CN107630104A - 一种用于鉴定霍山石斛或铁皮石斛的系统发育树及鉴定方法 - Google Patents
一种用于鉴定霍山石斛或铁皮石斛的系统发育树及鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定霍山石斛或铁皮石斛的系统发育树及鉴定方法，属于霍山石斛或铁皮石斛鉴定技术领域。所述系统发育树包括用霍山石斛、铁皮石斛及部分相近物种的一段特定DNA序列作为内群，用菱唇石斛的2条特定DNA序列作为外群。所述霍山石斛的特定DNA序列通过测序获得，霍山石斛的部分相近物种和菱唇石斛的特定DNA序列来自于GenBank。分别用贝叶斯法和简约法进行系统发育分析，构建BI系统树和MP系统树。本发明通过构建霍山石斛、铁皮石斛及部分相似种的系统发育树，通过对霍山石斛与铁皮石斛之间的特定DNA序列进行对位排序和比较，能够快速、准确鉴别霍山石斛与铁皮石斛，为霍山石斛鉴别提供了新方法。
Description
技术领域
本发明涉及霍山石斛或铁皮石斛鉴定技术领域，尤其涉及一种用于鉴定霍山石斛或铁皮石斛的系统发育树及鉴定方法。
背景技术
霍山石斛(Dendrobium huoshanense)是安徽省大别山地区特有的植物，且为国家重点保护的名贵中草药，隶属于兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)。铁皮石斛(Dendrobium catenatum)为霍山石斛的同属近缘种，两者形态特征比较相近，制成枫斗后两者不易通过外形进行鉴别，导致在市场上铁皮石斛成为霍山石斛的混淆品之一。由于霍山石斛与铁皮石斛通过外形鉴别比较困难，采用传统的鉴定方法有一定的局限。因此，亟需寻找一种快速、准确的鉴定方法，以确保霍山石斛药材鉴定的准确性。如果能够找到一种对比验证方法，每次在验证物种时，只要按着实验方法做一些实验进行验证就能达到鉴别种群是十分有意义的。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛的系统发育树，具体如下
一种用于鉴定霍山石斛的系统发育树，所述系统发育树的外群为菱唇石斛的2条特定DNA序列，其中，所述菱唇石斛的2条特定DNA序列的GenBank登录号分别为AF521612和EU840697，所述系统发育树的内群至少包括待鉴定石斛和霍山石斛。所述特定DNA序列是“18S基因和16S基因之间的一段非编码DNA序列，长度在600bp到700bp之间。
一种用于鉴定铁皮石斛的系统发育树，所述系统发育树的外群为菱唇石斛的2条特定DNA序列，其中，所述菱唇石斛的2条特定DNA序列的GenBank登录号分别为AF521612和EU840697，所述系统发育树的内群至少包括待鉴定石斛和铁皮石斛。
分别用贝叶斯法和简约法进行系统发育分析，构建BI系统树和MP系统树，其中BI系统树用MrBayes version 3.1.2软件构建，MP系统树用PAUP*version 4.0beta 10软件构建。
本发明还提供一种通过系统发育树鉴定霍山石斛或铁皮石斛的方法，所述鉴定方法包括如下步骤：
①从待测样品中提取基因组DNA并测定其特定DNA序列；
②用菱唇石斛的2条特定DNA序列作为外群，用待测样品和至少一个霍山石斛或铁皮石斛的特定DNA序列作为内群，分别用贝叶斯法和简约法进行系统发育分析，构建BI系统树和MP系统树。
③判断分析：若待测样品和已知霍山石斛或铁皮石斛聚类为一个单系，则该待测样品为此类别的霍山石斛或铁皮石斛。
优选的，所述BI系统树和MP系统树的主干一致，所述BI系统树和MP系统树谱系分支的节点处标有BI树的后验概率值和MP树的自举支持度。
优选的，霍山石斛的后验概率值＝1.00、自举支持度＝96，铁皮石斛的后验概率值＝1.00、自举支持度＝100。
优选的，所述系统发育树构建BI系统树和MP系统树用于鉴定霍山石斛或铁皮石斛。
优选的，所述特定DNA序列是“18S基因和16S基因之间的一段非编码DNA序列，长度在600bp到700bp之间。
有益效果
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
1、本发明中，通过构建霍山石斛、铁皮石斛及部分相似种的系统发育树，通过对霍山石斛与铁皮石斛之间的特定DNA序列进行对位排序和比较，能够快速、准确鉴别霍山石斛与铁皮石斛，为霍山石斛鉴别提供了新方法。
2、与传统形态鉴定方法相比，该方法不需要形态分类学基础且实现了快速鉴定霍山石斛与铁皮石斛，且通过系统发育树的进行对位排序和比较，能够找到霍山石斛与其他相似种的进化关系，也解决了从形态学鉴定难的问题。
3、技术通用性强，对仪器设备要求不高，在实际工作中容易推广应用，且操作过程简单、耗时较短、灵敏度高且较稳定。
附图说明
图1为霍山石斛、铁皮石斛及其相似种的系统发育树；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例
一、用于鉴定霍山石斛的系统树的构建方法
从GenBank查找或通过本研究进行测序获得霍山石斛及部分相近物种的特定DNA序列，详见下表1。其中，本研究测序所得单倍型序列，包括Hap5，Hap6和Hap7分别对应于序列表中序列1，序列2和序列3。
表1霍山石斛、铁皮石斛及部分相似种的特定DNA序列
分别用贝叶斯法(Bayesian inference,BI)和简约法(maximum parsimony,MP)进行系统发育分析，构建BI和MP两种系统树。构建系统树时，用菱唇石斛Dendrobiumleptocladum的2条特定DNA序列作为外群，其中GenBank登录号分别为AF521612和EU840697，其中BI树用MrBayes version 3.1.2软件构建，MP树用PAUP*version 4.0beta10软件构建。构建BI树时，用MrModeltest version 2.3软件根据AIC(Akaike InformationCriterion)检验标准选择数据的最适模型，所选最适模型是(SYM+G)。马尔科夫链的蒙特卡洛方法(Markov Chains Monte Carlo,MCMC)设置为四条链并运行500000代。为了确定其收敛情况，MCMC分别运行两次。每100代抽取一个样本，共形成10002个样本。经过分析得知，整个运行在20000代后达到平稳，这样，总共剩余的样本数为9602，用剩余样本重建系统树并估计其后验概率值。构建MP树时，设置自举重复次数bootstrap nreps为1000次，使用启发式搜索分析自举重复数据集，启发式搜索设置为由随机逐步添加法产生起始树，重复10次，采用TBR分支交换。通过BI法和MP法构建的系统发育树表明，2种方法构建的系统树主干一致(图1)。图1中各谱系分支的节点处标有BI树的后验概率(posterior probability，PP)值和MP树的自举支持度(Bootstrap,BS)。结果表明，霍山石斛所有序列的单倍型形成单系(PP＝1.00,BS＝96)。
用菱唇石斛的2条特定DNA序列作为外群，用霍山石斛及混淆品的特定DNA序列作为内群，分别用贝叶斯法和简约法进行系统发育分析，构建BI系统树和MP系统树应用于鉴定霍山石斛与铁皮石斛技术领域。
二、鉴定待测样品中是否含有霍山石斛的方法
采用构建系统树包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有霍山石斛：
待测样品：霍山石斛(采自于安徽霍山)符合中国植物志和相关文献的鉴别特征描述。通过鉴定，各样品的实物与名称相符，质量符合标准。
1、从待测样品中提取基因组DNA并测定其特定DNA序列，其中，所述特定DNA序列是“18S基因和16S基因之间的一段非编码DNA序列，长度在630bp，bp是碱基对(Base Pair)的简称。。
2、用菱唇石斛的2条特定DNA序列作为外群，用待测样品、霍山石斛正品、铁皮石斛、金钗石斛和河南石斛的特定DNA序列作为内群，分别用贝叶斯法和简约法进行系统发育分析，构建BI系统树和MP系统树。通过分析，如果待测样品和霍山石斛正品聚类为一个单系，则该待测样品为霍山石斛；如果待测样品和铁皮石斛聚类为一个单系，则该待测样品为铁皮石斛。通过以上方法可以鉴定样品是否为霍山石斛。
三、鉴定待测样品中是否含有铁皮石斛的方法
采用构建系统树包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有铁皮石斛：
待测样品：铁皮石斛(采自于安徽霍山)符合中国植物志和相关文献的鉴别特征描述。通过鉴定，各样品的实物与名称相符，质量符合标准。
1、从待测样品中提取基因组DNA并测定其特定DNA序列，其中，所述特定DNA序列是“18S基因和16S基因之间的一段非编码DNA序列，长度在626bp，bp是碱基对(Base Pair)的简称。
2、用菱唇石斛的2条特定DNA序列作为外群，用待测样品、霍山石斛、铁皮石斛、金钗石斛和河南石斛的特定DNA序列作为内群，分别用贝叶斯法和简约法进行系统发育分析，构建BI系统树和MP系统树。通过分析，如果待测样品和铁皮石斛正品聚类为一个单系，则该待测样品为铁皮石斛；如果待测样品和霍山石斛聚类为一个单系，则该待测样品为霍山石斛。通过以上方法可以鉴定样品是铁皮石斛还是霍山石斛。
四、鉴定待测样品中是否含有霍山石斛的方法
采用构建系统树包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有霍山石斛：
待测样品：霍山石斛符合中国植物志和相关文献的鉴别特征描述。通过鉴定，各样品的实物与名称相符，质量符合标准。
1、从待测样品中提取基因组DNA并测定其特定DNA序列，其中，所述特定DNA序列是“18S基因和16S基因之间的一段非编码DNA序列，长度635bp，bp是指组成DNA的序列的基本单位碱基对。
2、用菱唇石斛的2条特定DNA序列作为外群，用待测样品、霍山石斛的特定DNA序列作为内群，分别用贝叶斯法和简约法进行系统发育分析，构建BI系统树和MP系统树。通过分析，如果待测样品和霍山石斛聚类为一个单系，则该待测样品为霍山石斛。
五、鉴定待测样品中是否含有铁皮石斛的方法
采用构建系统树包括如下步骤的方法鉴定待测样品中是否含有铁皮石斛：
待测样品：铁皮石斛符合中国植物志和相关文献的鉴别特征描述。通过鉴定，各样品的实物与名称相符，质量符合标准。
1、从待测样品中提取基因组DNA并测定其特定DNA序列，其中，所述特定DNA序列是“18S基因和16S基因之间的一段非编码DNA序列，长度在637bp，bp是碱基对(Base Pair)的简称。
2、用菱唇石斛的2条特定DNA序列作为外群，用待测样品、铁皮石斛的特定DNA序列作为内群，分别用贝叶斯法和简约法进行系统发育分析，构建BI系统树和MP系统树。通过分析，如果待测样品和铁皮石斛聚类为一个单系，则该待测样品为铁皮石斛。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 皖西学院
<120> 一种用于鉴定霍山石斛或铁皮石斛的系统发育树及鉴定方法
<141> 2017-11-13
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 629
<212> DNA
<213> 河南石斛(Dendrobium henanense)
<400> 1
aaacacaacg agcgattttg tgaacctgta aaaataagcg gtggctcttg ctgctgcgat 60
aaaatccacc cgagtcatcg cctcatcccc tctttggggt ggggacgtga tgaaggatgg 120
atgaaccctc aaatcggcgc agcgtagcgc caagggaatc ttgaaacaca agcctataaa 180
tgggttttgt gggatggggt gttgtcgcac gccatattga ttgacacgac tctcggcaat 240
ggatatctcg gctctcgcat cgatgaagag cgcagcgaaa tgcgatatgt ggtgcgaatt 300
gcagaatccc gcgaaccatc gagtctttga acgcaagttg cgcctgaggc caactggctg 360
agggcacgtc cgcctgggcg tcaagcattt tatcactctg tgcctagtct cccatccatg 420
gatgtgttgc caaggctcgg atgtgcacgg tggctcgtcg tgccccttgg tgcggcgggc 480
tgaagggctg gtcatcttct cgttggctgc caacaataag gggtggatta aataaggcct 540
atgctattgt gtcaagcgcg cctgagagat ggtcatactt ttctatgtga tcccaattca 600
tgcgttgatc catggatggc gtatcgaat 629
<210> 2
<211> 629
<212> DNA
<213> 河南石斛(Dendrobium henanense)
<400> 2
aaacacaacg agcgattttg tgaacctgta aaaataagcg gtggctcttg ctgctgcgat 60
aaaatccacc cgagtcatcg cctcatcccc tctttggggt ggggacgtga tgaaggatgg 120
atgaaccctc aaatcggcgc agcgtagcgc caagggaatc ttgaaacaca agcctataaa 180
tgggttttgt gggatggggt gttgtcgcac gccatattga ttgacacgac tctcggcaat 240
ggatatctcg gctctcgcat cgatgaagag cgcagcgaaa tgcgatatgt ggtgcgaatt 300
gcagaatccc gcgaaccatc gagtctttga acgcaagttg cgcctgaggc caactggctg 360
agggcacgtc cgcctgggcg tcaagcattt tatcactctg tgcctagtct cccatccatg 420
gatgtgttgc caaggctcgg atgtgcacgg tggctcgtcg tgccccttgg tgcggcgggc 480
tgaagggcgg gtcatcttct cgttggctgc caacaataag gggtggatta aataaggcct 540
atgctattgt gtcaagcgcg cctgagagat ggtcatactt ttctatgtga tcccaattca 600
tgcgttgatc catggatggc gtatcgaat 629
<210> 3
<211> 628
<212> DNA
<213> 霍山石斛(Dendrobium huoshanense)
<400> 3
aaacacaacg agcgattttg tgaacctgta aaaataagcg gtggctcttg ctgctgcgat 60
aaaatccacc cgagtcatcg cctcatcccc tctttggggt ggggacgtga tgaaggatgg 120
atgaaccctc aaatcggcgc agcgttgcgc caagggaatc ttgaagcaca agcccataaa 180
tgggtttcgt gggatggggt gctgtcgcac gccatattga ttgacacgac tctcggcaat 240
ggatatctcg gctctcgcat cgatgaagag cgcagcgaaa tgcgatatgt ggtgcgaatt 300
gcagaatccc gcgaaccatc gagtctttga acgcaagttg cgcctgaggc caaccggctg 360
agggcacgtc cgcctgggcg tcaagcattt tatcactccg tgcctactct cccatccatg 420
gatgtgttgc taaggctcgg atgtgcacgg tggctcgtcg tgccccttgg tgcggcgggc 480
tgaagggcgg gtcatcttct cgttggctgc caacaataag gggtggatta aataaggcct 540
atgctattgt gtcaagcgcg cccgagagat ggtcatactt tttaggtgat cccaattcat 600
gcgttgatcc atggatggcg tatcgaat 628
Claims (7)
1.一种用于鉴定霍山石斛的系统发育树，其特征在于：所述系统发育树的外群为菱唇石斛的2条特定DNA序列，其中，所述菱唇石斛的2条特定DNA序列的GenBank登录号分别为AF521612和EU840697，所述系统发育树的内群至少包括待鉴定石斛和霍山石斛，所述特定DNA序列是“18S基因和16S基因之间的一段非编码DNA序列，长度在600bp到700bp之间。
2.根据权利要求1所述的用于鉴定霍山石斛的系统发育树，其特征在于：所述霍山石斛或为铁皮石斛。
3.一种通过系统发育树鉴定霍山石斛或铁皮石斛的方法，其特征在于：所述鉴定方法包括如下步骤：
①从待测样品中提取基因组DNA并测定其特定DNA序列；
②用菱唇石斛的2条特定DNA序列作为外群，用待测样品和至少包括霍山石斛或铁皮石斛中的一种的特定DNA序列作为内群，分别用贝叶斯法和简约法进行系统发育分析，构建BI系统树和MP系统树；
③判断分析：若待测样品和霍山石斛或铁皮石斛聚类为一个单系，则该待测样品为此类别的霍山石斛或铁皮石斛。
4.根据权利要求3所述的通过系统发育树鉴定霍山石斛或铁皮石斛的方法，其特征在于，所述BI系统树和MP系统树的主干一致，所述BI系统树和MP系统树谱系分支的节点处标有BI树的后验概率值和MP树的自举支持度。
5.根据权利要求1所述的通过系统发育树鉴定霍山石斛或铁皮石斛的方法，其特征在于：所述霍山石斛的后验概率值= 1.00、自举支持度 = 96；所述铁皮石斛的后验概率值=1.00、自举支持度 = 100。
6.根据权利要求1所述的通过系统发育树鉴定霍山石斛或铁皮石斛的方法，其特征在于：所述特定DNA序列是“18S基因和16S基因之间的一段非编码DNA序列，长度在600bp到700bp之间。
7.一种权利要求1所述的系统发育树应用，其特征在于：所述系统发育树构建BI系统树和MP系统树用于鉴定霍山石斛或铁皮石斛。
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2017
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