JP7007132B2 - アミロイド凝集体の検出方法、アミロイド凝集体検出装置、及びアミロイド凝集体検出プログラム - Google Patents
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Description
本実施形態に係るアミロイド凝集体の検出方法は、チオフラビンTと接触させた被験試料の時間分解蛍光を測定するステップ(以下、「測定ステップ」ともいう。)と、測定された時間分解蛍光からチオフラビンTエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光を検出するステップ(以下、「検出ステップ」ともいう。)と、を含む。本実施形態に係る検出方法は、測定ステップの前に、被験試料とチオフラビンTとを接触させるステップ(以下、「接触ステップ」ともいう。)を更に含んでいてもよい。
接触ステップでは、被験試料とチオフラビンTとを接触させる。接触させる方法には特に制限はなく、例えば、アミロイド凝集体をThTで蛍光染色する際に用いられる方法に準じて実施することができる。
測定ステップでは、チオフラビンTと接触させた被験試料の時間分解蛍光を測定する。
検出ステップでは、測定された時間分解蛍光からチオフラビンTエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光(エキシマー蛍光)を検出する。
アミロイド凝集体検出装置の構成について説明する。
図1は、一実施形態に係るアミロイド凝集体検出装置Dのハードウェア的構成を示す概要図である。図1に示すように、アミロイド凝集体検出装置Dは、物理的には、CPU D11、ROM D12及びRAM D13等の主記憶装置、キーボード及びマウス等の入力デバイスD14、ディスプレイ等の出力デバイスD15、蛍光測定装置等の他の装置との間でデータの送受信を行うためのネットワークカード等の通信モジュールD16、ハードディスク等の補助記憶装置D17等を含む、通常のコンピュータとして構成される。後述するアミロイド凝集体検出装置Dの各機能は、CPU D11、ROM D12、RAM D13等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、CPU D11の制御の下で入力デバイスD14、出力デバイスD15、通信モジュールD16を動作させるとともに、主記憶装置D12及びD13、並びに補助記憶装置D17におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。
アミロイド凝集体検出プログラムは、コンピュータを、上述した取得手段D1、検出手段D2、判定手段D3、及び表示手段D4として機能させるものである。コンピュータにアミロイド凝集体検出プログラムを読み込ませることにより、コンピュータはアミロイド凝集体検出装置Dとして動作する。アミロイド凝集体検出プログラムは、例えば、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されて提供される。記録媒体は、非一時的記録媒体であってもよい。記録媒体としては、フレキシブルディスク、CD、DVD等の記録媒体、ROM等の記録媒体、半導体メモリ等が例示される。
アミロイド凝集体検出装置Dにより行われるアミロイド凝集体検出方法について説明する。図3は、アミロイド凝集体検出方法のフローチャートである。アミロイド凝集体検出装置Dにより行われるアミロイド凝集体検出方法により、被験試料がアミロイド凝集体を含むか否かを自動的に精度高く検出することができる。
最初に、取得手段D1が、蛍光寿命測定装置等から時間分解蛍光測定データを取得する。
次に、検出手段D2が、取得した時間分解蛍光測定データからチオフラビンTエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光が存在するか否かを検出する。当該結合体に由来する蛍光は、上述した波長領域に出現する蛍光である。
次に、判定手段D3が、検出ステップS2にて検出した結果に基づき、被験試料にアミロイド凝集体が存在するか否かを判定する。例えば、結合体に由来する蛍光が検出された場合は、被験試料にアミロイド凝集体が存在すると判定する。
次に、表示手段D4が、判定ステップS3にて判定した結果を表示する。例えば、被験試料にアミロイド凝集体が存在するか否かが表示手段D4によって表示される。
(Aβ線維を含む試料の調製)
非特許文献(J.Biol.Chem.,2003年,278巻(13号),pp.11612-11622)に記載された方法に基づき、下記手順でAβ線維を含む試料を調製した。まず、Aβ1-42(商品名:Amyloid β-prоtein Human,1-42、株式会社ペプチド研究所製)をジメチルスルホキシドに5mmol/Lとなるように溶解し、さらに10mmol/L HCl水溶液を用いて、Aβ1-42の濃度が100μmol/Lとなるように希釈した。得られたAβの調製液は、インキュベータを用いて37℃で24時間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Aβ線維(Aβ凝集体)を含む試料を調製した。
ThT(ウルトラピュアグレード,AAT Bioquest Inc.社製)を蒸留水に溶解し、100μmol/LのThT水溶液を得た。
Aβ線維を含む試料を10μL分取したものを6試料分用意し、これらに対して、100μmol/LのThT水溶液及び蒸留水を、それぞれ2.5μL及び77.5μL、5μL及び75μL、10μL及び70μL、20μL及び60μL、40μL及び40μL、又は80μL及び0μL添加した。さらに、50mmol/Lグリシン-水酸化ナトリウム溶液(pH9.0)410μLをそれぞれに添加した後、混合してThT染色試料とした。各ThT染色試料中のAβ線維の濃度は2μmol/L(6試料共通)であり、ThTの濃度は、それぞれ0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L及び16μmol/Lである。なお、モル濃度比([ThT]/[Aβ])は、それぞれ0.25、0.5、1、2、4及び8である。
Aβ線維を含む試料を10μLに蒸留水を80μL添加した。さらに、50mmol/Lグリシン-水酸化ナトリウム溶液(pH9.0)410μLを添加した後、混合して、ThTを含まないネガティブコントロール試料とした。
各ThT染色試料及びネガティブコントロール試料を、内径3mmの石英セルに分注し、小型蛍光寿命測定装置(Quantaurus-Tau型、浜松ホトニクス製)を用い、時間相関単光子係数法を用いて、励起波長405nmにおける蛍光減衰曲線I(t)を測定波長500nmで測定した。図4に蛍光減衰曲線を示す。図4に示す蛍光減衰曲線は、励起した時点から起算した時間に対する蛍光強度をプロットしたものである。また、図4中、「IRF」は、装置応答関数を示す。
得られた各蛍光減衰曲線I(t)は、以下に示す手順で、固有の蛍光寿命と重み因子を有する複数の成分に分離した。まず、数式1で示される関数G(t)を、数式2にしたがってコンボリューション積分し、曲線F(t)を得た。数式2において、E(t)は蛍光寿命測定装置の装置応答関数(IRF)、Cはバックグラウンドで、ネガティブコントロールの平均値から算出される定数である。
(Aβ線維を含む試料の調製)
参考例と同様の手順により、Aβ線維(Aβ凝集体)を含む試料を調製した。
ThT(ウルトラピュアグレード,AAT Bioquest Inc.社製)を蒸留水に溶解し、400μmol/LのThT水溶液を得た。
Aβ線維を含む試料を8μL分取したものを5試料分用意し、これらに対して、400μmol/LのThT水溶液及び蒸留水を、それぞれ5μL及び75μL、10μL及び70μL、20μL及び60μL、40μL及び40μL、又は80μL及び0μL添加した。さらに、50mmol/Lグリシン-水酸化ナトリウム溶液(pH9.0)912μLをそれぞれに添加した後、混合してThT染色試料とした。各ThT染色試料中のAβ線維の濃度は0.8μmol/L(5試料共通)であり、ThTの濃度は、それぞれ2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、及び32μmol/Lである。なお、モル濃度比([ThT]/[Aβ])は、それぞれ2.5、5、10、20及び40である。
Aβ線維を含む試料に代えて、ジメチルスルホキシドを10mmol/L HCl水溶液で2%(v/v)となるように希釈した溶液を用いたこと以外は、上記(Aβ線維を含む試料のThT染色)と同様の手順により、各ThT染色試料に対応するネガティブコントロール試料を調製した。
各ThT染色試料及びネガティブコントロール試料を、内径3mmの石英セルに分注し、小型蛍光寿命測定装置(Quantaurus-Tau型、浜松ホトニクス製)を用い、時間相関単光子係数法を用いて、励起波長405nmにおける蛍光減衰曲線を、420nmから620nmまで5nmおきに測定した。測定された蛍光減衰曲線のピーク値の5%の立ち上がり部分を時刻0とし、時間10ns~18nsの蛍光減衰曲線の測定値をそれぞれ積算し、積算値を波長別にプロットすることで時間10ns~18nsにおける時間分解蛍光スペクトルを得た。
図6(A)~(D)は、各ThT染色試料及びネガティブコントロール試料の時間10ns~18nsにおける時間分解蛍光スペクトル及びその規格化スペクトルである。図6(A)は、各ThT染色試料の時間10ns~18nsにおける時間分解蛍光スペクトルである。当該時間分解蛍光スペクトルは、試料とは無関係の発光成分を除去するため、対応するネガティブコントロール試料の測定値をバックグラウンド蛍光として差し引いている。図6(B)は、図6(A)に示した時間分解蛍光スペクトルの規格化スペクトルである。規格化スペクトルは、時間分解蛍光スペクトルにおける最大の蛍光強度で各波長の蛍光強度を除したものである。また、図6(C)及び(D)は、それぞれネガティブコントロール試料の時間10ns~18nsにおける時間分解蛍光スペクトル及びその規格化スペクトルである。なお、図6(C)及び(D)中の「モル濃度比」は、当該「モル濃度比」のThT染色試料に対応するネガティブコントロール試料であることを意味する。
Claims (4)
- チオフラビンTと接触させた被験試料の時間分解蛍光を測定するステップと、
測定された時間分解蛍光からチオフラビンTエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光を検出するステップと、を含み、
前記結合体に由来する蛍光は、波長405nmの光で励起したとき、これに応じた蛍光として波長570nmで検出可能な蛍光である、アミロイド凝集体の検出方法。 - チオフラビンTと接触させた被験試料の時間分解蛍光データを取得する取得手段と、
取得した時間分解蛍光データからチオフラビンTエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光が存在するか否かを検出する検出手段と、
検出結果に基づき、前記被験試料にアミロイド凝集体が存在するか否かを判定する判定手段と、を備え、
前記結合体に由来する蛍光は、波長405nmの光で励起したとき、これに応じた蛍光として波長570nmで検出可能な蛍光である、アミロイド凝集体検出装置。 - コンピュータを、
チオフラビンTと接触させた被験試料の時間分解蛍光データを取得する取得手段、
取得した時間分解蛍光データからチオフラビンTエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光を検出する検出手段、及び
検出結果に基づき、前記被験試料にアミロイド凝集体が存在するか否かを判定する判定手段、
として機能させるためのアミロイド凝集体検出プログラムであって、
前記結合体に由来する蛍光は、波長405nmの光で励起したとき、これに応じた蛍光として波長570nmで検出可能な蛍光である、アミロイド凝集体検出プログラム。 - 請求項3に記載のアミロイド凝集体検出プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
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