JP2019032275A - アミロイド凝集体の検出方法、アミロイド凝集体検出装置、及びアミロイド凝集体検出プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】アミロイド凝集体を簡便かつ精度よく検出できるアミロイド凝集体の検出方法を提供すること。【解決手段】チオフラビンＴと接触させた被験試料の時間分解蛍光を測定するステップと、測定された時間分解蛍光からチオフラビンＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光を検出するステップと、を含む、アミロイド凝集体の検出方法。【選択図】図３

Description

本発明は、アミロイド凝集体の検出方法、アミロイド凝集体検出装置、及びアミロイド凝集体検出プログラムに関する。

社会的問題となっている認知症の半数以上がアルツハイマー型認知症（以下、「ＡＤ」と略すこともある。）と言われている。ＡＤ患者の脳内には、アミロイドβ（以下、「Ａβ」と略すこともある。）の凝集体が蓄積した老人斑が認められることがある。Ａβは様々な凝集体を形成して神経細胞に悪影響を与えるため、診断及び治療の研究では、Ａβの凝集メカニズム、Ａβ凝集体の構造及び機能を解析することが重要である。そのため、Ａβの凝集を確認する手法が必要となる。

Ａβの凝集を確認するために、原子間力顕微鏡による観察、チオフラビンＴ（以下、「ＴｈＴ」と略すこともある。）等の蛍光色素を用いた蛍光測定が行われている。ＴｈＴは、波長４００〜４４０ｎｍの光を照射すると、波長４８０ｎｍ付近をピークとする微弱な蛍光（自家蛍光）を放出する。また、Ａβ凝集体に結合したＴｈＴは、同波長の強い蛍光を放出する。この現象に基づいて、蛍光分光光度計による蛍光強度測定法が、Ａβの凝集進行のモニタリング、Ａβ凝集体の検出に利用されている（例えば、非特許文献１）。

エキシマー蛍光は、エキシマー（励起二量体）と呼ばれる励起状態で結合した２分子の蛍光色素による蛍光現象である。ＴｈＴエキシマーは、高濃度ＴｈＴ水溶液中で検出されることが報告されている（非特許文献２）。一方、Ａβ凝集体中でのＴｈＴエキシマー形成については、形成を示唆するシミュレーション結果は存在するものの（非特許文献３）、形成を決定付ける報告は存在しない。

Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，大学出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ），１９９９年，第３０９巻，ｐｐ．２７４−２８７、３０４−３０５ Ａｎｎａ Ｉ． Ｓｕｌａｔｓｋａｙａら，Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｓ ａｓ ｅｘｃｉｍｅｒ ｉｎ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ａｑｕｅｏｕｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｓ ｍｏｎｏｍｅｒ ｂｅｉｎｇ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ ｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｒｉｌｓ．，Ｎａｔｕｒｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｒｅｐｏｒｔｓ．７，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ２１４６，２０１７年 Ｒａｉｍｏｎ Ｓａｂａｔｅら，Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ−Ｔ ｅｘｃｉｍｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｕｐｏｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｍｙｌｏｉｄ ｆｉｂｅｒｓ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，２０１３年，４９巻，ｐｐ．５７４５−５７４７

従来行われているＴｈＴを用いた蛍光強度測定は、操作が簡便である一方、測定の対象とすべきでないＴｈＴの自家蛍光（未結合ＴｈＴ蛍光）及び不純物由来の蛍光も積算してしまうため、正確な値を測定できないという問題を有する。

本発明は、アミロイド凝集体を簡便かつ精度よく検出できるアミロイド凝集体の検出方法を提供することを目的とする。本発明はまた、アミロイド凝集体の検出方法に用いられるアミロイド凝集体検出装置及びアミロイド凝集体検出プログラムを提供することも目的とする。

本発明者らは、実施例において説明するとおり、アミロイド凝集体の一種であるＡβ線維とＴｈＴエキシマーが結合体を形成すること、及び当該結合体が、従来の蛍光波長（４８０ｎｍ）よりも長波長（５７０ｎｍ）にピークを有する蛍光を発することを見出した。本発明はこの新規な知見に基づくものである。

本発明は、チオフラビンＴと接触させた被験試料の時間分解蛍光を測定するステップと、測定された時間分解蛍光からチオフラビンＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光を検出するステップと、を含む、アミロイド凝集体の検出方法に関する。

本発明の検出方法は、ＴｈＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光（以下、「エキシマー蛍光」と略すこともある。）を検出するものである。エキシマー蛍光は、ＴｈＴの自家蛍光（未結合ＴｈＴ蛍光）と蛍光波長が大きく異なるため、自家蛍光との識別が可能になる。これにより、アミロイド凝集体を簡便かつ精度よく検出できる。また、生体試料を測定する場合、生体由来の自家蛍光は、エキシマー蛍光の検出に利用可能な波長５００ｎｍ以上の長波長領域では小さくなることから、より一層検出の精度を向上させることができる。

本発明はまた、チオフラビンＴと接触させた被験試料の時間分解蛍光データを取得する取得手段と、取得した時間分解蛍光データからチオフラビンＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光が存在するか否かを検出する検出手段と、検出結果に基づき、被験試料にアミロイド凝集体が存在するか否かを判定する判定手段と、を備える、アミロイド凝集体検出装置にも関する。

本発明は更に、コンピュータを、チオフラビンＴと接触させた被験試料の時間分解蛍光データを取得する取得手段、取得した時間分解蛍光データからチオフラビンＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光を検出する検出手段、及び検出結果に基づき、被験試料にアミロイド凝集体が存在するか否かを判定する判定手段、として機能させるためのアミロイド凝集体検出プログラム、並びに当該アミロイド凝集体検出プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体にも関する。

本発明によれば、簡便かつ精度よくアミロイド凝集体を検出できる。

アミロイド凝集体検出装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図である。 アミロイド凝集体検出装置Ｄの機能的構成を示す概要図である。 アミロイド凝集体検出方法のフローチャートである。 Ａβ線維をＴｈＴ染色した試料の蛍光減衰曲線である。 Ａβ線維をＴｈＴ染色した試料の蛍光減衰曲線から分離可能な３つの指数関数成分（成分Ａ１、成分Ａ２及び成分Ａ３）の蛍光強度を、それぞれＡβ線維とＴｈＴのモル濃度比（［ＴｈＴ］／［Ａβ］）に対してプロットしたグラフである。 Ａβ線維のＴｈＴ染色試料及びネガティブコントロール試料の時間１０ｎｓ〜１８ｎｓにおける時間分解蛍光スペクトル及びその規格化スペクトルである。（Ａ）ＴｈＴ染色試料の時間分解蛍光スペクトルである。（Ｂ）（Ａ）の規格化スペクトルである。（Ｃ）ネガティブコントロール試料の時間分解蛍光スペクトルである。（Ｄ）（Ｃ）の規格化スペクトルである。

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

〔アミロイド凝集体の検出方法〕
本実施形態に係るアミロイド凝集体の検出方法は、チオフラビンＴと接触させた被験試料の時間分解蛍光を測定するステップ（以下、「測定ステップ」ともいう。）と、測定された時間分解蛍光からチオフラビンＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光を検出するステップ（以下、「検出ステップ」ともいう。）と、を含む。本実施形態に係る検出方法は、測定ステップの前に、被験試料とチオフラビンＴとを接触させるステップ（以下、「接触ステップ」ともいう。）を更に含んでいてもよい。

（接触ステップ）
接触ステップでは、被験試料とチオフラビンＴとを接触させる。接触させる方法には特に制限はなく、例えば、アミロイド凝集体をＴｈＴで蛍光染色する際に用いられる方法に準じて実施することができる。

ＴｈＴエキシマーを効率よく形成させる観点から、被験試料とチオフラビンＴとを接触させた後の被験試料中のチオフラビンＴの濃度が、所定量以上あることが好ましい。例えば、被験試料が液体である場合、チオフラビンＴの濃度が４μｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、５μｍｏｌ／Ｌ以上であることがより好ましい。上限は特に制限はないが、例えば、１０μｍｏｌ／Ｌ以下であってよい。被験試料が固体である場合、チオフラビンＴの濃度が１μｇ／ｇ以上であることが好ましく、１．５μｇ／ｇ以上であることがより好ましい。上限は特に制限はないが、例えば、３μｇ／ｇ以下であってよい。

同じくＴｈＴエキシマーを効率よく形成させる観点から、被験試料とチオフラビンＴとを接触させた後の被験試料中のチオフラビンＴのモル濃度とアミロイド凝集体を形成するタンパク質のモル濃度の比（［ＴｈＴ］／［アミロイド凝集体を形成するタンパク質］）は、５以上であることが好ましく、１０以上であることがより好ましく、２０以上であることが更に好ましく、４０以上であることが更により好ましい。モル濃度比の上限は特に制限はないが、例えば、１００以下であってよい。アミロイド凝集体を形成するタンパク質のモル濃度は、検出対象であるアミロイド凝集体を形成し得るタンパク質（例えば、アミロイドβ）に換算したモル濃度である。

被験試料は、アミロイド凝集体の有無を調べたい試料であれば特に制限されるものではない。被験試料の具体例としては、脳切片、脳脊髄液、血液、粘膜が挙げられる。被験試料は、これらの試料を適当な媒体（例えば、水、緩衝液、培地等）に懸濁又は溶解させた溶液であってもよく、懸濁又は溶解させた後、不溶物を濾過した溶液であってもよい（被験試料溶液）。

チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は、下記式で表され、４−（３，６−ジメチル−１，３−ベンゾチアゾール−３−イウム−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンクロリドとも称される公知の化合物である。ＴｈＴは、アミロイドの染色（ＴｈＴ染色）に汎用されている蛍光色素である。

本実施形態に係る検出方法には、例えば、市販されているＴｈＴ試薬を特に制限なく使用することができる。

ＴｈＴは、４８０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、４０５ｎｍ）を発する。一方、ＴｈＴは、光照射により、４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、３５０ｎｍ）を発する光反応物（蛍光性不純物）を生じる。市販されているＴｈＴ試薬は、この蛍光性不純物を含むものである。本実施形態に係る検出方法は、ＴｈＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体からの長波長（例えば、５７０ｎｍ付近）の蛍光を検出するものであるため、蛍光性不純物による影響を受けにくいという利点もある。

アミロイド凝集体は、βシート構造が特徴的なタンパク質の特殊な凝集体である。アミロイド凝集体を形成するタンパク質は、インスリン、β２ミクログロブリン及びアミロイドβ等の様々な種類が存在する。体内での特定のアミロイド凝集体の蓄積は、病気の原因にもなる。例えば、β２ミクログロブリン凝集体の蓄積は透析アミロイドーシス、アミロイドβ凝集体の蓄積はアルツハイマー病に関連がある。

（測定ステップ）
測定ステップでは、チオフラビンＴと接触させた被験試料の時間分解蛍光を測定する。

時間分解蛍光の測定は、公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、蛍光寿命測定装置により、ＴｈＴと接触させた被験試料に波長４００〜４２０ｎｍ（好ましくは４０５ｎｍ）の光を照射し、これに応じた波長５００〜６２０ｎｍの発光（蛍光）を測定する。時間分解蛍光の測定は、所定の波長領域（例えば、上述の５００〜６２０ｎｍ）におけるスペクトルとして測定してもよく、また特定の波長（例えば、エキシマー蛍光のピークがある５７０ｎｍ）の発光（蛍光）のみを測定してもよい。

より具体的には、例えば、被験試料とＴｈＴとを含む溶液を測定サンプルとし、蛍光寿命測定装置（例えば、小型蛍光寿命測定装置：Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ型、浜松ホトニクス株式会社製）を用いて、時間相関単光子係数法により、励起波長４０５ｎｍにおける蛍光減衰曲線を波長５００ｎｍから６２０ｎｍまで５ｎｍおきに測定し、所定の時間（例えば、測定開始から１０〜２０ｎｓ等）の蛍光減衰曲線の値を積算し、これを波長別にプロットすることで時間分解蛍光スペクトルを得ることができる。また、励起波長４０５ｎｍにおける蛍光減衰曲線を特定の波長（例えば、５７０ｎｍ）で測定し、所定の時間（例えば、測定開始から１０〜２０ｎｓ等）の蛍光減衰曲線の値を積算することで、特定の波長における時間分解蛍光の測定データを得ることができる。

時間分解蛍光は、バックグラウンド値を補正することが好ましい。バックグラウンド値は、例えば、ＴｈＴを含まない測定サンプルに対して同様の測定を行ったときの測定値とすることができる。例えば、被験試料の測定値からバックグラウンド値を引くことによって、被験試料とは無関係の発光成分（例えば、ラマン散乱光）を除去することができ、より精度高くアミロイド凝集体を検出することができる。

（検出ステップ）
検出ステップでは、測定された時間分解蛍光からチオフラビンＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光（エキシマー蛍光）を検出する。

エキシマー蛍光は、波長５７０ｎｍ付近にピークを有する蛍光である。したがって、例えば、波長５００〜６２０ｎｍの領域内の特定の波長について、好ましくは波長５５０〜６００ｎｍの領域内の特定の波長について、より好ましくは波長５７０ｎｍについて、エキシマー蛍光の有無を検出すればよい。

エキシマー蛍光の有無は、例えば、ＴｈＴを接触させていない被験試料について時間分解蛍光を測定したデータと比べて、蛍光強度が増加したか否かにより検出することができる。

〔アミロイド凝集体検出装置〕
アミロイド凝集体検出装置の構成について説明する。
図１は、一実施形態に係るアミロイド凝集体検出装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図である。図１に示すように、アミロイド凝集体検出装置Ｄは、物理的には、ＣＰＵ Ｄ１１、ＲＯＭ Ｄ１２及びＲＡＭ Ｄ１３等の主記憶装置、キーボード及びマウス等の入力デバイスＤ１４、ディスプレイ等の出力デバイスＤ１５、蛍光測定装置等の他の装置との間でデータの送受信を行うためのネットワークカード等の通信モジュールＤ１６、ハードディスク等の補助記憶装置Ｄ１７等を含む、通常のコンピュータとして構成される。後述するアミロイド凝集体検出装置Ｄの各機能は、ＣＰＵ Ｄ１１、ＲＯＭ Ｄ１２、ＲＡＭ Ｄ１３等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、ＣＰＵ Ｄ１１の制御の下で入力デバイスＤ１４、出力デバイスＤ１５、通信モジュールＤ１６を動作させるとともに、主記憶装置Ｄ１２及びＤ１３、並びに補助記憶装置Ｄ１７におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。

図２は、一実施形態に係るアミロイド凝集体検出装置Ｄの機能的構成を示す概要図である。図２に示すように、アミロイド凝集体検出装置Ｄは、機能的構成要素として、取得手段Ｄ１、検出手段Ｄ２、判定手段Ｄ３、及び表示手段Ｄ４を備える。

取得手段Ｄ１は、蛍光寿命測定装置等（図示せず）で得た時間分解蛍光測定データを取得するものである。検出手段Ｄ２は、時間分解蛍光測定データからチオフラビンＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光が存在するか否かを検出するものである。判定手段Ｄ３は、検出結果に基づき、（被験試料に）アミロイド凝集体が存在するか否かを判定するものである。表示手段Ｄ４は、判定した結果を表示するものである。

〔アミロイド凝集体検出プログラム〕
アミロイド凝集体検出プログラムは、コンピュータを、上述した取得手段Ｄ１、検出手段Ｄ２、判定手段Ｄ３、及び表示手段Ｄ４として機能させるものである。コンピュータにアミロイド凝集体検出プログラムを読み込ませることにより、コンピュータはアミロイド凝集体検出装置Ｄとして動作する。アミロイド凝集体検出プログラムは、例えば、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されて提供される。記録媒体は、非一時的記録媒体であってもよい。記録媒体としては、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等の記録媒体、ＲＯＭ等の記録媒体、半導体メモリ等が例示される。

（アミロイド凝集体検出方法）
アミロイド凝集体検出装置Ｄにより行われるアミロイド凝集体検出方法について説明する。図３は、アミロイド凝集体検出方法のフローチャートである。アミロイド凝集体検出装置Ｄにより行われるアミロイド凝集体検出方法により、被験試料がアミロイド凝集体を含むか否かを自動的に精度高く検出することができる。

［取得ステップＳ１］
最初に、取得手段Ｄ１が、蛍光寿命測定装置等から時間分解蛍光測定データを取得する。

［検出ステップＳ２］
次に、検出手段Ｄ２が、取得した時間分解蛍光測定データからチオフラビンＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光が存在するか否かを検出する。当該結合体に由来する蛍光は、上述した波長領域に出現する蛍光である。

［判定ステップＳ３］
次に、判定手段Ｄ３が、検出ステップＳ２にて検出した結果に基づき、被験試料にアミロイド凝集体が存在するか否かを判定する。例えば、結合体に由来する蛍光が検出された場合は、被験試料にアミロイド凝集体が存在すると判定する。

［表示ステップＳ４］
次に、表示手段Ｄ４が、判定ステップＳ３にて判定した結果を表示する。例えば、被験試料にアミロイド凝集体が存在するか否かが表示手段Ｄ４によって表示される。

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［参考例：蛍光減衰曲線の解析］
（Ａβ線維を含む試料の調製）
非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，２７８巻（１３号），ｐｐ．１１６１２−１１６２２）に記載された方法に基づき、下記手順でＡβ線維を含む試料を調製した。まず、Ａβ１−４２（商品名：Ａｍｙｌｏｉｄ β−ｐｒоｔｅｉｎ Ｈｕｍａｎ，１−４２、株式会社ペプチド研究所製）をジメチルスルホキシドに５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、さらに１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ水溶液を用いて、Ａβ１−４２の濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。得られたＡβの調製液は、インキュベータを用いて３７℃で２４時間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Ａβ線維（Ａβ凝集体）を含む試料を調製した。

（ＴｈＴ水溶液の調製）
ＴｈＴ（ウルトラピュアグレード，ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ Ｉｎｃ．社製）を蒸留水に溶解し、１００μｍｏｌ／ＬのＴｈＴ水溶液を得た。

（Ａβ線維を含む試料のＴｈＴ染色）
Ａβ線維を含む試料を１０μＬ分取したものを６試料分用意し、これらに対して、１００μｍｏｌ／ＬのＴｈＴ水溶液及び蒸留水を、それぞれ２．５μＬ及び７７．５μＬ、５μＬ及び７５μＬ、１０μＬ及び７０μＬ、２０μＬ及び６０μＬ、４０μＬ及び４０μＬ、又は８０μＬ及び０μＬ添加した。さらに、５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ９．０）４１０μＬをそれぞれに添加した後、混合してＴｈＴ染色試料とした。各ＴｈＴ染色試料中のＡβ線維の濃度は２μｍｏｌ／Ｌ（６試料共通）であり、ＴｈＴの濃度は、それぞれ０．５μｍｏｌ／Ｌ、１μｍｏｌ／Ｌ、２μｍｏｌ／Ｌ、４μｍｏｌ／Ｌ、８μｍｏｌ／Ｌ及び１６μｍｏｌ／Ｌである。なお、モル濃度比（［ＴｈＴ］／［Ａβ］）は、それぞれ０．２５、０．５、１、２、４及び８である。

（ネガティブコントロール試料）
Ａβ線維を含む試料を１０μＬに蒸留水を８０μＬ添加した。さらに、５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ９．０）４１０μＬを添加した後、混合して、ＴｈＴを含まないネガティブコントロール試料とした。

（蛍光減衰曲線の測定）
各ＴｈＴ染色試料及びネガティブコントロール試料を、内径３ｍｍの石英セルに分注し、小型蛍光寿命測定装置（Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ型、浜松ホトニクス製）を用い、時間相関単光子係数法を用いて、励起波長４０５ｎｍにおける蛍光減衰曲線Ｉ（ｔ）を測定波長５００ｎｍで測定した。図４に蛍光減衰曲線を示す。図４に示す蛍光減衰曲線は、励起した時点から起算した時間に対する蛍光強度をプロットしたものである。また、図４中、「ＩＲＦ」は、装置応答関数を示す。

（蛍光寿命値の解析）
得られた各蛍光減衰曲線Ｉ（ｔ）は、以下に示す手順で、固有の蛍光寿命と重み因子を有する複数の成分に分離した。まず、数式１で示される関数Ｇ（ｔ）を、数式２にしたがってコンボリューション積分し、曲線Ｆ（ｔ）を得た。数式２において、Ｅ（ｔ）は蛍光寿命測定装置の装置応答関数（ＩＲＦ）、Ｃはバックグラウンドで、ネガティブコントロールの平均値から算出される定数である。

次に、Ｉ（ｔ）とＦ（ｔ）が最も良く一致するように、数式３におけるχ^２を最小にする変数の組み合わせを非線形最小二乗法で探索し、数式１におけるτ_０〜τ_ｎ、Ａ_０〜Ａ_ｎの最良の組み合わせを得た。なお、数式３において、ｍ_ｊは解析の時間範囲を示し、ｍ_１は解析の開始時間、ｍ_２は解析の終了時間を示す。この解析の結果得られたτ_０〜τ_ｎが各蛍光又は発光成分の寿命、Ａ_０〜Ａ_ｎが各蛍光又は発光成分の重み因子（すなわち発光成分の量）である。

ｎ＋１の値は、すなわち減衰曲線解析に必要な指数関数の数を示す成分数と呼ばれる数値であり、各成分は違う物理的機構および／もしくは発光種を起源とする。減衰曲線が複数ある場合は、試料間で各成分の寿命値がお互いに等しいと仮定する、非特許文献（Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，１９８３年，１０２巻，６号，ｐｐ．５０１）に記載のグローバル解析を行い、より信頼性の高い解析を実施した。

上記解析の結果、各蛍光減衰曲線は成分数ｎ＝０〜３、すなわち４つの成分で解析され、その寿命値はそれぞれ０．００７１ｎｓ、０．２６ｎｓ（成分Ａ１）、０．８９ｎｓ（成分Ａ２）及び２．２ｎｓ（成分Ａ３）であった。寿命値から、最も寿命の短い成分はＡβ線維と結合していない未結合ＴｈＴ、残りの３つの成分がＡβと結合したＴｈＴ由来の蛍光成分であると帰属した。

（各蛍光成分の蛍光強度の濃度依存性の解析方法）
成分ｉの蛍光強度Ｆ_ｉは数式４で計算した。

各ＴｈＴ濃度における成分別のＴｈＴの蛍光強度を数式４で求めた。図５（Ａ）は、成分Ａ１、成分Ａ２及び成分Ａ３それぞれの蛍光強度（Ｆ_１、Ｆ_２及びＦ_３）を、モル濃度比（［ＴｈＴ］／［Ａβ］）に対してプロットしたグラフである。成分Ａ３は、モル濃度比が高くなるにつれて蛍光強度が飽和する傾向が認められたため、モル濃度比を更に高くしたＴｈＴ染色試料に対して、上記と同様の解析を実施した。結果を図５（Ｂ）に示す。

図５において、Ａβ線維と結合したＴｈＴの寿命成分Ａ１〜Ａ３は、独自の濃度依存性を示しており、これらの寿命成分が実在するＡβ線維の結合サイトに由来することを示している。最も寿命の長い寿命成分Ａ３に関して、高モル濃度比において、蛍光強度が低下する現象が観測された。高濃度の色素溶液で蛍光が消光する現象は、濃度消光と呼ばれ（例えば、坪村宏著、新物理化学（下）、化学同人、７３２頁）、色素が二量体を作ることが原因であることが知られている。さらに励起状態において形成される二量体はエキシマーと呼ばれ、単量体とは異なる蛍光特性を示すことも知られている。したがって、寿命成分Ａ３における消光は、ＴｈＴが二量体、すなわちエキシマーを形成することに由来するものである。

［試験例：時間分解蛍光スペクトルの測定］
（Ａβ線維を含む試料の調製）
参考例と同様の手順により、Ａβ線維（Ａβ凝集体）を含む試料を調製した。

（ＴｈＴ水溶液の調製）
ＴｈＴ（ウルトラピュアグレード，ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ Ｉｎｃ．社製）を蒸留水に溶解し、４００μｍｏｌ／ＬのＴｈＴ水溶液を得た。

（Ａβ線維を含む試料のＴｈＴ染色）
Ａβ線維を含む試料を８μＬ分取したものを５試料分用意し、これらに対して、４００μｍｏｌ／ＬのＴｈＴ水溶液及び蒸留水を、それぞれ５μＬ及び７５μＬ、１０μＬ及び７０μＬ、２０μＬ及び６０μＬ、４０μＬ及び４０μＬ、又は８０μＬ及び０μＬ添加した。さらに、５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ９．０）９１２μＬをそれぞれに添加した後、混合してＴｈＴ染色試料とした。各ＴｈＴ染色試料中のＡβ線維の濃度は０．８μｍｏｌ／Ｌ（５試料共通）であり、ＴｈＴの濃度は、それぞれ２μｍｏｌ／Ｌ、４μｍｏｌ／Ｌ、８μｍｏｌ／Ｌ、１６μｍｏｌ／Ｌ、及び３２μｍｏｌ／Ｌである。なお、モル濃度比（［ＴｈＴ］／［Ａβ］）は、それぞれ２．５、５、１０、２０及び４０である。

（ネガティブコントロール試料の調製）
Ａβ線維を含む試料に代えて、ジメチルスルホキシドを１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ水溶液で２％（ｖ／ｖ）となるように希釈した溶液を用いたこと以外は、上記（Ａβ線維を含む試料のＴｈＴ染色）と同様の手順により、各ＴｈＴ染色試料に対応するネガティブコントロール試料を調製した。

（蛍光測定）
各ＴｈＴ染色試料及びネガティブコントロール試料を、内径３ｍｍの石英セルに分注し、小型蛍光寿命測定装置（Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ型、浜松ホトニクス製）を用い、時間相関単光子係数法を用いて、励起波長４０５ｎｍにおける蛍光減衰曲線を、４２０ｎｍから６２０ｎｍまで５ｎｍおきに測定した。測定された蛍光減衰曲線のピーク値の５％の立ち上がり部分を時刻０とし、時間１０ｎｓ〜１８ｎｓの蛍光減衰曲線の測定値をそれぞれ積算し、積算値を波長別にプロットすることで時間１０ｎｓ〜１８ｎｓにおける時間分解蛍光スペクトルを得た。

（Ａβ線維に結合したＴｈＴエキシマーの蛍光識別方法）
図６（Ａ）〜（Ｄ）は、各ＴｈＴ染色試料及びネガティブコントロール試料の時間１０ｎｓ〜１８ｎｓにおける時間分解蛍光スペクトル及びその規格化スペクトルである。図６（Ａ）は、各ＴｈＴ染色試料の時間１０ｎｓ〜１８ｎｓにおける時間分解蛍光スペクトルである。当該時間分解蛍光スペクトルは、試料とは無関係の発光成分を除去するため、対応するネガティブコントロール試料の測定値をバックグラウンド蛍光として差し引いている。図６（Ｂ）は、図６（Ａ）に示した時間分解蛍光スペクトルの規格化スペクトルである。規格化スペクトルは、時間分解蛍光スペクトルにおける最大の蛍光強度で各波長の蛍光強度を除したものである。また、図６（Ｃ）及び（Ｄ）は、それぞれネガティブコントロール試料の時間１０ｎｓ〜１８ｎｓにおける時間分解蛍光スペクトル及びその規格化スペクトルである。なお、図６（Ｃ）及び（Ｄ）中の「モル濃度比」は、当該「モル濃度比」のＴｈＴ染色試料に対応するネガティブコントロール試料であることを意味する。

図６（Ａ）及び（Ｂ）に示すとおり、モル濃度比（［ＴｈＴ］／［Ａβ］）の上昇に従って、４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光が減少し、５７０ｎｍ付近をピークとする蛍光が出現することが分かる。出現する蛍光は、蛍光波長が水溶液中のＴｈＴエキシマーの蛍光波長（５７０ｎｍ付近。非特許文献２）と近く、Ａβ線維（アミロイド凝集体）とＴｈＴエキシマーの結合体に由来する蛍光であると考えられる。したがって、本発明に基づいて、エキシマー蛍光を検出することにより、長波長蛍光にてＡβ線維（アミロイド凝集体）を検出することができる。

Ｄ…アミロイド凝集体検出装置、Ｄ１…取得手段、Ｄ２…検出手段、Ｄ３…判定手段、Ｄ４…表示手段、Ｄ１１…ＣＰＵ、Ｄ１２…ＲＯＭ、Ｄ１３…ＲＡＭ、Ｄ１４…入力デバイス、Ｄ１５…出力デバイス、Ｄ１６…通信モジュール、Ｄ１７…補助記憶装置。

Claims (4)

1. チオフラビンＴと接触させた被験試料の時間分解蛍光を測定するステップと、
   測定された時間分解蛍光からチオフラビンＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光を検出するステップと、を含む、アミロイド凝集体の検出方法。
2. チオフラビンＴと接触させた被験試料の時間分解蛍光データを取得する取得手段と、
   取得した時間分解蛍光データからチオフラビンＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光が存在するか否かを検出する検出手段と、
   検出結果に基づき、前記被験試料にアミロイド凝集体が存在するか否かを判定する判定手段と、を備える、アミロイド凝集体検出装置。
3. コンピュータを、
   チオフラビンＴと接触させた被験試料の時間分解蛍光データを取得する取得手段、
   取得した時間分解蛍光データからチオフラビンＴエキシマーとアミロイド凝集体との結合体に由来する蛍光を検出する検出手段、及び
   検出結果に基づき、前記被験試料にアミロイド凝集体が存在するか否かを判定する判定手段、
   として機能させるためのアミロイド凝集体検出プログラム。
4. 請求項３に記載のアミロイド凝集体検出プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体。