CN109321649A - Sca3基因cag重复序列动态突变的引物及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体地说是SCA3基因CAG重复序列动态突变的引物及检测方法，其特征在于，famF向引物5’端带5’‑FAM荧光基团，反向引物3’端包含5个CTG重复，引物序列如下：SCA3‑famF：CCAGTGACTACTTTGATTCGTGAAACAATG；SCA3‑R：TCCTGATAGGTCCCCCTGCTGCTGCTGCTG。本发明同现有技术相比，检测速度快，整个实验流程下来，只需要4到5个小时；准确率高，重复次数误差为正负1次。

Description

SCA3基因CAG重复序列动态突变的引物及检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体地说是SCA3基因CAG重复序列动态突变的引物及检测方法。
背景技术
Spinocerebeller ataxia type 3(SCA3)是脊髓小脑共济失调三型，也被称为Machado-Joseph病(MJD)，是中枢神经系统发生病变的一系列遗传病的一种。同其他遗传性共济失调疾病一样，SCA3由于一种特定的基因缺陷而导致脑部和从脑部发送和接受信号的神经纤维中的神经细胞出现障碍而形成的。在SCA3中，由于神经细胞和神经纤维出现障碍，会导致小脑和相关的脑部区域出现退化。
而在SCA3相关的ATXN3基因中CAG会出现异常重复，基于此，可以尝试设计一种检测CAG重复状况的引物及方法，通过对重复数的确定，辅助判断相关疾病。
发明内容
本发明的目的是针对SCA3的CAG重复，专门设计了两条特异性的引物，使用这对引物采用TP PCR的方法对ATXN3的CAG重复序列进行检测。
为实现上述目的，设计一种SCA3基因CAG重复序列动态突变的引物，其特征在于，famF向引物5’端带5’-FAM荧光基团，反向引物3’端包含5个CTG重复，引物序列如下：
SCA3-famF：CCAGTGACTACTTTGATTCGTGAAACAATG；
SCA3-R：TCCTGATAGGTCCCCCTGCTGCTGCTGCTG。
一种如权利要求1所述引物的检测方法，其特征在于，采用如下步骤：
(1)、对提取的DNA进行PCR扩增；
(2)、对PCR扩增产物进行毛细管电泳；
(3)、数据分析；
——所述的PCR扩增采用如下步骤：
2.1、试剂配置：按DNA检测样本数量配置扩增反应液混合液，每份19ul分装，所述扩增反应液混合液中：2×PreMix ExTaq试剂用量10×nμl；浓度为10uM的SCA3-famF引物用量1×nμl；浓度为10uM的SCA3-R引物用量1×nμl；ddH2O用量7×nμl；所述n＝检测样本数+1；
2.2、加样：在19ul扩增反应混合液中加入1ul DNA；
2.3、扩增：在PCR仪中先以95℃变性5分钟；再运行35次如下循环：95℃变性1分钟、65℃退火1分钟、72℃延伸2分钟；之后72℃延伸15分钟，4℃保存，完成PCR扩增程序；
——所述对PCR扩增产物进行毛细管电泳采用如下步骤：
3.1、样本稀释：对PCR扩增产物进行20倍和100倍样本稀释，分别在19ul的ddH2O和99ul的ddH2O中加入1ulPCR扩增产物；
3.2、配置上机混合液：取ABI GS500-LIZ内标和HIDI按1∶99的体积比混合后，取9ul混合液与与上述稀释后的PCR扩增产物1ul混合制成上机混合液；
3.3、预变性：将配置好的上机混合液在PCR仪上以95℃运行3分钟后，冰水混合物中极速冷却5分钟，确保温度在0°左右，作变性处理；
3.4、毛细管电泳：上机混合液在ABI3730xl测序仪中进行检测，采用G5颜色分组，在ABI3730xl测序仪中的分型参数设置如下：检测恒温OVEN_Temperature 60℃，缓冲液温度Buffer_Temperature 35℃；预电泳电压PreRun_Voltage 15kV，预电泳时间PreRun_Time180s；注入电压Injection_Voltage为1.5kV；注入时间Injection_Time为15s；第一次读数First_ReadOut_Time 300ms；第二次读数Second_ReadOut_Time 300ms；电泳电压Run_Voltage 15kV；突跳步数Voltage_Number_of_steps设置为10步；突跳电压Voltage_steps_Interval设置为20s；电压容差Voltage_Tolerance设置为0.6kV；电流Current_Stability为30uA，变温延迟Ramp_Delay 1s；日期延迟Data_Delay 600s；电泳时间Run_Time 1600s。
所述数据分析为采用genemapper4.0软件中对分型结果进行判读，分析方法采用该软件默认设置，核对校正内标峰后定义164bp处为(CAG)5处，根据每隔3bp左右出现的荧光串峰个数判断CAG重复数，(CAG)5之后第一个最高峰所对应的CAG重复数为第一个等位基因，之后如果还有荧光串峰，则选取五指峰中的最高峰所对应的CAG重复数作为第二个等位基因。
本发明同现有技术相比，检测速度快，整个实验流程下来，只需要4到5个小时；准确率高，重复次数误差为正负1次。
附图说明
图1为本发明实施例中采用ABI3730xl测序仪对上机混合液进行毛细管电泳时，测序仪的参数设置。
图2为本发明实施例中一个样本采用genemapper4.0分析后的波形图，该样本中CAG重复数为22/76。
图3中本发明实施例中另一个样本采用genemapper4.0分析后的波形图，该样本中CAG重复数为8/31。
具体实施方式
现结合附图及实施例对本发明作进一步地说明。
本发明的设计思路是：针对SCA3基因的CAG重复，专门设计了两条特异性的引物：其中一条引物包含有CAG重复。使用这对引物对样本进行PCR扩增，会产生一系列片断长度不等的PCR产物，产物的一端包含有fam荧光，对PCR产物进行毛细管电泳，可以清楚的看到产物中CAT的重复数，误差不超过1次重复。
实施例1
针对SCA3的CAG重复，专门设计了两条特异性的引物，famF向引物5’端带5’-FAM荧光基团，反向引物3’端包含5个CTG重复，引物序列如下：
SCA3-famF：CCAGTGACTACTTTGATTCGTGAAACAATG；
SCA3-R：TCCTGATAGGTCCCCCTGCTGCTGCTGCTG。
实施例2
本例中采用实施例1中设计的一对引物，对血液样本进行检测。
血液样本提取采用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒(0.1-1ml)(DP348)，下面的DNA的提取流程是试剂盒中的标准流程：一、提取200μl血液样品加入200μl缓冲液GB和20μl Proteinase K的预混溶液至上述处理获得的200μ l样品中，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮；室温放置2-5min后加入350μl缓冲液BD，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CG2中，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中；向吸附柱CG2中加入500μl缓冲液GDB，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中；向吸附柱CG2中加入600μl漂洗液PWB，12,000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CG2放入收集管中；12000rpm(～13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CG2置于室温放置2min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CG2转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12,000rpm(～13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
二、对提取的DNA进行PCR扩增。
使用上述这对引物对血液样本进行PCR扩增，会产生一系列片断长度不等的PCR产物，产物的一端包含有fam荧光；
1、试剂配置：按DNA检测样本数量配置扩增反应液混合液，每份19ul分装，所述扩增反应液混合液中试剂用量如下：
试剂 用量(ul)
2×PreMix ExTaq 10×n
SCA3-famF(10uM) 1×n
SCA3-R(10uM) 1×n
ddH<sub>2</sub>O 7×n
其中，n＝检测样本数+1。
2、加样：在19ul扩增反应混合液中加入1ul DNA；
3、扩增：在PCR仪中进行PCR扩增程序，扩增程序如下：
95℃变性5分钟；之后运行35次如下循环：95℃变性1分钟、65℃退火1分钟、72℃延伸2分钟；之后72℃延伸15分钟，4℃保存。
四、对PCR产物进行毛细管电泳。
1、样本稀释：对PCR产物进行20倍和100倍样本稀释，分别在19ul ddH2O和99ulddH2O中加入1ulPCR扩增产物。
2、配置上机混合液：取ABI GS500-LIZ内标和HIDI按1∶99体积比混合后，取9ul混合液与1ul稀释后的PCR扩增产物混合制成上机混合液。
3、预变性：将配置好的上机混合液在PCR仪上95℃运行3分钟后，冰水混合物中极速冷却5分钟，作变性处理。
4、毛细管电泳：上机混合液在ABI3730xl测序仪中进行检测，采用G5颜色分组，在ABI3730xl测序仪中分型参数设置如图1所示。
五、数据分析
3730xl测序仪分型完成后在genemapper4.0中对分型结果进行判读，分析方法采用该软件默认设置，核对校正内标峰后定义164bp处为(CAG)5处，根据每隔3bp左右出现的荧光串峰个数判断CAG重复数，(CAG)5之后第一个最高峰所对应的CAG重复数为第一个等位基因，之后如果还有荧光串峰，则选取五指峰中的最高峰所对应的CAG重复数作为第二个等位基因，参见图2和图3。

Claims (3)

1.一种SCA3基因CAG重复序列动态突变的引物，其特征在于，famF向引物5’端带5’-FAM荧光基团，反向引物3’端包含5个CTG重复，引物序列如下：
SCA3-famF：CCAGTGACTACTTTGATTCGTGAAACAATG；
SCA3-R：TCCTGATAGGTCCCCCTGCTGCTGCTGCTG。
2.一种如权利要求1所述引物的检测方法，其特征在于，采用如下步骤：
(1)、对提取的DNA进行PCR扩增；
(2)、对PCR扩增产物进行毛细管电泳；
(3)、数据分析；
——所述的PCR扩增采用如下步骤：
2.1、试剂配置：按DNA检测样本数量配置扩增反应液混合液，每份19ul分装，所述扩增反应液混合液中：2×PreMix ExTaq试剂用量10×n μl；浓度为10uM的SCA3-famF引物用量1×n μl；浓度为10uM的SCA3-R引物用量1×n μl；ddH2O用量7×n μl；所述n＝检测样本数+1；
2.2、加样：在19ul扩增反应混合液中加入1ul DNA；
2.3、扩增：在PCR仪中先以95℃变性5分钟；再运行35次如下循环：95℃变性1分钟、65℃退火1分钟、72℃延伸2分钟；之后72℃延伸15分钟，4℃保存，完成PCR扩增程序；
——所述对PCR扩增产物进行毛细管电泳采用如下步骤：
3.1、样本稀释：对PCR扩增产物进行20倍和100倍样本稀释，分别在19ul的ddH2O和99ul的ddH2O中加入1ulPCR扩增产物；
3.2、配置上机混合液：取ABI GS500-LIZ内标和HIDI按1∶99的体积比混合后，取9ul混合液与与上述稀释后的PCR扩增产物1ul混合制成上机混合液；
3.3、预变性：将配置好的上机混合液在PCR仪上以95℃运行3分钟后，冰水混合物中极速冷却5分钟，作变性处理；
3.4、毛细管电泳：上机混合液在ABI3730xl测序仪中进行检测，采用G5颜色分组，在ABI3730xl测序仪中的分型参数设置如下：检测恒温OVEN_Temperature 60℃，缓冲液温度Buffer_Temperature 35℃；预电泳电压PreRun_Voltage 15kV，预电泳时间PreRunTime180s；注入电压Injection_Voltage为1.5kV；注入时间Injection_Time为15s；第一次读数First_ReadOut_Time 300ms；第二次读数Second_ReadOut_Time 300ms；电泳电压Run_Voltage 15kV；突跳步数Voltage_Number_of_steps设置为10步；突跳电压Voltage_steps_Interval设置为20s；电压容差Voltage_Tolerance设置为0.6kV；电流Current_Stability为30uA，变温延迟Ramp_Delay ls；日期延迟Data_Delay 600s；电泳时间Run_Time 1600s。
3.如权利要求2所述引物的检测方法，其特征在于，所述数据分析为采用genemapper4.0软件中对分型结果进行判读，分析方法采用该软件默认设置，核对校正内标峰后定义164bp处为(CAG)5处，根据每隔3bp左右出现的荧光串峰个数判断CAG重复数，(CAG)5之后第一个最高峰所对应的CAG重复数为第一个等位基因，之后如果还有荧光串峰，则选取五指峰中的最高峰所对应的CAG重复数作为第二个等位基因。
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