CN109554445A - 一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法。具体的，利用花生属叶绿体基因组筛选得到一个高突变区通过简单扩增和测序来解析花生属种间遗传关系。包括如下步骤：(1)根据已有数据库获取栽培种花生及其近缘物种叶绿体全基因组基因序列；(2)将多个物种叶绿体全基因组基因序列进行对比分析，锚定叶绿体全基因组范围内的高突变区域并进行注释；(3)对选定高突变区域进行引物设计，PCR扩增和一代测序后，构建系统发生树。本发明利用花生属的高突变区psbE‑petL，通过简单的扩增和构树，可以有效地解析花生属种间遗传关系，省时，省力和省费用，是有效解析花生属种间遗传关系上的一项重大突破，具有突出的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法。
背景技术
栽培种花生种植面积广泛，但是遗传基础相对狭窄。因此，拓宽栽培种花生的种质资源遗传基础显得尤为重要。花生属包含了81个已命名的物种，野生种质资源丰富，优异资源基因丰富，在热带亚热带气候环境下有广泛的适应性。和栽培种花生相比，野生种质具有叶斑病、锈病、青枯病等抗病虫害基因，是用于花生品种改良的重要基因源。尽管有些种质资源并无栽培价值，但可根据不同的目的，通过杂交选育利用其有利基因，获得新种或达到改良现有栽培种的目的。揭示栽培种花生与花生区组其它野生种之间的亲缘关系是野生资源引入和遗传资源保存的重要参考。近年来，随着高通量测序技术的发展促进了基因组学分析和研究。但是，通过叶绿体全基因组序列去解析花生属种间系统进化关系需要经过建库、测序、原始数据过滤、组装和大数据分析等多步骤，最终完成基于叶绿体全基因组序列的系统进化树的构建。上述方法耗费的时间和费用较多，并且生物信息学分析较为复杂。因此，现在急需一种方法简单，所用时间短，效率高，费用低的解析花生属种间遗传关系的方法。
发明内容
为解决现有技术存在的不足，本发明提供一种方法简单，所用时间短，效率高，费用低的解析花生属种间遗传关系的方法。
本发明的技术方案为：
一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，利用花生属叶绿体基因组筛选得到一个高突变区，可通过简单扩增和测序来快速有效地解析花生属种间遗传关系。
上述解析花生属种间遗传关系的有效简易方法，包括如下步骤：
(1)根据已有数据库记录获取栽培种花生及其近缘物种叶绿体全基因组基因序列；
(2)将多个物种叶绿体全基因组基因序列进行核苷酸多态性分析，锚定叶绿体全基因组范围内的高突变区域并进行注释；
(3)对选定高突变区域进行引物设计，PCR扩增和一代测序后，构建系统发生树来解析花生属种间遗传关系。
进一步的，所述步骤(2)中，利用VISTA软件使用通过500bp大小滑动窗口的计算不同窗口的核苷酸多样性比对，锚定叶绿体全基因组上的高核苷酸多样性域。
进一步的，所述高突变区域为psbE-petL基因间隔区，所述psbE-petL基因间隔区的序列如序列表41所示，所述psbE-petL基因间隔区为花生属的DNA barcode。
进一步的，所述步骤(3)中，引物设计的过程中取高突变区域约总长500bp片段长度进行引物设计。
进一步的，引物上游设计范围1-100bp，下游设计范围600-700bp，产物大小在500-700bp之间，退火温度58℃。
进一步的，所述步骤(3)中，随机选取几个具有叶绿体全基因组的花生属的物种，通过DNA提取的方法将每个物种随机选取2-3粒完整种子，培养皿中浸种3-4d，待种子萌发出芽后置入培养盒，28℃下培养10-13d，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取花生叶片DNA。
进一步的，所述步骤(3)中，PCR扩增的反应体系为MasterMix 12.5μL、DNA模板0.5μL、ddH2O10μL、上游引物1μL、下游引物1μL。
进一步的，所述步骤(3)中，PCR扩增的反条件为95℃预变性5min，94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸50s，33个循环，72℃再延伸7min。
进一步的，通过一代测序方法，获得扩增片段序列。
进一步的，所述步骤(3)中，利用MEGA软件对多个扩增序列片段构建系统关系树。
本发明所达到的有益效果为：
本发明通过锚定花生属各物种间特有的叶绿体基因组高突变区psbE-petL，即花生属的DNAbarcode，进行构建系统关系树与通过叶绿体全基因构建的系统关系树进行比对分析，得到了较为一致的结果。因此，证明了该花生属叶绿体基因组高突变区psbE-petL就可以用来解析花生属种间遗传关系。并且，本发明通过筛选花生属叶绿体基因组高突变区，仅仅通过简单的扩增和对比，可以有效地解析种间遗传关系，做到省时，省力和省费用，是解析花生属种间遗传关系上的一项重大突破，具有突出的现实意义。
附图说明
图1是利用叶绿体基因组高突变区域构建的系统关系树。
图2是利用叶绿体全基因组构建的系统关系树。
具体实施方式
为便于本领域的技术人员理解本发明，下面结合实施例说明本发明的具体实施方式。
实施例
1大数据分析
通过数据库现有数据及高通量测序和组装，获得到了4个栽培种花生的生物学类型(GenBank accession no.MG814006 for var.fastigiata Waldron,MG814007 forvar.hirsute Kohler,MG814008 for var.hypogaea L.和MG814009 for var.vulgarisHarz)和11个野生种的叶绿体全基因组(MK144818 for A.monticola,MK144823 forA.paraguariensis,MK144822 for A.duranensis,MK144819 for A.stenosperma,MK144820 for A.batizocoi,MK144824 for A.cardenasii,MK144826 for A.helodes,MK144828 for A.correntina,MK144827 for A.hoehnei,MK144821 for A.chacoensis,MK144829 for A.和MK144825 for A.villosa)序列，通过全基因组序列的对比和分析，得到候选高突变区域。具体的，通过500bp大小滑动窗口的核苷酸多样性比对，利用VISTA软件锚定叶绿体全基因组上的高突变区域。
2验证实验
2.1研究材料
选用4份栽培种花生，花生属野生种11份。
2.2引物的设计
通过高通量数据的生物信息学分析获取花生叶绿体全基因组水平上高突变区域，即psbE-petL基因间隔区，如序列表41所示。该区域两端进行引物设计，总长593bp。引物设计用primerpremier6.0，上游设计范围1～100bp，下游设计范围600～700bp，产物大小593bp，退火温度58℃。引物合成信息见表1。
表1引物合成信息
2.3 DNA的提取
每份种质材料随机选取2-3粒完整种子，培养皿中浸种3-4d，待种子萌发出芽后置入培养盒，28℃下培养10-13d。使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,Beijing)提取花生叶片DNA。利用Super GelRed(S-2001)进行凝胶电泳检测(US Everbright Inc，Suzhou，China)后，使用NanodropTM2000(Thermo Scientific)分光光度计检测DNA完整性和纯度。所得栽培种4份DNA样品，野生种11份DNA样品，每份DNA样品保证单位浓度不少于50ng/μL，总质量大于2μg，放于-80℃冰箱保存备用。
2.4PCR扩增及电泳检测
用编号为20的引物扩增基因组DNA样品，反应体系总体积为25μL，含Master Mix12.5μL，DNA模板0.5μL，ddH2O 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL。反条件为95℃预变性5min，94℃变性50s，60℃退火1min，72℃延伸50s，33个循环，72℃再延伸7min，4℃保存。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳40min,经凝胶成像分析系统(上海天能)检测后，将条带清晰的进行测序。
2.5测序及数据分析
经过一代测序，经MEGAv7.0((http://www.megasoftware.net)和进行比对分析，统计每个滑动窗口的核苷酸多态性。用DNAsp软件统计序列的插入和缺失数据及π值(核酸多样性)、θ值(核酸多态性)等相关统计数据如表2所示。利用MEGA软件构建系统发育树，如图1所示，分析物种间的进化关系。
表2序列的插入和缺失数据统计
对比例
利用叶绿体全基因组序列进行系统关系构树
1、DNA的提取(同实施例)
2、建库、测序
通过建立一个平均插入片段大小350bp的双末端文库(Illumina，中国)，该文库不同物种加入不同接头。构建的文库首先使用高灵敏度检测试剂盒(Caliber，美国)在Caliper LabChip GX上评估其质量，然后在流动池上杂交和扩增，接着使用Truseq PEClusterKit v3-cBot-HS(Illumina，中国)在cBOT平台上生成克隆簇。使用Truseq v3-HS试剂盒(Illumina，中国)在Illumina Hiseq Xten平台上进行高通量测序。
3、原始数据过滤
每个样品通过Illumina测序生成大于1Gb数据量的原始reads。使用NGS QCToolKitv2.3.3分析这些原始reads，过滤掉低质量数据并且移除adaptor序列，reads长度和phred值分别设为80和30。并且，利用软件bowtie将过滤reads比对到栽培种花生参考基因组(GenBank accession No.KX257487,Prabhudas et al.2016)。接着，使用软件SPAdesv3.9.0(Bankevich et al.,2012)(不同的k-mer大小:93,105,117and 121)提取属于叶绿体基因组的高质量reads并且将其组装成contigs。这些contigs将被NOVOPlasty v2.6.2软件(Dierckxsens et al.,2016)进一步组装成完整的叶绿体基因组。
4、建树
利用MEGA软件构建系统发育树，如图2所示，分析物种间的系统进化关系。
实施例和对比例的结果分析：
如图1和2所示，突变区域构建的系统关系树与相应物种叶绿体基因组全序列构建的种间系统关系树较为一致。从而证明，简单地通过对该高突变区(psbE-petL基因间隔区)的扩增和建树，可以完成花生属种间遗传关系解析。
以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 山东省花生研究所
<120> 一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法
<130> 2018
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacccgtgca atgctgtag 19
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agaatagaag actgactcct tcatg 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<210> 6
<211> 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 7
<211> 20
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<211> 19
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<211> 20
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<211> 20
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<211> 22
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<211> 21
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<211> 22
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acgaacgaga tggatgcttg t 21
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<210> 37
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<400> 37
cggaatagca aattccaaac tg 22
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aattcgcttc cgactgtagg 20
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cgtgcgagtt tgttgaatta c 21
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tctcttagct gctttgatag gt 22
<210> 41
<211> 454
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aaaaagaggg gggcccgatt tttccgattt ttttccatag aaattcaaga attaagttaa 60
acaacaaagt tcttttttat tattataaaa aagattattt tattaatatc tttttttaat 120
tctttattta aaattattaa atatttcgaa atagaactga ataaatattc tattttagaa 180
tagaaagaag aaatagaaat attctagaaa ctagaaataa aaaaataatt tgaaattctt 240
tttggattat tttactcaac ttacgagttg ctcaaaaaat ctgttgattt tgaaccacag 300
gatggatagt tgtcataggt gatgaattga tttcttaccg atgtcactct atttttgttc 360
gtctataatg attgagaaat ccacaaatct caattgtatt tctcaaatgg tatttttttc 420
ttcttctcct attcgattgt atttccttgg aaac 454
Claims (10)
1.一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：利用花生属多个物种叶绿体基因组筛选得到一个高突变区，可通过简单扩增和测序来快速有效地解析花生属种间遗传关系。
2.根据权利要求1所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据已有数据库记录获取栽培种花生及其近缘物种叶绿体全基因组基因序列；
(2)将多个物种叶绿体全基因组基因序列进行核苷酸多态性分析，锚定叶绿体全基因组范围内的高突变区域并进行注释；
(3)对选定高突变区域进行引物设计，PCR扩增和一代测序后，构建系统发生树来快速有效地解析花生属种间遗传关系。
3.根据权利要求2所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，利用VISTA软件使用500bp大小滑动窗口的计算不同窗口的核苷酸多样性，锚定叶绿体全基因组上的高核苷酸多样性域。
4.根据权利要求2或3所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：所述高突变区域为psbE-petL基因间隔区，所述psbE-petL基因间隔区的序列如序列表41所示。
5.根据权利要求2所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，引物设计的过程中取高突变区域约总长700bp片段长度进行引物设计。
6.根据权利要求5所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：引物上游设计范围1-100bp，下游设计范围600-700bp，产物大小在500-700bp之间，退火温度58℃。
7.根据权利要求2所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，随机选取几个具有叶绿体全基因组的花生属的物种，通过DNA提取的方法将每个物种随机选取2-3粒完整种子，培养皿中浸种3-4d，待种子萌发出芽后置入培养盒，28℃下培养10-13d，使用植物基因组DNA提取试剂盒提取花生叶片DNA。
8.根据权利要求2所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR扩增的反应体系为MasterMix 12.5μL、DNA模板0.5μL、ddH2O10μL、上游引物1μL、下游引物1μL。
9.根据权利要求2所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，PCR扩增的反条件为95℃预变性5min，94℃变性50s，58℃退火1min，72℃延伸50s，33个循环，72℃再延伸7min，通过一代测序方法，获得扩增片段序列。
10.根据权利要求2所述的一种解析花生属种间遗传关系有效简易的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，利用MEGA软件对多个扩增序列片段构建系统关系树。
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