CN108763866B - 一种利用叶绿体全基因组精准鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用叶绿体全基因组序列精准鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的方法，该方法包括以下步骤：DNA提取和测序；叶绿体基因组拼接；叶绿体全基因组序列比对和构树；结果判定。本发明的方法针对利用常规方法难以鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的问题，建立了一种基于叶绿体全基因组序列的种质鉴定方法，该方法也可为确立铁皮石斛及其近缘种的系统分类地位、追溯物种起源和进化历程提供数据支持和理论依据。利用此方法可对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行高效、精准地鉴别，同时此方法具有稳定性好、通用性强、可重复性好等特点。

Description

一种利用叶绿体全基因组精准鉴别铁皮石斛及其近缘极易混 淆种的方法

技术领域

本发明属于铁皮石斛鉴定。具体涉及一种利用叶绿体全基因组序列对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行精准种质鉴定的方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)隶属于兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)，是我国特有珍稀濒危植物，主要分布于云南、贵州、广西、福建和浙江等地。铁皮石斛具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳、抗癌防老等功效，在《神农本草经》和《本草纲目》中均有记载，现已被列入中国药典。铁皮石斛由于其功效显著，价格昂贵，常常被其他价格低廉的石斛“冒充”，而这种混伪现象严重影响了该药材的有效性和安全性。目前市场上可用作混伪品的石斛种类较多且形态相似，往往难以区分；尤其是其近缘极易混淆种(黄石斛D.tosaense Makino，始兴石斛D.shixingense Z.L.Chen,S.J.Zeng etJ.Duan，曲茎石斛D.flexicaule Z.H.Tsi,S.C.Sun et L.G.Xu，滇桂石斛D.scoriarumW.W.Smith，钩状石斛D.aduncum Lindl.)，由于与铁皮石斛的亲缘关系极近，形态和遗传背景均高度相似，更是难以区别。

传统的石斛鉴别方法主要有外部形态观察和组织切片观察等，但易受个体差异和鉴别者经验等因素影响，往往准确性较差，尤其是在非花期(石斛属植物花期很短)，很难鉴定到种。近年来也使用一些分子标记或构建指纹图谱等，但此类方法操作较复杂，且易受产地、生长期等影响，稳定性较差。此外，药学工作者也尝试使用一些DNA片段序列鉴别石斛，虽然这一方法在大多数石斛中适用，但仍无法区分铁皮石斛及其近缘极易混淆种。因此，建立一种高效、精准鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的方法已是迫在眉睫。

叶绿体是植物特有的进行光合作用的细胞器，具有自身独立的基因组。叶绿体基因组具有基因组小、结构稳定、编码区较密集、基因种类和数量较稳定等特点，因此易于测序、组装和比对。近年来随着第二代测序技术的迅猛发展，测序成本不断降低，利用叶绿体全基因组进行物种鉴别已变得切实可行。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于叶绿体全基因组序列对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行种质鉴定的方法，该方法针对利用常规方法难以鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的问题，建立了一种基于叶绿体全基因组序列的种质鉴定方法，该方法也可为确立铁皮石斛及其近缘种的系统分类地位、追溯物种起源和进化历程提供数据支持和理论依据。

本发明还提供一种基于叶绿体全基因组序列对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行种质鉴定的方法的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于叶绿体全基因组序列对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行种质鉴定的方法，包括如下步骤：

(1)DNA提取和测序

分别取待检材料的叶片或茎尖及表皮，充分研磨，提取总DNA；将各个DNA样品进行高通量测序获取一定读长的片段序列(pair-end reads)；

(2)叶绿体基因组拼接

将上述片段序列进行修整(trim)后，以有参方法进行拼接，即：将修整过的片段序列匹配(map)到参考基因组上，提取合议序列(consensus)从而获得待检样品全叶绿体基因组序列；

其中，采用CLC Genomics Workbench 6.0.1(CLC Bio,Aarhus,Denmark)软件对片段序列进行修整(trim)，参数设定为：error probability<0.05。

(3)叶绿体全基因组序列比对和构树

将上述拼接获得的待检样品叶绿体基因组序列，以及标准参照序列和用作外类群的叶绿体基因组序列，进行多序列比对，然后去除空缺(gap)和比对模糊区域序列构树；

其中，使用MAFFT v7.221软件进行多序列比对，然后去除空缺(gap)和比对模糊区域，去除方法为：利用GBLOCKS v.0.91b软件，将参数“allowed gap positions”设为“none”，其余参数设为默认值，该操作可在数秒内完成，大大提高工作效率。利用上述比对和校对完成的序列构建最大似然(Maximum likelihood，ML)树，所用软件为RAxML 8.0.2，进行1000次循环；

(4)结果判定

构树完成后打开树文件，各待检样品分别与其标准参照序列各自聚为一支，且支持率大于50％，铁皮石斛及其近缘极易混淆种均得以成功鉴定。为了验证实验结果，所有待检材料的物种名在原植物开花后进行了确认。

其中，步骤(1)所述的提取总DNA的方法为通过改良CTAB法提取总DNA。

所述的用于提取DNA的改良CTAB法为：将100mg左右研磨充分的样品，迅速转入2mL离心管中，加入800uL事先预热的CTAB抽提液(100mmol/L Tris-HCl,30mL/L EDTA,1400mmol/L NaCl,2％CTAB,2％PVP,140mmol/Lβ-巯基乙醇)，65℃水浴1h，每隔10min轻轻震荡几次。加入800uL氯仿异/戊醇(24∶1)，轻摇10min，使材料和试剂充分混匀。配平后离心(4℃，10000rpm，10min)，取上清液至新管。重复氯仿/异戊醇抽提步骤两次。加入2倍体积、预冷的无水乙醇，轻轻混匀，4℃静置，离心10min(4℃)。70％乙醇洗两次，自然风干。用50–100μL灭菌超纯水溶解保存。该方法适用于从多糖等次生代谢物质含量多的石斛样品中提取高质量DNA，尤其适用于从石斛的茎(即市售鲜条)中提取DNA。

作为优选，步骤(1)所述将各个DNA样品进行测序分别获取5.0–8.0Gb数据量的片段序列(pair-end reads)。

作为优选，步骤(2)所述将修整过的片段序列匹配(map)到参考基因组上时，为确保准确性，测序深度大于100×的DNA区域提取合议(consensus)序列，极少数测序深度小于100×的区域通过PCR扩增和测序补全从而获得全叶绿体基因组序列。

步骤(2)所述拼接时所有待检样品以事先选定的铁皮石斛叶绿体基因组(GenBank登录号LC348520)为参考基因组。

其中，步骤(3)所述的用于比对和构树的序列为各样品的叶绿体全基因组序列。

进一步地，步骤(3)和(4)所述的标准参照序列为LC348520(铁皮石斛)、LC348720(黄石斛)、LC348860(始兴石斛)、LC348855(曲茎石斛)、LC348864(滇桂石斛)和LC348858(钩状石斛)，共6个，并且6个标准参照序列同时使用。

本发明所述的种质鉴定的方法，须事先确立铁皮石斛及其近缘极易混淆种(黄石斛、始兴石斛、曲茎石斛、滇桂石斛和钩状石斛)的叶绿体基因组的标准参照序列，方法是：每个种从其代表性产区采集一株性状优良的野生植株，经开花鉴定无误后，测序获得其叶绿体基因组序列。这6个标准参照序列已提交至GenBank保存，药学工作者可免费下载直接用于鉴定。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明提供的种质鉴别方法精准而可靠。叶绿体全基因组相较于单个或数个片段而言，可以提供更多的变异位点，基于此序列构树可解决铁皮石斛及其近缘极易混淆种这一复杂类群的种间关系，每个物种的所有样品分别聚为一支，且支持率高。

(2)稳定性好。本发明提供的方法是在DNA水平上进行种质鉴别，且采用大量信息位点，因此不易受石斛产地、生长期及生长环境等的影响。

(3)通用性强。相较于利用片段进行种质鉴定而言，本方法不需要进行片段筛选(不同类群往往需要筛选不同的片段)、特异性引物设计等，同时也避免了可能出现的扩增效率低、非特异性扩增等一系列问题。

(4)可建立标准化操作流程，可行性强。本方法只需要有合格的DNA样品和计算机操作平台即可开展工作，测序则由公司完成；而本方法涉及的软件等均可通过商业途径或免费获取，其操作方法单一，可建立标准化操作流程，因此具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用叶绿体全基因组序列构建的ML树，6种不同图形分布代表铁皮石斛及5个近缘极易混淆种，分支点上的数字代表支持率(％)，低于50％不标注；

图2为对比例中利用片段序列构建的ML树。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

(1)DNA提取和测序

采集不同产地的铁皮石斛及其近缘极易混淆种(见表1)，剪取新鲜叶片，或用刀片削取茎的表皮及茎尖(当材料无叶片时)，加入液氮充分研磨至粉末状，迅速转入2mL离心管中(每管约100mg)，加入800uL事先预热的CTAB抽提液(100mmol/L Tris-HCl,30mL/L EDTA,1400mmol/L NaCl,2％CTAB,2％PVP,140mmol/Lβ-巯基乙醇)，65℃水浴1h，每隔10min轻轻震荡几次。加入800uL氯仿异/戊醇(24∶1)，轻摇10min，使材料和试剂充分混匀。配平后离心(4℃，10000rpm，10min)，取上清液至新管。重复氯仿/异戊醇抽提步骤两次。加入2倍体积、预冷的无水乙醇，轻轻混匀，4℃静置，离心10min(4℃)。70％乙醇洗两次，自然风干。用50–100μL灭菌超纯水溶解保存。

经检测合格的总DNA样品分别进行高通量测序，每个样品获取数据量为5.0–8.0Gb、读长为150bp的片段序列(pair-end reads)。

(2)叶绿体基因组拼接及注释

利用CLC Genomics Workbench 6.0.1(CLC Bio,Aarhus,Denmark)软件，将上述片段序列进行修整(trim)，参数设定为：error probability<0.05；将修整过的片段序列匹配(map)到参考基因组(铁皮石斛叶绿体基因组，GenBank登录号LC348520)上，为确保准确性，测序深度大于100×的DNA区域提取合议(consensus)序列，极少数测序深度小于100×的区域可通过PCR扩增和测序补全，从而获得全叶绿体基因组序列；拼接后，叶绿体基因组的基因及tRNA注释使用DOGMA和tRNAscan-SE 1.21，并手动完成基因起始子、终止子、外显子和内含子注释。各样品的叶绿体基因组序列已上传至GenBank保存，登录号见表1。

(3)叶绿体全基因组序列比对和构树

将上述拼接获得的待检样品叶绿体基因组序列以及各物种标准参照序列(铁皮石斛LC348520，黄石斛LC348720，始兴石斛LC348860，曲茎石斛LC348855，滇桂石斛LC348864，钩状石斛LC348858)和用作外类群的叶绿体基因组序列(从GenBank下载，登录号见表1中带“*”物种)，用MAFFT v7.221软件进行比对(参数均设置为默认值)，然后在MEGA 5.2中进行必要的校对。然后，去除空缺(gap)和比对模糊区域，即利用GBLOCKS v.0.91b软件，将参数“allowed gap positions”设为“none”，其余参数设为默认值。

利用上述比对和校对完成的序列构建最大似然(Maximum likelihood,ML)树，所用软件为RAxML 8.0.2，进行1000次循环。

(5)结果判定

构树完成后以FigTree V1.4.2软件打开树文件，发现每个物种的所有样品各自独立聚为一支，且支持率均大于85％(见图1)，依据标准参照序列的指示，铁皮石斛及其近缘极易混淆种均得以成功鉴定，鉴定成功率100％。

对比例1

采用现有技术的适用于石斛属种质鉴定的片段(组合)，对实施例1中的样品进行鉴别研究。采用的片段(组合)分别有：

(a)ITS(Chattopadhyay P,Banerjee G,Banerjee N.Distinguishing orchidspecies by DNA barcoding:Increasing the resolution of population studies inplant biology.OMICS 2017；21:711–20.)；

(b)ITS2(Feng SG,Jiang Y,Wang S,Jiang MY,Chen Z,Ying QC,etal.Molecular identification of Dendrobium species(Orchidaceae)based on theDNA barcode ITS2region and its application for phylogenetic study.Int J MolSci2015；16:21975–88.)；

(c)ITS+matK(Xu SZ,Li DZ,Li JW,Xiang XG,Jin WT,Huang WC,etal.Evaluation of the DNA barcodes in Dendrobium(Orchidaceae)from mainlandAsia.PLoS ONE 2015；10:e0115168)，三种现有技术。

实验流程是：(1)DNA提取；(2)引物设计；(3)PCR扩增；(4)Sanger测序；(5)序列比对和构树；(6)结果判定。Sanger测序获得的片段序列已上传至GenBank保存，登录号见表1。构树结果如图2所示，在铁皮石斛及其近缘极易混淆种这一类群中，各个种的样本不能各自独立聚为一个分支(仅偶尔可见某个种的样本聚为一支且支持率大于50％的情况)，不同种的样本相互嵌套，以上结果表明，片段(组合)并不能将铁皮石斛及其近缘极易混淆种区分开。

表1样品编号和相关序列GenBank登录号

“a”：代表从GenBank下载的序列。

“b”：代表通过PCR扩增和Sanger测序获得的序列。

“*”：代表用作外类群的物种。

“★”：代表各物种的标准参照序列。

样品编号的前两个字母代表物种名，后两个字母代表采集地。下同。

Claims (7)

1.一种基于叶绿体全基因组序列对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行种质鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤 ：

（1）DNA提取和测序

分别取待检材料的叶片或茎尖及表皮，充分研磨，提取总DNA；将各个DNA样品分别进行高通量测序获取片段序列；步骤（1）所述的提取总DNA的方法为通过改良CTAB法提取总DNA；

（2）叶绿体基因组拼接

将上述片段序列进行修整，以有参方法进行拼接，将修整过的片段序列匹配到参考基因组上，提取合议序列从而获得待检样品全叶绿体基因组序列；

（3）叶绿体全基因组序列比对和构树

将上述拼接获得的待检样品叶绿体基因组序列以及标准参照序列和用作外类群的叶绿体基因组序列，进行多序列比对，然后去除空缺和比对模糊区域序列构树；其中使用MAFFT v7 .221软件进行多序列比对，然后去除空缺gap和比对模糊区域，去除方法为：利用GBLOCKS v .0 .91b软件，将参数allowed gap positions设为none，其余参数设为默认值，利用上述比对和校对完成的序列构建最大似然树；

（4）结果判定

构树完成后打开树文件，各待检样品分别与各自的标准参照序列聚为一支，且支持率大于85%，铁皮石斛及其近缘极易混淆种均得以成功鉴定；

步骤（1）所述改良CTAB法为：将研磨充分的样品，迅速转入离心管中，加入事先预热的CTAB抽提液：100 mmol/L Tris-HCl, 30mL/L EDTA, 1400 mmol/L NaCl, 2 % CTAB, 2 %PVP, 140 mmol/L β-巯基乙醇，65℃水浴1 h，每隔10 min轻轻震荡几次，加入氯仿异/戊醇，轻摇，使材料和试剂充分混匀；配平后离心，取上清液至新管，重复氯仿/异戊醇抽提步骤两次；加入2倍体积、预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置离心；70 %乙醇洗，自然风干；灭菌超纯水溶解保存；

步骤（3）和（4）所述标准参照序列包括铁皮石斛、黄石斛、始兴石斛、曲茎石斛、滇桂石斛和钩状石斛的叶绿体基因组。

2.根据权利要求1所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（1）所述将各个DNA样品分别进行测序获取5.0–8.0 Gb 数据量的片段序列。

3.根据权利要求1所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（2）所述将修整过的片段序列匹配到参考基因组上时，测序深度大于100×的DNA区域提取合议序列，测序深度小于100×的区域通过PCR扩增和测序补全。

4.根据权利要求1所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（2）所述拼接时所有待检样品以铁皮石斛叶绿体基因组，GenBank登录号LC348520， 为参考基因组。

5.根据权利要求1所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（3）所述的用于比对和构树的序列为各样品的叶绿体全基因组序列。

6.根据权利要求1所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（3）和（4）所述的标准参照序列为LC348520铁皮石斛、LC348720黄石斛、LC348860始兴石斛、LC348855曲茎石斛、LC348864滇桂石斛和LC348858钩状石斛，共6个。

7.根据权利要求1-6任一所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（3）和（4）所述基因组通过每个种从其代表性产区采集一株性状优良的野生植株，经开花鉴定无误后，测序获得其叶绿体基因组序列。

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