩增片段为带有荧光标记的通用引物序列,特异性扩增片段以及各基因的上游引物序列或下游引物序列。
可以理解的是,本发明的发明思路在于将荧光标记设计在通用引物上而非特异性引物上,通过在通用引物上标记荧光基团,并且在各基因的特异性引物上分别连接预设固定片段,即可实现对三个致病基因同步扩增和检测。各基因的特异性引物上连接的预设固定片段可以相同也可以不同,当各基因的特异性引物上连接的预设固定片段不同时,试剂盒中含有至少与不同预设固定片段对应的序列相同的通用引物,且不同通用引物上均连接有荧光基团。
一些具体实施方案中,用于扩增AXTN3基因的特异性引物上游引物如SEQ ID NO.1所示,特异性下游引物如SEQ ID NO.2所示;用于扩增AXTN2基因的特异性上游引物如SEQID NO.3所示,特异性下游引物如SEQ ID NO.4所示;用于扩增CACNA1A基因的特异性上游引物如SEQ ID NO.5所示,特异性下游引物如SEQ ID NO.6所示;
SEQ ID NO.1:
5’-GTTCACGGTGCCCTCCTTTCCTAAGATCAGCACTTCCA-3’;
SEQ ID NO.2:5’-ACTGCTCCTTAATCCAGGGAA-3’;
SEQ ID NO.3:5’-GGCTTGCGGACATTGGCA-3’;
SEQ ID NO.4:5’-GTTCACGGTGCCCTCCCCGCCCCTTCGTCGTC-3’;
SEQ ID NO.5:5’-GTTCACGGTGCCCTCCCGTGGGCGGCCGATCT-3’;
SEQ ID NO.6:5’-CCTATTCCCCTGTGATCCGT-3’。
一些实施方案中,试剂盒包括如SEQ ID NO.7所示序列的通用引物;
SEQ ID NO.7:5’-GTTCACGGTGCCCTCC-3’。
一些实施方案中,荧光基团包括FAM基团、HEX基团、TAMARA基团和ROX基团中的至少一种。
一些实施方案中,试剂盒还包括DNA提取试剂和PCR扩增试剂中的至少一种。
一些实施方案中,PCR扩增试剂还包括PCR反应缓冲液、无核酸酶水、DNA聚合酶中的一种或多种。
一些具体实施方案中,DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。
一些实施方案中,试剂盒中还包括PCR产物质检试剂和PCR产物分子量检测试剂中的一种或多种。
本发明的第二方面还提供了一种用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的方法,方法包括:
获取待测样本的DNA,采用上述试剂盒对待测样本的DNA进行PCR扩增以得到目标扩增片段;
根据目标扩增片段确定待测样本的AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因中各基因的CAG重复次数。
在一些实施方案中,待测样本来自人的血液、血浆、细胞培养上清、唾液、精液、组织(例如羊水或绒毛)、组织裂解液、骨骼或毛发中的至少一种。
在一些具体实施方案中,获取待测样本的DNA的步骤包括:采用血液基因组对血液样本提取试剂盒进行DNA提取,并用Qubit 3.0荧光定量仪进行浓度测定,并稀释到一定浓度,用于后续PCR扩增步骤。
进一步,对待测样本的DNA进行PCR扩增包括:将待测样本和试剂盒中的多重特异性引物和通用引物、PCR扩增试剂混合以用于对待测样本的DNA进行PCR扩增反应,以分别获得AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因的特异性目标扩增。
一些实施方案中,根据目标扩增片段确定待测样本的AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因中各基因的CAG重复次数具体包括:
根据目标扩增片段获取AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因对应的目标扩增片段长度信息;
根据AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因对应的目标扩增片段长度信息确定待测样本的AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因中各基因的CAG重复次数。
进一步,对目标扩增片段长度进行毛细管电泳检测,根据毛细管电泳检测结果获取AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因对应的目标扩增片段长度信息,具体地,各基因的目标扩增片段长度信息等于各基因的特异性扩增片段长度、预设固定片段长度、上游特异性引物片段长度和下游特异性引物片段长度之和,其中,各基因的特异性扩增片段长度为各基因特异性扩增片段保守区域与CAG可变区域长度之和。
一些实施方案中,PCR扩增程序为:95℃预变性5min,进入1个循环;95℃变性15s,65℃退火15s,72℃延伸15s,然后进入25个循环;95℃变性15s,60℃退火15s,72℃延伸15s,然后进入8个循环;72℃补延伸10min,进入1个循环;目标扩增于4℃保存。
按照上述程序设定PCR反应程序,采用2步PCR程序法进行扩增,其中,变性温度可根据具体引物对的Tm值设定,以在第一步PCR扩增时先通过特异性引物对致病基因的靶标区域进行特异性扩增,再通过通用引物对连接有通用引物序列的特异性扩增片段进行进一步扩增,因而能在在扩增后期保持三个致病基因扩增效率的一致性,实现同时对AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因CAG变异的检测,提高动态突变的检测效率。
进一步,对各基因的目标扩增片段进行质检步骤,质检步骤包括:采用琼脂糖凝胶电泳对目标扩增片段进行质检,判断在目的条带附近是否有清晰条带。
进一步,对质检步骤中有目标条带的目标扩增片段进行上机检测,检测过程包括:将目标扩增片段变性,变性后在冰盒中冷却,加入变性剂及染料片段标准品,混合均匀后在SeqStudio基因分析仪进行毛细管电泳分析检测。其中,变性剂可以为甲酰胺,以防止变性后的DNA形成二级结构,染料片段标准品可以为LIZ600。
进一步,对毛细管电泳检测结果进行分析,确定目标扩增片段长度信息,分析过程具体包括:毛细管电泳检测结果采用GeneMapper分析软件进行结果分析,得到目标扩增片段的分子量大小及丰度信息。
本实施例用目标扩增片段的序列长度表示目标扩增的分子量大小,根据各基因的目标扩增片段长度信息可以计算各致病基因的CAG重复次数。
一些实施方案中,各基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-(该基因的特异性扩增片段保守区域长度+该基因特异性上游引物的长度+该基因特异性下游引物的长度+该基因特异性上游引物和/或特异性下游引物连接的预设固定片段长度)]/3,其中,该基因的特异性扩增片段由该基因的特异性扩增片段保守区域和该基因的特异性扩增片段CAG可变区域组成。
具体地,当采用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性引物对AXTN3基因进行特异性扩增时,AXTN3基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-459]/3;
当采用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的特异性引物对AXTN2基因进行特异性扩增时,AXTN2基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-244]/3;
当采用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的特异性引物对CACNA1A基因进行特异性扩增时,CACNA1A基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-153]/3。
本发明的第三方面还提供了一种用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的装置,包括:
片段长度信息获取模块:用于获取AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因对应的目标扩增片段长度信息;
CAG变异信息计算模块:用于根据AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因对应的目标扩增片段长度信息确定待测样本的AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因中各基因的CAG重复次数。
本发明还涉及一种计算机可读存储介质,计算机存储介质用于存储计算机指令、程序、代码集或指令集,当其在计算机上运行时,使得计算机执行上述检测脊髓小脑共济失调动态突变的方法。
计算机可读的信号介质可以包括在基带中或者作为载波一部分传播的数据信号,其中承载了计算机可读的程序代码。这种传播的数据信号可以采用多种形式,包括——但不限于——电磁信号、光信号或上述的任意合适的组合。计算机可读的信号介质还可以是计算机可读存储介质以外的任何计算机可读介质,该计算机可读介质可以发送、传播或者传输用于由指令执行系统、装置或者器件使用或者与其结合使用的程序。计算机可读介质上包含的程序代码可以用任何适当的介质传输,包括——但不限于——无线、电线、光缆、RF等等,或者上述的任意合适的组合。
可以以一种或多种程序设计语言或其组合来编写用于执行本公开操作的计算机程序代码,程序设计语言包括面向对象的程序设计语言—诸如Java、Smalltalk、C++,还包括常规的过程式程序设计语言—诸如“C语言或类似的程序设计语言。程序代码可以完全地在用户计算机上执行、部分地在用户计算机上执行、作为一个独立的软件包执行、部分在用户计算机上部分在远程计算机上执行、或者完全在远程计算机或服务器上执行。在涉及远程计算机的情形中,远程计算机可以通过任意种类的网络——包括局域网(LAN)或广域网(WAN)—连接到用户计算机,或者,可以连接到外部计算机(例如利用因特网服务提供商来通过因特网连接)。
本发明还涉及一种电子设备,包括:
一个或多个处理器;以及
存储装置,存储一个或多个程序,
当一个或多个程序被一个或多个处理器执行,使得一个或多个处理器实现上述用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的方法。
可选的,电子设备还可以包括收发器。处理器和收发器相连,如通过总线相连。需要说明的是,实际应用中收发器不限于一个,该电子设备的结构并不构成对本申请实施例的限定。
其中,处理器可以是CPU,通用处理器,DSP,ASIC,FPGA或者其他可编程逻辑器件、晶体管逻辑器件、硬件部件或者其任意组合。其可以实现或执行结合本申请公开内容所描述的各种示例性的逻辑方框,模块和电路。处理器也可以是实现计算功能的组合,例如包含一个或多个微处理器组合,DSP和微处理器的组合等。
总线可包括一通路,在上述组件之间传送信息。总线可以是PCI总线或EISA总线等。总线可以分为地址总线、数据总线、控制总线等。存储器802可以是ROM或可存储静态信息和指令的其他类型的静态存储设备,RAM或者可存储信息和指令的其他类型的动态存储设备,也可以是EEPROM、CD-ROM或其他光盘存储、光碟存储(包括压缩光碟、激光碟、光碟、数字通用光碟、蓝光光碟等)、磁盘存储介质或者其他磁存储设备、或者能够用于携带或存储具有指令或数据结构形式的期望的程序代码并能够由计算机存取的任何其他介质,但不限于此。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
本实施例募集了1个外周血样本各5ml于EDTA抗凝采血管中保存,使用本发明的检测方法用于常见脊髓小脑性共济失调动态突变的筛查。
1、血液基因组DNA采用天根全血提取试剂盒进行抽提,检测引物序列如表1所示。
表1
2、按照表2将多重特异性引物、通用引物和PCR反应试剂等混合得到PCR反应混合液,以使得AXTN3,AXTN2,CACNA1A对应的特异性引物及通用引物的终浓度分别为0.4uM、0.4uM、0.1uM、0.4uM,每个反应管的PCR反应混合液体积为25uL。
表2
试剂 | 反应体积(μL) |
Max Super-Fidelity DNA Polymerase | 0.5 |
dNTP(10mM) | 0.5 |
2×Phanta Max Buffer | 12.5 |
多重引物 | 5.5 |
荧光引物 | 1 |
gDNA | 1 |
甜菜碱(4M) | 1.5 |
Nuclease-Free H2O | 加至25 |
3、按照表3的程序设定PCR反应程序,采用2步PCR程序法进行扩增,其中变性温度可根据具体引物对的Tm值设定最佳的反应。
表3
4、PCR产物质检
配置2%琼脂糖凝胶电泳,取3μl目标扩增进行质检,判断目标扩增在目的条带附近是否有清晰条带。
5、产物上机检测
取目标扩增0.5ul,95℃变性4min,冰盒中冷却4min,加入10.2uHI-DI及0.3ulLIZ600,混合均匀后取10ul在SeqStudio基因分析仪进行毛细管电泳分析检测。
6、毛细管电泳检测结果分析
毛细管电泳检测结果采用GeneMapper分析软件进行结果分析,得到目标扩增片段长度及丰度信息。
如图1所示,图谱上依次为SCA6、SCA2及SCA3分型对应致病基因AXTN3,AXTN2,CACNA1A的CAG变异区域的DNA片段长度,SCA6、SCA2及SCA3分型对应的CAG重复数量分别是.8/11,19/19,17/35,三个基因的CAG动态突变重复数量均在正常范围内。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州贝康医疗器械有限公司
<120> 用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的试剂盒、方法和装置
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttcacggtg ccctcctttc ctaagatcag cacttcca 38
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actgctcctt aatccaggga a 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcttgcgga cattggca 18
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttcacggtg ccctccccgc cccttcgtcg tc 32
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gttcacggtg ccctcccgtg ggcggccgat ct 32
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctattcccc tgtgatccgt 20
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gttcacggtg ccctcc 16
Claims (8)
1.用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的引物组合物,其特征在于,包括用于扩增AXTN3基因的第一特异性引物对、用于扩增AXTN2基因的第二特异性引物对、用于扩增CACNA1A基因的第三特异性引物对以及通用引物;所述特异性引物对中的一条引物连接有预设固定片段,所述预设固定片段的序列和通用引物的序列相同,所述通用引物连接有荧光基团;
连接有预设固定片段的用于扩增AXTN3基因的特异性上游引物如SEQ ID NO.1所示,用于扩增AXTN3基因的特异性下游引物如SEQ ID NO.2所示;用于扩增AXTN2基因的特异性上游引物如SEQ ID NO.3所示,连接有预设固定片段的用于扩增AXTN2基因的特异性下游引物如SEQ ID NO.4所示;连接有预设固定片段的用于扩增CACNA1A基因的特异性上游引物如SEQ ID NO.5所示,用于扩增CACNA1A基因的特异性下游引物如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合物,其特征在于,所述预设固定片段的序列如SEQ IDNO.7所示。
3.根据权利要求1或2所述的引物组合物,其特征在于,所述荧光基团包括FAM基团、HEX基团、TAMARA基团和ROX基团中的至少一种。
4.一种用于检测脊髓小脑共济失调动态突变的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1~3任一项所述的引物组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括DNA提取试剂和PCR扩增试剂中的至少一种。
6.权利要求1-3任一所述的引物组合物或权利要求4-5任一所述的试剂盒在制备用于检测脊髓小脑共济失调动态突变试剂中的用途,其特征在于,包括:采用权利要求1~3中任一项所述的引物组合物扩增得到AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因的目标扩增片段,根据所述目标扩增片段的长度信息确定待测样本的AXTN3基因、AXTN2基因和CACNA1A基因中各基因的CAG重复次数。
7.根据权利要求6所述的用途,其特征在于,各基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-(该基因的特异性扩增片段保守区域长度+该基因特异性上游引物的长度+该基因特异性下游引物的长度+该基因特异性上游引物或特异性下游引物连接的预设固定片段长度)]/3,其中,各基因目标扩增片段由该基因的特异性扩增片段,该基因特异性上游引物,该基因特异性下游引物片段,以及该基因特异性上游引物或特异性下游引物连接的预设固定片段组成,该基因的特异性扩增片段由该基因的特异性扩增片段保守区域和该基因的特异性扩增片段CAG可变区域组成。
8.根据权利要求7所述的用途,其特征在于,AXTN3基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-459]/3;
AXTN2基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-244]/3;
CACNA1A基因的CAG重复次数=[该基因的目标扩增片段长度-153]/3。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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