JP2001021561A - 検出素子、それを用いた測定方法、検出装置、およびその分析方法、分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】生体物質の親和性を利用した分析を行うための
検出素子、それを用いた測定方法および検出装置とその
分析方法、分析装置を提供し、高感度分析および測定時
間の短縮を可能にすること。 【解決手段】極性を有する官能基で置換された坦持層
に、分析標的物質の捕捉物質を結合させることと、被験
試料溶液のpHを変えて被験試料中の両性イオンである標
的物質の荷電を、極性を有する官能基で置換された坦持
層と逆に荷電させることにより、捕捉物質を結合した坦
持層への標的物質拡散速度の上昇を達成し、その結果、
坦持層中での捕捉物質・標的物質結合がより均一に誘起
されることで、結合頻度が上昇することから、適当な検
出方法・手段と組み合わせて、高感度分析および測定時
間の短縮を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】［発明の分野］本発明は、被験試料に対
する捕捉物質を結合する担持層を有する検出素子、それ
を用いた測定方法、および検出装置、さらにはそれを利
用した分析方法、分析装置に関する。

【０００２】［背景技術］従来より、生体物質の親和性
を利用した分析、特に免疫センサの領域では、被験試料
中の標的物質を捕捉物質（主に抗体）をセンサ素子上に
担持する場合に、適当なポリマーやゲルに固定化する方
法が採用されている（特開昭５３−１４９３９４、特表
平４−５０１６０５、Ｗａｙｎｅ Ｒ等（１９８６
年）、Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌ１，ｃｈａｐｔｅｒ
５，ｐａｇｅ９５−１２６など）。用いられたヒドロゲ
ルとしては硝酸セルロース、デキストラン、ポリメタク
リル酸などがあり、センサシステムとしては、ＦＥＴセ
ンサ、レゾナントミラーセンサ、表面プラズモン共鳴セ
ンサなどが用いられている。この方法は、センサ素子の
単位面積あたりの捕捉物質担持持量を高めるために有効
であるとされてきた。実際、センサ素子表面に２次元的
に捕捉物質を担持した場合よりも、検出感度が上昇する
という報告もある（Ｉｎｇｅｍａｒ Ｌｕｎｄｓｔｒｏ
ｍ（１９９４年）、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆ Ｂｉｏｅ
ｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，ｖｏｌ９，ｐａｇｅ７２５−７
３６、ＢｏＬｉｅｄｂｅｒｇ（１９９５年）、Ｂｉｏｓ
ｅｎｓｏｒｓ ＆ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，
ｖｏｌ１０，ｐａｇｅ１−９など）。

【０００３】このような構造のセンサ素子は、微視的に
は素子表面がある一定濃度のポリマーやゲルに覆われて
おり（水溶液と接触して膨潤した場合には数％程度のヒ
ドロゲル濃度となる場合もありうる。）、被験試料溶液
や緩衝液と接触させた場合にも、これらのヒドロゲルが
共存する溶液となっている点が、２次元的に捕捉物質を
担持したセンサ素子とは異なっている。このような状況
で、標的物質が捕捉物質と結合する場合には、これらの
ヒドロゲルが共溶解した被験試料溶液中に移動していく
ことになる。このような場合、高分子物質の含まれる溶
液中では物質移動速度が低下する。特に、免疫分析の標
的物質になることの多い蛋白質などは、それ自体も高分
子であるため、センサ素子表面への接近には、センサ素
子表面のヒドロゲルの影響を受けている。実際、センサ
素子表面での捕捉物質と標的物質の結合をリアルタイム
にモニタリングして、結合速度、解離速度、親和性など
を測定する、いわゆる動力学的分析を行う場合には、こ
のヒドロゲルの存在は、動力学的分析結果に影響を与
え、通常の緩衝液、体液などにおける値と乖離すること
が知られている。このような影響を最小にするため、被
験試料溶液をセンサ素子表面へ導く流速を上げ、ヒドロ
ゲルへの標的物質の移動を高めるような対策が講じられ
ている。

【０００４】このようなヒドロゲルの生体親和性に対す
る動力学的な影響は、エンドポイント法で被験試料中の
標的物質を測定する場合にも問題となる場合がある。こ
のような状況では、標的物質は主にセンサ素子上のヒド
ロゲル層の上部で捕捉物質と結合する可能性が高く、よ
りセンサ素子表面に近い部分へは接近しづらくなると考
えられる。そのため、感度を上昇させるためには被験試
料とセンサ素子の接触時間を長くする必要があった。

【０００５】

【発明の概要】本発明者らはこのような状況を打開する
ために研究を重ねた結果、極性を有する官能基で置換さ
れた担持層に分析標的物質の捕捉物質を結合させること
と、被験試料溶液のｐＨを変えて被験試料溶液中の両性
イオンである標的物質を、担持層に置換された極性を有
する官能基と逆に荷電させることで、標的物質移動速度
を高め、かつヒドロゲルに非特異的に吸着した標的物質
を解離させることができれば、結果として、標的物質の
検出信号が増強されうる可能性があると考えた。つま
り、ヒドロゲルが負に荷電している場合は、被験試料溶
液のｐＨを標的物質の等電点よりも低くして標的物質を
正に荷電させ、また、ヒドロゲルが正に帯電している場
合は、被験試料溶液のｐＨを標的物質の等電点よりも高
くして標的物質を負に荷電させることにより、物質移動
速度の向上を計り、また、反応後、標的物質をヒドロゲ
ルに置換された極性を有する官能基と同じ符号に荷電さ
せれば、標的物質とヒドロゲルの非特異的吸着を最小限
に抑制する事ができるという着想に至った。

【０００６】本発明はかかる着想を実現するためのもの
である。具体的にはヒドロゲルを担持させるという原理
に基づいた構造を有する検出素子、検出素子表面を平衡
化する緩衝液と被験試料溶液のｐＨを最適化する測定方
法、および検出装置さらに分析方法、分析装置への広範
な応用に関するものである。この原理に基づく検出素子
および、測定方法は、ヒドロゲル中での標的物質と捕捉
物質との結合を均一化、最適化できるため、種々のトラ
ンスデューサーと連結させたセンサ素子、適切な標識物
質を利用した免疫分析、特に２次抗体を用いたサンドイ
ッチ法と呼ばれるカテゴリーに近縁の分析を行うための
場、つまり検出素子として高い感度を有することにな
り、測定時間の短縮を可能にする。

【０００７】

【発明の具体的説明】［ヒドロゲルを用いた検出素子の
基本構成］本発明によるヒドロゲルがカルボキシル基を
含む官能基で置換されている検出素子および測定方法の
概念を図１、図２に示す。図１において、本発明による
検出素子は、適当な支持体上にカルボキシル基を含む官
能基で置換されているヒドロゲルが担持されている。ヒ
ドロゲルには適当な方法により捕捉物質が担持されてい
る。被験試料溶液のｐＨを、捕捉物質・標的物質結合の
解離するｐＨ（、およびヒドロゲルのｐＫａ）＜被験試
料溶液のｐＨ＜標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）のように
すると、標的物質は正に荷電し、負に荷電しているヒド
ロゲルに引き寄せられてヒドロゲル中への標的物質の拡
散速度が上昇し、捕捉物質・標的物質複合体の形成が促
進される。逆に、図２において、標的物質のｐＫａ＜洗
浄液のｐＨとなるような洗浄液を通液すると、ヒドロゲ
ルに非特異的に吸着していた標的物質は負に荷電し、ヒ
ドロゲルと静電的に反発して解離する。

【０００８】本発明によるヒドロゲルが１級アミノ基を
含む官能基で置換されている検出素子および測定方法の
概念を図３、図４に示す。図３において、本発明による
検出素子は、適当な支持体上にアミノ基を含む官能基で
置換されているヒドロゲルが担持されている。ヒドロゲ
ルには適当な方法により捕捉物質が担持されている。被
験試料溶液のｐＨを、標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）＜
被験試料溶液のｐＨ＜ヒドロゲルのｐＫａ（ｐＫａ２）
のようにすると、標的物質は負に荷電し、正に荷電して
いるヒドロゲルに引き寄せられてヒドロゲル中への標的
物質の拡散速度が上昇し、捕捉物質・標的物質複合体の
形成が促進される。逆に、図４において、捕捉物質・標
的物質結合の解離するｐＨ＜解離液のｐＨ＜標的物質の
ｐＫａ（ｐＫａ１）となるような解離液を通液すると、
ヒドロゲルに非特異的に吸着していた標的物質は正に荷
電し、ヒドロゲルと静電的に反発して解離する。

【０００９】［検出素子の利用態様］本発明による検出
素子は次のように利用される。

【００１０】捕捉物質を担持した検出素子表面に標的物
質を含んだ被験試料溶液を接触させる。被験試料溶液中
に標的物質が存在すると、検出素子表面に担持した捕捉
物質に捕捉される。この捕捉の程度は、両者の親和性
と、標的物質とヒドロゲルとの親和性、被験試料溶液中
の標的物質の濃度に比例する事、よって、検出素子表面
に捕捉される標的物質の量は、被験試料溶液中の標的物
質の濃度に依存する。標的物質が検出素子表面に捕捉さ
れると、その結合量に依存して、検出素子の屈折率、質
量、キャパシタンス、およびインピーダンスが変化す
る。よって、標的物質について所定の濃度と、屈折率、
質量、インピーダンス、およびキャパシタンスの変化と
の関係を示す検量線をあらかじめ作成し、それに基づい
て検出素子表面に結合する被験試料溶液中の標的物質の
濃度を知る事ができる事になる。

【００１１】被験試料溶液中の標的物質が蛋白質である
場合、通常、弱酸性領域に等電点を持っているため、中
性領域では負に荷電している。そのため、図１に示した
中性領域で負に荷電しているヒドロゲルとは静電的に反
発し、図３に示した正に荷電するヒドロゲルとは静電的
に引き付け合う。したがって、前者の場合、捕捉物質を
結合した担持層への標的物質の拡散が抑制され、その結
果、担持層中での捕捉物質・標的物質結合が、本来誘起
される量よりも減少される事になる。後者の場合、捕捉
物質を結合した担持層への標的物質の拡散が促進され、
その結果、担持層中での捕捉物質・標的物質結合がより
均一に誘起されるため、エンドポイント法で被験試料溶
液中の標的物質を測定する場合に有利であると考えられ
る。しかしながら、標的物質がヒドロゲルに非特異的に
吸着され、実際に起こっている捕捉物質・標的物質結合
よりも過大な信号を読み取ってしまうという欠点があ
る。

【００１２】本発明は、これらの現象における欠点を克
服し、エンドポイント法で被験試料溶液中の標的物質を
測定する場合に被験試料溶液のｐＨを変えて被験試料溶
液中の標的物質の荷電を、極性を有する官能基で置換さ
れた担持層と逆に荷電させることにより、捕捉物質を結
合した担持層への標的物質拡散速度の上昇を達成し、そ
の結果、担持層中での捕捉物質・標的物質結合がより均
一に誘起されることで、結合頻度が上昇することと、標
的物質のヒドロゲルに対する非特異吸着を抑制すること
により、適当な検出方法・手段と組み合わせて、高感度
分析および測定時間の短縮を可能にした。

【００１３】中性領域で負に荷電するヒドロゲルを使用
する場合は、まず、中性緩衝液を検出素子表面に通液
し、ベースラインとなる値を測定する。つぎに、被験試
料溶液のｐＨを、捕捉物質・標的物質結合の解離するｐ
Ｈ＜被験試料溶液のｐＨ＜標的物質のｐＫａ（ｐＫａ
１）となるようにして、被験試料溶液を通液する。この
ｐＨにおいては、標的物質は正に荷電し、ヒドロゲルは
負に荷電しているため、捕捉物質を結合した担持層への
標的物質の拡散速度が上昇し、その結果、担持層中での
捕捉物質・標的物質結合がより均一に誘起される。した
がって、エンドポイント法で被験試料溶液中の標的物質
を測定する場合に得られる信号の量は増大する。続い
て、中性緩衝液を通液すると、非特異的にヒドロゲルに
吸着していた標的物質は負に荷電するため、ヒドロゲル
と静電的に反発して解離する。したがって、このとき得
られる信号は、捕捉物質・標的物質複合体のみに起因し
ているものになる。

【００１４】具体的には、ヒドロゲルにカルボキシメチ
ルデキストランを使用して、ｐＨ６．９のリン酸緩衝液
中でアルブミンの濃度測定を行う場合、溶出液（塩酸）
のｐＨ（１〜２）＜カルボキシメチルデキストランのｐ
Ｋａ（３〜３．５）＜被験試料溶液のｐＨ（４．５）＜
標的物質（アルブミン）のｐＫａ（５．５）＜測定用緩
衝液のｐＨ（６．９）のように、被験試料溶液のｐＨを
決定すれば良い。

【００１５】中性領域で正に荷電するヒドロゲルを使用
する場合は、まず、中性緩衝液を検出素子表面に通液
し、ベースラインとなる値を測定する。つぎに、被験試
料溶液のｐＨを、標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）＜被験
試料溶液のｐＨ＜ヒドロゲルに含まれる官能基のｐＫａ
（ｐＫａ２）となるようにして、被験試料溶液を通液す
る。このｐＨにおいては、標的物質は負に荷電し、ヒド
ロゲルは正に荷電しているため、捕捉物質を結合した担
持層への標的物質の拡散速度が上昇し、その結果、担持
層中での捕捉物質・標的物質結合がより均一に誘起され
る。したがって、エンドポイント法で被験試料中の標的
物質を測定する場合に得られる信号の量は増大する。続
いて、捕捉物質・標的物質結合の解離するｐＨ＜解離液
のｐＨ＜標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）となるような解
離液を通液すると、非特異的にヒドロゲルに吸着してい
た標的物質は正に荷電するため、ヒドロゲルと静電的に
反発して解離する。この後、中性緩衝液を通液して測定
を行うと、得られる信号は、捕捉物質・標的物質複合体
のみに起因しているものになる。

【００１６】具体的には、ヒドロゲルにアミノデキスト
ランを使用して、ｐＨ６．９のリン酸緩衝液中でアルブ
ミンの濃度測定を行う場合、溶出液（塩酸）のｐＨ（１
〜２）＜解離液のｐＨ（４．５）＜標的物質（アルブミ
ン）のｐＫａ（５．５）＜被験試料溶液および測定用緩
衝液のｐＨ（６．９）＜アミノデキストランのｐＫａ
（８〜９）のように、解離液および被験試料溶液のｐＨ
を決定すれば良い。

【００１７】ここで、標的物質と親和性を有する捕捉物
質の具体例としては、蛋白質、ペプチド、抗生物質、色
素、核酸、農薬、微生物、ホルモン、もしくはウイル
ス、またはそれらの構成成分の抗原；これらの抗原を認
識するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組み
換え抗体、一本鎖抗体、もしくはこれら抗体種の改変修
飾体；または活性部位を破壊し結合部位の機能のみを有
する酵素、レクチン、核酸、もしくは生体内のシグナル
伝達に関わるレセプターリガンドなどの生体関連物質が
挙げられる。このような生体関連物質を利用する事で、
本発明による検出素子は、例えば臨床試料を対象とする
場合、蛋白質であればアルブミン、ヘモグロビンなどの
測定が可能となる。また、環境試料を対象とする場合、
環境ホルモン（内分泌撹乱物質）、水、食品中の残留農
薬、抗生物質などの検出や表面抗原を認識する事でサル
モネラ菌、病原性大腸菌などに代表される病原性微生物
の検出が可能となるバイオセンサとして利用できる。

【００１８】さらに、この態様にあって中性緩衝液中で
負に荷電するヒドロゲルを構成する物質は、カルボキシ
ル基、またはスルホニル基を含む官能基からなる群から
選択される基を含んでなる多糖類もしくは有機ポリマ
ー、または前記基を含んでなるモノマーからなるコポリ
マーが挙げられる。さらにこれらの具体例としては、カ
ルボキシルメチル化デキストラン、誘導体化などにより
カルボキシル、スルホニル基のいずれかを含むデキスト
ラン、アガロース、カラギーナン、アルギン酸、でん
粉、ポリガラクチュロン酸、セルロースなどの多糖類、
ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリメタクリ
ル酸、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド等
の有機ポリマー、およびこれらポリマーを構成するモノ
マーのコポリマーが挙げられる。

【００１９】さらに、この態様にあって中性緩衝液中で
正に荷電するヒドロゲルを構成する物質は１級アミノ
基、２級アミノ基、および３級アミノ基を含む官能基か
らなる群から選択される基を含んでなる多糖類もしくは
有機ポリマー、または前記基を含んでなるモノマーから
なるコポリマーが挙げられる。さらにこれらの具体例と
しては、アミノ化デキストラン、誘導体化などにより１
級アミノ基、２級アミノ基、および３級アミノ基のいず
れかを含むデキストラン、アガロース、カラギーナン、
でん粉、セルロースなどの多糖類、ポリビニルアルコー
ル、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド等の
有機ポリマー、およびこれらポリマーを構成するモノマ
ーのコポリマーが挙げられる。

【００２０】このヒドロゲルの厚みは、種々のトランス
デューサーを備えてなる検出装置によって異なり、特に
限定されるものではない。

【００２１】このヒドロゲルの捕捉物質の担持は、その
表面のみならず、ヒドロゲル内部においてなされていて
もよく、またその態様は好ましいものと考えられる。標
的物質は、このヒドロゲル中を拡散して支持体表面近傍
に達する場合、支持体により近い場所で標的物質と捕捉
物質との結合を生じさせる事ができ、より感度の高い測
定が可能となる。

【００２２】上記の利用態様において、標的物質と親和
性を有する捕捉物質は使用者が選択し、使用に先立ちヒ
ドロゲルに担持させる事ができる。すなわち、検出素子
は捕捉物質を担持させない態様で使用者に供給され、使
用者が適宜捕捉物質を選択し、担持させて使用する事が
できる。

【００２３】本発明によれば、検出素子および測定方法
は、以上のような態様で利用されるが、別の観点からす
れば、この検出素子を利用した検出装置、分析方法、分
析装置が提供される。

【００２４】まず、上記の使用態様に対応して、本発明
によれば、被験試料中の標的物質を定量する検出装置が
提供される。この装置は、本発明による検出素子と、捕
捉物質と試料液中の標的物質との結合に由来する屈折率
の変化を観察する手段、捕捉物質と試料液中の標的物質
との結合に由来する質量の変化を観察する手段、捕捉物
質と試料液中の標的物質との結合に由来するキャパシタ
ンスの変化を観察する手段、捕捉物質と試料液中の標的
物質との結合に由来するインピーダンスの変化を観察す
る手段のいずれか一つ以上の手段を備えてなる。

【００２５】また、上記の使用態様に対応して、本発明
によれば、被験試料中の標的物質を定量する分析装置が
提供される。この装置は、本発明による検出素子と被験
試料液と接触させる手段と、各検出装置に固有の変化量
を観察する手段と、検出素子上の捕捉物質と標的物質の
結合を解離させる手段とを備えてなる。

【００２６】さらに、上記の使用態様に対応して、本発
明によれば、被験試料中の標的物質を定量する分析方法
が提供される。この方法は、上記の検出装置に、被験試
料液と接触させる工程と、各検出装置に固有の変化量を
観察する工程と、検出素子上の捕捉物質と標的物質の結
合を解離させる工程とを含んでなる。

【００２７】また、上記の使用態様に対応して、本発明
によれば、被験試料中の標的物質を定量する分析装置が
提供される。この装置は、本発明による検出素子と被験
試料液と接触させる手段と、担持層上に非特異的に吸着
した標的物質のみを解離させる手段と、各検出装置に固
有の変化量を観察する手段と、検出素子上の捕捉物質と
標的物質の結合を解離させる手段とを備えてなる。

【００２８】さらに、上記の使用態様に対応して、本発
明によれば、被験試料中の標的物質を定量する分析方法
が提供される。この方法は、上記の検出装置に、被験試
料液と接触させる工程と、担持層上に非特異的に吸着し
た標的物質のみを解離させる工程と、各検出装置に固有
の変化量を観察する工程と、検出素子上の捕捉物質と標
的物質の結合を解離させる工程とを含んでなる。

【００２９】この使用態様にあって各検出装置に固有の
変化量を観察する方法は、検出素子の捕捉物質と試料液
中の標的物質とを結合させる工程と、標的物質と親和性
を有する標識物質を結合させる工程と、検査素子上に捕
捉された標識物質由来の信号を観察する工程とを含んで
なる。

【００３０】この使用態様にあって検査素子上に捕捉さ
れた標識物質由来の信号を観察するを観察する方法は、
前記標識物質が放射線物質により標識され、前記信号が
放射線量である工程、前記標識物質が酵素により標識さ
れ、前記信号が前記酵素と反応する基質由来の発色、蛍
光または発光のいずれかである工程、前記標識物質が蛍
光物質により標識され、前記信号が蛍光である工程、前
記標識物質が化学発光物質により標識され、前記信号が
発光である工程、のいずれか一つ以上の工程を含んでな
る。

【００３１】また、さらに上記の使用態様に対応して、
本発明によれば、被験試料中の標的物質を定量する分析
装置が提供される。この装置は、上記記載の分析方法を
自動で行う手段と、濃度既知の標的物質を含む標準液を
対象として分析した場合の前記標識物質由来の信号を観
察する手段と、被験試料液中の標的物質を対象として分
析した場合の前記信号を観察する手段と、前記２種類の
信号を比較する事で、被験試料液中の標的物質濃度を算
出する手段とを備えてなる。

【００３２】本発明による上記の使用態様において、検
出素子表面には標的物質が捕捉物質に捕捉されて残る。
この捕捉された標的物質は適当な条件で解離させる事が
できる。例えば、抗原抗体反応を利用している場合、ｐ
Ｈがある範囲にある緩衝液で洗浄する、または、酸、ア
ルカリ溶液で洗浄する事で、抗原および抗体を互いに引
き離す事ができる。このような方法によって標的物質が
その表面から除かれた検出素子は、再度測定に利用する
事ができる。

【００３３】ヒドロゲルへの標的物質に対する捕捉物質
の担持は、ヒドロゲルに含まれる官能基に対応して異な
り、特に限定されるものではないが、捕捉物質に含まれ
る官能基によって、ヒドロゲルに含まれる官能基に化学
結合を介して化学的に結合される。

【００３４】本発明を以下の実施例によってさらに詳細
に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。

【００３５】まず、担持層を担持するための基板を作製
した。支持体としてのガラス基板（１０ｍｍ×８ｍｍ）
を用意し、希硝酸、中性洗剤、および超純水の順で洗浄
した。この支持体上にマグネトロンスパッタリング法に
よって、２ｎｍ厚のクロム接着層を付し、その後で５０
ｎｍ厚の金薄膜を蒸着した。続いて、５ｎｍ厚の二酸化
シリコンを蒸着した。その基板を０．５（ｖ／ｖ）％の
グリシドキシプロピルトリメトキシシラン溶液（溶媒：
イソプロピルアルコール）に室温で５分間浸漬して、表
面に架橋層を形成した。その後、イソプロピルアルコー
ルと水で洗浄した。

【００３６】［実施例１］ 被験試料溶液のｐＨを、被
験試料溶液中の標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）に等しく
したとき、ヒドロゲルが負に荷電する場合の検出素子の
作製（その１）。

【００３７】架橋層を形成した基板を、２３（ｗ／ｖ）
％のデキストラン（分子量５００，０００）水溶液中で
２０時間振盪して、デキストラン層を形成し、その後大
量の水で洗浄した。担持したデキストラン層を、１Ｍヨ
ード酢酸中で４８時間振盪し、デキストランをカルボキ
シメチル化（ＣＭ化）し、その後大量の水で洗浄した。

【００３８】［実施例２］ 被験試料溶液のｐＨを、被
験試料溶液中の標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）に等しく
したとき、ヒドロゲルが負に帯電する場合の検出素子の
作製（その２）。

【００３９】実施例１とは異なる方法でＣＭ化デキスト
ラン層を形成した。まず、４Ｎの水酸化ナトリウムを含
む水溶液を調整した。この水溶液５００ｍｌにデキスト
ラン（分子量５００，０００）４０ｇを添加して、溶解
する。続いて、０．９５Ｍのブロモ酢酸を添加した後、
室温で２０時間攪拌してデキストランをＣＭ化した。反
応溶液を酢酸で中和して、大量のメタノール中に攪拌し
ながら滴下し、析出したＣＭ化デキストランををろ過し
た。さらにＣＭ化デキストランを８０％メタノール水溶
液中で洗浄し、ろ過して得られたＣＭ化デキストランを
水に再溶解し、凍結乾燥して使用直前まで保存した。

【００４０】架橋層を形成した基板を、２３（ｗ／ｖ）
％のＣＭ化デキストラン水溶液中で２０時間振盪して、
ＣＭ化デキストラン層を形成し、その後大量の水で洗浄
した。

【００４１】［実施例３］ アルブミン測定用検出素子
の作製（その１） 実施例１または実施例２で作製した基板のＣＭ化デキス
トランを０．２Ｍのジメチルアミノプロピルカルボジイ
ミド（ＥＤＣ）、および０．０５ＭのＮ−ヒドロキスク
シンイミド（ＮＨＳ）で活性化した後、抗ヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ）抗体を担持した。

【００４２】得られた基板を検出素子とした。

【００４３】［実施例４］ 被験試料溶液のｐＨを、被
験試料溶液中の標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）に等しく
したとき、ヒドロゲルが正に荷電する場合の担持層の作
製 まず、４Ｎの水酸化ナトリウムを含む水溶液を調整し
た。この水溶液５００ｍｌにデキストラン（分子量５０
０，０００）４０ｇを添加して、溶解する。続いて、
０．９５Ｍの２−ブロモエチルアミン・臭化水素酸塩を
添加した後、室温で２０時間攪拌してデキストランをア
ミノ化した。反応溶液を臭化水素酸で中和した後、大量
の水で透析精製し、凍結乾燥して使用直前まで保存し
た。

【００４４】架橋層を形成した基板を、２３（ｗ／ｖ）
％のアミノ化デキストラン水溶液中で２０時間振盪し
て、アミノ化デキストラン層を形成し、その後大量の水
で洗浄した。

【００４５】［実施例５］ アルブミン測定用検出素子
の作製（その２） 実施例４で作製した基板のアミノ化デキストランを１％
のグルタルアルデヒド溶液で活性化した後、抗ＨＳＡ抗
体を担持した。

【００４６】得られた基板を検出素子とした。

【００４７】［実施例６］ ＨＳＡの検出（その１） 実施例３で作製した抗ＨＳＡ抗体を固定化した検出素子
を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した装置に装着
し、ＨＳＡの測定を行った。ここでいうＳＰＲを利用し
た装置とは、被験試料溶液中の標的物質の定量が可能な
センサ装置であって、検出素子表面に担持した捕捉物質
に、標的物質が結合したときの屈折率の変化を観察する
検出装置を備えてなる分析装置である。

【００４８】まず、燐酸緩衝液（ｐＨ６．９；緩衝液の
ｐＨ＞ＣＭ化デキストランのｐＫａ）を検出素子表面に
通液し、そのときの共振角を測定し、ベースラインとし
た。このとき、ＣＭ化デキストランは負に荷電している
次にＨＳＡ溶液（ｐＨ４．５；抗ＨＳＡ抗体・ＨＳＡ複
合体の解離するｐＨ＜ＨＳＡ溶液のｐＨ＜ＨＳＡのｐＫ
ａ）を検出素子表面に一定時間接触させ、素子表面上の
抗ＨＳＡ抗体とＨＳＡを結合させた。このとき、ＣＭ化
デキストランは負に、ＨＳＡは正に荷電しており、互い
に静電的相互作用により引き付け合う。その結果、ＨＳ
Ａと、ＣＭ化デキストランに担持された抗ＨＳＡ抗体と
の結合が促進される。その後、初めに通液した燐酸緩衝
液を用いて洗浄した。このとき、ＣＭ化デキストランは
負に、ＨＳＡも負に荷電しており、互いに静電的に反発
する。その結果、非特異的にＣＭ化デキストランに結合
した、抗ＨＳＡ抗体と結合していないＨＳＡは検出素子
表面上から解離する。したがって、洗浄後の共振角とベ
ースラインでの共振角との差が、検出素子表面の抗体に
結合したＨＳＡ量に起因する共振角変化となる。抗体に
結合したＨＳＡは適当な溶出液（ｐＨ３．０以下の希塩
酸またはグリシン緩衝液）によって解離させる事がで
き、検出表面の再使用を可能にした。

【００４９】以上の操作における共振角の変化は図５に
示される通りであった。

【００５０】また、いくつかのＨＳＡ濃度が既知の試料
を用いて、ＨＳＡ濃度と共振角とを測定した。その結果
は図６Ａに示される通りであった。これを検量線として
用いる事で、濃度未知のＨＳＡ測定を行う事ができる。

【００５１】［実施例７］ ＨＳＡの検出（その２） 実施例５で作製した抗ＨＳＡ抗体を固定化した検出素子
を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した装置に装着
し、ＨＳＡの測定を行った。ここでいうＳＰＲを利用し
た装置とは、被験試料溶液中の標的物質の定量が可能な
センサ装置であって、検出素子表面に担持した捕捉物質
に、標的物質が結合したときの屈折率の変化を観察する
検出装置を備えてなる分析装置である。

【００５２】まず、燐酸緩衝液（ｐＨ６．９；緩衝液の
ｐＨ＜アミノ化デキストランのｐＫａ）を検出素子表面
に通液し、そのときの共振角を測定し、ベースラインと
した。このとき、アミノ化デキストランは正に荷電して
いる 次にＨＳＡ溶液（ｐＨ６．９；ＨＳＡのｐＫａ＜ＨＳＡ
溶液のｐＨ＜アミノ化デキストランのｐＫａ）を検出素
子表面に一定時間接触させ、素子表面上の抗ＨＳＡ抗体
とＨＳＡを結合させた。このとき、アミノ化デキストラ
ンは正に、ＨＳＡは負に荷電しており、互いに静電的相
互作用により引き付け合う。その結果、ＨＳＡと、アミ
ノ化デキストランに担持された抗ＨＳＡ抗体との結合が
促進される。その後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．
５；抗ＨＳＡ抗体・ＨＳＡ複合体の解離するｐＨ＜解離
液のｐＨ＜ＨＳＡのｐＫａ）を用いて洗浄した。このと
き、アミノ化デキストランは正に、ＨＳＡも正に荷電し
ており、互いに静電的に反発する。その結果、非特異的
にアミノ化デキストランに結合した、抗ＨＳＡ抗体と結
合していないＨＳＡは検出素子表面上から解離する。そ
の後、初めに通液した燐酸緩衝液で平衡化して、共振角
を測定した。平衡化後の共振角とベースラインでの共振
角との差が、検出素子表面の抗体に結合したＨＳＡ量に
起因する共振角変化となる。抗体に結合したＨＳＡは適
当な溶出液（ｐＨ３．０以下の希塩酸またはグリシン緩
衝液）によって解離させる事ができ、検出表面の再使用
を可能にした。

【００５３】以上の操作における共振角の変化は図７に
示される通りであった。

【００５４】また、いくつかのＨＳＡ濃度が既知の試料
を用いて、ＨＳＡ濃度と共振角とを測定した。その結果
は図６Ｂに示される通りであった。これを検量線として
用いる事で、濃度未知のＨＳＡ測定を行う事ができる。

【００５５】［参考例］ 従来技術によるＨＳＡ溶液の
検出 実施例３で作製した抗ＨＳＡ抗体を固定化した検出素子
を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用した装置に装着
し、ＨＳＡの測定を行った。ここでいうＳＰＲを利用し
た装置とは、被験試料溶液中の標的物質の定量が可能な
センサ装置であって、検出素子表面に担持した捕捉物質
に、標的物質が結合したときの屈折率の変化を観察する
検出装置を備えてなる分析装置である。

【００５６】まず、燐酸緩衝液（ｐＨ６．９；緩衝液の
ｐＨ＞ＣＭ化デキストランのｐＫａ）を検出素子表面に
通液し、そのときの共振角を測定し、ベースラインとし
た。このとき、ＣＭ化デキストランは負に荷電してい
る。

【００５７】次にＨＳＡ溶液（ｐＨ６．９；ＣＭ化デキ
ストランのｐＫａ＜ＨＳＡのｐＫａ＜ＨＳＡ溶液のｐ
Ｈ）を検出素子表面に一定時間接触させ、素子表面上の
抗ＨＳＡ抗体とＨＳＡを結合させた。このとき、ＣＭ化
デキストランは負に、ＨＳＡも負に荷電しており、互い
に静電的相互作用により反発する。その結果、ＨＳＡ
と、ＣＭ化デキストランに担持された抗ＨＳＡ抗体との
結合が抑制される。その後、燐酸緩衝液（ｐＨ６．９）
を用いて余剰のＨＳＡを洗い流して共振角を測定した。
共振角とベースラインでの共振角との差が、検出素子表
面の抗体に結合したＨＳＡ量に起因する共振角変化とな
る。抗体に結合したＨＳＡは適当な溶出液（ｐＨ３．０
以下の希塩酸またはグリシン緩衝液）によって解離させ
る事ができ、検出表面の再使用を可能にする。

【００５８】また、いくつかのＨＳＡ濃度が既知の試料
を用いて、ＨＳＡ濃度と共振角とを測定した。その結果
は図６Ｃに示される通りであった。

【００５９】実施例６，実施例７で行ったＨＳＡ溶液の
検出は、従来技術による参考例で行ったＨＳＡ溶液の検
出時と比較して検量線の傾きが大きく、検量線から濃度
未知のＨＳＡ溶液を測定する場合に精度の高い測定が可
能となっている。また、低濃度のＨＳＡ溶液を検出する
場合にも従来技術と比較して高い応答が得られるため、
従来技術と比較してより低濃度のＨＳＡ溶液の検出も可
能となっている。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明による検出素子１Ａおよび測定方法１
の好ましい例を示す図である。図１の態様において、検
出素子１Ａは支持体２とその上に形成されたヒドロゲル
３を有し、ヒドロゲル３は負に荷電した官能基４が置換
されている。ヒドロゲル３には捕捉物質５が担持されて
いる。被験試料溶液のｐＨを、捕捉物質５・標的物質６
結合の解離するｐＨ＜被験試料溶液のｐＨ＜標的物質６
のｐＫａ（ｐＫａ１）のようにすると、標的物質６は正
に荷電し、負に荷電しているヒドロゲルに引き寄せられ
てヒドロゲル中への標的物質６の拡散速度が上昇し、捕
捉物質５・標的物質６複合体の形成が促進される。

【図２】 図２の態様において、標的物質６のｐＫａ
（ｐＫａ１）＜洗浄液のｐＨとなるような洗浄液を通液
すると、ヒドロゲルに非特異的に吸着していた標的物質
６は負に荷電し、ヒドロゲルと静電的に反発して解離す
る。

【図３】 本発明による検出素子１Ｂおよび測定方法２
の好ましい例を示す図である。図３の態様において、検
出素子１Ｂは支持体７とその上に形成されたヒドロゲル
８を有し、ヒドロゲル８は正に荷電した官能基９が置換
されている。ヒドロゲル８には捕捉物質１０が担持され
ている。被験試料溶液のｐＨを、標的物質１１のｐＫａ
（ｐＫａ１）＜被験試料溶液のｐＨ＜ヒドロゲルのｐＫ
ａ（ｐＫａ２）のようにすると、標的物質１１は負に荷
電し、正に荷電しているヒドロゲルに引き寄せられてヒ
ドロゲル中への標的物質１１の拡散速度が上昇し、捕捉
物質１０・標的物質１１複合体の形成が促進される。

【図４】 図４の態様において、捕捉物質１０・標的物
質１１結合の解離するｐＨ＜解離液のｐＨ＜標的物質１
１のｐＫａ（ｐＫａ１）となるような解離液を通液する
と、ヒドロゲルに非特異的に吸着していた標的物質１１
は正に荷電し、ヒドロゲルと静電的に反発して解離す
る。

【図５】 実施例６において実施された、本発明による
検出素子に、ＨＳＡ溶液、洗浄液、または溶出液を接触
させたときの共振角の変化を示す図である。

【図６】 実施例６、実施例７および参考例において実
施した、いくつかのＨＳＡ濃度が既知の試料を用いて、
ＨＳＡ濃度と共振角とを測定した結果を示す図である。
Ａは実施例６を、Ｂは実施例７を、Ｃは参考例を表して
いる。これを検量線として用いる事で、濃度未知のＨＳ
Ａ測定を行う事ができる。

【図７】 実施例７において実施された、本発明による
検出素子に、ＨＳＡ溶液、解離液、洗浄液、または溶出
液を接触させたときの共振角の変化を示す図である。

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 溶液中の標的物質に対する捕捉物質を
   担持する担持層が、水溶液中で正、または負に荷電する
   官能基で置換されている事を特徴とする検出素子。
2. 【請求項２】 担持層がヒドロゲルを含む事を特徴と
   する請求項１記載の検出素子。
3. 【請求項３】 ヒドロゲルがカルボキシル、もしくは
   スルホニル基を含んでなる多糖類もしくは有機ポリマ
   ー、または前記基を含んでなるモノマーからなるコポリ
   マーであることを特徴とする請求項１乃至２いずれか一
   項記載の検出素子。
4. 【請求項４】 ヒドロゲルが、１級アミノ基、もしく
   は２級アミノ基、もしくは３級アミノ基を含んでなる多
   糖類もしくは有機ポリマー、または前記基を含んでなる
   モノマーからなるコポリマーであることを特徴とする請
   求項１乃至２いずれか一項記載の検出素子。
5. 【請求項５】 前記捕捉物質が、蛋白質、ペブチド、
   抗生物質、色素、核酸、農薬、微生物、ホルモン、もし
   くはウイルス、またそれらの構成成分の抗原；これらの
   抗原を認識するポリクローナル抗体、モノクローナル抗
   体、組み換え抗体、一本鎖抗体、もしくはこれら抗体種
   の改変修飾体；または活性部位を破壊し結合部位の機能
   のみを有する酵素、レクチン、核酸、もしくは生体内の
   シグナル伝達に関わるレセプターリガンドであることを
   特徴とする請求項１〜４記載の検出素子。
6. 【請求項６】 担持層に担持された捕捉物質に対し
   て、被験試料溶液中の標的物質を結合させてなる測定方
   法において、 被験試料溶液のｐＨを、担持層の官能基のｐＫａ（ｐＫ
   ａ２）と標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）の間の値にした
   ことを特徴とする測定方法。
7. 【請求項７】 捕捉物質・標的物質−複合体の解離す
   るｐＨ＜被験試料溶液のｐＨとすることを特徴とする請
   求項６記載の測定方法。
8. 【請求項８】 担持層の官能基のｐＫａ（ｐＫａ２）
   ＜被験試料溶液のｐＨ＜標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）
   とすることを特徴とする請求項６または７記載の測定方
   法。
9. 【請求項９】 被験試料溶液のｐＨを標的物質のｐＫ
   ａ（ｐＫａ１）に等しくしたとき、担持層の官能基が、
   負に荷電することを特徴とする請求項８記載の測定方
   法。
10. 【請求項１０】 担持層に担持された捕捉物質に対し
    て、標的物質を結合させてなる測定方法において、 請求項１〜３、５に記載の検出素子を使用し、担持層の
    官能基のｐＫａ（ｐＫａ２）＜被験試料溶液のｐＨ＜標
    的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）とすることを特徴とする測
    定方法。
11. 【請求項１１】 標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）＜被
    験試料溶液のｐＨ＜担持層の官能基のｐＫａ（ｐＫａ
    ２）とすることを特徴とする請求項６または７記載の測
    定方法。
12. 【請求項１２】 被験試料溶液のｐＨを、標的物質の
    ｐＫａ（ｐＫａ１）に等しくしたとき、担持層の官能基
    が、正に荷電することを特徴とする請求項１１記載の記
    載の測定方法。
13. 【請求項１３】 担持層に担持された捕捉物質に対し
    て、被験試料溶液中の標的物質を結合させてなる測定方
    法において、 請求項１、２、４、５に記載の検出素子を使用し、標的
    物質のｐＫａ（ｐＫａ１）＜被験試料溶液のｐＨ＜担持
    層の官能基のｐＫａ（ｐＫａ２）とすることを特徴とす
    る測定方法。
14. 【請求項１４】 担持層に担持された捕捉物質に対し
    て、被験試料溶液中の標的物質を結合させてなる測定方
    法において、 被験試料溶液を通液した後、捕捉物質に結合していない
    標的物質を洗い流すための洗浄液を通液するとともに、 洗浄液のｐＨを、担持層の官能基のｐＫａ（ｐＫａ２）
    及び標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）よりも大きい値にし
    たことを特徴とする測定方法。
15. 【請求項１５】 補足物質・標的物質−複合体の解離
    するｐＨ＜標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）とすることを
    特徴とする請求項１４記載の測定方法。
16. 【請求項１６】 担持層の官能基は、洗浄液のｐＨを
    標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）に等しくした場合、負に
    荷電するものであることを特徴とする請求項１４または
    １５記載の測定方法。
17. 【請求項１７】 担持層に担持された捕捉物質に対し
    て、被験試料溶液中の標的物質を結合させてなる測定方
    法において、 被験試料溶液を通液した後、捕捉物質に結合していない
    標的物質を洗い流すための洗浄液を通液するとともに、 請求項１〜３、５に記載の検出素子を使用し、洗浄液の
    ｐＨを、担持層の官能基のｐＫａ（ｐＫａ２）及び標的
    物質のｐＫａ（ｐＫａ１）よりも大きい値にしたことを
    特徴とする測定方法。
18. 【請求項１８】 担持層に担持された捕捉物質に対し
    て、被験試料溶液中の標的物質を結合させてなる測定方
    法において、 被験試料溶液を通液した後、捕捉物質に結合していない
    標的物質を洗い流すための洗浄液を通液するとともに、 洗浄液のｐＨを、担持層の官能基のｐＫａ（ｐＫａ２）
    及び標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）よりも小さい値にし
    たことを特徴とする測定方法。
19. 【請求項１９】 捕捉物質・標的物質−複合体の解離
    するｐＨ＜洗浄液のｐＨとすることを特徴とする請求項
    １８記載の測定方法。
20. 【請求項２０】 担持層の官能基は、洗浄液のｐＨを
    標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）に等しくした場合、正に
    荷電するものであることを特徴とする請求項１８または
    １９記載の測定方法。
21. 【請求項２１】 担持層に担持された捕捉物質に対し
    て、被験試料溶液中の標的物質を結合させてなる測定方
    法において、 被験試料溶液を通液した後、捕捉物質に結合していない
    標的物質を洗い流すための洗浄液を通液するとともに、 請求項１、２、４、５に記載の検出素子を使用し、洗浄
    液のｐＨを、担持層の官能基のｐＫａ（ｐＫａ２）及び
    標的物質のｐＫａ（ｐＫａ１）よりも小さい値にしたこ
    とを特徴とする測定方法。
22. 【請求項２２】 被験試料溶液中の標的物質が、水溶
    液中で正、および負に荷電する２種以上の官能基を有す
    ることを特徴とする請求項６〜２１記載の測定方法
23. 【請求項２３】 請求項６〜２２記載の測定方法に基
    づき、担持層に結合した捕捉物質と被験試料溶液中の標
    的物質との結合に由来する屈折率の変化を観察する検出
    装置。
24. 【請求項２４】 請求項６〜２２記載の測定方法に基
    づき、担持層に結合した捕捉物質と被験試料溶液中の標
    的物質との結合に由来するキャパシタンスの変化を観察
    する検出装置。
25. 【請求項２５】 請求項６〜２２記載の測定方法に基
    づき、担持層に結合した捕捉物質と被験試料溶液中の標
    的物質との結合に由来する質量の変化を観察する検出装
    置。
26. 【請求項２６】 請求項６〜２２記載の測定方法に基
    づき、担持層に結合した捕捉物質と被験試料溶液中の標
    的物質との結合に由来するインピーダンスの変化を観察
    する検出装置。
27. 【請求項２７】 被験試料溶液中の標的物質の定量が
    可能なセンサ装置であって、請求項２３〜２６記載の検
    出装置に、被験試料溶液と接触させる手段と、各検出装
    置に固有の変化量を算出する手段と、担持層上の捕捉物
    質と標的物質の結合を解離させる手段とを備えてなる分
    析装置。
28. 【請求項２８】 被験試料溶液中の標的物質を定量す
    る方法であって、請求項２３〜２６記載の検出装置に、
    被験試料溶液と接触させる工程と、各検出装置に固有の
    変化量を観察する工程と、担持層上の捕捉物質と標的物
    質の結合を解離させる工程とを含んでなる分析方法。
29. 【請求項２９】 被験試料溶液中の標的物質の定量が
    可能なセンサ装置であって、請求項２３〜２６記載の検
    出装置に、被験試料溶液と接触させる手段と、担持層上
    に非特異的に吸着した標的物質のみを解離させる手段
    と、各検出装置に固有の変化量を観察する手段と、担持
    層上の捕捉物質と標的物質の結合を解離させる手段とを
    含んでなる分析装置。
30. 【請求項３０】 被験試料溶液中の標的物質を定量す
    る方法であって、請求項２３〜２６記載の検出装置に、
    被験試料溶液と接触させる工程と、担持層上に非特異的
    に吸着した標的物質のみを解離させる工程と、各検出装
    置に固有の変化量を算出する工程と、担持層上の捕捉物
    質と標的物質の結合を解離させる工程とを含んでなる分
    析方法。
31. 【請求項３１】 請求項１〜４記載の担持層に結合し
    た捕捉物質に、被験試料溶液中の標的物質を結合させ、
    さらに標的物質と親和性を有する標的物質を結合させ、
    担持層上に捕捉された標的物質由来の信号を観察する分
    析方法。
32. 【請求項３２】 前記標識物質が放射線物質により標
    識され、前記信号が放射線量であることを特徴とする請
    求項３１記載の分析方法。
33. 【請求項３３】 前記標識物質が酵素により標識さ
    れ、前記信号が前記酵素と反応する基質由来の発色、蛍
    光または発光のいずれかであることを特徴とする請求項
    ３１記載の分析方法。
34. 【請求項３４】 前記標識物質が蛍光物質により標識
    され、前記信号が蛍光であることを特徴とする請求項３
    １記載の分析方法。
35. 【請求項３５】 前記標識物質が化学発光物質により
    標識され、前記信号が発光であることを特徴とする請求
    項３１記載の分析方法。
36. 【請求項３６】 被験試料溶液中の標的物質を分析す
    る装置であって、請求項３１〜３５記載の分析方法を自
    動的に行い、濃度既知の標的物質を含む標準液を対象と
    して分析した場合の前記標的物質由来の信号と、被験試
    料溶液中標的物質を対象として分析した場合の前記信号
    とを比較する事で、被験試料溶液中の標的物質の濃度を
    算出する分析装置。