CN110890134A - 利用叶绿体基因组大单拷贝区鉴别枫斗类石斛基源的方法 - Google Patents

利用叶绿体基因组大单拷贝区鉴别枫斗类石斛基源的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用叶绿体基因组大单拷贝区(LSC)精准鉴别枫斗类石斛基源的方法。该方法包括以下具体步骤：(1)DNA提取和测序；(2)叶绿体基因组的拼接；(3)叶绿体基因组LSC序列获取和比对；(4)聚类对比鉴定；(5)结果判定。本发明所提供的方法主要针对基于现有技术难以有效鉴别枫斗类石斛基源的问题，建立了一种利用叶绿体基因组大单拷贝区(LSC)序列进行种质鉴定的方法。该方法适用性广、操作简便、易于掌握、准确性高、通用性强，能够实现对基源复杂的枫斗类石斛高效、精准的鉴定，对确保枫斗类石斛药材使用的准确性和安全性具有重要意义。

Description

利用叶绿体基因组大单拷贝区鉴别枫斗类石斛基源的方法
技术领域
本发明属于药用植物分子鉴定技术领域，具体涉及一种利用叶绿体基因组大单拷贝区(LSC)对枫斗类石斛基源进行种质鉴定的方法。
背景技术
枫斗类石斛是石斛属中一组非常重要的类群，其茎柔软、富含胶质，经过烘焙软化、去除叶鞘，可加工成紧密或疏松的团状、弹簧状药材，形似“枫斗”，因而称之为枫斗类石斛。在中国，枫斗类石斛大约有20种，主要分布在秦岭山脉以南地区。由于其茎富含多糖、石斛碱等药用成分，枫斗类石斛具有滋阴生津、补脾益胃、润肺止咳、清音明目等功效。枫斗类石斛基源复杂，其中许多物种在非花期形态上极其相似，很难根据形态学特征区分它们，然而不同枫斗类石斛的药用成分、功效存在一定差异，市场价格也不尽相同。在目前的药材市场，以假乱真、以次充好的现象屡见不鲜，这些现象导致了枫斗药材种质混乱，严重影响枫斗类石斛药材使用的有效性和安全性。因此，枫斗类石斛基源的准确鉴定非常重要。
近年来，随着分子生物学技术的发展，DNA条形码技术已经被广泛地应用于中药材植物的鉴定，尤其是针对形态上难以区分的类群。在石斛属中，DNA条形码候选片段ITS、ITS2、matK、rbcL、psbA-trnH以及线粒体nad 1intron 2等已经被应用去解决复杂的物种鉴定问题。然而这些常用的DNA片段并不能有效地鉴别一些重要的枫斗类石斛，如霍山石斛(Dendrobium huoshanense)、细茎石斛(D.moniliforme)、铁皮石斛(D.officinale)、梵净山石斛(D.fanjingshanense)、美花石斛(D.loddigesii)、杯鞘石斛(D.gratiosissimum)、大包鞘石斛(D.wardianum)等。因此，到目前为止仍然缺乏一种快速，有效地鉴别枫斗类石斛基源的方法。
叶绿体是绿色植物细胞中半自主的细胞器，有独立的基因组。叶绿体基因组的基因组小、拷贝数高、结构稳定，因此易于测序、组装和注释。随着高通量测序技术的快速发展，叶绿体基因组测序成本急剧下降，越来越多的研究者选择利用叶绿体全基因组序列鉴别分类上困难的类群。最近，在石斛属中利用叶绿体基因组进行物种鉴定的研究已有报道。如中国专利文献CN108763866A，公开了一种利用叶绿体全基因组精准鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的方法，该方法成功地对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行了高效、精准的鉴别。但该方法使用的是叶绿体全基因组序列，叶绿体基因组的IR/SC节点处结构不稳定，这些节点处序列往往需要进行PCR扩增、Sanger测序验证并补全，需要花费一些额外的人力和物力。
而本发明使用的叶绿体基因组大单拷贝区(LSC)序列，其结构稳定，更容易拼接并获得准确的序列，可以省去叶绿体基因组节点处验证的繁琐工作。因此，本发明可以大大减少了鉴定的工作量和成本。另外，LSC的大小仅为叶绿体基因组总长度的一半，其较短的长度在一定程度上也可以减少鉴定分析的时间(如序列比对、构树的时间)。迄今为止，利用叶绿体基因组LSC进行物种鉴定研究还未见报道。
发明内容
本发明针对传统鉴别方法难以解决枫斗类石斛基源种质鉴定的技术问题，提供了一种利用叶绿体基因组大单拷贝区(LSC)对枫斗类石斛基源进行精准鉴定的方法，该方法操作过程简单、易于掌握、鉴定结果准确，是一种简便而可靠的分子鉴定方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用叶绿体基因组大单拷贝区精准鉴别枫斗类石斛基源的方法，包括以下步骤：
步骤1，DNA提取和测序，提取待测样本的总DNA，将得到的DNA样品进行高通量测序获取片段序列；
步骤2，叶绿体基因组拼接，将步骤1得到的序列进行修整，采用有参方法进行拼接，将修整后的序列匹配到参考基因组上，提取合议序列从而获得待检样本的叶绿体基因组序列；
步骤3，叶绿体基因组LSC序列获取及比对，从步骤2得到的待检样本叶绿体基因组序列中提取LSC序列，与标准参照个体的LSC序列和外类群物种的LSC序列进行多序列比对；
步骤4，聚类对比鉴定，将步骤3进行多序列比对后得到的LSC序列矩阵进行手动校正，去除所有空缺和比对模糊区域，然后采用建树的方法基于LSC序列矩阵对枫斗类石斛基源进行聚类鉴别；
步骤5，结果判定，构树完成后打开树文件，待检样本与其标准参照个体聚为一支，且支持率大于50％，枫斗类石斛中的各个物种均得以成功鉴定。
进一步地，步骤1中选择待测样本的叶片或茎尖提取总DNA。
进一步地，步骤2中所述参考基因组为霍山石斛叶绿体基因组，GenBank登录号LC490207。
进一步地，步骤2中所述提取合议序列是指优选测序深度大于80×的核苷酸位点提取合议序列。
进一步地，步骤4中所述建树的方法是构建NJ树，模型设为K2P距离模型，bootstrap循环设定为1000次。
进一步地，步骤3和步骤5中所述标准参照个体是在枫斗类石斛的每个种选择一株开过花，并经专家对其花部等形态特征进行鉴定，能够保证其种质正确无误的个体。
进一步地，所述枫斗类石斛基源包括霍山石斛、广东石斛、细茎石斛、西畴石斛、梵净山石斛、重唇石斛、铁皮石斛、曲茎石斛、钩状石斛、齿瓣石斛、杯鞘石斛、大包鞘石斛、肿节石斛、晶帽石斛、玫瑰石斛、束花石斛、罗河石斛、串珠石斛、美花石斛、报春石斛、兜唇石斛、喇叭唇石斛、梳唇石斛。
有益效果：
1、高分辨率和准确度。叶绿体基因组LSC的长度约为叶绿体基因组全长的一半，相比较单个DNA片段或多片段组合，其包含了更加丰富的鉴定信息，具有更高的分辨率。在基于该区域的鉴定结果中，枫斗类石斛中每个种的所有个体均能与其标准参照个体聚为一支，且获得最高的支持率，因此本方法可以精准地鉴别枫斗类石斛基源植物。
2、简便、快速。相比较于叶绿体全基因组而言，LSC具有更小的尺度，更容易去比对，可以减少计算的时间和存储的空间，尤其是涉及到大样本量时，本方法具有更大的生物信息学优势。此外，由于本方法仅需要LSC序列，在拼接叶绿体基因组时，可以省去叶绿体基因组各个节点处PCR验证等繁琐的工作，更加省时省力。
3、检测成本低。随着高通量测序技术的进步，叶绿体基因组测序成本已经急剧下降，传统利用DNA片段进行物种鉴定的方法在成本上已经不具优势。另外，由于LSC结构稳定，相对于拼接叶绿体全基因组而言，LSC区域更容易拼接并获得准确序列，需要更少的测序深度(一般测序深度达到3×既可)，在一定程度上可以节约成本。因此本方法是一种比较经济的分子鉴定方法。
4、通用性好。相比较于传统的DNA片段鉴别方法，本方法不用设计特异性引物，所以不需要考虑引物扩增效率低，以及由于基因丢失导致的扩增失败等诸多问题，具有良好的通用性。
5、应用范围广。本发明提供的方法仅需要样本的少量DNA，不易受产地、植物生长期等条件的影响。另外，随着高通量测序技术不断的进步，对DNA样品的总量及完整性要求越来越低，本方法也可尝试用于提取DNA不够理想的材料，如植物标本、干燥处理后材料等，因此本方法具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中基于叶绿体基因组大单拷贝区(LSC)序列对枫斗类石斛基源构建的NJ树，分支节点上的数字代表支持率(％),其中大于50％被显示，
Figure BDA0002256083960000031
代表每个种的标准参照个体。
图2为对比实施例1中基于片段及片段组合对枫斗类石斛基源构建的NJ树，分支节点上的数字代表支持率(％)，其中大于50％被显示，(a):ITS；(b):ITS2；(c):ITS2+psbA-trnH。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
(1)DNA提取和测序
枫斗类石斛中每个种均采集了多个样本，具体采样信息见表1。每个样本选取0.2g新鲜叶片或幼茎，加入液氮充分研磨至粉末，然后按照植物DNA提取试剂盒提供的步骤并做适当的调整，将试剂盒推荐的加去离子水溶解DNA的时间由1分钟调整为15分钟，这样可以提高提取的样本DNA的浓度和得率，最终获得的各样本的总DNA于-20℃保存。
经质检合格的DNA样品送生物公司进行高通量测序。选择IIIumina Hiseq 4000测序平台，建库测序模式为pair-end，测序类型为PE400，读长为150bp，每个样本获得4.0-5.0Gb的总数据量。
表1样品信息和相关序列GenBank登录号
Figure BDA0002256083960000041
Figure BDA0002256083960000051
Figure BDA0002256083960000061
“a”代表从GenBank下载的序列。
“*”代表用作为外类群的物种。
Figure BDA0002256083960000062
代表每个种的标准参照个体。
(2)叶绿体基因组拼接及注释
将测序获得原始序列利用CLC Genomics Workbench 6.0.1(CLC Bio,Aarhus,Denmark)软件进行修整(trimmed)，参数设为：error probability<0.05。将修整后的序列匹配(map)到参考基因组上(霍山石斛，登陆号：LC490207)，测序深度大于80×的核苷酸位点用于提取consensus序列，从而获得各样本的叶绿体基因组序列。利用在线分析软件DOGMA对拼接获得的叶绿体基因组进行基因注释，并用tRNAscan-SE 1.21软件对tRNA基因进行校对。蛋白编码基因的起始子、终止子、外显子和内含子的边界进行人工校对。最后各个样本的叶绿体基因组序列上传至GenBank，登录号见表1。
(3)叶绿体基因组LSC序列获取及比对
从拼接获得的各个样本叶绿体基因组序列中提取各自的LSC序列。另外，为了进一步验证本发明的有效性，NCBI数据库已收录的枫斗类石斛叶绿体基因组也被下载，并提取其LSC序列进行鉴定分析(登录号见表1，铁皮石斛、曲茎石斛、钩状石斛的标准参照个体的选定参考专利：CN108763866A)。利用MAFFT v7软件对提取的所有枫斗类石斛LSC序列与各物种的标准参照个体和外类群物种的LSC序列(从GenBank下载，登录号见表1中带“*”物种)进行多序列比对。
(4)聚类对比鉴定
对上述比对后获得的LSC序列矩阵进行手动校对，利用Gblocks v.0.91b软件，去除空缺(gap)和比对模糊区域，参数“allowed gap positions”设为“none”，其余参数设为默认值。然后利用MEGA 6.0软件对LSC序列矩阵构建NJ树，模型设为K2P距离模型，bootstrap循环设定为1000次。
(5)结果判定
利用FigTree V1.4.2软件打开树文件，每个物种的所有样本均能与其标准参照个体聚为独立的一支，且支持率均100％(见图1)，因此枫斗类石斛中的各个物种均得以成功鉴定，鉴定成功率为100％。
以上所述的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
对比实施例1
利用现有技术，选择适用于药用植物物种鉴定的DNA片段及组合，对实施例中的样本进行种质鉴定。采用的片段及组合如下：
(a)ITS(Chattopadhyay P,Banerjee G,Banerjee N.Distinguishing orchidspecies by DNA barcoding:Increasing the resolution of population studies inplant biology.OMICS 2017；21:711–20.)；
(b)ITS2(Chen SL,Yao H,Han JP,Liu C,Song JY,Shi LC,et al.Validation ofthe ITS2region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plantspecies.PLoS One 2010；5:e8613.)；
(c)ITS2+psbA-trnH(Chen SL,Pang XH,Song JY,Shi LC,Yao H,Han JP,et al.Arenaissance in herbal medicine identification:from morphology toDNA.Biotechnol Adv 2014；32:1237–44.).
实验步骤：(1)DNA提取；(2)引物设计；(3)PCR扩增；(4)Sanger测序；(5)序列比对和建树；(6)结果判定。步骤(1)–(4)用于ITS序列的获取，经测序得到的ITS序列已上传至GenBank保存，登录号见表1。psbA-trnH序列直接从各样本的叶绿体基因组序列中获取。鉴定结果如图2所示，许多重要的枫斗类石斛样本不能与其标准参照个体聚为独立一支，而是与其他枫斗类石斛物种嵌套在一起，例如：霍山石斛、细茎石斛、梵净山石斛、广东石斛、曲茎石斛、杯鞘石斛等。以上结果表明，现有技术(DNA片段及组合)并不能有效鉴别所有枫斗类石斛基源植物。对比实施例进一步突出了本发明提供的方法对枫斗类石斛基源鉴定的优势。

Claims (7)

1.一种利用叶绿体基因组大单拷贝区精准鉴别枫斗类石斛基源的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，DNA提取和测序，提取待测样本的总DNA，将得到的DNA样品进行高通量测序获取片段序列；
步骤2，叶绿体基因组拼接，将步骤1得到的片段序列进行修整，采用有参方法进行拼接，将修整后的序列匹配到参考基因组上，提取合议序列从而获得待检样本的叶绿体基因组序列；
步骤3，叶绿体基因组LSC序列获取及比对，从步骤2得到的待检样本叶绿体基因组序列中提取LSC序列，与标准参照个体的LSC序列和外类群物种的LSC序列进行多序列比对；
步骤4，聚类对比鉴定，将步骤3进行多序列比对后得到的LSC序列矩阵进行手动校正，去除所有空缺和比对模糊区域，然后采用建树的方法基于LSC序列矩阵对枫斗类石斛基源进行聚类鉴别；
步骤5，结果判定，构树完成后打开树文件，待检样本与其标准参照个体聚为一支，且支持率大于50％，枫斗类石斛中的各个物种均得以成功鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中选择待测样本的叶片或茎尖提取总DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中所述参考基因组为霍山石斛叶绿体基因组，GenBank登录号LC490207。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中所述提取合议序列是指优选测序深度大于80×的核苷酸位点提取合议序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4中所述建树的方法是构建NJ树，模型设为K2P距离模型，bootstrap循环设定为1000次。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3和步骤5中所述标准参照个体是在枫斗类石斛的每个种选择一株开过花，并经专家对其花部等形态特征进行鉴定，能够保证其种质正确无误的个体。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述枫斗类石斛基源包括霍山石斛、广东石斛、细茎石斛、西畴石斛、梵净山石斛、重唇石斛、铁皮石斛、曲茎石斛、钩状石斛、齿瓣石斛、杯鞘石斛、大包鞘石斛、肿节石斛、晶帽石斛、玫瑰石斛、束花石斛、罗河石斛、串珠石斛、美花石斛、报春石斛、兜唇石斛、喇叭唇石斛、梳唇石斛。
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