KR101957919B1

KR101957919B1 - 각막이상증 진단용 바이오센서 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101957919B1
Application number: KR1020170000370A
Authority: KR
Inventors: 유소영
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2017-01-02
Filing date: 2017-01-02
Publication date: 2019-03-13
Also published as: KR20180079778A

Abstract

본 발명은 각막이상증 진단용 바이오센서 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오센서는 BIGH3 유전자의 점 돌연변이를 타겟으로 하는 토홀드-매개 DNA 치환 반응 및 표면증강 라만산란 활성을 이용하는 것으로, 라만 시그널의 민감도 및 안정성이 우수하고, 상기 바이오센서를 이용하여 BIGH3 유전자의 점 돌연변이를 검출하는 경우, 단순하고 경제적인 방법으로 우수한 각막 이상증 진단 효과를 나타낸다.

Description

각막이상증 진단용 바이오센서 및 이의 용도{Biosensors for Diagnosing Corneal Dystrophies and Uses Thereof}

본 발명은 각막이상증 진단용 바이오센서 및 이의 용도에 관한 것이다.

특정 질환에 대한 특정 DNA 서열의 검출 또는 탐지는 생물학적 연구나 의학적 진단에 있어서 중요한 도구이다. 그러나, DNA는 매우 낮은 농도로 존재하므로, DNA 분석시 더욱더 민감한 검출 기술이 요구된다. 일반적인 DNA 검출에는 PCR을 이용한 DNA 증폭 기술과 형광 검출 기술이 널리 이용되어왔다. 이 중, 라만 분광법(Raman spectroscopy)은 극미량의 단위에서 화합물의 생물학적, 구조적 성질을 규명할 수 있다는 장점이 있다. 빛을 유형 매질에 통과시키는 경우, 어느 정도의 양은 고유 방향에서 벗어나는데, 이러한 현상은 라만 산란(Raman scattering)으로 알려져 있다. 또한, 산란된 광 중 일부는 광의 흡수 및 전자의 높은 에너지 준위로의 여기로 인해 고유의 자극된 광과 진동수가 상이하다. 라만 방출 스펙트럼의 파장은 시료 내의 광 흡수 분자의 화학적 조성 및 구조적 특성을 나타내고, 광 산란의 강도는 시료 내의 분자의 농도에 따라 상이하다. 그러나, 시료 내의 자극된 광과 개개의 분자 사이에 라만 상호작용이 일어날 가능성은 매우 낮기 때문에, 저감도성으로 인해 라만 분석의 응용성을 제한한다.

은 나노 입자를 사용하는 표면 증강 라만 분광법(surface enhanced Raman spectroscopy, SERS)은 라만 분광법에 존재하던 문제점인 낮은 감도를 극복할 수 있는 가능성을 보여주었다, 또한, 나노 구조의 금속 표면에 흡착된 서로 다른 분자들의 라만 시그널은, 은, 금, 구리 등의 경우에 매우 높게 나타났다. 그러나, 금의 경우 안정된 라만 시그널을 나타내지만 민감도가 낮고, 은의 경우는 민감도가 높으나 불안정한 시그널 특성을 나타내는 문제점이 존재하였다.

따라서, 특정 질환에 대한 특정 DNA 서열의 고감도 탐지를 위한, 라만 시그널의 민감도 및 안정성을 동시에 높일 수 있는 바이오센서에 대한 연구의 필요성이 절실히 대두되고 있다.

한편, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키는 DNA의 점 돌연변이는 심각한 유전 질환과 암을 유발할 수 있다. ACD(Avellino corneal dystrophy), RBCD(Reisec-Bucklers corneal dystrophy), 및 LCD(lattice corneal dystrophy type I)과 같은 가장 일반적인 각막 이상증(CD, corneal dystrophy)은 BIGH3 유전자의 점 돌연변이로 인한 아미노산 치환에 기인한다. 증례보고에 의하면 레이저를 이용한 LASIK은 각막 침착을 악화시키고 ACD 환자에서 증상이 반복적으로 재발하는 것으로 나타났다. 따라서, 특히 이형접합성 ACD 유전자형 환자의 경우 실명 예방을 위해 라식 수술 전에 ACD를 진단해야한다. 이들은 대개 60 대가 되기 전에 눈에 띄는 증상을 보이지 않는다.

당업계에 각막이상증을 유발하는 BIGH3 유전자의 점 돌연변이의 해당 서열은 잘 알려져 있으며, 하기 표 1에 나타내었다.

서열 (5' → 3')	돌연변이	표현형	엑손(Exon) No.	타겟 서열 모티프(Target sequence motif)(엑손 4의 5' → 3' 서열)
417 C G C → C A C 419	R124H	ACD(Avellino corneal dystrophy)	엑손 4	CCCTACCACTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACC A CACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCTTCGCCCCTAGCAACGAGGCCTGGGCCTCCTTGCCAGCT
417 C G C → C T C 419	R124L	RBCD(Reis-Bucklers corneal dystrophy)	엑손 4	CCCTACCACTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACC T CACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCTTCGCCCCTAGCAACGAGGCCTGGGCCTCCTTGCCAGCT
417 C GC → T GC 419	R124C	LCD(Lattice corneal dystrophy)	엑손 4	CCCTACCACTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGAC T GCACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCTTCGCCCCTAGCAACGAGGCCTGGGCCTCCTTGCCAGCT

또한, 라식수술의 시술 전에 아벨리노 각막이상증 환자에 대한 정확한 진단을 수행하여, 라식수술에 의한 증상 진행을 방지할 필요가 있다. 그러나, 기존의 안과에서는 안과의사가 현미경으로 안구 혼탁을 검사하는 것만으로 아벨리노 각막이상증을 진단하고 있어 증상이 진행되지 않은 환자의 경우는 발견하지 못하고, 라식수술을 시행하여 실명으로 발전하는 경우도 종종 발생하고 있다.

현재 이용되고 있는 DNA 시퀀싱을 포함한 통상적인 방법은 시간 소모적이며 노동 집약적이므로, 서로 다른 유전자형에서 DNA의 단일-점 돌연변이를 확인할 수 있는 간단한 센서는 실제 임상 분석에 유용할 것이다. 형광, 전기 화학, SPR(surface plasmon resonance), SERS(colorimetry and surface-enhanced Raman scattering)과 같은 다양한 시그널 태깅을 사용하는 감지 기술의 발전이 보고되고 있으나, 결과는 주로 모델 DNA 검출에 국한되어 있다.

따라서, 정확하고 신속한 각막이상증의 진단방법이 절실히 요구되고 있는 실정이며, 이러한 임상에 적용하려면 민감도와 같은 분석 성능의 실질적인 향상이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 정확하고 신속한 각막이상증 진단을 위해 BIGH3 유전자의 점 돌연변이를 표적으로 하는 표적 DNA 검출용 바이오센서를 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 BIGH3 유전자의 핫-스팟 돌연변이 영역에서 단일 염기 불일치(single base mismatch, 1MM)를 확인하기 위해 토홀드-매개 DNA 치환(toehold-mediated DNA displacement) 반응을 도입한 SERS 센서를 제작하였다. 또한, 표적 DNA(tDNA)의 결합시 큰 시그널 변화를 유도하는 SERS 플랫폼으로서 Ag@Au 바이메탈 나노덴드라이트를 사용하여 제작한 본 발명의 바이오센서를 이용하는 경우 단순하고 경제적인 방법으로 우수한 표적 DNA 검출 효과를 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 일 목적은 신규한 각막이상증 진단용 바이오센서를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 각막이상증 진단용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 각막이상증 진단 키트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 각막이상증 진단 방법을 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 각막이상증 진단용 바이오센서를 제공한다:

(a) 서열번호 1에 기재된 염기서열, 서열번호 2에 기재된 염기서열, 서열번호 3에 기재된 염기서열 및 서열번호 4에 기재된 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 염기서열로 표시되는 탐침 DNA(pDNA); 및 서열번호 5에 기재된 염기서열로 표시되는 라만 염료(Raman dye)가 결합된 표지 DNA(iDNA)의 혼성화물; 및

(b) 상기 혼성화물의 탐침 DNA가 고정화된 금속 기판.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 탐침 DNA 및 표지 DNA는 염기서열의 상보적인 결합에 의해 혼성화된다.

본 발명에서는 안과 질환 중 각막이상증이 BIGH3 유전자의 점 돌연변이에 의한 것임에 착안하여, 다양한 각막이상증 환자에게서 나타나는　BIGH3 유전자의 점돌연변이를 타겟으로 하여 각막이상증을 진단할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 바이오센서를 제작하였다.

상기 바이오센서는 탐침 DNA(pDNA; probe DNA) 및 라만 염료가 부착된 표지 DNA(iDNA; indicator DNA)로 구성된 이중-가닥 DNA(dsDNA) 이합체(duplex)인 혼성화물에 금속 기판이 결합된 것이다.

본 발명의 탐침 DNA는 라만 염료가 결합된 표지 DNA와 염기서열의 상보적인 결합에 의해 혼성화되는 DNA를 의미한다. 상기 혼성화된 표지 DNA를 라만 염료가 없는 표적 DNA로 치환함으로써 라만 염료로부터의 라만 시그널의 변화를 통해 표적 DNA(tDNA; target DNA)를 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 탐침 DNA는 이의 3'-말단에 토홀드 영역(toehold region)을 포함한다.

상기 토홀드 영역은 바람직하게는 2 내지 10 개의 뉴클레오티드를 포함하며, 보다 바람직하게는 4 내지 8 개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 6 개의 뉴클레오티드로 이루어진 것이다.

본 발명에서 토홀드 영역을 포함하는 각각의 탐침 DNA(pDNA; probe DNA)들은 서열번호 1 내지 4에 기재된 염기서열이며, 표지 DNA(iDNA)는 서열번호 5에 기재된 염기서열이다.

보다 구체적으로, 서열번호 1은 8 개 뉴클레오티드의 토홀드 영역을 포함하는 pDNA(T8)이며, 서열번호 2는 6 개 뉴클레오티드의 토홀드 영역을 포함하는 pDNA(T6)이고, 서열번호 3은 4 개 뉴클레오티드의 토홀드 영역을 포함하는 pDNA(T4)이며, 서열번호 4는 2 개 뉴클레오티드의 토홀드 영역을 포함하는 pDNA(T2)이다.

본 발명에서 이용될 수 있는 금속 기판은 본 발명의 표적 DNA인 BIGH3 유전자(TGFBI 유전자; Human transforming growth factor b-induced gene)의 점 돌연변이를 검출할 수 있는 한 특별하게 제한되지 않으며, 당업계에서 이용되는 어떠한 금속 기판도 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 이용되는 금속 기판의 표면의 형상, 크기 및 화학적 조성은 특별히 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에서 이용 가능한 기질은 당업계에 공지된 다양한 기질을 포함할 수 있다. 기질 표면의 형상, 크기 및 화학적 조성은 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 적합한 고체 기질은 예를 들어, 실리콘 와퍼, 유리, 석영, 융합 실리카, 금속, 플라스틱 및 중합체[예컨대, 사이클로올레핀 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리스틸렌, 폴리에틸렌 및 폴리프로필렌]를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 이용될 수 있는 고상 기질은 표면 특성에 무관하게 어떠한 것도 이용 가능하다. 예를 들어, 고상 기질은, 금속, 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "금속 기판"은 금속, 금속 옥사이드 및 합금의 기판을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 금속으로 이루어진 기판뿐만 아니라, 금속이 표면 코팅된 기판도 포함한다.

본 발명의 금속 기판은 금(Au), 은(Ag), 동(Cu), 알루미늄(Al), 백금(Pt), 니켈(Ni) 및 아연(Zn)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이며, 본 발명에서 바람직하게 이용되는 금속 기판은 금(Au) 및 은(Ag) 기판이며, 금 및 은 나노 입자로 표면 코팅된 기판을 포괄하는 의미를 갖는다.

상기 금속 기판은 마름모형, 정사각형, 직사각형, 원형 및 덴드라이트(dendrite) 형으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 구조로 형성되며, 가장 바람직하게는 덴드라이트(dendrite) 형이다.

상기 덴드라이트 형은 금속 전착에서 뼈대 또는 나뭇가지형의 성장 패턴("덴드라이트 성장")을 가지는 결정 구조이다.

일 구현예에서, 본 발명의 금속 기판은 금 및 은의 바이메탈 나노덴드라이트를 이용한다.

또한, 본 발명에 따른 나노입자의 표면은 다양한 물질을 결합시켜 나노입자의 특성을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 나노입자의 표면에 바이오 분자를 기능화할 수 있다. 본 발명에 따른 나노입자의 표면이 바이오분자로 기능화될 경우, 나노입자가 측정 대상에만 결합할 수 있어, 나노입자를 이용한 분석 능력을 더욱 향상시킬 수 있다. 상기 나노입자에 기능화하는 바이오 분자의 예로, 항체, 항체 단편, 유전조작 항체, 단일쇄 항체, 수용체, 단백질, 결합 단백질, 효소, 억제제 단백질, 렉틴, 세포 유착 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산 또는 압타머를 들 수 있다.

상기 혼성화된 탐침 DNA는 기판 표면에 고정하기 위해, 활성기가 유도될 수 있다. 예를 들어, 상기 탐침 DNA는 -SH, -CHO, -COOH 또는 -NH₂ 기의 연결에 의해 기판 표면에 고정될 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 표지 DNA(iDNA)에 라만 활성 분자가 결합될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "라만 활성 분자"란, 본 발명의 나노입자가 하나 이상의 분석물에 부착되었을 때 라만 검출 장치에 의한 분석물의 검출 및 측정을 용이하게 하는 물질을 의미한다. 라만 활성분자는 특정 라만 스펙트럼을 보여주기 때문에, 이후 생체분자를 보다 효과적으로 분석할 수 있게 하는 이점이 있다.

라만 분광법에 사용될 수 있는 라만 활성분자는 유기 또는 무기 분자, 원자, 복합체 또는 합성 분자, 염료, 천연발생 염료(피코에리스린 등), C60과 같은 유기 나노구조체, 벅키볼, 탄소 나노튜브, 양자점, 유기 형광 분자 등을 포함한다.

상기 라만 염료는 라만 활성 유기 화합물을 의미하며, 이 기술분야에서 널리 사용되는 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 시아닌(Cy3, Cy3.5, 또는 Cy5), 크산틴(xanthines), 로다민6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-플루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리미딘, 8-머캅토아데닌, 및 9-아미노-아크리딘 등을 들 수 있으나 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.

일 구현예에서, 상기 금 및 은의 바이메탈 나노덴드라이트는 금 및 은의 갈바닉 치환 반응을 이용한 전기화학 증착법으로 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 금 및 은의 바이메탈 나노덴드라이트는 1 내지 10 원자 퍼센트(%)의 금 및 90 내지 99 원자 퍼센트(%)의 은을 포함하는 것이 바람직하고, 이전의 본 발명자의 선행 기술에 따르면, 은 나노덴드라이트(금이 0 원자 퍼센트)의 경우 금 나노덴드라이트에 비해 약 17배의 라만 시그널 강도를 나타내나, 시그널의 표준편차(RSV)가 34.6%로 금 나노덴드라이드의 9.2%에 비해 매우 불안정하다. 또한, 금 3.17 원자 퍼센트(%) 및 은 96.83 원자 퍼센트(%)의 바이메탈 나노덴드라이트의 경우, 시그널의 표준편차(RSV)가 8.7%로 은 나노덴드라이트보다 4배 더 안정한 것으로 나타났다.

본 발명의 각막이상증은 BIGH3 유전자(TGFBI 유전자; Humantransforming growth factor b-induced gene)의 점 돌연변이에 의해 유발되는 것이다. 각막이영양증(corneal dystrophy)은 각막 중심에 혼탁이 발생하여 나이가 듦에 따라 점차 혼탁이 많아져서 시력이 감소 하는 상염색체 우성 유전질환으로, 아벨리노각막이영양증(Avellino corneal dystrophy), 과립형각막이영양증(Granular corneal dystrophy), 라티스 타입 I 각막이영양증(lattice type I corneal dystrophy) 및 레이스버클러스 I 각막이영양증 (Reis-bucklers corneal dystrophy) 등이 있으며, BIGH3 단백질을 코딩하는 유전자의 점 돌연변이에 의하여 발생한다.

상기 BIGH3 유전자의 점 돌연변이에 대해서는 이미 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명에 이용될 수 있는 타겟 서열들을 하기 표 2에 나타내었다.

	길이(mer)	타겟 DNA 서열 (5' → 3')	돌연변이 부위
정상	30 50 100 147 190 225	TCAGCTTCTCCGTGCGGTCCGTGTACAGCT CTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGG CTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCA CAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGG TTTGAGAGTGGTAGGGCT CCGGGCAGACGGAGGTCATCTCACAGCTGGCAAGGAGGCCCAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCA CCGGGCAGACGGAGGTCATCTCACAGCTGGCAAGGAGGCCCAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCAGGAGCAGAAGACAGAAGGAGGGATGGCCTCTGGGG	엑손4	정상
ACD	30 50 100 147 190 225	TCAGCTTCTCCGTGTGGTCCGTGTACAGCT CTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGTGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGG CTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGTGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCA CAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGTGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGG TTTGAGAGTGGTAGGGCT CCGGGCAGACGGAGGTCATCTCACAGCTGGCAAGGAGGCCCAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGTGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCA CCGGGCAGACGGAGGTCATCTCACAGCTGGCAAGGAGGCCCAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGTGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCAGGAGCAGAAGACAGAAGGAGGGATGGCCTCTGGGG	엑손4	ACD
RBCD	30 50 100 147 190 225	TCAGCTTCTCCGTGAGGTCCGTGTACAGCT CTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGAGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGG CTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGAGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCA CAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGAGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGG TTTGAGAGTGGTAGGGCT CCGGGCAGACGGAGGTCATCTCACAGCTGGCAAGGAGGCCCAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGAGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCA CCGGGCAGACGGAGGTCATCTCACAGCTGGCAAGGAGGCCCAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGAGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCAGGAGCAGAAGACAGAAGGAGGGATGGCCTCTGGGG	엑손4	RBCD
LCD	30 50 100 147 190 225	TCAGCTTCTCCGTGCAGTCCGTGTACAGCT CTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCAGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGG CTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCAGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCA CAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCAGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGG TTTGAGAGTGGTAGGGCT CCGGGCAGACGGAGGTCATCTCACAGCTGGCAAGGAGGCCCAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCAGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCA CCGGGCAGACGGAGGTCATCTCACAGCTGGCAAGGAGGCCCAGGCCTCGTTGCTAGGGGCGAAGATGGTGAAGCTGCCGGGCCCCTCCATCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCAGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCAGGGTCTCGTAAAGGTTTGAGAGTGGTAGGGCTGCAGGAGCAGAAGACAGAAGGAGGGATGGCCTCTGGGG	엑손4	LCD

치환된 염기는 굵은 문자로 나타내었다.

본 발명에서 이용될 수 있는 타겟 서열, 즉, 표적 DNA(tDNA)은 본 발명의 각막이상증 진단용 바이오센서가 BIGH3 유전자(TGFBI 유전자; Human transforming growth factor b-induced gene)의 점 돌연변이를 검출할 수 있는 한, 당업계에 공지된 어떠한 BIGH3 유전자(TGFBI 유전자; Human transforming growth factor b-induced gene)의 점 돌연변이 서열도 이용할 수 있으며, 표 2에 특별하게 제한되지 않는다.

예컨대, 본 발명에 이용될 수 있는 점 돌연변이를 타겟으로 하는 tDNA들은 BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 A로 치환된 점 돌연변이이며 124번째 단백질인 아르기닌을 히스티딘으로 바꾸게 되고 이는 ACD(Avellino corneal dystrophy)을 유발하며; BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 T로 치환된 점돌연변이는 124번째 아르기닌을 루신으로 바꾸게 되고 이는 RBCD(Reisec-Bucklers corneal dystrophy)을 유발하고; 또는 417 번째 염기 C가 T로 치환된 점 돌연변이는 124번째 아르기닌을 시스테인으로 바꾸게 되고 이는 LCD(lattice corneal dystrophy type I)을 유발한다.

본 발명의 일 실시예에서 이용된 tDNA들은 서열번호 6 내지 13에 기재된 염기서열이다.

결과적으로, 이러한 점돌연변이가 BIGH3 단백질의 아미노산의 치환을 일으키고 이는 각막이영양증을 일으킨다.

따라서, 본 발명의 바이오센서가 타겟으로 하는 표적 DNA는 BIGH3 유전자의 점 돌연변이이며, 이에 의하여 검출될 수 있는 각막이상증은, BIGH3 유전자의 점 돌연변이에 의해 유발되는 ACD(Avellino corneal dystrophy), RBCD(Reisec-Bucklers corneal dystrophy), LCD(lattice corneal dystrophy type I), 과립각막이상증(granular corneal dystrophy), 티엘-벤케 각막이상증(Thiel-Behnke corneal dystrophy), 상피기저막 각막이상증(epithelial basement membrane corneal dystrophy) 및 그로에노우브 각막이상증(Groenouw type corneal dystrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상이다.

또한, 본 발명의 바이오센서는 탐침 프로브인 탐침 DNA(pDNA; probe DNA) 및 라만 염료가 부착된 표지 DNA(iDNA; indicator DNA)로 구성된 이중-가닥 DNA(dsDNA) 이합체(duplex)로서, 표적 DNA와의 혼성화를 일으키는 이중-가닥 이합체(duplex) 말단의 혼성화되지 않은 염기 영역인 토홀드(toehold)를 사용하는 토홀드-매개 DNA 치환 반응을 이용한다. 이러한 토홀드 영역에 의하여 표적 DNA와의 혼성화를 위한 열역학 추진력이 제공되며 상기 반응이 효소적 도움 없이 실온에서 진행되도록 하므로 DNA 검출에 유리하다.

본 발명의 pDNA 서열은 tDNA와 완벽하게 일치(PM; perfect match)하거나 또는 불일치할 수 있으며, 상기 불일치는 바람직하게는 미스매치, 가장 바람직하게는 단일 염기 불일치(single base mismatch, 1MM)할 수 있다.

본 발명의 iDNA는 점 돌연변이의 위치까지는 포함하지 않아서 tDNA의 인식을 위한 선택성을 제공한다.

본 발명의 금속 기판 상에서의 이합체의 결합(Conjugation)은 표면 근처에 라만 리포터를 위치시키게 되고 라만 시그널을 활성화시킨다. pDNA에 대한 tDNA의 접근은 토홀드-매개 치환을 통해, 전혼성화된(prehybridized) iDNA가 가닥으로부터 멀어지도록 하므로 iDNA의 방출은 라만 시그널을 감소시킨다. 예컨대, 1MM tDNA가 존재하면 iDNA는 방출되지 않고 초기 라만 시그널이 유지된다. 따라서, 라만 시그널을 측정함으로써 분석 대상의 샘플 내 질환 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 바이오센서를 포함하는 각막이상증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 바이오센서 뿐만 아니라, 라만 시그널을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 제제, 분석에 사용되는 당 분야에서 통상적인 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다.

상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 바이오 센서를 유효성분으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 바이오센서를 포함하는 각막이상증 진단 키트를 제공한다.

상기 도구 또는 시약의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 키트는 상술한 바이오 센서 및 조성물을 구성으로 포함하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 각막이상증 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다:

(a) 분석하고자 하는 대상의 생물학적 샘플을 준비하는 단계;

(b) 상기 (a) 단계의 샘플과 본 발명의 바이오 센서를 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 접촉 전 및 후의 표면증강 라만산란(SERS) 시그널을 측정하는 단계.

보다 상세하게는, 본 방법은 분석하고자 하는 대상의 생물학적 샘플을 준비하는 단계; 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 표시되는 탐침 DNA(pDNA) 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 라만 염료(Raman dye)가 결합된 표지 DNA(iDNA)를 혼성화시킨 혼성화물의 탐침 DNA를 금속 기판에 고정시키는 단계; 상기 샘플과 상기 금속 기판에 고정된 혼성화물을 접촉시키는 단계; 상기 접촉 전 및 후의 표면증강 라만산란(SERS) 시그널을 측정하는 단계; 및 상기 접촉 전 및 후의 시그널 정도를 비교하여 각막이상증을 진단하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 샘플 내 본 발명의 바이오 센서가 타겟으로 하는 표적 DNA는 BIGH3 유전자(TGFBI 유전자; Humantransforming growth factor b-induced gene)의 점 돌연변이이다.

본 발명에서 상기 "진단"이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 각막이상증의 발병 가능성, 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 각막이상증의 발병 여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

상기에서 "샘플"이란 생물학적 샘플을 말하며, 각막이상증이 발생 또는 진행 정도에 따른 환자 또는 각막이상증으로 의심되는 환자로부터 채취된 것이다. 상기 샘플로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다. 또한, 상기 샘플로부터 수득한 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.

즉, 본 발명에 따르면, 본 발명의 탐침 DNA(pDNA; probe DNA) 및 라만 염료가 부착된 표지 DNA(iDNA; indicator DNA)로 구성된 이중-가닥 DNA(dsDNA)를 기판(Ag@Au 나노덴드라이트)에 고정화시킨 바이오 센서를, 분석하고자 하는 샘플과 접촉시켰을 때, 상기 샘플 내의 tDNA가 상기 바이오 센서의 pDNA 서열에 대하여 완전 일치(PM; perfect match)하는 서열이라면, 상기 바이오 센서의 pDNA 서열과 tDNA가 혼성화되면서 표지 DNA(iDNA)를 방출하게 되어, 라만 시그널이 감소하거나 매우 약하게 측정된다.

반면, 상기 샘플 내의 tDNA가 단일 염기 미스매치(1 MM; 1 base mismatch) 라면, 상기 바이오 센서의 pDNA 서열과 tDNA가 혼성화되긴 하나, 일부 토홀드 부위만 혼성화되어 표지 DNA(iDNA)는 여전히 남아있게 되어, 라만 시그널이 강하게 측정된다.

따라서, 접촉 전 및 후의 라만 시그널 정도를 비교하여 샘플 내 질환, 특히, 각막이상증의 발병 여부를 확인할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 탐침 DNA(pDNA)가 ACD(BIGH3 유전자 점 돌연변이가 존재하는 염기서열)에 대한 것이고,

(i) 샘플 내 존재하는 표적 DNA(tDNA)가 정상 유전자(BIGH3 유전자 돌연변이가 존재하지 않는 야생형 유전자)라면, ACD pDNA에 대하여 1MM(One base mismatch)이므로, 혼성화가 이루어져도 일부 토홀드 부위만 혼성화되어 표지 DNA(iDNA)는 여전히 남아있게 된다. 이에 따라, 라만 시그널이 강하게 측정되므로, 상기 샘플은 각막이상증, 특히, ACD가 발병되지 않은 상태로 진단할 수 있다.

(ii) 반면, 샘플 내 존재하는 표적 DNA(tDNA)가 ACD(BIGH3 유전자 돌연변이가 존재)라면, ACD pDNA에 대하여 PM(Perfect match)이므로, 혼성화가 이루어지면서 표지 DNA(iDNA)가 방출된다. 이에 따라, 라만 시그널이 점멸하거나 감소 또는 매우 약하게 측정되므로, 상기 샘플은 각막이상증, 특히, ACD가 발병된 상태임을 진단할 수 있다.

상기 표면증강 라만산란(SERS) 시그널은 20 내지 400 mW 에너지로 632 내지 785 ㎚ 파장의 레이저 빛 조사로 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 표면증강 라만산란(SERS) 시그널은 라만 염료의 530~1540 cm^-1 영역의 진동 밴드를 측정하고, 측정시간은 10 분 내지 120 분인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 표적 DNA 검출용 바이오센서는 상기 SERS 방법을 이용함으로써 펨토몰(femto-molar) 농도 수준에서 표적 DNA를 검출할 수 있을 정도로 우수한 효과가 있다.

본 발명의 방법은 상술한 바이오 센서를 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명에 따른 바이오센서는 BIGH3 유전자의 점 돌연변이를 타겟으로 하는 토홀드-매개 DNA 치환 반응 및 표면증강 라만산란 활성을 이용하는 것으로, 라만 시그널의 민감도 및 안정성이 우수하고, 상기 바이오센서를 이용하여 BIGH3 유전자의 점 돌연변이를 검출하는 경우, 단순하고 경제적인 방법으로 우수한 각막 이상증 진단 효과를 나타낸다.

도 1은 Ag-Au 나노덴드라이트를 사용하여 단일 염기 불일치(single-base mismatch, 1MM) tDNA 대 pDNA에 대한 완벽한 매치 (PM) tDNA의 SERS-기반 검출을 나타내는 도이다.
도 2는 합성 tDNA를 이용한 점 돌연변이 검출의 최적화를 보여준다. 도 2a는 토홀드 길이가 2-mer 내지 8-mer일 때 PM tDNA 샘플의 측정 결과이고, 도 2b는 다른 위치에 있는 인식 부위가 있는 3 개의 합성 50-mer tDNA의 측정 결과이며, 도 2c는 4, 23, 36, 47 및 55℃의 혼성화 조건 하에서의 20-mer PM tDNA 샘플의 측정 결과이다. 1MM tDNA 샘플(빨간색 원) 및 tDNA가 없는 완충액(파란색 원)을 측정한 PIC를 비교하였다. 도 2a 및 2b는 20 nM tDNA로 실온에서 1 시간 동안 혼성화를 수행한 결과이다. 도 2c는 200 pM tDNA로 30 분 동안 혼성화를 수행한 결과이다. 도 2d는 4, 23, 36, 46, 55, 65 및 75℃에서의 혼성화 온도에 대한 PICs를 이용한 iDNA의 용융 곡선을 나타냈다.
도 3a는 정제 및 비정제 실제 DNA 샘플(50, 100, 147, 190 및 225-mer)의 PIC 측정 결과를 보여준다. PM(원) 및 1MM (삼각형) tDNA를 측정하였다. 도 3b는 1 fM 내지 100 nM PM tDNA 샘플을 측정할 때 PIC의 변이를 보여준다. 동일한 농도 범위를 갖는 해당 1 MM tDNA 샘플로부터의 결과를 비교하였다. 혼성화는 36℃에서 30 분 동안 10 nM tDNA로 수행하였다.
도 4는 증폭된 실제 동형 접합체(A) 및 이형 접합체(B) tDNA 샘플을 측정하기 위해 정상, ACD, RBCD 및 LCD pDNA를 사용한 혼성화 엄격 실험 결과를 보여준다. 혼성화는 동형 접합체 또는 이형 접합체 샘플의 10 nM 147-mer tDNA로 36℃에서 30 분 동안 수행하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 금 및 은이 코팅된 나노덴드라이트를 이용한 바이오센서의 제조

본 발명자들은 갈바닉 치환반응을 이용한 전기화학 증착법을 이용하여 금 및 은이 코팅된 바이메탈 나노덴드라이트를 제조하였고, 표적 DNA를 효과적으로 검출할 수 있는 바이오센서를 제작하였다.

1-1. 올리고뉴클레오티드의 제작

본 발명자들은 본 발명에 이용된 탐침 DNA(pDNA), 표지 DNA(iDNA) 및 표적 DNA(tDNA)을 설계 및 제작하였다.

표지 DNA의 경우, 탐침 DNA에서 점돌연변이 염기서열에 해당하는 부분 바로 아래 염기서열과 혼성화를 일으키도록 설계하였다. 토홀드 길이를 조정하기 위해서는 표지 DNA와 혼성화되지 않는 부위의 길이를 조절하면 되므로, 즉, 탐침 DNA의 길이를 조절하여 다양한 길이의 토홀드 부위를 생성할 수 있도록 올리고뉴클레오티드를 제작하였다.

ACD 및 정상 DNA를 구별하는 데 이용된 본 발명의 탐침 DNA(pDNA), 표지 DNA(iDNA) 및 표적 DNA(tDNA)의 서열은 표 3에 나타내었다.

			ID	서열 (5' → 3')
탐침 (pDNA)	ACD		T8	HS-(CH₂)₆-TGTACACGGACC ACACGGAG(서열번호 1)
			T6	HS-(CH₂)₆-TGTACACGGACC ACACGG(서열번호 2)
			T4	HS-(CH₂)₆-TGTACACGGACC ACAC(서열번호 3)
			T2	HS-(CH₂)₆-TGTACACGGACC AC(서열번호 4)
표지 (iDNA)				GGTCCGTGTAC-Cy5(서열번호 5)
표적 (tDNA)	정상	ACD pDNA에 대한 1MM(One base mismatch)	20mer	CTCCGTGCGGTCCGTGTACA(서열번호 6)
			50mer-M	CTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGG(서열번호 7)
			50mer-A	GAAGCTGCCGGGCCCCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGCGGTCCGTGTACA(서열번호 8)
			50mer-B	CTCCGTGCGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCA(서열번호 9)
	ACD	ACD pDNA 에 대한 PM(Perfect match)	20mer	CTCCGTGTGGTCCGTGTACA(서열번호 10)
			50mer-M	CTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGTGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGG(서열번호 11)
			50mer-A	GAAGCTGCCGGGCCCCTCAGGCCTCAGCTTCTCCGTGTGGTCCGTGTACA(서열번호 12)
			50mer-B	CTCCGTGTGGTCCGTGTACAGCTGAGTGGTGGTGGATCCAACGACTCCCA(서열번호 13)

밑줄은 pDNA 내의 iDNA와의 혼성화 영역을 나타낸다. 점 돌연변이 서열은 굵은 문자로 지정된다.

1-2. 탐침 DNA 및 라만 염료(Raman dye)가 결합된 표지 DNA의 혼성화물의 제조

상기 실시예 1-1에서 제작된, 5'-말단에 티올 기능기를 포함하는, 14-20 개의 염기서열로 이루어진 탐침 DNA, 및 3'-말단에 연결 사슬 분자를 통하여 라만 염료인 Cy5가 결합된, 11 개의 염기서열을 갖는 표지 DNA를 완충용액 상에서 교반함으로써, 상보적으로 결합된 탐침 DNA 및 표지 DNA의 혼성화물을 제조하였다.

1-3. 금 및 은의 바이메탈 나노덴드라이트의 제조

먼저, 은 나노덴드라이트 구조체를 증착하기 위하여 얇은 티타늄 호일을 1X2 cm로 절단한 후, 10 mM 질산 은, 1 M 시트르산 용액에 1cm 깊이로 담궜다. 상기 티타늄 호일은 작업전극에, 백금전극은 상대전극에, 은/염화은 전극은 기준전극 위치에 두고, 450 uA의 전류를 780초 동안 가해주면, 은 이온이 은으로 환원되어 티타늄 호일에 덴드라이트 구조를 가지며 증착된다. 이러한 기판을 교반되고 있는0.1 mM 염화금산 용액에 담그면, 은보다 금의 환원성이 더 크기 때문에 구조체 표면의 은이 산화되고, 금이 환원되어 원자간 치환반응이 발생한다. 이러한 갈바닉 치환 반응을 1 내지 12분 동안 유지하여 구조체의 금의 원자 비율을 조절하였다.

1-4. 바이메탈 나노덴드라이트에 DNA 혼성화물의 결합

상기 실시예 1-2에서 제조한 탐침 DNA 및 표지 DNA의 혼성화물 용액에 상기 실시예 1-3에서 제조한 금 및 은의 바이메탈 나노덴드라이트를 담금으로써, 상기 혼성화물을 나노덴드라이트의 표면에 자발적으로 결합시켰다.

실시예 2. 바이오센서를 이용한 표적 DNA의 검출 방법

상기 실시예 1에서 제조된 바이오센서 및 라만 시그널을 이용하여, 표적 DNA을 검출하였다.

2-1. 바이오센서 내의 표지 DNA를 표적 DNA로 치환

상기 실시예 1에서 제조된 바이오센서를 표적 DNA 용액에 담그면, 상기 탐침 DNA 및 표지 DNA의 혼성화물에서 치환 반응이 발생하여, 탐침 DNA의 3' 말단에 6 내지 7개의 단일염기 사슬에 표적 DNA가 혼성화되기 시작한다. 상기 표적 DNA는 상기 탐침 DNA와 완전한 상보적 결합을 하는 염기 서열을 가지므로, 혼성화가 염기 순서대로 차례로 진행되어 본래 붙어있던 표지 DNA를 밀어낸다. 이러한 반응은 가역반응이나, 모든 표적 DNA가 탐침 DNA와 결합하면, 치환 반응은 비가역적으로 되므로, 표지 DNA가 떨어진 양을 확인함으로써, 표적 DNA의 양을 측정할 수 있다.

2-2. 라만 시그널의 측정

라만 측정은 카이저 옵틱스 라만 현미경 통합시스템을 이용하여 이루어졌다. 20 내지 400 mW의 레이저 출력을 가지는 여기원으로서, λ=785 nm의 다이오드 레이저를 사용하였다. 시료에 초점을 맞추기 위해서 10X 대물렌즈 및 10X 카메라 이미징 시스템을 사용하였다. 레이저 조사 후, 기판에서 산란된 빛 무리를 홀로그래픽 회절발을 이용하여 분해하고, 열전기적으로 냉각되는 고체 촬상 소자 검출기를 이용하여 라만 스펙트럼을 수집하였다.

상기 바이오센서를 이용한 표적 DNA의 검출방법을 도 1에 나타내었다.

실험예 1. 바이오센서에 의한 표적 DNA의 검출 확인 및 표적 DNA의 검출을 위한 바이오센서의 최적화

본 발명자들은 실시예 1에 따라 제조한 바이오센서의 표적 DNA의 검출 최적화 조건을 확인하기 위해, 혼성화된 표지 DNA를 표적 DNA(tDNA)로 치환한 후의 라만 시그널 변화를 측정하였다.

1-1. 토홀드 영역 길이에 따른 최적화

본 발명자들은 표적 DNA를 검출하는 데 최적화된 바이오센서를 선별하기 위하여, 실시예 1에 따라 제작된 바이오센서의 토홀드 영역을 조절하여 이에 따른 라만 시그널 변화를 측정하였다.

즉, DNA 혼성화를 일으키는 이중-가닥 이합체(duplex) 말단의 혼성화되지 않은 염기 영역(toehold)을 사용하는 토홀드-매개 DNA 치환 반응은 혼성화를 위한 열역학 추진력을 제공하여 반응이 효소적 도움없이 실온에서 진행되도록 하므로 DNA 검출에 유리하다. 센서로서, 탐침 프로브인 탐침 DNA(pDNA; probe DNA) 및 라만 리포터(Cy5)가 부착된 표지 DNA(iDNA; indicator DNA)로 구성된 이중-가닥 DNA(dsDNA)를 Ag@Au 나노덴드라이트에 고정화시켰다. pDNA 서열은 tDNA와 완벽하게 일치(PM; perfect match)하며, iDNA는 점 돌연변이의 위치까지는 포함하지 않아서 tDNA의 인식을 위한 선택성을 제공한다. 나노덴드라이트상에서의 이합체의 결합(Conjugation)은 표면 근처에 라만 리포터를 위치시키게 되고 라만 시그널을 활성화시킨다. pDNA에 대한 tDNA의 접근은 토홀드-매개 치환을 통해 전혼성화된(prehybridized) iDNA가 가닥으로부터 멀어지도록 한다. iDNA의 방출은 라만 시그널을 감소시킨다. 1MM tDNA가 존재하면 iDNA는 방출되지 않고 초기 라만 시그널이 유지된다.

본 SERS-기반 센서는 네 가지 pDNAs(정상, ACD, RBCD 및 LCD)를 이용하여 타겟 정보를 식별할 수 있는 이진 센싱 시스템(binary sensing system)으로서, 분석하고자 하는 샘플에 본 발명의 pDNA와 혼성화되는(완전히 일치하는) PM tDNA가 존재하는 지 여부를 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 SERS-기반 센서의 가장 중요한 분석 장점 중 하나는 pDNAs를 기반으로 하여 PM tDNA와 1MM tDNA를 구별할 수 있다는 것이다. 즉, (i) BIGH3의 점 돌연변이(ACD, RBCD, 또는 LCD tDNA)가 각 pDNA(ACD, RBCD, 또는 LCD pDNA)에 대하여 PM(Perfect match; 완전 일치)인 PM tDNA인 경우, 혼성화되면서 iDNA가 방출되어 라만 시그널을 잃게 되는 반면, (ii) 각 pDNA에 대하여 1MM(One base mismatch; 단일 염기 불일치)인 1MM tDNA인 경우에는 일부만 혼성화되면서 iDNA가 방출되지 않고 존재하게 되어 라만 시그널이 유지된다.

예컨대, ACD tDNA는 ACD pDNA에 대해서만 센서의 시그널의 감소를 나타내나, ACD tDNA는 그외 다른 프로브(정상, RBCD 또는 LCD tDNA)에서는 시그널의 감소를 나타내지 않는다.

기준 치환의 동역학은 토홀드의 길이 및 서열에 따라 달라지므로, 토홀드 최적화 조건을 확인하기 위하여, 2-, 4-, 6-, 8-mer 길이의 토홀드 구조물(각각 T2, T4, T6 및 T8로 지정)을 제작하여 실험하였다. 이러한 토홀드들을 제작하기 위하여, 14-, 16-, 18-, 및 20-mer pDNAs(각 서열번호 4 내지 1)를 제작하였고, 11-mer iDNA는 pDNAs를 기준으로 12 번째 염기를 통해 두번째에 전혼성화시켰다(도 2a). 상술한 pDNAs, iDNA 및 tDNA의 서열은 표 3에 나타내었다.

20 nM PM tDNA 샘플(20-mer)의 측정 전후 PICs(Percent intensity changes)는 1,468cm^-1 Cy5 밴드를 이용하여 계산하였다. 또한, 1MM tDNA 샘플 및 버퍼(어떤 tDNA도 없음)에 대해 측정된 PICs를 비교하였다. T2의 경우, 짧은 토홀드 길이 때문에 PM tDNA 및 1MM tDNA 간의 구별능(discrimination)이 만족스럽지 못하다. 토홀드 길이가 증가될수록, PM tDNA을 측정하기 위한 PICs도 증가하였다. 이러한 결과는 긴 토홀드일수록 큰 구동력을 제공하여 iDNA를 후속 방출하도록 tDNA을 유치한다는 것을 명백하게 보여준다. 구별능은 18-mer pDNA 및 11-mer iDNA 쌍(T6)일 때 극대화되었다.

따라서, T6 구조일 때 가장 극대화된 구별 결과를 확인하였으므로, 이후 실험에는 T6 구조를 이용하였다.

1-2. 인식 부위에 따른 최적화

본 발명자들은 표적 DNA를 검출하는 데 최적화된 바이오센서를 선별하기 위하여, 실시예 1에 따라 제작된 바이오센서의 tDNA 인식 부위를 조절하여 이에 따른 라만 시그널 변화를 측정하였다.

실제 DNA 샘플은, 50-mer보다 긴 tDNA가 일반적으로 사용된다. 긴 tDNA에서 토홀드 인식 부위의 위치는 검출 효능에 영향을 줄 수 있다. T6 구조를 사용하여 서로 다른 위치에 인식 부위가 있는 3 개의 합성 50-mer tDNA를 제작하였다(도 2b). 50-mer M은 거의 중간에 인식 부위를 가지므로, 혼성화 후에 상부와 하부가 유리(free) DNA 쇄가 되었다. 50-mer A와 50-mer B는 각각 tDNA의 하부와 상부에 인식 부위를 가지므로 혼성화 후에 각각 상부 및 하부가 유리 DNA 쇄가 된다.

PM 50-mer M 및 PM 50-mer A를 사용한 측정에서, 해당 1MM tDNA의 구별이 명확했다. 1MM 50-mer B의 측정에 대한 PIC는 PM 50-mer B의 측정에 대한 PIC와 유사했다. 1MM 50-mer B의 바닥에서 더 긴 유리 쇄는 보고된 바와 같이 나노덴드라이트 표면에 보다 쉽게 흡착되었고, 강한 열역학적 추진동력을 제공하여 iDNA가 치환되어 이에 따라 1MM 서열의 존재가 무시된다. 따라서, 중간에 토홀드-인식 부위가 있는 tDNA는 토홀드 영역에 의해 인식되고 혼성화된 후 양쪽에서 유리 DNA 쇄에 의해 균형잡힌 열역학 상태를 만들 수 있다.

1-1. 토홀드 영역 길이에 따른 최적화

본 발명자들은 표적 DNA를 검출하는 데 최적화된 바이오센서를 선별하기 위하여, 실시예 1에 따라 제작된 바이오센서의 최대 검출 민감도를 유도하기 위한 최적 온도를 결정하였다.

20-mer tDNA와 T6 토홀드 구조를 사용하여 4, 23, 36, 47 및 55℃의 혼성화 온도에서 PIC를 실험하였다(도 2C). 23℃에서, 1 MM 구별이 가능했으나, 36℃에서의 혼성화는 1MM 구별을 최대화시켰다. 36℃ 이상의 온도에서, PM tDNA의 측정에 대한 PIC가 증가한 반면, 1MM tDNA는 또한 iDNA의 낮은 용융 온도(Tm)로 인해 큰 시그널 변화를 유도하였다. 도 2d에 4, 23, 36, 46, 55, 65 및 75℃에서의 혼성화 온도에 대한 PICs를 사용하여 iDNA의 용융 곡선을 나타냈다. 오차 막대는 각 온도에서 45 회의 관측치에 대한 표준 편차를 나타낸다. 계산된 iDNA의 Tm은 57℃였고, 이는 상승된 온도에서의 iDNA의 비특이적 방출을 설명한다. 저온(3℃)에서 1MM tDNA의 PIC 값의 증가는 아마도 열에너지가 1MM 서열을 구별하기에 너무 낮았기 때문인 것으로 판단된다. 혼성화 과정에는 다양한 부분 안정 상태와 부분 혼성화 상태가 있다. 3℃에서 부분 혼성화 상태의 에너지 장벽을 극복하기에는 열 에너지가 너무 낮을 수 있다. 따라서, DNA 혼성화는 이 조건 하에서 잠재적으로 일어나며, 이는 1MM 서열의 구별을 방지하고 3℃에서 1MM tDNA의 PIC를 증가시킨다. 36℃에서 30 분(10, 20, 30, 45 및 60 분 시험) 반응을 수행하여 1 MM 구별을 최대화시켰다. 모든 후속 DNA 혼성화는 36℃에서 30 분에 걸쳐 수행되었다.

50, 100, 147, 190 및 225-mer의 다양한 쇄 길이를 갖는 tDNA를 포함하는 5 개의 정제 및 비정제 실제 샘플을 제작하고 최적의 조건에서 측정하였다. tDNA의 농도는 10 nM이며, 이는 PCR-증폭 샘플의 10⁵ 배 희석에 해당한다(도 3a). PM(원)과 1MM tDNA(삼각형) 사이의 구별은 tDNA 길이가 147-mer까지 증가함에 따라 향상되었다. 이전에 보고된 바와 같이 tDNA의 분자간 2 차 구조가 DNA 혼성화에 영향을 미쳤을 수 있기 때문에 더 긴 길이에서 구별이 악화되었다. 147-mer tDNA는 정제된 샘플 및 비정제샘플을 모두 측정 할 수 있는 최상의 차별성을 나타냈다. 측정은 신뢰할 만 했으며 비정제 샘플의 효소, 염 또는 프라이머에 의해 방해받지 않았다. tDNA 농도(100 fM에서 100 nM 범위) 대 PIC의 반응 곡선으로부터 계산된 검출 한계(LOD)는 약 400 fM이었다(도 3b). 우수한 재현성(평균 상대 표준 편차(RSD): 10.2%)과 민감도는 Ag@Au 바이메탈 나노덴드라이트의 사용에 기인한 것으로, 안정성을 위해 Au의 장점을 포함하고 덴드라이트 구조에서 민감성을 위해 Ag를 사용했다. 또한, 테라스에서 모서리와 각도의 높은 집단 때문에 많은 핫스팟을 제공했다.

한편, 표 4에 50, 100, 147, 190 및 225-mer tDNA의 제작에 이용된 프라이머 서열들을 나타내었다.

ID	서열 (5' → 3')
50Fw	CCACCACCACTCAGCTGT(서열번호 14)
100Re	CTCAGGCCTCAGCTTCTC(서열번호 15)
Exon4Fw2	TGCAGCCCTACCACTCTCAA(서열번호 16)
Exon4Fw	AGCCCTACCACTCTCAAACC(서열번호 17)
Exon4Re	CAGGCCTCGTTGCTAGGG(서열번호 18)
Ori4Fw	CCCCAGAGGCCATCCCTCCT(서열번호 19)

BIGH3-관련 CD는 질병을 일으키는 단일 돌연변이 대립 유전자를 필요로 하는 상 염색체 우성 장애이다. 임상 상황에서는 두 대립 유전자의 유전적 돌연변이가 확인되어야 한다. 따라서 정상 및 동형 접합체 또는 이형 접합체 ACD, RBCD 및 LCD 샘플을 사용하여 진단 효능을 평가했다. 동형 접합체는 두 개의 동일한 대립 유전자를 갖는 유전자형을 의미하고 이형 접합체는 주어진 유전자좌에서 두 개의 다른 대립 유전자를 의미한다. 모호한 증상을 가진 이형 접합체 ACD 환자에서 LASIK 후에 필연적인 시각 상실이 발생할 수 있기 때문에 이형 접합체 샘플을 진단하는 것이 중요하다. 또한, 두 경우 모두에서 iDNA가 방출되지 않고 라만 시그널이 유지되기 때문에 1MM tDNA의 존재 및 tDNA 부재를 구별하는 것이 중요하다. 이것은 tDNA가 증폭되지 않을 때 중요할 수 있으며, 이는 1MM tDNA로 오진될 수 있다. 본 센서는 4 개의 프로브를 동시에 실험함으로써 이 문제를 방지한다. tDNA 부재의 경우, 임의의 프로브에 대해 시그널 변화가 관찰되지 않았지만, 1MM tDNA의 경우 적어도 하나의 프로브에서 시그널 변화가 있을 것이다.

연구 참여자 혈액 샘플로부터 준비된 실제 tDNA 샘플을 측정하였다. 본 시스템을 사용하여 참가자의 DNA를 검사하기 위해 지원 정보에서 설명한대로 참가자의 게놈 DNA에서 돌연변이된 부위를 포함하는 147-mer 부위를 증폭시켰다. 30% 이상의 PIC는 예 Y)로 분류되었고 다른 범주는 아니요(N)로 분류되었다. 동형 접합체 환자의 증폭된 tDNA 샘플은 해당 각막 질환에 대한 각 프로브에 대한 시그널만 나타날 것이다. 그러나 이형 접합체 샘플은 정상적인 대립 유전자와 하나의 돌연변이 대립 유전자를 포함하고 있기 때문에 이형 접합체 환자로부터 증폭된 tDNA 샘플은 질환에 대한 정상 및 각 프로브 모두에 대한 신호를 나타낼 것이다. 4 개의 동형 접합체 tDNA(정상, ACD, RBCD, LCD)를 측정하기 위해 각 pDNA 유형을 사용하는 혼성화 엄격 테스트의 결과를 도 4a에 나타내었다. 시그널은 정상 pDNA-정상 tDNA, ACD pDNA-ACD tDNA, RBCD pDNA-RBCD tDNA 및 LCD pDNA-LCD tDNA와 같이 쌍이 일치한 경우에만 Y였다. 이 결과는 이 방법이 BIGH3 유전자의 1 MM을 구별한다는 것을 보여준다. 실제 tDNA 샘플에서, 이형 접합체 환자에서 1MM을 찾는 것은 환자 샘플이 대부분 이형 접합이기 때문에 중요하다. 측정시 정상 pDNA 및 해당 pDNA의 경우 PIC는 Y일 것으로 예상하였다. 이형 접합체 CD 샘플의 시그널은 정상 및 해당 CD pDNA 모두에 대해 Y였다(도 4b). 이 결과는 임상 샘플을 사용하여 이형 접합체 및 동형 접합체 CD에 대한 진단 능력을 나타낸다.

결론적으로, 본 발명자는 일반적인 CD를 일으키는 BIGH3 유전자의 DNA 점 돌연변이의 신속하고 민감한 검출을 위해 Ag@Au 바이메탈 SERS 센서 유형을 제시하였다. 이 바이메탈 SERS 센서는 용액 매트릭스(예: 효소, 단백질, 프라이머, 염 등)의 간섭을 무시하고 우수한 재현성(RSD=10.2%), 민감도(약 400fM) 및 빠른 속도 (<30 분)로 ACD, RBCD 및 LCD를 일으키는 동형 접합체 및 이형 접합체 돌연변이를 성공적으로 검출할 수 있다. 이것은, 본 방법을 사용하여 DNA 점 돌연변이를 검출하고 유전 질환을 진단하는 첫 번째 예이며, 이는 실제 샘플로 SERS 시스템을 사용하는 이전에 보고된 점 돌연변이 검출보다 우수하다. 따라서, 본 발명의 SERS 센서는 BIGH3 유전자의 점 돌연변이를 선택적으로 민감하게 검출할 수 있는 새로운 진단 플랫폼으로 유용할 것이다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Biosensors for Diagnosing Corneal Dystrophies and Uses Thereof <130> PNUIUCF1-313p <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDNA <400> 1 tgtacacgga ccacacggag 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDNA <400> 2 tgtacacgga ccacacgg 18 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDNA <400> 3 tgtacacgga ccacac 16 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pDNA <400> 4 tgtacacgga ccac 14 <210> 5 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iDNA <400> 5 ggtccgtgta c 11 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tDNA <400> 6 ctccgtgcgg tccgtgtaca 20 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tDNA <400> 7 ctcaggcctc agcttctccg tgcggtccgt gtacagctga gtggtggtgg 50 <210> 8 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tDNA <400> 8 gaagctgccg ggcccctcag gcctcagctt ctccgtgcgg tccgtgtaca 50 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tDNA <400> 9 ctccgtgcgg tccgtgtaca gctgagtggt ggtggatcca acgactccca 50 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tDNA <400> 10 ctccgtgtgg tccgtgtaca 20 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tDNA <400> 11 ctcaggcctc agcttctccg tgtggtccgt gtacagctga gtggtggtgg 50 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tDNA <400> 12 gaagctgccg ggcccctcag gcctcagctt ctccgtgtgg tccgtgtaca 50 <210> 13 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tDNA <400> 13 ctccgtgtgg tccgtgtaca gctgagtggt ggtggatcca acgactccca 50 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 50Fw <400> 14 ccaccaccac tcagctgt 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 100Re <400> 15 ctcaggcctc agcttctc 18 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon4Fw2 <400> 16 tgcagcccta ccactctcaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon4Fw <400> 17 agccctacca ctctcaaacc 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon4Re <400> 18 caggcctcgt tgctaggg 18 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ori4Fw <400> 19 ccccagaggc catccctcct 20

Claims

다음을 포함하며, BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 A로 치환된 점 돌연변이; BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 T로 치환된 점돌연변이; 또는 417 번째 염기 C가 T로 치환된 점 돌연변이에 의해 유발되는 각막이상증 진단용 바이오센서:
(a) 3'-말단에 6 개의 뉴클레오티드로 이루어진, 라만 염료(Raman dye)가 결합된 표지 DNA(iDNA)와 혼성화되지 않는 염기 영역인 토홀드 영역(toehold region)을 포함하며, BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 A로 치환된 점 돌연변이; BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 T로 치환된 점돌연변이; 또는 417 번째 염기 C가 T로 치환된 점 돌연변이를 타겟팅하는 탐침 DNA(pDNA); 및 서열번호 5에 기재된 염기서열로 표시되는 라만 염료(Raman dye)가 결합된 표지 DNA(iDNA)의 혼성화물로서,
상기 탐침 DNA(pDNA) 및 표지 DNA(iDNA)는 염기서열의 상보적인 결합에 의해 혼성화되고, 상기 혼성화는 36℃에서 30 분 동안 실시되며; 및
(b) 상기 혼성화물의 탐침 DNA가 고정화된 금속 기판.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 금속 기판은 금(Au), 은(Ag), 동(Cu), 알루미늄(Al), 백금(Pt), 니켈(Ni) 및 아연(Zn)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 각막이상증 진단용 바이오센서.
제5항에 있어서,
상기 금속 기판은 마름모형, 정사각형, 직사각형, 원형 및 덴드라이트(dendrite) 형으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 구조로 형성되는 것을 특징으로 하는, 각막이상증 진단용 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 탐침 DNA는 -SH, -CHO, -COOH 또는 -NH₂ 기에 의해 상기 금속 기판 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는, 각막이상증 진단용 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 라만 염료는 시아닌(Cy3, Cy3.5, 또는 Cy5), 크산틴(xanthines), 로다민6G, 로다민 B 이소티오시아네이트(RBITC), 아데닌, 4-아미노-피라졸(3,4-d)피리미딘, 2-플루오로아데닌, N6-벤조일아데닌, 키네틴, 디메틸-알릴-아미노-아데닌, 제아틴(zeatin), 브로모-아데닌, 8-아자-아데닌, 8-아자구아닌, 6-머캅토퓨린, 4-아미노-6-머캅토피라졸로(3,4-d)피리미딘, 8-머캅토아데닌, 9-아미노-아크리딘 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 각막이상증 진단용 바이오센서.
삭제
제1항에 있어서, 상기 각막이상증은 ACD(Avellino corneal dystrophy), RBCD(Reisec-Bucklers corneal dystrophy), LCD(lattice corneal dystrophy type I), 과립각막이상증(granular corneal dystrophy), 티엘-벤케 각막이상증(Thiel-Behnke corneal dystrophy), 상피기저막 각막이상증(epithelial basement membrane corneal dystrophy) 및 그로에노우브 각막이상증(Groenouw type corneal dystrophy)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 각막이상증 진단용 바이오센서.
제1항, 제5항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항의 바이오센서를 포함하며, BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 A로 치환된 점 돌연변이; BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 T로 치환된 점돌연변이; 또는 417 번째 염기 C가 T로 치환된 점 돌연변이에 의해 유발되는 각막이상증 진단용 조성물.
제1항, 제5항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항의 바이오센서를 포함하며, BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 A로 치환된 점 돌연변이; BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 T로 치환된 점돌연변이; 또는 417 번째 염기 C가 T로 치환된 점 돌연변이에 의해 유발되는 각막이상증 진단용 키트.
다음 단계를 포함하며, BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 A로 치환된 점 돌연변이; BIGH3(GenBank ID OMIM 601692)의 418 번째 염기 G가 T로 치환된 점돌연변이; 또는 417 번째 염기 C가 T로 치환된 점 돌연변이에 의해 유발되는 각막이상증 진단을 위한 정보 제공 방법:
(a) 분석하고자 하는 대상의 생물학적 샘플을 준비하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 샘플과 제1항, 제5항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 따른 바이오 센서를 접촉시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 접촉 전 및 후의 표면증강 라만산란(SERS) 시그널을 측정하는 단계.