TWI662271B

TWI662271B - 檢測方法

Info

Publication number: TWI662271B
Application number: TW105100716A
Authority: TW
Inventors: 莊漢聲; 鍾智堯
Original assignee: 國立成功大學
Priority date: 2016-01-11
Filing date: 2016-01-11
Publication date: 2019-06-11
Also published as: TW201725375A

Abstract

一種檢測方法，包括下列步驟。首先，提供一檢測樣本。檢測樣本包括一檢測粒子。接著，接附一待測物於檢測粒子。之後，觀測檢測粒子的布朗運動隨時間的變化以獲得待測物的一狀態變化。本檢測方法可應用於藥敏檢測、污染檢測等。

Description

檢測方法

本發明是有關於一種檢測方法。

自動化儀器是目前醫院廣泛使用的藥敏檢測的平台，其菌種辨識及藥敏結果分別需3～4小時以及8～24小時。此檢測結果與傳統方法所得到的結果差異不大。然而，8～24小時的作業時間不盡理想，而影響病人的存活率，且其成本高昂。另外，次世代定序（next generation sequence）完成病原菌基因體的定序則必須花費大量時間，且完成後仍需進行生物資訊的藥敏基因比對。因此，次世代定序所投入的時間及其成本並不適用於處理臨床大量的檢體。除此之外，聚合酶連鎖反應法（Multiplex PCR）雖不需經過培養的步驟，可在2～3小時內偵測檢體內是否有抗藥性基因序列存在。然而，聚合酶連鎖反應法的反應過程中無法放入過多組引子，對於抗藥性基因種類眾多的革蘭氏陰性桿菌並不適用。即使未偵測到特定抗藥基因，亦不代表此菌株不具有其他類型的抗藥機制。

據此，藥敏檢測緩慢實為當前臨床治療的重大問題之一。通常在檢測報告出爐之前，醫生僅能依據經驗療法投予病患抗生素來進行治療。然而，在抗生素的濫用下，使得抗生素治療常常無法達到預期的效果，甚至影響到往後抗生素使用上所能產生的效用。

本發明提供一種檢測方法，其檢測速度快且成本低。

本發明的檢測方法首先提供檢測樣本，其包括檢測粒子。此外，接附待測物於檢測粒子，並且藉由觀測檢測粒子的布朗運動隨時間的變化，以獲得待測物的狀態變化。

在本發明的一實施例中，上述的檢測粒子表面具有官能基，且接附待測物於檢測粒子的方法包括藉由官能基接附待測物。

在本發明的一實施例中，上述的官能基選自胺基（-NH2）、羧基（-COOH）、硫基（-SH）、羰基（-CO）鏈霉親和素、生物素、核酸探針或其組合。

在本發明的一實施例中，上述的檢測粒子表面具有抗體，且接附待測物於檢測粒子的方法包括藉由抗體接附待測物。

在本發明的一實施例中，上述的抗體選自鴨源抗綠膿桿菌多株抗體、兔源抗金黃色葡萄球菌多株抗體或其組合。

在本發明的一實施例中，上述的檢測粒子為一螢光粒子。

在本發明的一實施例中，上述的螢光粒子包括第一螢光粒子以及第二螢光粒子。第一螢光粒子以及第二螢光粒子具有不同的螢光波長。接附待測物於檢測粒子的方法包括分別接附不同的待測物於第一螢光粒子與第二螢光粒子。

在本發明的一實施例中，上述的第一螢光粒子表面與第二螢光粒子表面分別具有不同的官能基，以接附不同的待測物。

在本發明的一實施例中，上述的第一螢光粒子表面與第二螢光粒子表面分別具有不同的抗體，以接附不同的待測物。

在本發明的一實施例中，上述的待測物包括生物分子。

在本發明的一實施例中，上述的生物分子選自金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌或其組合。

在本發明的一實施例中，上述的生物分子為活體生物分子。

在本發明的一實施例中，上述的待測物包括非生物分子。

在本發明的一實施例中，上述的檢測方法更包括在接附待測物於檢測粒子之後，加入反應物至檢測樣本，以藉由觀測檢測粒子的布朗運動隨時間的變化來獲得待測物與反應物反應後的狀態變化。

在本發明的一實施例中，上述的待測物包括活體生物分子，且反應物包括抗生素。

在本發明的一實施例中，上述的抗生素選自氨基糖苷類抗生素之健大霉素（Gentamicin）、第四代頭孢子素麥希平（Cefepime）或其組合。

在本發明的一實施例中，上述的狀態變化包括數量變化、濃度變化、形狀變化、構型變化、活性變化、活動力變化、物理特性變化、化學特性變化。

本發明更提出應用於藥敏檢測的一種檢測方法，可藉由快速、低成本的檢測來獲得生物分子與抗生素反應後的狀態變化。

本發明的檢測方法首先提供檢測樣本，其包括檢測粒子，且檢測粒子表面具有抗體。此外，藉由抗體接附生物分子於檢測粒子，以及加入抗生素至檢測樣本。之後，可藉由觀測檢測粒子的布朗運動隨時間的變化，以獲得生物分子與抗生素反應後的狀態變化。

在本發明的一實施例中，上述的檢測粒子為螢光粒子。

在本發明的一實施例中，上述的螢光粒子包括第一螢光粒子以及第二螢光粒子。第一螢光粒子以及第二螢光粒子具有不同的螢光波長。藉由抗體接附生物分子於檢測粒子的方法包括分別接附不同的生物分子於第一螢光粒子與第二螢光粒子。

在本發明的一實施例中，上述的第一螢光粒子表面與第二螢光粒子表面分別具有不同的抗體，以接附不同的生物分子。

基於上述，本發明藉由直接觀測檢測粒子的布朗運動隨時間的變化以獲得待測物的狀態變化，例如濃度變化、數量變化等，其檢測速度快且成本低。當應用於藥敏檢測時，同樣觀測檢測粒子的布朗運動隨時間的變化來獲得生物分子與抗生素反應後的狀態變化，例如判斷抗生素是否能有效抑制生物分子的生長等等。相較於傳統的檢測方法，本發明的檢測方法不需要耗費長時間進行菌種培養或基因體定序等繁複步驟，便可得到準確的結果，因此可以實現快速且低成本的藥敏檢測。

為讓本發明的上述特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式作詳細說明如下。

圖1A繪示本發明一實施例之檢測樣本的一部分的示意圖，而圖1B繪示圖1A實施例之檢測粒子上接附待測物的示意圖，請參考圖1A以及圖1B。在本實施例中，檢測方法包括提供檢測樣本S。檢測樣本S包括檢測粒子100，且檢測方法包括接附待測物120於檢測粒子100。具體而言，待測物120包括生物分子。在本發明的相關實施例中，生物分子可以是活體生物分子，例如是活體的細菌，或者是死亡的生物分子，例如是死亡的細菌。檢測粒子100表面具有對應於此細菌的抗體110。另外，生物分子亦可以是病毒，或是生物細胞。在其他實施例中，待測物120亦可以包括非生物分子，本發明並不以此為限。

在本實施例中，接附待測物120於檢測粒子100的方法包括藉由抗體110接附待測物120。也就是說，藉由抗體110與細菌（待測物120）接附，而使得細菌藉由抗體110而與檢測粒子100接附，使得細菌得以跟隨著檢測粒子100進行運動。在本實施例中，檢測粒子100為微粒子，其粒徑範圍為小於15微米，較佳地，其粒徑範圍落在0.2至5微米之間。細菌可以跟隨著檢測粒子100進行布朗運動（Brownian motion），並且在運動的過程中保持其與檢測粒子100相接附的狀態。此外，細菌亦可以跟隨著檢測粒子100進行其他類型的熱力學運動或者是其他類型的運動，本發明並不以此為限。

在本實施例中，細菌（待測物120）可以例如是選自金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（Escherichia coli）或其組合，而抗體110可以例如是選自鴨源抗綠膿桿菌多株抗體、兔源抗金黃色葡萄球菌多株抗體或其組合。在其他相關實施例中，細菌亦可以選自其他類型的細菌。並且，可以依據細菌的種類而選擇適合的抗體110，使得抗體110選擇性地與細菌相接附。另外，在一些實施例中，檢測粒子100表面亦可以具有官能基，而接附待測物120於檢測粒子100的方法包括藉由官能基接附待測物120。在這些實施例中，官能基與細菌（待測物120）接附，而使得細菌藉由官能基而與檢測粒子100接附，使得細菌得以跟隨著檢測粒子100進行運動。具體而言，官能基可以例如是選自胺基（-NH2）、羧基（-COOH）、硫基（-SH）、羰基（-CO）、鏈霉親和素、生物素、核酸探針或其組合，官能基可以非選擇性地與多種細菌或其他類型的待測物120相接附，本發明並不以此為限。

在本實施例中，檢測方法包括觀測檢測粒子100的布朗運動隨時間的變化以獲得待測物120的狀態變化。另外，檢測方法亦可包括在接附待測物120於檢測粒子100之後，加入反應物（未繪示）至檢測樣本S，以藉由觀測檢測粒子100的布朗運動隨時間的變化來獲得待測物120與反應物反應後的狀態變化。具體而言，狀態變化包括數量變化、濃度變化、形狀變化、構型變化、活性變化、活動力變化、物理特性變化、化學特性變化或者是其他類型的狀態變化。在本實施例中，待測物120例如是活體的細菌，且反應物例如是包括對應於此活體的細菌的抗生素。也就是說，本實施例之檢測方法包括加入抗生素至檢測樣本S，並且藉由觀測檢測粒子100的布朗運動隨時間的變化以獲得生物分子（待測物120）與抗生素（反應物）反應後的狀態變化。抗生素可以例如是抑菌性（bacteriostatic）的抗生素，用以抑制活體的細菌的生長或複製，而使得細菌的數量不增加或者增加速度減緩。或者，抗生素可以例如是殺菌性（bactericidal）的抗生素，用以使得細菌的數量減少。具體而言，抗生素可以例如是選自氨基糖苷類抗生素之健大霉素（Gentamicin)、第四代頭孢子素之麥希平（Cefepime)或其組合。並且，可以依據細菌的種類而選擇適合的抗生素。在本實施例中，可以透過檢測方法而得知抗生素是否可以與細菌發生作用。

圖2A繪示本發明一實施例中用以觀測檢測樣本的觀測裝置的示意圖，圖2B繪示圖2A實施例的區域A的放大示意圖，而圖2C繪示圖2B實施例檢測樣本之配置的上視示意圖，上述圖2A、圖2B以及圖2C用以示例地說明觀測檢測樣本所使用的觀測裝置，請參考圖2A、圖2B以及圖2C。在本實施例中，觀測裝置200用以觀測檢測樣本S中檢測粒子100的布朗運動隨時間的變化，以獲得生物分子與抗生素反應後的狀態變化。具體而言，檢測樣本S位於顯微鏡210的平台上，且被放置於載玻片250、蓋玻片260與間隙物270所構成的空間中。藉由外部光源220，例如是汞燈(mercury lamp)提供的照明而使檢測樣本S得以被觀察。檢測樣本S例如是透過粒子影像流速儀(Particle Image Velocimetry,PIV)來觀察。檢測樣本S的觀測影像藉由影像接收裝置230，例如是高速的感光耦合元件(Charge-coupled Device,CCD)來接收。當檢測樣本S的檢測粒子100在不同方向進行布朗運動時，粒子影像流速儀會觀測到影像強度峰值的移動。影像處理裝置240，例如是電腦，對檢測樣本S的觀測影像進行處理或分析，而得以觀測檢測樣本S中檢測粒子100的布朗運動隨時間的變化，以獲得生物分子與抗生素反應後的狀態變化。

在本實施例中，理論上，粒子在一流體環境中的布朗運動行為依循愛因斯坦方程式(Stokes-Einstein equation)：

其中，D表示為擴散係數(diffusion coefficient)，k_B表示為波茲曼常數(Boltzmann constant)，T表示為絕對溫度，η表示為流體的黏滯度(viscosity of the fluid)，而d_P表示為此粒子的直徑(particle diameter)。具體而言，當粒子的平均半徑越大時，其擴散係數越小，因此粒子的布朗運動情形較不顯著，其布朗運動的運動範圍較小。相對地，當粒子的平均半徑越小時，其擴散係數越大，因此粒子的布朗運動情形較為顯著，其布朗運動的運動範圍較大。請參考圖1A以及圖1B，當待測物120未接附於檢測粒子100上時(如圖1A)，檢測粒子100以及其表面上接附的抗體110所形成的平均半徑會共同地決定檢測粒子100的擴散係數。相對地，當待測物120接附於檢測粒子100上時(如圖1B)，檢測粒子100、抗體110以及待測物120會共同地決定檢測粒子100的擴散係數。一般而言，接附於檢測粒子100上的待測物120會增加檢測粒子100擴散係數之計算中的平均半徑值。待測物120未接附於檢測粒子100時的檢測粒子100，其擴散係數大於待測物120接附於檢測粒子100時的檢測粒子100的擴散係數。因此，待測物120未接附於檢測粒子100時的檢測粒子100，其布朗運動情形較待測物120接附於檢測粒子100時的檢測粒子100的布朗運動情形為顯著。

在本實施例中，可以藉由對檢測樣本S的觀測影像進行處理或分析，而得以觀測檢測粒子100的布朗運動隨時間的變化。具體而言，可以將檢測樣本S的觀測影像中亮度大於特定值的部分定義為檢測粒子100所在位置。在一單位時間內，取得多個觀測影像，並且根據觀察這些觀測影像中的檢測粒子100所在位置，定義出檢測粒子100在此單位時間內的運動範圍，例如是檢測粒子100在此單位時間內的隨機擴散範圍。舉例而言，可以藉由計算出此運動範圍的面積值，定義出檢測粒子100在此單位時間內隨機擴散的運動範圍。

圖2D繪示圖2A實施例中觀測裝置接收到的觀測影像經分析後的形成的影像強度峰值示意圖。具體而言，可以對觀測裝置200所接收到的這些觀測影像進行疊加及交越相關分析（cross-correlation）而獲得影像強度峰值。影像強度峰值關連於檢測粒子100在單位時間內因布朗運動而產生的位移。在本實施例中，可以藉由對影像強度峰值的進一步分析，而了解檢測粒子100的布朗運動情形。

在本實施例中，可以在接附細菌（待測物120）於檢測粒子100之前，先以觀測裝置200對檢測粒子100進行觀測，以透過觀測影像疊加及交越相關分析而得出檢測粒子100的一第一影像強度峰值。第一影像強度峰值具有一x軸方向半徑，例如是圖2D中標示的（△S_c ）_x ，且第一影像強度峰值具有一y軸方向半徑，例如是圖2D中標示的（△S_c ）_y 。將x軸方向半徑（△S_c ）_x 以及y軸方向半徑（△S_c ）_y 平均，可以獲致一第一平均半徑△S_c 。接著，利用觀測裝置200對接附有細菌的檢測粒子100進行觀測，以透過觀測影像疊加及交越相關分析而得出接附細菌之檢測粒子100的一第二影像強度峰值。第二影像強度峰值具有一x軸方向半徑（△S_a ）_x 及一y軸方向半徑（△S_a ）_y 。將x軸方向半徑（△S_a ）_x 以及y軸方向半徑（△S_a ）_y 平均，可以獲致一第二平均半徑△S_a 。

具體而言，檢測粒子100位移的計算，是使用Evaluation software for Digital Particle Image Velocimetry（EDPIV）此款軟體來進行。在計算條件的設定中，判讀視窗尺寸（Window size）設定為96×96（pix×pix），Grid size設定為48×48（pix×pix），Filter設定為mpiv，而1/pix設定為46082（因數位攝影配合倒立式顯微鏡1pix=21.7微米）。最後，設定兩張影像所距離的時間。具體而言，所有實例尺寸為長624×寬432（單位為pix）。

在本實施例中，自相關分析（Auto-correlation）係以兩張相同的初始影像來做影像位移的計算（時間間格設定為1張影像的時間）。此外，利用EDPIV軟體可以得到大量檢測粒子100位移的窗格，例如是117個。每個窗格為一個24×24影像之影像強度變化的矩陣。在本實施例中，每組資料點都進行5組，因而獲致5組矩陣。將5組矩陣進行疊加（Ensemble Average）後，將其結果進行單位正交化，而得到一個單位正交化的峰。在本實施例中，將第十三列及第十三行數值利用軟體Matlab進行高斯（Gausian）曲線擬合（Curve fitting（其指令為cftool）。擬合函數為：

其中，c₁ 表示為寬度半徑。以第二影像強度峰值為例，第二影像強度峰值具有兩個方向的寬度半徑（△S_a ）_x 以及（△S_a ）_y 。將寬度半徑（△S_a ）_x 以及寬度半徑（△S_a ）_y 取其平均，可得第二平均半徑ΔS_a 。除此之外，第一平均半徑△S_c 可透過交越相關分析獲致。交越相關分析的操作類似於上述自相關分析的操作，而其中時間間格設定為實際影像的間距。透過交越相關分析，可以獲致兩個方向的寬度半徑（△S_c ）_x 以及（△S_c ）_y 。將寬度半徑（△S_c ）_x 以及寬度半徑（△S_c ）_y 取其平均，可得第一平均半徑ΔS_c 。

在本實施例中，可以根據接附細菌於檢測粒子100之前的第一平均半徑△S_c 以及接附細菌於檢測粒子100之後的第二平均半徑△S_a ，判斷接附細菌於檢測粒子100之後檢測粒子100布朗運動情形的改變。舉例而言，第一平均半徑△S_c 的平方值與第二平均半徑△S_a 的平方值，二者的差值可以表示當細菌加入檢測樣本S後，檢測粒子100的運動範圍之面積值的改變量。具體而言，當細菌加入檢測樣本S後，若檢測粒子100的運動範圍之面積值發生改變，例如是變小，則可以判斷細菌確實有接附於檢測粒子100上，以致於檢測粒子100擴散係數之計算中的平均半徑變大，使得擴散係數變小，布朗運動情形變得不顯著。值得注意的是，可以事先接附細菌於檢測粒子100上，並將接附有細菌的檢測粒子100加入檢測樣本S中以利於觀測。或者，可以將細菌加入已具有檢測粒子100的檢測樣本S中，使細菌自然接附於檢測粒子100上，本發明並不以此為限。

具體而言，由於附於檢測粒子100上的細菌會自然生長或複製，而使得細菌的數量增加，因此自然增加的細菌也會自然接附於檢測粒子100上，而使得檢測粒子100的布朗運動情形隨著時間改變。一般而言，當越來越多自然增加的細菌接附於檢測粒子100上時，檢測粒子100的布朗運動情形會變得不顯著。在本實施例中，檢測方法亦可以檢測細菌與抗生素反應後的狀態變化，例如是數量變化。具體而言，可以先以觀測裝置200對接附有細菌的檢測粒子100進行觀測，以定義出檢測粒子100在單位時間內的運動範圍之面積值，例如是前述第一平均半徑△S_c 的平方值。接著，加入抗生素至檢測樣本S，使抗生素與細菌發生反應，並且以觀測裝置200對檢測粒子100進行觀測，以定義出檢測粒子100在單位時間內的運動範圍之面積值，例如是前述第二平均半徑△S_a 的平方值。

在本實施例中，當抗生素加入檢測樣本S後，若檢測粒子100的運動範圍之面積值變小，則表示依然有增加的細菌接附於檢測粒子100上，而使得檢測粒子100的布朗運動情形變得不顯著。因此，可以得知抗生素對細菌的抑制效果有限。相對地，當抗生素加入檢測樣本S後，若檢測粒子100的運動範圍之面積值近似於抗生素加入檢測樣本S之前的檢測粒子100的運動範圍之面積值，則表示沒有增加的細菌接附於檢測粒子100上。因此抗生素加入檢測樣本S後的檢測粒子100的布朗運動情形保持類似於抗生素加入檢測樣本S之前的檢測粒子100的布朗運動情形。

在本實施例中，藉由觀察檢測粒子100的布朗運動變化，可以得知抗生素對細菌是否有抑制的效果，而達到藥敏檢測的目的。在本實施例的檢測方法中，檢測粒子100的布朗運動變化可以直接透過顯微鏡觀測得知。藉由直接觀測檢測粒子的布朗運動隨時間的變化，細菌的狀態變化，例如是濃度變化、數量變化、形狀變化、構型變化、活性變化、活動力變化、物理特性變化、化學特性變化等便可以快速地得知。相較於傳統的檢測方法，本實施例的檢測方法不需要耗費長時間進行菌種培養或基因體定序等繁複步驟，且不必使用複雜的自動化儀器，便可得到準確的結果。因此，本實施例的檢測方法可以實現快速且低成本的藥敏檢測。

在一些實施例中，檢測粒子100可以例如為螢光粒子。螢光粒子包括第一螢光粒子以及第二螢光粒子，且第一螢光粒子以及第二螢光粒子具有不同的螢光波長。第一螢光粒子表面與第二螢光粒子表面分別具有不同的抗體，以接附不同的待測物。在這些實施例中，接附待測物於檢測粒子的方法包括分別接附不同的待測物於第一螢光粒子與第二螢光粒子。具體而言，第一螢光粒子可以在特定波長光的照射下，發出具有對應波長的光線，而第二螢光粒子可以在另一特定波長光的照射下，發出具有對應波長的光線。因此，即使第一螢光粒子以及第二螢光粒子平均地分散於檢測樣本S中，觀察者可以利用適當的波長的光線照射檢測樣本S，使得對應的螢光粒子發光，並觀測其布朗運動的情形。由於第一螢光粒子以及第二螢光粒子適於透過不同的抗體接附不同的待測物，因此在這些實施例中，可以在同一檢測樣本S中藉由切換照射檢測樣本S的光線波長而觀察多種待測物，而達到更多的應用。在一些相關實施例中，第一螢光粒子表面與第二螢光粒子表面亦可以是分別具有不同的官能基，而這些官能基可以非選擇性地與多種類型的待測物相接附，本發明並不以此為限。

在其他實施例中，如圖1A以及圖1B所述的待測物120亦可以是其他類型的有機分子或是無機分子。舉例而言，檢測方法可以用以檢測空氣中的污染物的濃度，其中待測物120可以是污染物，例如是重金屬粒子，而檢測粒子100表面具有適於與欲檢測之重金屬粒子相連接的官能基。藉由此官能基接附重金屬粒子，使重金屬粒子接附於檢測粒子100表面上。在這些實施例中，可以藉由直接觀察檢測粒子100的布朗運動變化，得知空氣中是否含有重金屬粒子。另外，可以將檢測粒子100在不同濃度之重金屬粒子環境下的布朗運動情形進行多次紀錄。透過這些紀錄，可以藉由觀察檢測粒子100的布朗運動變化，而得知空氣中含有的重金屬粒子濃度，而達到快速且低成本的污染檢測。或者，檢測方法亦可以搭配適當的數據分析，而達到不同的檢測應用，本發明並不以此為限。

以下圖3A至圖7舉出本發明多個實施例的實驗作圖。圖3A繪示本發明一實施例待測物為綠膿桿菌的實驗作圖，請參考圖3A，其中綠膿桿菌為死亡的綠膿桿菌。具體而言，圖3A繪示本發明一實施例檢測粒子在單位時間內的移動範圍面積的作圖。圖3A橫軸標示「時間間距」，其單位為秒，而縱軸標示「面積差值」。檢測粒子的布朗運動情形是透過如圖2A所繪示的觀測裝置200進行觀測而得知，而檢測粒子的布朗運動範圍之面積在檢測影像上佔據多個像素。因此，縱軸標示「面積差值」的單位為像素數。在本實施例中，「檢測粒子未接附綠膿桿菌」表示檢測粒子未接附綠膿桿菌時，此檢測粒子在單位時間內的運動範圍的面積差值。另外，「檢測粒子接附1個綠膿桿菌」表示當一個檢測粒子接附1個綠膿桿菌時，此檢測粒子在單位時間內的運動範圍的面積差值。此外，「檢測粒子接附2個綠膿桿菌」表示當一個檢測粒子接附2個綠膿桿菌時，此檢測粒子在單位時間內的運動範圍的面積差值。再者，「檢測粒子接附3個綠膿桿菌」表示當一個檢測粒子接附3個綠膿桿菌時，此檢測粒子在單位時間內的運動範圍的面積差值。

具體而言，「檢測粒子未接附綠膿桿菌」、「檢測粒子接附1個綠膿桿菌」、「檢測粒子接附2個綠膿桿菌」以及「檢測粒子接附3個綠膿桿菌」其各自的數據值可以各自計算回歸直線，而分別得到直線L1、直線L2、直線L3以及直線L4。在本實施例中，直線L2的斜率與直線L1的斜率的比值為0.89，直線L3的斜率與直線L1的斜率的比值為0.81，直線L4的斜率與直線L1的斜率的比值為0.75。由圖3A可以看出，當檢測粒子接附越多綠膿桿菌時，檢測粒子在單位時間內的運動範圍的面積差值越小。也就是說，當檢測粒子接附越多綠膿桿菌時，檢測粒子布朗運動的情形越不顯著。

圖3B繪示本發明另一實施例之待測物為綠膿桿菌的實驗作圖，請參考圖3B，其中綠膿桿菌為死亡的綠膿桿菌。具體而言，圖3B繪示本發明另一實施例檢測粒子在單位時間內的移動範圍面積的作圖。在本實施例中，檢測粒子運動的觀察並非針對特定檢測粒子進行觀察，而是對於檢測樣本S中整體的檢測粒子進行觀察。舉例而言，根據檢測樣本S中檢測粒子的數量，而直接地加入綠膿桿菌於檢測樣本S中，而使得這些檢測粒子平均地接附對應數量的綠膿桿菌。圖3B橫軸標示「時間間距」，其單位為秒，而縱軸標示「面積差值」，其單位為像素數。在本實施例中，「檢測粒子未接附綠膿桿菌」表示並未加入綠膿桿菌於檢測樣本S中。也就是說這些檢測粒子未接附綠膿桿菌時，這些檢測粒子在單位時間內共同的運動範圍的面積差值。另外，「檢測粒子平均接附1／100個綠膿桿菌」表示各檢測粒子平均接附1／100個綠膿桿菌時，這些檢測粒子在單位時間內共同的運動範圍的面積差值。此外，「檢測粒子平均接附1／10個綠膿桿菌」表示各檢測粒子平均接附1／10個綠膿桿菌時，這些檢測粒子在單位時間內共同的運動範圍的面積差值。再者，「檢測粒子平均接附1個綠膿桿菌」表示各檢測粒子平均接附1個綠膿桿菌時，這些檢測粒子在單位時間內共同的運動範圍的面積差值。除此之外，「檢測粒子平均接附10個綠膿桿菌」表示各檢測粒子平均接附10個綠膿桿菌時，這些檢測粒子在單位時間內共同的運動範圍的面積差值。

具體而言，「檢測粒子未接附綠膿桿菌」、「檢測粒子平均接附1/100個綠膿桿菌」、「檢測粒子平均接附1/10個綠膿桿菌」、「檢測粒子平均接附1個綠膿桿菌」以及「檢測粒子平均接附10個綠膿桿菌」其各自的數據值可以各自計算回歸直線，而分別得到直線L5、直線L6、直線L7、直線8以及直線L9。在本實施例中，直線L6的斜率與直線L5的斜率的比值為0.99，直線L7的斜率與直線L5的斜率的比值為0.98，直線L8的斜率與直線L5的斜率的比值為0.80，而直線L9的斜率與直線L5的斜率的比值為0.53。由圖3B可以看出，當這些檢測粒子平均地接附越多綠膿桿菌時，這些檢測粒子在單位時間內的運動範圍的面積差值越小。也就是說，當這些檢測粒子平均地接附越多綠膿桿菌時，這些檢測粒子布朗運動的情形越不顯著。

圖4繪示本發明又一實施例之待測物為綠膿桿菌的實驗作圖，請參考圖4。具體而言，圖4繪示本發明一實施例經運算後之斜率的比值與綠膿桿菌數對檢測粒子數的比值的作圖，其中綠膿桿菌為死亡的綠膿桿菌。圖4橫軸標示「綠膿桿菌數對檢測粒子數的比值」，其無單位，而縱軸標示「斜率的比值」，其單位為百分比。在本實施例中，檢測粒子粒徑為2微米而綠膿桿菌寬與長分別為1微米與2微米時，以類似圖3A以及圖3B所述之方法計算可得一第一斜率值，而此檢測粒子未接附綠膿桿菌時，以類似圖3A以及圖3B所述之方法計算可得一第二斜率值。圖4中，「理論值曲線一」即表示依據理論所估得的上述第一斜率值與上述第二斜率值的比值，其對綠膿桿菌數對檢測粒子數的比值之作圖。另外，「理論值曲線二」類似於「理論值曲線一」，但「理論值曲線二」綠膿桿菌寬與長分別為1.5微米與3微米。除此之外，「實驗值一」為對應於「理論值曲線一」的實際的實驗數據，且「實驗值二」為對應於「理論值曲線二」的實際的實驗數據。由圖4可以看出，實際的實驗數據接近於理論值。

圖5繪示本發明一實施例之待測物為綠膿桿菌且加入抗生素至檢測樣本的實驗作圖。具體而言，圖5繪示本發明一實施例加入抗生素至檢測樣本後經運算後之斜率的比值與時間的作圖，其中綠膿桿菌為活體的綠膿桿菌。另外，抗生素為氨基糖苷類抗生素之健大霉素(Gentamicin)，請參考圖5。圖5橫軸標示「時間」，其單位為分鐘，而縱軸標示「斜率的比值」，其單位為百分比。在本實施例中，在未加入抗生素至檢測樣本的情況下，當檢測粒子接附綠膿桿菌時，以類似圖3A以及圖3B所述之方法計算可得一第三斜率值，而當檢測粒子未接附綠膿桿菌時，以類似圖3A以及圖3B所述之方法計算可得一第四斜率值。圖5中，「未加抗生素」即表示依據實驗數值所得的上述第三斜率值與上述第四斜率值的比值，其對時間之作圖。另外，當檢測粒子接附綠膿桿菌且加入0.02微克/毫升的抗生素至檢測樣本的情況下，以類似圖3A以及圖3B所述之方法計算可得一第五斜率值。圖5中，「抗生素0.02微克/毫升」即表示依據實驗數值所得的上述第五斜率值與上述第四斜率值的比值，其對時間之作圖。此外，「抗生素0.5微克／毫升」類似於「抗生素0.02微克／毫升」，但「抗生素0.5微克／毫升」加入檢測樣本的抗生素濃度為0.5微克／毫升。再者，「抗生素2微克／毫升」類似於「抗生素0.02微克／毫升」，但「抗生素2微克／毫升」加入檢測樣本的抗生素濃度為2微克／毫升。由圖5可以看出，在0至20分鐘屬於尚不穩定的階段，抗生素於檢測樣本中尚未對綠膿桿菌產生明顯的抑制作用。然而，在20分鐘之後，加入較高濃度抗生素的檢測樣本中，檢測粒子其布朗運動較不易隨著時間增加而減緩。也就是說，加入較高濃度抗生素的檢測樣本中，其檢測粒子上的綠膿桿菌增加的量減緩，表示高濃度的抗生素對綠膿桿菌產生了抑制的作用。

圖6繪示本發明一實施例之待測物為金黃色葡萄球菌的實驗作圖，請參考圖6。具體而言，圖6繪示本發明一實施例經運算後之擴散係數的比值與金黃色葡萄球菌對檢測粒子的比值的作圖，其中金黃色葡萄球菌為活體的金黃色葡萄球菌。圖6橫軸標示「金黃色葡萄球菌對檢測粒子數的比值」，其無單位，而縱軸標示「擴散係數的比值」，其單位為百分比。在本實施例中，「理論值曲線一」表示檢測粒子接附金黃色葡萄球菌時的擴散係數與檢測粒子未接附金黃色葡萄球菌時的擴散係數的比值，其中檢測粒子粒徑為2微米而金黃色葡萄球菌寬與長分別為1.5微米與1.5微米。另外，「理論值曲線一」類似於「理論值曲線二」，但「理論值曲線二」金黃色葡萄球菌寬與長分別為2微米與2微米。除此之外，「實驗值一」為對應於「理論值曲線一」的實際的實驗數據。由圖6可以看出，實際的實驗數據接近於理論值。

圖7繪示本發明一實施例之待測物為金黃色葡萄球菌且加入抗生素至檢測樣本的實驗作圖。具體而言，圖7繪示本發明一實施例加入抗生素至檢測樣本後經運算後之斜率的比值與時間的作圖，其中金黃色葡萄球菌為活體的金黃色葡萄球菌。另外，抗生素為第四代頭孢子素之麥希平（Cefepime），請參考圖7。圖7橫軸標示「時間」，其單位為分鐘，而縱軸標示「斜率的比值」，其單位為百分比。在本實施例中，在未加入抗生素至檢測樣本的情況下，當檢測粒子接附金黃色葡萄球菌時，以類似圖3A以及圖3B所述之方法計算可得一第六斜率值，而當檢測粒子未接附金黃色葡萄球菌時，以類似圖3A以及圖3B所述之方法計算可得一第七斜率值。圖7中，「未加抗生素」即表示依據實驗數值所得的上述第六斜率值與上述第七斜率值的比值，其對時間之作圖。另外，當檢測粒子接附金黃色葡萄球菌且加入0.1微克／毫升的抗生素至檢測樣本的情況下，以類似圖3A以及圖3B所述之方法計算可得一第八斜率值。圖7中，「抗生素0.1微克／毫升」即表示依據實驗數值所得的上述第八斜率值與上述第七斜率值的比值，其對時間之作圖。此外，當檢測粒子接附金黃色葡萄球菌且加入1微克／毫升的抗生素至檢測樣本的情況下，以類似圖3A以及圖3B所述之方法計算可得一第九斜率值。圖7中，「抗生素1微克／毫升」即表示依據實驗數值所得的上述第九斜率值與上述第七斜率值的比值，其對時間之作圖。再者，當檢測粒子接附金黃色葡萄球菌且加入4微克／毫升的抗生素至檢測樣本的情況下，以類似圖3A以及圖3B所述之方法計算可得一第十斜率值。圖7中，「抗生素4微克／毫升」即表示依據實驗數值所得的上述第十斜率值與上述第七斜率值的比值，其對時間之作圖。由圖7可以看出，加入抗生素的檢測樣本中，檢測粒子其布朗運動較不易隨著時間增加而減緩。也就是說，加入抗生素的檢測樣本中，其檢測粒子上的金黃色葡萄球菌增加的量減緩，表示抗生素對金黃色葡萄球菌產生了抑制的作用。

值得住意的是，上述圖3A、圖3B、圖4、圖5、圖6以及圖7的作圖僅為本發明的一些實施例，並非用以限定本發明。任何所屬技術領域中具有通常知識者在參照本發明之後，當可應用本發明的原則對其參數或設定作適當的更動，以致使其設定之數據改變，惟其仍應屬於本發明之範疇內。

以下圖8以及圖9舉出本發明一些實施例的檢測方法之主要的步驟。圖8繪示本發明一實施例之檢測方法的步驟流程圖，請參考圖8。所述檢測方法至少可應用在上述圖1A至圖7的實施例。所述檢測方法如下步驟。在步驟S800中，提供檢測樣本，檢測樣本包括檢測粒子。接著，在步驟S810中，接附待測物於檢測粒子。之後，在步驟S820中，觀測檢測粒子的布朗運動隨時間的變化以獲得待測物的狀態變化。具體而言，本發明之實施例的檢測方法可以由圖1A至圖7實施例之敘述中獲致足夠的教示、建議與實施說明，因此不再贅述。

圖9繪示本發明另一實施例之檢測方法的步驟流程圖，請參考圖9。所述檢測方法至少可應用在上述圖1A至圖7的實施例。所述檢測方法如下步驟。在步驟S900中，提供檢測樣本，檢測樣本包括檢測粒子，檢測粒子表面具有抗體。接著，在步驟S910中，藉由抗體接附生物分子於檢測粒子。之後，在步驟S920中，加入抗生素至檢測樣本。在步驟S930中，觀測檢測粒子的布朗運動隨時間的變化以獲得生物分子與抗生素反應後的狀態變化。具體而言，本發明之實施例的檢測方法可以由圖1A至圖7實施例之敘述中獲致足夠的教示、建議與實施說明，因此不再贅述。

雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作些許的更動與潤飾，故本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

100‧‧‧檢測粒子

110‧‧‧抗體

120‧‧‧待測物

200‧‧‧觀測裝置

210‧‧‧顯微鏡

220‧‧‧光源

230‧‧‧影像接收裝置

240‧‧‧影像處理裝置

250‧‧‧載玻片

260‧‧‧蓋玻片

270‧‧‧間隙物

A‧‧‧區域

L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9‧‧‧直線

S‧‧‧檢測樣本

S800、S810、S820、S900、S910、S920、S930‧‧‧檢測方法的步驟

(△S_c)_x、(△S_c)_y‧‧‧寬度半徑

圖1A繪示本發明一實施例之檢測樣本的一部分的示意圖。圖1B繪示圖1A實施例之檢測粒子上接附待測物的示意圖。圖2A繪示本發明一實施例中用以觀測檢測樣本的觀測裝置的示意圖。圖2B繪示圖2A實施例的區域A的放大示意圖。圖2C繪示圖2B實施例檢測樣本之配置的上視示意圖。圖2D繪示圖2A實施例中觀測裝置接收到的觀測影像經分析後的形成的影像強度峰值示意圖。圖3A繪示本發明一實施例待測物為綠膿桿菌的實驗作圖。圖3B繪示本發明另一實施例之待測物為綠膿桿菌的實驗作圖。圖4繪示本發明又一實施例之待測物為綠膿桿菌的實驗作圖。圖5繪示本發明一實施例之待測物為綠膿桿菌且加入抗生素至檢測樣本的實驗作圖。圖6繪示本發明一實施例之待測物為金黃色葡萄球菌的實驗作圖。圖7繪示本發明一實施例之待測物為金黃色葡萄球菌且加入抗生素至檢測樣本的實驗作圖。圖8繪示本發明一實施例之檢測方法的步驟流程圖。圖9繪示本發明另一實施例之檢測方法的步驟流程圖。

Claims

一種檢測方法，包括：提供一檢測樣本，該檢測樣本包括多個檢測粒子；接附一待測物於該些檢測粒子；藉由一觀測裝置獲得該檢測樣本的多個觀測影像，將該些觀測影像進行疊加及交越相關分析而獲得影像強度峰值，接著再由影像強度峰值的分析了解該些檢測粒子的布朗運動情形；以及觀測該些檢測粒子的布朗運動隨時間的變化以獲得該待測物的一狀態變化。
如申請專利範圍第1項所述的檢測方法，其中該些檢測粒子表面具有一官能基，且接附該待測物於該些檢測粒子的方法包括藉由該官能基接附該待測物。
如申請專利範圍第2項所述的檢測方法，其中該官能基選自胺基(-NH2)、羧基(-COOH)、硫基(-SH)、羰基(-CO)鏈霉親和素、生物素、核酸探針或其組合。
如申請專利範圍第1項所述的檢測方法，其中該些檢測粒子表面具有一抗體，且接附該待測物於該些檢測粒子的方法包括藉由該抗體接附該待測物。
如申請專利範圍第4項所述的檢測方法，其中該抗體選自鴨源抗綠膿桿菌多株抗體、兔源抗金黃色葡萄球菌多株抗體或其組合。
如申請專利範圍第1項所述的檢測方法，其中該些檢測粒子為一螢光粒子。
如申請專利範圍第6項所述的檢測方法，其中該螢光粒子包括一第一螢光粒子以及一第二螢光粒子，該第一螢光粒子以及該第二螢光粒子具有不同的螢光波長，且接附該待測物於該些檢測粒子的方法包括分別接附不同的待測物於該第一螢光粒子與該第二螢光粒子。
如申請專利範圍第7項所述的檢測方法，其中該第一螢光粒子表面與該第二螢光粒子表面分別具有不同的官能基，以接附不同的待測物。
如申請專利範圍第7項所述的檢測方法，其中該第一螢光粒子表面與該第二螢光粒子表面分別具有不同的抗體，以接附不同的待測物。
如申請專利範圍第1項所述的檢測方法，其中該待測物包括一生物分子。
如申請專利範圍第10項所述的檢測方法，其中該生物分子選自金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌或其組合。
如申請專利範圍第10項所述的檢測方法，其中該生物分子為活體生物分子。
如申請專利範圍第1項所述的檢測方法，其中該待測物包括一非生物分子。
如申請專利範圍第1項所述的檢測方法，更包括：在接附該待測物於該些檢測粒子之後，加入一反應物至該檢測樣本，以藉由觀測該些檢測粒子的布朗運動隨時間的變化來獲得該待測物與該反應物反應後的該狀態變化。
如申請專利範圍第14項所述的檢測方法，其中該待測物包括一活體生物分子，且該反應物包括一抗生素。
如申請專利範圍第15項所述的檢測方法，其中該抗生素選自氨基糖苷類抗生素之健大霉素(Gentamicin)、第四代頭孢子素之麥希平(Cefepime)其組合。
如申請專利範圍第1項所述的檢測方法，其中該狀態變化包括數量變化、濃度變化、形狀變化、構型變化、活性變化、活動力變化、物理特性變化、化學特性變化。
一種檢測方法，包括：提供一檢測樣本，該檢測樣本包括多個檢測粒子，該些檢測粒子表面具有一抗體；藉由該抗體接附一生物分子於該些檢測粒子；加入一抗生素至該檢測樣本；藉由一觀測裝置獲得該檢測樣本的多個觀測影像，將該些觀測影像進行疊加及交越相關分析而獲得影像強度峰值，接著再由影像強度峰值的分析了解該些檢測粒子的布朗運動情形；以及觀測該些檢測粒子的布朗運動隨時間的變化以獲得該生物分子與該抗生素反應後的一狀態變化。
如申請專利範圍第18項所述的檢測方法，其中該些檢測粒子為一螢光粒子。
如申請專利範圍第19項所述的檢測方法，其中該螢光粒子包括一第一螢光粒子以及一第二螢光粒子，該第一螢光粒子以及該第二螢光粒子具有不同的螢光波長，且藉由該抗體接附該生物分子於該些檢測粒子的方法包括分別接附不同的生物分子於該第一螢光粒子與該第二螢光粒子。
如申請專利範圍第20項所述的檢測方法，其中該第一螢光粒子表面與該第二螢光粒子表面分別具有不同的抗體，以接附不同的生物分子。