CN116134151A - 多重分析物检测 - Google Patents

Abstract

提供了用于对生物样品中的多种分析物进行多重检测的方法和试剂盒。所述多重方法包括使样品与以下接触：至少一种磁性缀合物，所述至少一种磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分各自被配置为结合相应分析物；多个报告物结合部分，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的标签并且各自也结合相应分析物；和多个报告物，所述多个报告物各自具有相应标签结合配偶体，所述相应标签结合配偶体结合相应标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；施加磁场；以及基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物的存在、不存在或水平。

Description

多重分析物检测

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年8月7日提交的标题为“MULTIPLEXED ANAL YTE DETECTION”的美国临时专利申请第63/063,028号的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明尤其涉及检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式通过EFS-Web提交并且特此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2021年8月6日，名为124436-5011_Sequence_Listing_ST25.txt，且大小为8,192字节。

背景技术

医学、生物医学研究和其他领域依赖于对各种靶分析物的检测、鉴定和定量，这些靶分析物包括蛋白质、小分子、细菌、全细胞、病毒，以及生物样品和其他类型的样品中的其他分析物。需要可靠的测试来检测各种各样的靶标，以诊断疾病和疾患，监测和评估治疗进展，以及用于临床和非临床应用的各种其他目的。

用于分析物检测的传统方法涉及例如像酶联免疫吸附测定(ELISA)、质谱、流式细胞术和高压液相色谱(HPLC)的测定。现有的每一种方法都有其优点和局限性。例如，广泛用于许多领域(包括抗体检测)的ELISA测定可能是耗时的，因为它包括多个费力的程序。此外，ELISA测定的参数可能是高度可变的，并且ELISA可能不够灵敏，这可能会影响检测质量。

此外，生物样品和其他不同类型的样品通常很复杂，它们包括多种靶分析物。在各种生物医学、临床、流行病学、法医学和其他应用中都需要多重测定。然而，常规免疫测定的处理时间较长且还有其他缺点，通常不太适合同时检测超过一种分析物。例如，ELISA只能检测样品中的一种分析物。此外，在现有的免疫测定系统中，分析所需的样品体积通常与被检测分析物的数目成线性比例。因此，检测多种分析物可能具有挑战性。

因此，需要可靠、准确且省时的诊断测试以对样品进行全面分析，包括检测样品中的多种分析物。

发明内容

因此，在各个方面，本发明提供了用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法，以及实现这些方法的试剂盒。这些方法允许对样品中的多种分析物进行多重检测。通过用具有某种性质(例如，能够产生特定颜色的信号)的报告颗粒标记每种分析物，所述方法可用于同时检测同一样品中的多种分析物。所述方法可随分析物的数目有效扩展，使得无需增加样品体积即可检测多种分析物。此外，所述方法还提高了灵敏度、特异性，降低了背景噪声，并增大了信噪比。

在各个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法，所述生物样品可以获自受试者。所述方法包括：(a)使所述样品与至少一种磁性缀合物接触，所述至少一种磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与所述磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(b)使所述磁性缀合物与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(c)使所述磁性缀合物与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有结合的相应标签结合配偶体，所述相应标签结合配偶体被配置为结合相应标签，从而任选地将报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；(d)施加磁场以分离所述至少一种磁性缀合物，所述至少一种磁性缀合物任选地具有与其缔合的所述多种分析物中的分析物和与相应报告物缔合的相应报告物结合部分，所述相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述相应报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物中每种分析物的存在、不存在或水平。

在多个方面，提供了用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法，所述方法包括：(a)使所述样品与至少一种磁性缀合物接触，所述至少一种磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与所述磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(b)使所述磁性缀合物与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，所述标签包含脱硫生物素并且每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(c)使所述磁性缀合物与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有相应标签结合配偶体，所述相应标签结合配偶体被配置为结合相应标签，从而将报告物结合部分与相应报告物缔合，其中所述标签结合配偶体包含链霉亲和素并且每个报告物被配置为产生相应的不同信号；(d)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物具有与其缔合的所述多种分析物中的分析物和与相应报告物缔合的相应报告物结合部分，所述相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述相应报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物中每种分析物的存在、不存在或水平，其中：所述报告物结合部分具有与其结合的第一寡核苷酸，并且所述报告物具有与其结合的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸被配置为在所述标签与所述标签结合配偶体相互作用时与所述第一寡核苷酸杂交，从而将所述报告物结合部分与所述报告物缔合；并且所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自具有约50个核苷酸或更少的长度。

在一些实施方案中，所述用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法包括：(a)使所述样品与至少一种磁性缀合物接触，所述至少一种磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与所述磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(b)使所述样品与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(c)使所述样品与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有与其结合的相应标签结合配偶体，使得所述标签结合配偶体结合相应标签，从而将与所述标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；(d)通过施加磁场从所述样品中分离所述多种分析物中的每种分析物，所述分析物具有相应磁性颗粒和与相应报告物缔合的相应报告物结合部分，所述相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述相应报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物中每种分析物的存在、不存在或水平。

在一些实施方案中，在步骤(b)和(c)之间进行磁向下牵引和洗涤(重悬)，这可以去除可能存在于反应混合物与样品中的过量报告物结合部分。

在一些实施方案中，标签-标签结合配偶体对是正交的，使得标签仅结合相应标签结合配偶体，反之亦然。因此，为了检测样品中的某些分析物，可以选择标签-标签结合配偶体对，使得来自不同对的标签与标签结合配偶体之间不会发生相互作用。换句话讲，每个标签-标签结合配偶体对经选择而对待检测的多种分析物中的特定分析物具有特异性。

可以根据本公开的实施方案使用各种标签和相应标签结合配偶体。在一些实施方案中，标签包含生物素且标签结合配偶体包含链霉亲和素，或者标签包含异硫氰酸荧光素(FITC)且标签结合配偶体包含抗FITC抗体，或者标签包含二硝基苯酚(DNP)且标签结合配偶体包含抗DNP抗体，或者标签包含地高辛(DIG)且标签结合配偶体包含抗DIG抗体，或者标签包含Etag(GAPVPYPDPLEPR(SEQ ID NO:1))且标签结合配偶体包含抗Etag抗体，或者标签包含FLAG(DYKDDDDK(SEQ ID NO:2))且标签结合配偶体包含抗FLAG抗体，或者标签包含Myc(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:3))且标签结合配偶体包含抗Myc抗体，或者标签包含HA(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:4))且标签结合配偶体包含抗HA抗体，或者标签包含SNAP且标签结合配偶体包含苄基鸟嘌呤衍生物，或者标签包含“CLIP”且标签结合配偶体包含苄基胞嘧啶衍生物。

在一些实施方案中，当报告物结合部分通过标签-标签结合配偶体相互作用与相应报告物结合时，通过使用可以彼此杂交的寡核苷酸(如果存在互补性)来促进标签-标签结合配偶体相互作用。在此类实施方案中，选择寡核苷酸对使得它们对于检测多种分析物中的某种分析物是唯一的，从而允许模拟检测样品中的多种分析物。在这些实施方案中，可以使用相同的标签和标签结合配偶体以检测所述多种分析物中的分析物。所述标签可以是具有短结合半衰期的标签(其也可以称为低亲和力标签或具有高解离速率的标签)。这种标签可以是(但不限于)脱硫生物素(或其衍生物或类似物)，其被配置为结合相应标签结合配偶体，例如像亲和素(例如，但不限于链霉亲和素)。可以使用任何其他标签和标签结合配偶体。

因此，在一些实施方案中，报告物结合部分具有与其结合的第一寡核苷酸，并且报告物具有与其结合的第二寡核苷酸，其中第二寡核苷酸被配置为在标签与标签结合配偶体相互作用时与第一寡核苷酸杂交，从而将报告物结合部分与报告物缔合。

第一寡核苷酸和第二寡核苷酸可以彼此完全互补或部分互补。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸可以彼此完全互补。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸可能不是完美互补的，但它们仍然能够彼此杂交。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自具有约50个核苷酸或更少的长度。

在一些实施方案中，所述至少一种磁性缀合物的所述多个捕获部分中的捕获部分包含被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物的抗体。与磁性颗粒偶联的所述多个捕获部分中的全部或至少一些捕获部分可以是抗体。使用此类捕获部分可以同时检测各种分析物(例如，血液中的hCG、PSA、TSH和CRP)。

在一些实施方案中，所述至少一种磁性缀合物的所述多个捕获部分中的捕获部分包含被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物的第一抗体，并且其中报告物结合部分包含被配置为结合相应分析物的第二抗体。在一些实施方案中，所述多种分析物可以包含多种抗体，并且所述至少一种磁性缀合物的捕获部分可以包含被配置为结合相应抗体的抗原。在一些实施方案中，所述多个报告物结合部分中的报告物结合部分包含被配置为结合所述抗原的第二抗体。所述方法可以指示受试者是否产生针对抗原的抗体。在一些实施方案中，所述方法可以提供样品中抗体的数量。

在一些实施方案中，报告分子是金属芯和二氧化硅壳或所述报告物；其中所述二氧化硅壳任选地浸渍有多个量子点；并且其中所述金属芯任选地包含金。在一些实施方案中，报告物包含多个量子点、单个量子点、有机染料、上转换荧光粉(upconvertingphosphor)和其他类型。

在实施方案中，所述多个报告物中的每个报告物能够产生相应信号，所述信号具有至少一种与由所述多个报告物中的另一报告物产生的信号的性质不同的性质。

在实施方案中，所述方法允许同时检测至少四种分析物、或至少六种分析物或任何其他数目的分析物。

在实施方案中，所述方法允许同时检测至少2种分析物，或至少3种分析物，或至少4种分析物，或至少5种分析物，或至少6种分析物，或至少7种分析物，或至少8种分析物，或至少9种分析物或至少10种分析物。

在实施方案中，所述方法允许同时检测约2种分析物，或约3种分析物，或约4种分析物，或约5种分析物，或约6种分析物，或约7种分析物，或约8种分析物，或约9种分析物或约10种分析物。

在各个方面，本发明提供了适用于本文公开的任何实施方案的方法的试剂盒。所述试剂盒可包括所述至少一种磁性缀合物、所述多个报告物结合部分和所述多个报告物。

在以下附随描述中阐述了本发明的细节。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但现在描述了说明性的方法和材料。根据描述和权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将为显而易见的。在说明书和所附权利要求书中，单数形式还包括复数，除非上下文另外清楚地指出。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。

本文公开的任何方面或实施方案可以与如本文公开的任何其他方面或实施方案组合。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。具有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求并支付必要费用后由专利局提供。

图1A至图1E示出了根据本公开的一些实施方案检测样品中的多种分析物的方法的实例。图1A示出了磁性颗粒，每个磁性颗粒与相应捕获部分和目标分析物偶联。图1B示出了图1A的分析物，所述分析物各自与报告物结合部分缔合，所述报告物结合部分具有与其结合的标签。图1C示出了最终的可检测复合物，所述复合物各自是在具有结合的标签结合配偶体的相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与图1A的相应报告物结合部分结合时形成的。所述报告物各自可以产生不同颜色的信号。图1D示出可以施加磁场使得图1C的复合物从样品中分离。图1E示出对由图1D的复合物的报告物产生的不同信号的检测允许检测相应分析物。

图2A和图2B示出了根据本公开的一些实施方案检测样品中的多种分析物的方法的实例。图2A描绘了具有与其结合的标签(例如，脱硫生物素)和第一寡核苷酸的报告物结合部分，以及具有与其结合的标签结合配偶体(例如，链霉亲和素)和第二寡核苷酸的报告物(橙色)。图2B显示，当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸彼此互补时，它们彼此杂交而形成稳定的结构，从而将报告物结合部分与报告物缔合。

图3A和图3B示出了根据本公开的一些实施方案检测样品中的多种分析物的方法的另一实例。图3A描绘了具有与其结合的标签(例如，脱硫生物素)和第一寡核苷酸的报告物结合部分，以及具有与其结合的标签结合配偶体(例如，链霉亲和素)和第二寡核苷酸的报告物(橙色)。图3B显示，当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸彼此不互补时，标签-标签结合配偶体相互作用解离并且报告物结合部分不与报告物缔合。

图4描绘了根据本公开的一些实施方案检测HCG、PSA、TSH和CRP的多重免疫测定的性能。

具体实施方式

本公开提供了满足准确检测生物样品中的多种分析物这一需求的方法和系统。

在与诊断或治疗受试者有关的许多场景中，期望在同一样品中同时检测多种分析物，以便在更短的时间内进行更全面和更可靠的分析。检测样品中的不止一种分析物在法医学、生物特征识别、疾病追踪和其他各个领域也很重要。

传统的免疫测定系统可以利用自动化装备操作。然而，许多常规免疫测定存在处理时间长(例如，3-6小时)、灵敏度差(例如，检测限(LoD)在皮摩尔-纳摩尔范围内)以及要求大样品体积(例如，数百微升)等问题。此外，所需样品的体积可能与被探测分析物的数目成线性比例。例如，如果系统检测一种分析物需要大约100μl的样品，那么检测五种分析物就需要约500μl的样品体积。在许多情况下，对大样品体积的要求可能是一个限制。因此，以多重方式检测多种分析物仍然是一个挑战。

因此，本公开的实施方案提供了一种多重免疫测定，其特征在于跨不同样品(例如，体液)的低背景、高灵敏度和缩短的总测定时间。此外，多重分析是通过在不同的分析物和测定类型中使用相同或相似的程序来实现的，这可以降低成本，并提高分析的速度、可靠性和重现性。

在实施方案中，所述多重免疫测定采用磁性颗粒和报告系统进行荧光检测。每种被检测分析物都可以用不同的报告颗粒进行标记，因此与传统方法相比，所述方法可以更有效地根据分析物的数量进行调节。例如，检测一种、两种、三种、四种、五种、六种或超过六种分析物可能需要相同体积的样品。报告颗粒可能够产生某种颜色的信号(例如，包含一个或多个量子点的报告颗粒)，或者它可以具有将该报告颗粒与标记其他分析物的其他报告颗粒区分开来的其他性质。其他性质的非限制性实例包括表面电荷、电荷密度、散射性质以及报告粒子的其他性质。在一些实施方案中，报告颗粒可以与基于核酸的条形码缔合(例如，用所述基于核酸的条形码包被)，在这种情况下，可以使用聚合酶链反应(PCR)通过检测所述基于核酸的条形码来检测所述报告物。正交报告颗粒可以允许在小样品体积(例如，1μl样品)中同时测量超过一种单独的分析物。

在各个方面，本发明提供了一种用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法。所述方法包括：(a)使所述样品与至少一种磁性缀合物接触，所述至少一种磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与所述磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(b)使所述磁性缀合物与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(c)使所述磁性缀合物与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有相应标签结合配偶体，所述相应标签结合配偶体被配置为结合相应标签，从而任选地将报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；(d)施加磁场以分离所述至少一种磁性缀合物，所述至少一种磁性缀合物任选地具有与其缔合的所述多种分析物中的分析物和与相应报告物缔合的相应报告物结合部分，所述相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述相应报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物中每种分析物的存在、不存在或水平。

在实施方案中，当样品中存在分析物时，磁性缀合物将具有与其缔合的所述多种分析物中的分析物(所述分析物具有与相应报告物缔合的相应报告物结合部分，所述相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述相应报告物结合部分结合)。当样品中不存在分析物时，磁性缀合物将不会与分析物缔合。此外，在一些实施方案中，当磁性颗粒具有被配置为结合相应的不同分析物的多个捕获部分时，其中一个或多个捕获部分可能与相应分析物结合，而一个或多个其他捕获部分可能由于样品中不存在相应分析物而不与分析物结合。

在一些实施方案中，一种用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法包括：(a)使所述样品与至少一种磁性缀合物接触，所述至少一种磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与所述磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(b)使所述样品与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(c)使所述样品与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有与其结合的相应标签结合配偶体，使得所述标签结合配偶体结合相应标签，从而将与所述标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；(d)通过施加磁场从所述样品中分离所述多种分析物中的每种分析物，所述分析物具有相应磁性颗粒和与相应报告物缔合的相应报告物结合部分，所述相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述相应报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物中每种分析物的存在、不存在或水平。

在一些实施方案中，在步骤(b)和(c)之间单独或同时进行磁向下牵引和洗涤(重悬)，这可以去除可能存在于包括样品在内的反应混合物中的过量报告物结合部分。在去除过量报告物结合部分后，可以将样品与多个报告物重悬，在一些实施方案中，所述报告物可以具有基本上低于报告物结合部分的浓度。

可以根据本公开的实施方案使用各种标签和相应标签结合配偶体。在一些实施方案中，标签包含生物素且标签结合配偶体包含亲和素，或者标签包含异硫氰酸荧光素(FITC)且标签结合配偶体包含抗FITC抗体，或者标签包含二硝基苯酚(DNP)且标签结合配偶体包含抗DNP抗体，或者标签包含地高辛(DIG)且标签结合配偶体包含抗DIG抗体，或者标签包含Etag且标签结合配偶体包含抗Etag抗体(GAPVPYPDPLEPR(SEQ ID NO:1))，或者标签包含FLAG且标签结合配偶体包含抗FLAG抗体(DYKDDDDK(SEQ ID NO:2))，或者标签包含Myc且标签结合配偶体包含抗Myc抗体(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:3))，或者标签包含HA且标签结合配偶体包含抗HA抗体(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:4))，或者标签包含SNAP且标签结合配偶体包含苄基鸟嘌呤衍生物，或者标签包含“CLIP”且标签结合配偶体包含苄基胞嘧啶衍生物。

各种标签可用于根据本公开的实施方案的方法和试剂盒中。所述标签可以是，例如，肽标签、共价肽标签和蛋白质标签。

肽标签的非限制性实例包括ALFA标签，这是一种用于生物化学和显微镜学应用的从头设计的螺旋肽标签(SRLEEELRRRLTE(SEQ ID NO:5))。所述标签由一系列单结构域抗体识别；AviTag，一种允许被BirA酶生物素化的肽，因此该蛋白质可以被链霉亲和素分离(GLNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO:6))；C标签，一种与通过噬菌体展示开发的单结构域骆驼抗体结合的肽(EPEA(SEQ ID NO:7))；钙调蛋白标签，一种由钙调蛋白结合的肽(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL(SE Q ID NO:8))；聚谷氨酸标签，一种与阴离子交换树脂诸如Mono-Q有效结合的肽(EEEEEE(SEQ ID NO:9))；聚精氨酸标签，一种与阳离子交换树脂有效结合的肽(5至9个连续R)；E标签，一种由抗体识别的肽(GAPVPYPDPLEPR(SEQ ID NO:1))；FLAG标签，一种由抗体识别的肽(DYKDDDDK(SEQ ID NO:2))；HA标签，一种由抗体识别的来自血凝素的肽，(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:4))；His标签，由镍或钴螯合物结合的5-10个组氨酸(HHHHHH(SEQ ID NO:10))；Myc标签，一种由抗体识别的源自c-myc的肽(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:3))；NE标签，一种由单克隆IgG1抗体识别的18个氨基酸的合成肽(TKENPRSNQEESYDDNES(SEQ ID NO:11))；Rho1D4标签，是指牛视紫红质细胞内C末端的最后9个氨基酸(TETSQVAPA(SEQ ID NO:12))；S标签，一种源自核糖核酸酶A的肽(KETAAAKFERQHMDS(SEQ ID NO:13))；SBP标签，一种与链霉亲和素结合的肽(MDEKTTGWRGGHV VEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP(SEQ ID NO:14))；Spot标签，一种由纳米抗体识别的肽(PDRVRAVSHWSS(SEQ ID NO:15))，用于免疫沉淀、亲和纯化、免疫荧光和超分辨率显微镜技术；Strep标签，一种与链霉亲和素或称为链霉肌动蛋白的修饰链霉亲和素结合的肽(Stre p标签II：WSHPQFEK(SEQ ID NO:16))；T7标签，一种源自T7基因的T7主要衣壳蛋白的表位标签(MASMTGGQQMG(SEQ ID NO:17))；TC标签，一种由FlAsH和ReAsH双砷化合物识别的四半胱氨酸标签(CCPGCC(SEQ ID NO:18))；Ty标签(EVHTNQDPLD(SEQ ID NO:19))；V5标签，一种由抗体识别的肽(GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:20))；VSV标签，一种由抗体识别的肽(YTDIEMNRLGK)；和Xpress标签(DLY DDDDK(SEQ ID NO:21))。

共价肽标签的非限制性实例包括Isopeptag，一种与菌毛蛋白(pilin)-C蛋白共价结合的肽(TDKDMTITFTNKKDAE(SEQ ID NO:22))；SpyTag，一种与SpyCatcher蛋白共价结合的肽(AHIVMVDAYKPTK(SEQ ID NO:23))；SnoopTag，一种与SnoopCatcher蛋白共价结合的肽(KLGDIEFIKVNK(SEQ ID NO:24))；DogTag，一种与SnoopTagJr共价结合的肽，由SnoopLigase介导(DIPATYEFTDGKHYITNEPIPPK(SEQ ID NO:25))；SdyTag，一种与SdyCatcher蛋白共价结合的肽(DPIVMIDNDKPIT(SEQ ID NO:26))；和SdyTag/SdyCatcher，与SpyTag/SpyCatcher具有动力学依赖性的交叉反应性。

蛋白质标签的非限制性实例包括：BCCP(生物素羧基载体蛋白)，一种被BirA生物素化的蛋白质结构域，能够由链霉亲和素识别；谷胱甘肽-S-转移酶标签，一种与固定化谷胱甘肽结合的蛋白质；绿色荧光蛋白标签，一种自发荧光并且可以由纳米抗体结合的蛋白质；HaloTag，一种共价附接至卤代烷底物的突变细菌卤代烷脱卤素酶；SNAP标签，一种共价附接至苄基鸟嘌呤衍生物的突变真核DNA甲基转移酶；CLIP标签，一种共价连接至苄基胞嘧啶衍生物的突变真核DNA甲基转移酶；HUH标签，一种与其靶序列共价结合的序列特异性单链DNA结合蛋白；麦芽糖结合蛋白标签，一种与直链淀粉琼脂糖结合的蛋白质；Nus标签；硫氧还蛋白标签；Fc标签，源自免疫球蛋白Fc结构域，允许二聚化和溶解；以及糖类识别结构域或“CRDSAT标签”，一种与乳糖琼脂糖或琼脂糖凝胶结合的蛋白质。

在一些实施方案中，选择标签和相应标签结合配偶体来检测样品中的多种分析物，以便使用不同的标签-标签结合配偶体对来检测所述多种分析物的每种分析物。因此，与报告物结合部分结合的标签将仅与相应标签结合配偶体相互作用，所述标签结合配偶体在特定多重反应中对此标签具有特异性。通过这种方式，使用对某分析物具有特异性的标签-标签结合配偶体对将报告物结合部分(结合至标签)与报告物(结合至标签结合配偶体)缔合，从而允许通过测量报告物的性质(例如，但不限于颜色、荧光强度等)来检测分析物。

在一些实施方案中，可以使用能够产生不同颜色信号的报告物。可以采用不同的合适技术。例如，在一些实施方案中，报告分子可以是涂有有机荧光染料的珠粒或其他类型的报告物。在一些实施方案中，报告分子是荧光团编码的微珠，例如编码不同染料的珠粒。

在一些实施方案中，报告物可以是荧光报告物、磷光报告物或比色报告物(诸如有色颗粒)，所述报告物可以被配置为测量光的吸收或散射(或者，例如通过比色分析测量某种颜色的存在/不存在)。

在一些实施方案中，报告物包含一个或多个量子点。量子点可以被配置为发射具有特定颜色(波长和频率)的信号。众所周知，原子可以发出的光的颜色取决于原子的身份，即不同的原子可以产生不同颜色的光。这是因为原子中的能级具有设定的值，即它们是量子化的。量子点以类似的方式产生光，因为它们内部约束的电子和空穴赋予它们类似的离散量子化能级。

量子点的能级取决于量子点的大小。例如，由相同材料制成的量子点将根据其大小产生不同颜色的光。量子点越大，它产生的波长越长(频率越低)。较小尺寸的量子点产生较短的波长(和更高的频率)。因此，在使用中，大量子点产生红光，小量子点产生蓝光，而中等大小的点产生绿光，以及其他颜色的光谱。量子点的发射光谱可以很好地彼此区分。

在一些实施方案中，光源可用于同时激发多个报告物(例如，能够产生不同颜色的量子点)。

在实施方案中，对报告物的检测允许检测在根据本公开实施方案的测定中与该报告物缔合的对应靶分析物的存在、不存在或数量。在实施方案中，对报告物的检测允许检测样品中的一种或多种分析物，这取决于样品中是否存在被检测的多种分析物中的一者或多者。

在一些实施方案中，检测到多种颜色使得检测到样品中的多种分析物。在一些实施方案中，检测到多种颜色使得检测到样品中的被检测分析物的全部。在一些实施方案中，检测到某些颜色使得检测到样品中的被检测分析物的一些但非全部。

在实施方案中，可以使用例如荧光显微镜技术、扫描电子显微镜(SEM)或其他技术来检测报告物。

在一些实施方案中，使用相同的标签和标签结合配偶体(其中标签和标签结合配偶体之间发生相对弱的相互作用)来检测样品中的多种分析物。在此类实施方案中，采用对每种分析物具有特异性的寡核苷酸对以实现报告物捕获部分(与标签缔合)和报告物(与标签结合配偶体缔合)之间的选择性相互作用和后续结合。在这些实施方案中，所述标签可以是具有短结合半衰期的标签，其也可以称为低亲和力标签或具有高解离速率的标签。低亲和力标签可以是(但不限于)包含脱硫生物素(或其衍生物或等效物)的标签，脱硫生物素是与亲和素(链霉亲和素同系物)结合的生物素类似物，其解离常数比生物素的解离常数弱10²-10⁴倍。脱硫生物素以类似的低亲和力与链霉亲和素结合。标签结合配偶体可以包括但不限于亲和素(例如，链霉亲和素)，或是能够以相对高解离常数(K_d)与所述标签形成相互作用的其他标签结合配偶体。例如，该K_d可以为生物素/链霉亲和素缔合的K_d的至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍，或至少约1000倍，或至少约10000倍大。

当对应标签和标签结合配偶体聚集在一起以在其之间产生低亲和力结合时，报告物结合部分与报告物之间的相互作用就发生了。结合发生迅速，但不稳定(高缔合速率(K_on)和高解离速率(K_off))。然而，在这些实施方案中，通过使用可以彼此杂交从而将报告物结合部分与报告物缔合的寡核苷酸可以促进报告物结合部分与报告物之间的相互作用。在此类实施方案中，选择寡核苷酸对使得它们对于从多种分析物中检测某种分析物是唯一的。

因此，在一些实施方案中，报告物结合部分具有与其结合的第一寡核苷酸，并且报告物具有与其结合的第二寡核苷酸，其中第二寡核苷酸被配置为在标签与标签结合配偶体相互作用时与第一寡核苷酸杂交，从而将报告物结合部分与报告物缔合。所述标签是低亲和力标签，例如但不限于脱硫生物素或其衍生物或等效物，或任何其他低亲和力标签。标签结合配偶体包括(例如，但不限于)亲和素(例如，链霉亲和素)，或能够与相应标签形成弱结合的另一标签结合配偶体。低亲和力标签与相应配偶体的结合迅速但微弱，具有高缔合速率和高解离速率，只有当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸之间存在互补性时，报告物结合部分与报告物之间才会产生稳定的结合。第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间的相互作用是高亲和力的，当寡核苷酸彼此互补并且报告物和报告物结合部分因此聚集在一起时，报告缀合物形成。如果第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间没有互补性，则标签-标签结合配偶体的结合强度迅速下降，并且报告物结合部分不会与报告物缔合。

第一寡核苷酸和第二寡核苷酸可以彼此完全互补或部分互补。对于待检测的多种分析物的每种分析物，可以选择第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，使得它们彼此杂交，并且它们不与用于检测所述多种分析物中另一种分析物的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸杂交。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各自具有约50个核苷酸或更少的长度。例如，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸可以具有约10个核苷酸、或约20个核苷酸、或约30个核苷酸、或约40个核苷酸、或约50个核苷酸、或约60个核苷酸的长度。

根据本公开实施方案的方法允许检测样品中的各种分析物。在一些实施方案中，分析物包含抗原。

在一些实施方案中，所述至少一种磁性缀合物的所述多个捕获部分中的捕获部分包含被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物的抗体。与磁性颗粒偶联的所述多个捕获部分中的全部或至少一些捕获部分可以是抗体。使用此类捕获部分可以同时检测各种分析物(例如，血液中的hCG、PSA、TSH和CRP)。

在一些实施方案中，所述至少一种磁性缀合物的所述多个捕获部分中的捕获部分包含被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物的第一抗体，其中报告物结合部分包含被配置为结合相应分析物的第二抗体。在一些实施方案中，所述多种分析物可以包含多种抗体，并且所述至少一种磁性缀合物的捕获部分可以包含被配置为结合相应抗体的抗原。在一些实施方案中，所述多个报告物结合部分中的报告物结合部分包含被配置为结合所述抗原的第二抗体。所述方法可以指示受试者是否产生针对抗原的抗体。在一些实施方案中，所述方法可以提供样品中抗体的数量。在一些实施方案中，捕获部分和报告物结合部分结合分析物的不同部分。在一些实施方案中，捕获部分和报告物结合部分是不同的。在一些实施方案中，捕获部分和报告物结合部分结合至不同的抗原或表位。

各种报告物可用于本公开的实施方案中。在一些实施方案中，报告分子是金属芯和二氧化硅壳或所述报告物；其中所述二氧化硅壳任选地浸渍有多个量子点；并且其中所述金属芯任选地包含金。在一些实施方案中，报告物包含多个量子点、单个量子点、有机染料、上转换荧光粉和其他类型。

在实施方案中，所述方法采用相对少量的多个量子点，例如约400pM或更少，或约300pM或更少，或约200pM或更少，或约100pM或更少，或约50pM或更少，或约10pM或更少，例如约400pM，或约300pM，或约200pM或更少，或约100pM，或约50pM，或约10pM。

在一些实施方案中，报告物是荧光报告物、磷光报告物或比色报告物。

在本公开的实施方案中，使用报告物结合部分允许显著提高检测速度，所述报告物结合部分具有与其结合的标签，并且被配置为通过可与标签相互作用(例如，通过抗原-抗体相互作用)的标签结合配偶体与报告物缔合。报告物结合部分的浓度可以显著大于报告物的浓度–例如，报告物结合部分的浓度可以在纳摩尔范围内，而报告物的浓度可以在皮摩尔范围内。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度可以为约10^-6M，或约10^-7M，或约10^-8M。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度可以为至少约10^-6M，或至少约10^-7M或至少约10^-8M。报告物的浓度可以小于约10^-11M，或不大于10^-11M。因此，可检测复合物(即，包含与磁性颗粒和报告物结合的分析物的复合物)的产生动力学得到显著改善，在一些情况下快了1000倍。此外，与样品中存在的未检测到的分析物相比，结合的可检测分析物的比例可以显著提高，在一些情况下高达100％。这进一步提高了信噪比，降低了背景噪声，并提高了多重检测的特异性和灵敏度。

因此，在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度大于报告物的浓度，任选地是至少5倍大，或至少10倍大，或至少100倍大，或至少1000倍大。

在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度或所述多个报告物结合部分(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个、或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物结合部分)的浓度是报告物的浓度或所述多个报告物(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物)的浓度的约1000倍大。

在一些实施方案中，所述报告物的浓度或所述多个报告物(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物)的浓度在皮摩尔范围内。例如，所述报告物的浓度或所述多个报告物(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物)的浓度可以为小于约300pM。在一些实施方案中，所述报告物的浓度或所述多个报告物(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物)的浓度为约10pM至约140pM，或约40pM至约140pM、约40pM至约100pM，或约60pM至约100pM，或约80pM至约100pM，或约100pM至约140pM。在一些实施方案中，所述报告物的浓度或所述多个报告物(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物)的浓度为约20pM，或约40pM，或约60pM，或约80pM，或约100pM。在一些实施方案中，所述报告物的浓度或所述多个报告物(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物)的浓度为约120pM。

在一些实施方案中，所述报告物结合部分的浓度或所述多个报告物结合部分(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物结合部分)的浓度在纳摩尔范围内。例如，所述报告物结合部分的浓度或所述多个报告物结合部分(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物结合部分)的浓度可以为大于约1nm。在一些实施方案中，所述报告物结合部分的浓度或所述多个报告物结合部分(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物结合部分)的浓度为约1nm至约60nM，或约1nm至约50nM，或约1nm至约40nM，或约1nm至约30nM，或约1nm至约20nM，或约1nm至约15nM，或约1nm至约10nM，或约1nm至约5nM。在一些实施方案中，所述报告物结合部分的浓度或所述多个报告物结合部分(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物结合部分)的浓度为约100nm至约700nM，例如约100nM，或约200nM，或约300nM，或约400nM，或约500nM，或约600nM，或约600nM。

在一些实施方案中，所述报告物结合部分的浓度或所述多个报告物结合部分(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物结合部分)的浓度在约1nM至约10nM的范围内，并且所述报告物的浓度在约15pM至约25pM的范围内。在一些实施方案中，所述报告物结合部分的浓度或所述多个报告物结合部分(例如，至少2个，或至少3个，或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少10个报告物结合部分)的浓度为约5nM，并且所述报告物的浓度为约20pM。

在实施方案中，所述多个报告物中的每个报告物能够产生相应信号，所述信号具有至少一种与由所述多个报告物中的另一报告物产生的信号的性质不同的性质。

在实施方案中，所述方法允许同时检测至少四种分析物、或至少六种分析物或任何其他数目的分析物。在一些实施方案中，所述方法允许检测至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种分析物，或超过10种分析物。在一些实施方案中，所述方法允许检测2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种或10种分析物，或超过10种分析物。

使用根据本公开实施方案的方法可以检测各种分析物。在一些实施方案中，分析物是或包含蛋白质生物标志物。在一些实施方案中，分析物是或包含以下一项或多项：人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促黄体激素(LH)/黄体生成素、前列腺特异性抗原(PSA)、单纯疱疹病毒(HSV)抗体、雌酮-3-葡糖苷酸(E3G)、细菌、血红蛋白A1C、C反应蛋白(CRP)、炎症生物标志物、肌钙蛋白、莱姆病抗原、莱姆病抗体、LDL生物标志物、HDL生物标志物、总胆固醇生物标志物、促甲状腺激素、丙型肝炎病毒生物标志物、鼻病毒生物标志物、流感病毒生物标志物、肝功能生物标志物、雌激素、孕酮、乳酸以及它们的组合(例如，上述物质中的至少2者，或至少3者，或至少4者，或至少5者，或至少6者，或至少10者)。在一些实施方案中，分析物另外或替代地包含以下一项或多项：N末端(NT)-前激素BNP(NT-proBNP)、C反应蛋白(CRP)、D-二聚体、维生素D、维生素B12、T3、T4、促甲状腺激素(TSH)、甲状旁腺激素(PTH)、促卵泡激素(FSH)、铁蛋白、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、孕酮、雌二醇、睾酮、前列腺特异性抗原(PSA)和同型半胱氨酸，以及它们的组合(例如，上述物质中的至少2者，或至少3者，或至少4者，或至少5者，或至少6者，或至少10者)。

在一些实施方案中，蛋白质生物标志物选自由以下组成的组：人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促黄体激素(LH)/黄体生成素、前列腺特异性抗原(PSA)、单纯疱疹病毒(HSV)抗体、雌酮-3-葡糖苷酸(E3G)、细菌、血红蛋白A1C、C反应蛋白、炎症生物标志物、肌钙蛋白、莱姆病抗原、莱姆病抗体、LDL生物标志物、HDL生物标志物、总胆固醇生物标志物、促甲状腺激素、丙型肝炎病毒生物标志物、鼻病毒生物标志物、流感病毒生物标志物、肝功能生物标志物、雌激素、孕酮、乳酸以及它们的组合(例如，上述物质中的至少2者，或至少3者，或至少4者，或至少5者，或至少6者，或至少10者)。

在实施方案中，样品的非限制性实例包括全血、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液、脑脊液(CSF)、精液、粘液、痰液、月经血、月经液、阴道粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、射精前液、恶露、发炎性分泌物(Rheum)、淋巴液、脓液以及它们的组合。在一些实施方案中，样品是全血、血浆、血清或尿液。

在一些实施方案中，样品具有约1微升的体积。在一些实施方案中，样品具有小于1微升的体积。在一些实施方案中，样品具有约2微升、或约3微升、或约4微升、或约5微升的体积。

在一些实施方案(例如，其中所检测分析物包含抗体)中，所述方法还包括用包含磁性颗粒和被配置为结合污染物抗体和/或非抗体部分的部分的磁性缀合物对所述样品进行预处理的步骤。在一些实施方案中，污染物抗体不针对被配置为结合相应抗体的抗原，或者在针对被配置为结合相应抗体的抗原产生免疫应答方面无效。在一些实施方案中，其中预处理减少或消除以下一项或多项：(a)嗜异性抗体；(b)与磁性颗粒非特异性相互作用的抗体；以及(c)与磁性颗粒非特异性相互作用的非抗体部分。

在一些实施方案中，所述方法适于即时使用。在一些实施方案中，所述方法适于现场使用和/或所述方法适于家庭使用。

在一些实施方案中，所述方法与世界卫生组织的ASSURED(经济、灵敏、特异、易使用、快速且稳定、无需设备和可传送)标准兼容。

在一些实施方案中，所述方法基本上无假阳性。在一些实施方案中，所述方法基本上无假阴性。

在一些实施方案中，与固相免疫测定方法、基于珠粒的流式细胞术或侧流免疫色谱测定相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。

在一些实施方案中，与使用以基于珠粒的流式细胞术为基础的测定、任选地是基于珠粒的基于流式细胞术的测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。在一些实施方案中，与使用侧流免疫色谱测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。

在一些实施方案中，所述方法提供纳摩尔、或皮摩尔、或飞摩尔级的灵敏度。

在各个方面，本发明提供了适用于本文公开的任何实施方案的方法的试剂盒。所述试剂盒可包括所述至少一种磁性缀合物、所述多个报告物结合部分和所述多个报告物。

在实施方案中，根据本公开的方法采用基于纳米颗粒的免疫测定，所述免疫测定被配置为通过检测报告物来检测抗体的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，免疫测定可以类似于PCT/US2018/015440(公布为WO2018140719)中描述的测定或作为这些测定的变型或组合实现，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。

免疫测定

本文所述的方法包括用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法。

图1A至图1E示出了检测样品中的多种靶分析物的方法的实例。图1A示出了磁性颗粒，所述磁性颗粒各自与相应捕获部分和目标分析物(“靶分析物”)偶联。在此实例中，检测五种目标分析物102、104、106、108和110，如仅出于说明目的所示的。

图1B显示，图1A的分析物102、104、106、108和110各自可以与报告物结合部分(“报告部分”)和与所述报告物结合部分结合的标签(“报告标签”)缔合。在图1C中，最终复合物形成，其中相应报告物202、204、206、208和210与每个报告物结合部分结合，所述报告物结合部分进而又与分析物102、104、106、108和110中的分析物结合。报告物202、204、206、208和210各自可以产生不同颜色的信号，这些颜色有例如橙色(202)、黄色(204)、红色(206)、绿色(208)和蓝色(210)。例如，每个报告物可以包含一个或多个具有不同大小的量子点。每个报告物具有与其结合的标签结合配偶体，所述标签结合配偶体被配置为与相应标签结合，从而将报告物与通过标签-标签结合配偶体相互作用与该标签结合的报告物结合部分缔合。图1D示出可以施加磁场使得复合物从样品中分离。然后可以将样品的其余部分洗掉(“洗涤”)。

图1E示出对由报告物202、204、206、208和210产生的不同信号的检测允许检测与这些报告物缔合的相应抗体。在此实例中，报告物202、204、206、208和210分别产生信号(光谱)302、304、306、308和310，这些信号具有不同的颜色。通过这种方式，可以检测样品中的多种分析物。然而，应当理解，取决于样品中是否存在分析物，根据报告物的检测结果可能会检测到或可能不会检测到对应信号。

在一些实施方案中，为了形成最终可检测复合物以便检测多种分析物中的每种分析物，可以通过与报告物结合部分和报告物结合的对应寡核苷酸之间的相互作用将报告物结合部分与相应报告物缔合。

在实施方案中，所述方法检测一种或多种分析物的存在以及一种或多种分析物的不存在。在实施方案中，所述方法检测多种分析物的浓度或水平。

图2A和图2B示出了根据本公开的一些实施方案检测样品中的多种分析物的方法的实例。图2A描绘了具有与其结合的标签(例如，脱硫生物素)和第一寡核苷酸的报告物结合部分(具有抗体样形状，仅举例说明)，以及具有与其结合的标签结合配偶体(例如，链霉亲和素)和第二寡核苷酸的报告物(橙色圆圈)。在图2A和图2B的实例中，第一核苷酸和第二寡核苷酸是彼此互补的。

如图2A所示，报告物结合部分与标签缔合，使得标签定位在靠近报告物结合部分的位置。标签可以与第一寡核苷酸偶联。在一些实施方案中，标签可以以其他方式与报告物结合部分缔合。同样如图2A所示，报告物与标签结合配偶体(例如，链霉亲和素)缔合，使得标签结合配偶体定位在与报告物偶联的末端相反的第二寡核苷酸的末端。通过这种方式，当标签和标签结合配偶体彼此缔合时，利用快速缔合速率和快速解离速率，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸被定位成进行可能的对齐，条件是它们之间存在互补性。因此，图2B显示，由于图2A的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸彼此互补，它们彼此杂交而形成稳定的结构，从而将报告物结合部分与报告物缔合。

应当理解，足以进行杂交的第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间的互补性可以小于100％互补性。例如，在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸可以为至少约60％、至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约98％、或至少约99％、或100％彼此互补。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸彼此完美互补。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸彼此不完美互补。第一寡核苷酸与第二寡核苷酸之间的杂交可能不需要完美的互补性。

图3A和图3B示出了根据本公开的一些实施方案检测样品中的多种分析物的方法的另一实例。图3A描绘了具有与其结合的标签(例如，脱硫生物素)和第一寡核苷酸的报告物结合部分，以及具有与其结合的标签结合配偶体(例如，链霉亲和素)和第二寡核苷酸的报告物(橙色)。在图3A和图3B的实例中，第一核苷酸和第二寡核苷酸彼此不互补。图3B显示，当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸彼此不互补(或不充分互补)时，标签-标签结合配偶体相互作用解离并且报告物结合部分不与报告物缔合。

在某些实施方案中，本文所述的方法涵盖夹心法、分次添加法、竞争法、三级(三结合事件)法、全细胞测定法或它们的组合。

例如，用于检测上述多种分析物的夹心法可能非常适于处理小流体样品体积。本文所述的分次添加法使得能够以提高的灵敏度处理更大的流体体积。竞争测定法可用于例如在没有匹配的捕获部分和相应报告物结合部分(它们可同时与分析物结合)对的场景下测定分析物。三级测定法可以涵盖三个结合事件，以增强用于本发明方法的系统的动力学。

在一些实施方案中，用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法可以包括夹心法、分次添加法和/或竞争测定法，或它们的任何组合。

在实施方案中，本文所述的方法采用免疫测定，诸如基于纳米颗粒的免疫测定，所述免疫测定被配置为对生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量进行本发明的检测。基于纳米颗粒的免疫测定可以作为多重测试平台的一部分来实现，所述多重测试平台可以是便携式系统。所述系统可以是试剂盒的形式，包括执行本发明检测所需的所有组分。

在根据夹心免疫测定法实现的方法的一些实施方案中，报告物可以是例如具有浸渍有100-600个量子点的二氧化硅壳的一个或多个金芯颗粒(nanoCompos ix,San Diego,CA)。在一些实施方案中，报告物包含一个或多个量子点，或另一种纳米颗粒。

在一些实施方案中，可使用的报告物是明亮的报告物(即，产生高质量的信号)，具有高表面积，并且在分析过程中保持胶体稳定。例如，在一些实施方案中，这种报告物可以是包括大量(例如，几百个)高荧光量子点的颗粒，提供高达约300倍的信号光学放大。

夹心免疫测定涉及检测是否形成包含至少一种磁性缀合物、目标分析物和与相应报告物缔合的报告物结合部分(所述相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述报告物结合部分结合)的复合物。在一些实施方案中，所述至少一种磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物。通过这种方式，可以使用相同的磁性颗粒检测样品中的多种分析物。所述测定可以包括一种磁性缀合物，所述磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物。在一些实施方案中，所述测定包括超过一种磁性缀合物。此外，在一些实施方案中，所述测定可以包括各种类型的磁性缀合物，包括至少一种包含磁性颗粒和多个与该磁性颗粒偶联的捕获部分的磁性缀合物，以及至少一种包含磁性颗粒和一个与该磁性颗粒偶联的捕获部分的磁性缀合物。

复合物(“夹心”)仅在存在分析物时形成。当存在分析物时，所得复合物可以被磁铁吸引并提供光信号，光信号的强度随着分析物浓度的增加而增加。

在不存在分析物时，夹心复合物无法形成，因为报告物结合部分/报告系统不与磁性缀合物结合。当不与磁性颗粒缔合时，报告物被洗掉，并且在分析样品时不会产生信号。

在夹心免疫测定法的一些实施方案中，可以将磁性缀合物(包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与所述磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合多种分析物中的相应分析物)、多个报告物结合部分(各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合多种分析物中的相应分析物)，以及多个报告物(各自具有与其结合的相应标签结合配偶体，使得所述标签结合配偶体结合相应标签，从而将与所述标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号)添加到分析腔室中并与包含一种或多种目标分析物的生物样品混合。可以通过磁体施加磁场(“向下牵引”)以将分析物从样品中分离。可以通过向样品(添加有其他成分)施加磁场持续一定时间(例如，约1分钟，或约2分钟，或约3分钟，或约4分钟，或约5分钟，或约6分钟，或约7分钟)来进行向下牵引。在一些实施方案中，施加磁场持续约5分钟。然而，应当理解，可以持续任何合适的持续时间向样品施加磁场。

如果报告物是荧光信号报告物(例如，有机染料、纳米材料或共轭聚合物)，则光随后可以透射通过分析腔室的至少一部分以使报告物发出荧光。这种荧光可以通过合适的检测器检测到。在实施方案中，与相应的不同分析物缔合的报告物可以产生不同颜色的信号，使得对报告物的检测允许确定被检测的多种分析物中的分析物的存在或数量。在不存在一种或多种目标分析物时，报告物不会与分析物一起被向下牵引，也不会发生荧光。

在一些实施方案中，本文所述的方法可包括：使所述样品与磁性缀合物接触，所述磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与所述磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(b)使所述磁性缀合物与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(c)使所述磁性缀合物与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有相应标签结合配偶体，所述相应标签结合配偶体被配置为结合相应标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；(d)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物任选地具有与其缔合的所述多种分析物中的分析物，所述分析物具有与相应报告物缔合的相应报告物结合部分，所述相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述相应报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物中每种分析物的存在、不存在或水平。

在上述实施方案中，磁性缀合物包含磁性颗粒，具有多个捕获部分，所述多个捕获部分与磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物。在一些实施方案中，磁性缀合物包含磁性颗粒，所述磁性颗粒与一个捕获部分偶联。因此，在一些实施方案中，用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法包括：(a)使所述样品与多种磁性缀合物接触，所述磁性缀合物各自包含磁性颗粒和被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物的捕获部分；(b)使所述磁性缀合物与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(c)使所述磁性缀合物与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有与其结合的相应标签结合配偶体，所述标签结合配偶体被配置为结合相应标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；(d)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物各自任选地具有所述多种分析物中的分析物，所述分析物具有与相应报告物缔合的相应报告物结合部分，所述相应报告物与所述相应报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物中每种分析物的存在、不存在或水平。

如果报告物是荧光信号报告物，则光可以透射通过携带样品的分析腔室的至少一部分以使报告物发出荧光，并且发射的荧光通过合适的检测器来测量。可以使用例如光源和光电检测器检测报告物。在实施方案中，与对应分析物结合(如果样品中存在分析物)的每个报告物产生具有不同性质(诸如颜色)的相应信号，因此所述方法允许区分样品中的不同分析物。

在一些实施方案中，除颜色以外或替代地，报告颗粒性质诸如表面电荷、电荷密度、散射性质以及其他性质可用于区分被检测的不同分析物。在一些实施方案中，报告颗粒可以与基于核酸的条形码缔合(例如，用所述基于核酸的条形码包被)，在这种情况下，可以使用聚合酶链反应(PCR)通过检测所述基于核酸的条形码来检测所述报告物。

在实施方案中，可以同时或在不同时间将至少一种磁性缀合物(包含磁性颗粒和与所述磁性颗粒偶联的多个捕获部分)、多个报告物结合部分和多个报告物添加到分析腔室中。因此，在一些实施方案中，可以单独添加磁性缀合物、多个报告物结合部分和多个报告物。此外，在一些实施方案中，多个报告物结合部分和多个报告物可以彼此预先结合。

在一些实施方案中，免疫测定法是一种分次添加法，其可用于处理更大的样品体积(但也可以分析小样品)，并且允许浓缩目标分析物。这种方法可允许以提高的灵敏度同时检测一种或多种分析物。在分次添加法中，可以将至少一种磁性缀合物添加到分析腔室中并与样品混合，所述样品可能包括也可能不包括目标分析物，或者其可以包括所检测多种分析物中的一些但不非全部。可以通过激活磁场(使得分析物(如果存在)与磁性缀合物的相应捕获部分结合)来进行向下牵引，并且可以去除一定体积(例如，一部分)的样品。然后可以添加另外体积的样品。在添加另外体积的样品之后(或在一些情况下，在添加之前)，可以使磁场解除激活，磁性缀合物可以再次与样品混合。该过程可以重复一定次数以浓缩分析物。在浓缩分析物之后，可以添加多个报告物结合部分和多个报告物并将其与样品混合，使得每个报告物结合部分结合多种分析物中的相应分析物，并且与报告物结合部分结合的标签与相应标签结合配偶体结合，所述标签结合配偶体进而又与相应报告物结合，从而将报告物结合部分与相应报告物缔合。然后可以再次进行磁向下牵引以分离分析物，所述分析物(如果存在)各自与相应磁性颗粒和报告物(通过报告物结合部分)结合。如果报告物是荧光信号报告物，则光可以透射通过分析腔室的至少一部分以使报告物发出荧光，并且发射的荧光通过合适的检测器来测量。在不存在分析物时，报告物将不会与分析物一起被向下牵引，也不会检测到荧光。

在一些实施方案中，执行竞争免疫测定法，所述方法可以包括两种类型的方法。每种方法都可用于同时检测样品中的多种分析物。

第一类竞争免疫测定法的方法可用于以下场景：分析物(例如，但不限于，抗原、抗体、细胞、细菌、病毒等)太小而无法同时结合相应捕获部分(其偶联至磁性颗粒，作为磁性缀合物的一部分)和报告物结合部分(其可能或可能不偶联至报告物，例如，通过标签-标签结合配偶体相互作用)。此方法也可用于捕获部分和报告物结合部分中任一者不可用的情况中。在此方法中，可以将磁性缀合物添加到测定腔室中，并与可能包括也可能不包括目标分析物的生物样品混合。然后可以添加报告物标记的第二分析物(一种形式与目标分析物不同的分析物，其被配置为在不存在目标分析物时结合磁性缀合物)并将其与样品混合。当样品中存在目标分析物时，报告物标记的第二分析物不与磁性缀合物结合，因为磁性缀合物的捕获部分的结合位点被目标分析物占据。但是，如果分析样品中不存在目标分析物，则磁性缀合物将与报告物标记的第二分析物结合。进行磁向下牵引以将目标分析物(如果存在)从样品中分离。如果报告物是荧光信号报告物，则光可以透射通过分析腔室的至少一部分以使报告物发出荧光，并且发射的荧光通过合适的检测器来测量。在不存在目标分析物时，报告物标记的分析物将与磁性缀合物一起被向下牵引，并且不会检测到荧光。

因此，在一些实施方案(例如，其中实现第一类竞争免疫测定法)中，本文所述的方法可包括以下步骤：(a)使样品与包含磁性颗粒和至少一个捕获部分的磁性缀合物接触，所述至少一个捕获部分被配置为结合样品中的目标分析物；(b)使磁性缀合物与报告物标记的第二分析物接触，所述第二分析物被配置为在样品中不存在所述分析物时结合磁性缀合物；(d)向分析腔室施加磁场以向下牵引磁性缀合物，所述磁性缀合物任选地具有与其缔合的分析物；以及(e)通过用光源和光电检测器检测报告物来检测分析物的存在、不存在或水平。

在第二类竞争免疫测定法中，磁性颗粒(例如，磁性珠粒)可以同与其结合的第二竞争分析物(例如，抗原、抗体或另一种类型)一起使用。第二分析物可以不同于目标分析物。第二分析物可以是，例如，被配置为结合报告物结合部分的抗原，所述报告物结合部分被配置为结合目标分析物。在不存在目标分析物时，第二分析物(与磁性颗粒结合)结合与报告物缔合的报告物结合部分。所得复合物可以被磁铁吸引并提供光信号，光信号的强度随着样品中目标分析物浓度的增加而降低。如果样品中存在目标分析物，则会阻止复合物的形成。特别地，当目标分析物存在于样品中时，它可以抢先结合报告物结合部分，与结合至磁性颗粒的第二分析物竞争形成完整复合物。例如，当目标分析物是抗原时，它会结合报告物结合部分(即，抗体)上的可用结合位点，从而阻止第二分析物(结合至磁性颗粒)与报告物结合部分(结合至报告物)结合。通过这种方式，报告物结合部分上的抗体结合位点被目标分析物占据，并且所述目标分析物因此竞争形成完整复合物。因此，当施加磁场时，与磁性颗粒结合且未与报告物结合的第二分析物被向下牵引。通过报告物结合部分与报告物结合的目标分析物(报告物和报告物结合部分可通过标签-标签结合配偶体相互作用)被洗掉。因此，由报告物产生的光信号的强度随着目标分析物浓度的增加而降低。

在第二类竞争免疫测定法中，在进行测定之前，可以将磁性颗粒与第二分析物偶联(以形成所谓的磁性颗粒标记的分析物)。在一些实施方案中，所述方法涉及使用包含报告物和报告物结合部分的报告缀合物。将报告缀合物添加到包含生物样品的分析腔室中，并将其与可能包含目标分析物的样品混合。将磁性颗粒和与其结合的第二分析物添加到分析腔室中并与样品混合。然后进行磁向下牵引以将磁性颗粒和与其结合的第二分析物从样品中分离。如果报告物是荧光信号报告物，则光可以透射通过样品以使报告物发出荧光，并且发射的荧光通过合适的检测器来测量。在存在目标分析物时，与第二分析物结合但不与报告物缔合的磁性颗粒被向下牵引，导致不存在荧光。取决于样品中目标分析物的浓度，由报告物产生的信号的强度随着分析物浓度增加而降低。

因此，在一些实施方案中(例如，其中实现第二类竞争免疫测定法)，本文所述的方法可包括以下步骤：(a)使样品与包含报告物和报告物结合部分的报告缀合物接触，所述报告物结合部分被配置为结合样品中的目标分析物；(b)使样品与磁性颗粒标记的第二分析物接触，所述第二分析物被配置为在样品中不存在目标分析物时结合报告缀合物；(c)通过向样品施加磁场将磁性颗粒标记的分析物从样品中分离；以及(d)通过检测报告物来检测分析物的存在、不存在或水平。可以例如，如上述实施方案所述，使用光源和光电检测器检测报告物。

如上文所讨论，在本公开的实施方案中，代替使用报告缀合物(即，报告物结合部分和与其结合的报告物)，多重检测方法可以涉及使用具有与其结合的标签(而不是报告物)的报告物结合部分。可以将具有与其结合的标签的报告物结合部分和具有与其结合的相应标签结合配偶体的报告物通过两个单独的步骤添加到反应混合物中。使用具有与其结合的标签的报告物结合部分(以及使用具有标签结合配偶体的报告物)允许增加报告物结合部分的浓度，并且报告物的浓度基本上低于报告物结合部分的浓度。最终复合物形成的速度显著提高，使得整个测定可以在不到20分钟的时间内(例如，在约15分钟内)进行，而传统测定可能需要长达6小时。

因此，在一些实施方案中，第二类竞争免疫测定法是多重免疫测定，其涉及使用标签和相应标签结合配偶体来检测样品中的多种分析物。可以选择标签和标签结合配偶体，使得唯一的标签-标签结合配偶体对用于检测多种分析物中的某种分析物。该对在检测测定的情形下是唯一的，使得标签和标签结合配偶体(它们可以彼此结合)不与该测定中使用的用于检测所述多种分析物中的其他分析物的任何其他标签和标签结合配偶体结合。

因此，在一些实施方案中，所述检测方法包括：(a)使样品与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应目标分析物；(b)使所述样品与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有与其结合的相应标签结合配偶体，使得所述标签结合配偶体结合相应标签，从而将与所述标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；(c)使样品与多个磁性颗粒标记的第二分析物接触，所述第二分析物各自被配置为在不存在所述多种分析物中的相应目标分析物时结合相应报告物结合部分；(d)通过向样品施加磁场从样品中分离所述多个磁性颗粒标记的分析物；以及(e)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述分析物的存在、不存在或水平。可以例如，如上述实施方案所述，使用光源和光电检测器检测报告物。

在实施方案中，可以使用竞争免疫测定法以多重方式检测生物样品中的多种目标分析物。如上文所讨论，所述方法可包括使用：多个报告物结合部分，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；以及多个报告物，所述多个报告物各自具有与其结合的相应标签结合配偶体，使得所述标签结合配偶体结合相应标签，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号。

在一些实施方案中，如上文所讨论，报告物结合部分(例如，低亲和力标签)和报告物可以各自具有与其结合的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，这些寡核苷酸可以彼此杂交，从而促进报告物结合部分与报告物之间的相互作用。第一寡核苷酸和第二寡核苷酸可以彼此互补，使得如果存在互补性，它们彼此结合，从而促进标签和标签结合配偶体的结合。标签可以对标签结合配偶体具有低亲和力，使得与标签结合的第一寡核苷酸和与标签结合配偶体结合的第二寡核苷酸之间的结合对于标签-标签结合配偶体缔合以及报告物结合部分与报告物之间的对应缔合是必需的。

在一些实施方案中，标签包含生物素且标签结合配偶体包含链霉亲和素，或者标签包含异硫氰酸荧光素(FITC)且标签结合配偶体包含抗FITC抗体，或者标签包含二硝基苯酚(DNP)且标签结合配偶体包含抗DNP抗体，或者标签包含地高辛(DIG)且标签结合配偶体包含抗DIG抗体，或者标签包含Etag且标签结合配偶体包含抗Etag抗体(GAPVPYPDPLEPR(SEQ ID NO:1))，或者标签包含FLAG且标签结合配偶体包含抗FLAG抗体(DYKDDDDK(SEQ IDNO:2))，或者标签包含Myc且标签结合配偶体包含抗Myc抗体(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:3))，或者标签包含HA且标签结合配偶体包含抗HA抗体(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:4))，或者标签包含SNAP且标签结合配偶体包含苄基鸟嘌呤衍生物，或者标签包含“CLIP”且标签结合配偶体包含苄基胞嘧啶衍生物。

在一些实施方案中，报告物结合部分具有与其结合的具短结合半衰期的标签(例如，脱硫生物素)和第一寡核苷酸，并且报告分子具有与其结合的标签结合配偶体(包含亲和素(例如，链霉亲和素))和第二寡核苷酸，其中第二寡核苷酸被配置为在报告物结合部分通过结合至报告物结合部分的具有短结合半衰期的标签与结合至报告物的亲和素之间的结合与相应报告物结合时与第一寡核苷酸杂交。

在一些实施方案中，用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法可包括：(a)使样品与多个报告物结合部分接触，每个报告物结合部分具有与其结合的相应标签并且被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(b)使所述样品与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有与其结合的相应标签结合配偶体，使得所述标签结合配偶体结合相应标签，从而将与所述标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；(c)使样品与具有与其结合的多种第二分析物的磁性颗粒接触，所述第二分析物各自被配置为结合相应报告物结合部分；(d)施加磁场以分离磁性颗粒，所述磁性颗粒任选地具有与其结合的多种第二分析物；以及(e)通过检测相应报告物来检测所述多种分析物的存在、不存在或水平。可以例如，如上述实施方案所述，使用光源和光电检测器检测报告物。

在一些实施方案中，实现三级免疫测定方法，所述方法利用三个结合事件来增强用于本发明的系统的动力学。三级结合法可以应用于夹心法、分次添加法和竞争测定(第一方法和第二方法)中或包括这些方法。三级模式可涉及使用：报告缀合物，所述报告缀合物包含具有与其结合的标签结合配偶体的报告物(例如，用链霉亲和素官能化的荧光量子点)和具有与其结合的标签的报告物结合部分(例如，用生物素标记的抗体)；以及包含磁性颗粒和多个捕获部分的磁性缀合物。样品可以置于分析腔室中。

三级结合方法可包括将磁性缀合物(包含磁性颗粒和多个捕获部分)添加到分析腔室中，并将磁性缀合物与可能包含至少一种目标分析物的样品混合。可以施加磁场(“向下牵引”)以将目标分析物从样品中分离。如上文所述，可以去除一定体积的样品，并且可以执行一次或多次分析物浓缩步骤。可以使磁场解除激活，并且可以将报告物结合部分(例如，具有与其结合的标签的抗体)添加到分析腔室中，所述报告物结合部分可以与目标分析物结合，所述目标分析物进而又与磁性缀合物结合。然后可以将报告物(具有与其结合的标签结合配偶体)添加到分析腔室中，所述报告物随后可以例如通过标签结合配偶体-标签相互作用(例如，链霉亲和素-生物素结合相互作用)与报告物结合部分结合。然后可以再次进行磁向下牵引以将目标分析物从样品中分离。如果报告物是荧光信号报告物，则光可以透射通过分析腔室的至少一部分以使报告物发出荧光，并且发射的荧光通过合适的检测器来测量。在不存在目标分析物时，不会发生荧光。

在一些实施方案(例如，其中实现三级免疫测定法)中，本文所述的方法可包括以下步骤：(a)使样品与至少一种磁性缀合物接触，所述至少一种磁性缀合物包含磁性颗粒和被配置为结合样品中多种分析物中的相应分析物的捕获部分；(b)施加磁场以将多种分析物中的每种分析物从样品中分离；(c)使所述磁性缀合物与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(d)使所述磁性缀合物与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有结合的相应标签结合配偶体，所述相应标签结合配偶体被配置为结合相应标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；(e)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物任选地具有所述多种分析物中的分析物，所述分析物具有与相应报告物缔合的相应报告物结合部分，所述相应报告物与所述相应报告物结合部分结合；以及(f)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物中每种分析物的存在、不存在或水平。

在上述实施方案中，在执行步骤(b)(通过磁铁向下牵引以将分析物从样品中分离)之后，并且在步骤(c)之前，可以使磁场解除激活。同样，在一些实施方案中，在步骤(b)之后且在步骤(c)之前，可以如上文所讨论去除一定体积的样品并且可以执行分析物浓缩步骤。

在一些实施方案中，多重检测方法包括全细胞免疫测定，其中可以在同一样品中同时检测多种不同类型的全细胞分析物(例如，不同的细菌)。全细胞免疫测定靶向目标细胞上存在的表面分析物(例如，生物标志物，诸如细胞表面受体)，从而检测整个细胞(例如，细菌)。测量全细胞的能力可以提供对健康、免疫病症、癌症和细菌感染的见解。就链球菌性咽喉炎而言，例如，检测酿脓链球菌是非常有价值的，因为这种感染在成人在儿童中非常流行。多重全细胞检测可以有利地允许检测复杂样品中的细菌，这可用于临床、流行病学和环境应用。

在实施方案中，全细胞免疫测定涉及使用磁性缀合物、多个报告物结合部分和多个报告物用于检测每种分析物。如在本文所述的其他实施方案中，磁性缀合物包含磁性颗粒和捕获部分，所述捕获部分与磁性颗粒偶联并且被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物。在一些实现方式中，磁性缀合物包含磁性颗粒，所述磁性颗粒具有与其偶联的多个捕获部分，所述多个捕获部分各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物。所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物。磁性缀合物的一个或多个捕获部分，和报告物结合部分(其可以是对目标细胞上的表面分析物具有特异性的抗体)可以被配置为结合被检测细胞表面分析物上的标志物(例如，细胞受体)。捕获部分和报告物结合部分可以被配置为与相同或不同的细胞表面受体结合。

所述多个报告物各自具有与其结合的相应标签结合配偶体，使得标签结合配偶体可以结合相应标签，从而将与所述标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合。每个报告物被配置为产生相应的不同信号，例如，具有不同颜色的信号。所述测定可以被设计成使得，对于每种类型的被检测细胞，将多个磁性颗粒和报告物与细胞缔合(通过对应捕获部分和报告物结合部分)。为了以多重方式检测多种分析物，选择不同类型的捕获部分和报告物结合部分以及不同的报告物来检测不同类型的细胞，例如像不同的细菌。

在全细胞多重免疫测定中，当目标细胞存在时，测定组分结合细胞表面上的细胞受体。所得复合物可以被磁铁吸引并且可以提供光信号，光信号的强度随着分析物浓度的增加而增加。如果样品中不存在目标细胞，则复合物不会形成，并且在磁向下牵引过程中报告系统被洗掉，从而产生负信号。

在各个实施方案中，用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法可以包括以下任一项：上述夹心法、分次添加法、竞争法(包括两种类型)、三级(三结合事件)法、全细胞或这些方法的组合和/或变型。在一些实施方案中，夹心法、分次添加法、竞争法和三级法中的一者或多者可以类似于PCT/US2018/015440(公布为WO2018140719)中描述的对应测定实现，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。

可以通过本发明方法来检测的分析物的非限制性实例包括以下一项或多项：人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促黄体激素(LH)/黄体生成素、前列腺特异性抗原(PSA)、单纯疱疹病毒(HSV)抗体、雌酮-3-葡糖苷酸(E3G)、细菌、血红蛋白A1C、C反应蛋白(CRP)、炎症生物标志物、肌钙蛋白、莱姆病抗原、莱姆病抗体、LDL生物标志物、HDL生物标志物、总胆固醇生物标志物、促甲状腺激素、丙型肝炎病毒生物标志物、鼻病毒生物标志物、流感病毒生物标志物、肝功能生物标志物、雌激素、孕酮、乳酸以及它们的组合。在一些实施方案中，分析物另外或替代地包含以下一项或多项：N末端(NT)-前激素BNP(NT-proBNP)、C反应蛋白(CRP)、D-二聚体、维生素D、维生素B12、T3、T4、促甲状腺激素(TSH)、甲状旁腺激素(PTH)、促卵泡激素(FSH)、铁蛋白、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、孕酮、雌二醇、睾酮、前列腺特异性抗原(PSA)和同型半胱氨酸，以及它们的组合(例如，上述物质中的至少2者，或至少3者，或至少4者，或至少5者，或至少6者，或至少10者)。

在一些实施方案中，分析物是全细胞，例如细菌、肿瘤细胞或任何其他类型的细胞，例如多个全细胞或一种或多种类型。本公开的实施方案还可用于检测病毒或其组分，例如多个病毒或其组分。

应当理解，本公开的实施方案提供了用于检测任何合适分析物的技术。

在实施方案中，被检测的多种分析物中的每种分析物(如果存在)与相应报告物缔合。具有不同性质的报告物用于与特定分析物缔合。例如，检测报告物产生的不同颜色的信号将允许区分不同的对应分析物，其中不同的颜色对应于对应分析物。分析物的存在、不存在或数量可以通过检测报告物的存在、不存在或不同强度(或其他性质)来确定。

在一些实施方案中，用于检测生物样品中多种目标分析物的存在、不存在或数量的方法可以包括，如上文所述结合分次添加法，浓缩目标分析物。在一些实施方案中，用于检测生物样品中多种目标分析物的存在、不存在或数量的方法可以包括竞争法和三级(三结合事件)法中的一者或两者的部分或全部步骤。

根据本公开实施方案的方法可以在本文使用的分析装置或系统的合适分析腔室中实现。在一些实施方案中，分析腔室包括或者是包括适当数量的孔的孔板。在实施方案中，多重检测分析可以在单个孔中进行。因此，孔板中的每个孔都可用于检测多种分析物。

分析系统可以包括被配置用于在其中接收生物样品的分析腔室、磁铁、光源和检测器(例如，光电检测器)等部件。分析系统可以包括磁铁或可以与磁铁相关联，磁铁可以是永磁体，其可以与分析腔室分开，以便向分析腔室施加磁场。在一些实施方案中，磁体可以是电磁铁，可以对其进行控制以将使其激活或解除激活，以便向分析腔室施加磁场。应当理解，根据本公开实施方案的分析装置或系统可以具有被配置为检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的任何合适的配置和任何合适的部件。

在一些实施方案中，分析系统包括连接至分析腔室或以其他方式与分析腔室相关联的光源。在一些实施方案中，光源被配置为使光透射通过分析腔室的至少一部分。

在一些实施方案中，分析腔室可以是一个腔室、或两个腔室、或三个腔室、或四个腔室。分析腔室可以包括多个腔室，这些腔室可以是超过四个腔室。在一些实施方案中，多个腔室可以彼此流体连通。在一些实施方案中，可以将生物样品、多个报告物、多个报告物结合部分、多个报告缀合物(各自包含报告物和报告物结合部分)和磁性缀合物(包含磁性颗粒和一个或多个与其缔合的捕获部分)中的一者或多者在所述多个腔室中的第一腔室中混合。在一些实施方案中，可以在所述多个腔室中的第二腔室中施加磁场，并且耦合至分析腔室的光源被配置为使光透射通过第二腔室。在一些实施方案中，本文所述的方法步骤可以各自在分析腔室的单独腔室中执行。在一些实施方案中，分析腔室可以是一个腔室，并且所有方法步骤可以在同一腔室中执行。

在一些实施方案中，光电检测器可以连接至分析腔室或以其他方式与分析腔室相关联(例如，定位为面向光源、与光源对齐、与光源相对，或呈其他方式)，并且可以被配置为检测由光源透射通过分析腔室的光，从而测量光的透射和/或吸收。在一些实施方案中，光电检测器可以相对于分析腔室定位，使得光电检测器与光源正交(正交照明)，并且可以被配置为检测分析腔室的一部分中的报告物或报告缀合物的荧光和/或磷光。在一些实施方案中，光电检测器可以相对于分析腔室定位，使得光电检测器与光源相对(透射照明)，并且可以被配置为检测分析腔室的一部分中的报告物或报告缀合物的荧光和/或磷光。在一些实施方案中，光电检测器可以连接至分析腔室(与光源对齐，例如通过二向色镜(顺光照明))，并且可以被配置为检测分析腔室的一部分中的报告物或报告缀合物的荧光和/或磷光。

本公开实施方案中使用的光电检测器可以具有各种配置。在一些实施方案中，光电检测器可包括一个或多个光电倍增管检测器和光电二极管检测器。如本文所用，术语“光电倍增器”或“光电倍增管”是指通过光电效应和二次电子发射将入射光子转换成电子的光学检测部件。术语光电倍增管意指包括含有用于电流倍增的单独倍增电极的器件以及含有一个或多个通道电子倍增器的那些器件。如本文所用，术语“光学检测器”或“光电检测器”是指当用光能照射时产生输出信号的器件。因此，术语光学检测器系统在其最广泛的意义上用于定义出于物理量测量或信息传递目的将能量从一种形式转换为另一种形式的装置。光学检测器包括但不限于光电倍增管和光电二极管。如本文所用，术语“光电二极管”是指固态光检测器类型，包括但不限于PN、PIN、APD、CMOS和CCD。在一些实施方案中，光电检测器可包括基于PN的检测器、基于PIN的检测器、基于APD的检测器、基于CMOS的检测器和基于CCD的检测器中的一者或多者。

在一些实施方案中，分析腔室包括如本文所述的光电检测器。在一些实施方案中，分析腔室包括包括基于PN的检测器、基于PIN的检测器、基于APD的检测器、基于CMOS的检测器和基于CCD的检测器中的一者或多者。

在各个实施方案中，分析装置或系统(其可以是试剂盒的形式)包括样品收集器，所述样品收集器被配置为接收从受试者获得的生物样品。在各个实施方案中，根据本公开的方法可涉及将从受试者获得的样品添加到分析腔室中。在一些实施方案中，将样品添加到分析腔室中可包括将样品递送至样品收集器。样品可以是血液、血浆或血清，并且样品收集器可以是或可以包括针刺(例如，刺血针)、注射器，或被配置为到达血液或另一种体液的另一形式的样品收集器。在一些实现方式中，样品收集器可以是可伸缩元件(可以是，例如，装载弹簧的可伸缩元件)，其可以在收集生物样品(例如，血液、血浆或血清)后安全地缩回样品收集管或其他隔室中。在一些实施方案中，用于安全样品收集的装置包括针刺(例如，刺血针)或注射器，其中针刺或注射器连接至盖子，所述盖子可拆卸地连接至样品收集管。在一些实施方案中，针刺、注射器或其他类型的样品收集器置于可拆卸的盖子(其可以连接至装置)中，所述盖子被配置为在不使用时覆盖样品收集器。可拆卸的盖子和/或样品收集器可以连接至阀门或被配置为激活以缩回样品收集器或以其他方式使样品收集器可用于样品收集的其他部件。在一些实施方案中，盖子可以被配置为自动打开，并且/或者样品收集器可以被配置为自动打开。

在一些实施方案中，样品收集器(例如，注射器)与分析装置或系统是分开的。单独的样品收集器可以是包括分析系统在内的试剂盒的一部分。

针刺、注射器或其他类型的样品收集器可以与分析腔室内部流体连通。因此，样品收集器可以将其中接收到的样品提供给分析腔室。在一些实施方案中，样品收集器可包括吸收剂和/或芯吸材料，或便于将收集的样品(例如，血液、血浆或血清)递送至分析腔室的其他类型的材料。

分析装置或系统可以是一次性的。在一些实施方案中，系统的零件(例如，样品收集器)可以是一次性的，而其他零件可以是可重复使用的。在一些实施方案中，系统的一些部件可以是可拆卸的和/或一次性的。

在一些实施方案中，可以将磁性缀合物、报告物、报告物结合部分和报告缀合物(包含报告物和报告物结合部分)中的一者或多者置于样品收集器处，并且使样品与磁性缀合物、报告物、报告物结合部分或报告缀合物接触的步骤可以在样品收集器处发生。在一些实施方案中，在将样品添加到样品收集器中之前，可以将磁性缀合物、报告物、报告物结合部分和报告缀合物中的一者或多者嵌入样品收集器的一部分中。在一些实施方案中，本文所述的方法可包括使分析腔室中的样品与磁性缀合物、报告物、报告物结合部分和/或报告缀合物接触。

在一些实施方案中，报告物可以是荧光报告物、磷光报告物或比色报告物(诸如有色颗粒)，所述报告物可以被配置为测量光的吸收或散射(或者，例如通过比色分析测量某种颜色的存在/不存在)。报告物可以具有被配置为与对应标签结合的标签结合配偶体，诸如上文所述的任何标签结合配偶体，或其他标签结合配偶体。

在一些实施方案中，本文所述的方法还可包括在使样品与磁性缀合物接触之后，通过向分析腔室施加磁场来浓缩样品中的目标分析物，然后减少分析腔室中样品的体积。在一些实施方案中，本文所述的方法还可包括在使样品与报告缀合物接触之前使磁场失活。

在一些实施方案中，减少分析腔室中样品的体积可以通过例如对一部分体积进行虹吸或通过去除全部样品并以新的较小体积重悬来进行。

在实施方案中，本文所述的方法还可包括以下步骤：在使样品与磁性缀合物接触之后，通过向分析腔室施加磁场来浓缩样品中的目标分析物；从分析腔室中去除一定体积的样品；以及将一定体积的缓冲液和/或另外体积的样品添加到分析腔室中。在一些实施方案中，本文所述的方法可包括在使样品与报告缀合物接触之前使磁场失活的步骤。

在一些实施方案中，本文所述的方法可包括将一定体积的缓冲液和/或另外体积的样品添加到分析腔室中的步骤。

在一些实施方案中，本文所述的方法可包括以下步骤：在将磁性缀合物向下牵引(即，施加磁场)之后以及在使样品与报告物结合部分接触之前或之后，从分析腔室中去除一定体积的样品。

在一些实施方案中，报告物结合部分包括用生物素标记的报告抗体，并且报告物用链霉亲和素功能化。在一些实施方案中，报告物结合部分(例如像报告抗体)用链霉亲和素功能化，并且报告物用生物素标记。

在根据本公开的可以利用本文所述的任何测定(或其他合适的测定)的任何实施方案中，标签和标签结合配偶体(有时也称为接头)可以是正交的，使得用于检测多种分析物中的某种分析物的标签和标签结合配偶体是唯一的(在该测定内)。

此外，在根据本公开的可以利用本文所述的任何测定(或其他合适的测定)的任何实施方案中，具有与其缔合的标签的报告物结合部分还具有与其结合的第一寡核苷酸，并且具有与其缔合的标签结合配偶体的报告物还具有与其结合的第二寡核苷酸，其中第二寡核苷酸被配置为在标签与标签结合配偶体相互作用时与第一寡核苷酸杂交，从而将报告物结合部分与报告物缔合。在此类实施方案中，标签是具有短结合半衰期的标签(例如，但不限于脱硫生物素、其衍生物或类似物)。标签结合配偶体可包括亲和素(例如，链霉亲和素)，或是能够以相对低解离常数(K_d)与所述标签形成相互作用的任何其他合适的标签结合配偶体。例如，该K_d可以比生物素/链霉亲和素缔合的K_d低至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍，或至少约1000倍，或至少约10000倍。

在各个实施方案中，本文所述的方法包括或利用例如用于检测报告信号的各种检测技术。检测技术可包括使用显微镜、分光光度计、荧光计、管式光度计或板式光度计、x射线技术、磁场、闪烁体、荧光激活细胞分选(FACS)设备、微流体设备、基于珠粒的设备等。

在一些实施方案中，磁性缀合物的磁性颗粒是顺磁性颗粒。在一些实施方案中，顺磁性颗粒是纳米颗粒，其可以是例如纳米珠粒。在一些实施方案中，顺磁性颗粒是微粒。在一些实施方案中，微粒是微珠。在各个实施方案中，顺磁性颗粒是磁性纳米珠粒或微珠，其允许颗粒被磁体固持和/或操纵。在一些实施方案中，顺磁性颗粒是涂覆有薄(例如，直径为约2nm)石墨烯类碳层的金属纳米颗粒。在一些实施方案中，顺磁性颗粒是被涂覆的，例如涂覆有链霉亲和素或PEG。可以使用的示例性磁性颗粒是DYNABEADs(THERMOFISHER)、MACS珠粒(MILTENYI BIOTEC)、TURBOBEADS(TURBOBEADS)、ABSOLUTE MAG STREPTAVIDIN MAGNETICPARTICLES(CREATIVE DIAGNOSTICS)和GOL D NANOPARTICLES(SIGMAALDRICH)。

在一些实施方案中，磁性珠粒是具有超顺磁性Fe₂O₃芯和生物相容性外包衣的纳米颗粒。磁性珠粒的表面可以用例如羧基激活。

在一些实施方案中，本文所述的报告颗粒可包括生物相容性涂层，所述生物相容性涂层可用胺基或羧基激活以促进酰胺偶联。在一些实施方案中，本文所述的报告颗粒可以用胺基或羧基激活以促进酰胺偶联。

在一些实施方案中，本文所述的颗粒可以是纳米颗粒(例如纳米珠粒)，其直径小于1微米(例如约5至约500纳米，例如约5纳米，或约10纳米，或约50纳米，或约100纳米，或约250纳米，或约500纳米)。在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)的平均粒径为25-500nm+/-5nm、25-500nm+/-10nm、25-500nm+/-15nm、25-500nm+/-20nm、25-500nm+/-25nm、25-500nm+/-30nm、25-500nm+/-35nm、25-500nm+/-40nm、25-500nm+/-45nm或25-500nm+/-50nm。在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)的平均粒径为约20至约200nm。

在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)的直径小于1微米(例如约5至约500纳米，例如约5纳米，或约10纳米，或约50纳米，或约100纳米，或约250纳米，或约500纳米)。在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)的平均粒径为25-500nm+/-5nm、25-500nm+/-10nm、25-500nm+/-15nm、25-500nm+/-20nm、25-500nm+/-25nm、25-500nm+/-30nm、25-500nm+/-35nm、25-500nm+/-40nm、25-500nm+/-45nm或25-500nm+/-50nm。在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)的平均粒径为约20至约200nm。在一些实施方案中，磁性颗粒可以是磁性纳米颗粒(例如纳米珠粒)，其由氧化物(诸如铁氧体、磁赤铁矿、磁铁矿或氧化铁)组成，任选地由表面活性剂、二氧化硅、硅氧烷或磷酸衍生物改性。在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)由具有壳(例如二氧化硅壳，任选地被改性)的铁氧体组成。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒是金属的(例如铁、钴等)。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒是包含壳(例如温和氧化、表面活性剂、聚合物和金属(例如金、石墨烯、钯、铂等))的金属纳米颗粒。

在一些实施方案中，本文所述的颗粒可以是包含一个或多个量子点的纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒包含金属芯和一个或多个量子点。在一些实施方案中，纳米颗粒包含可以散布有一个或多个量子点的金属芯。在一些实施方案中，纳米颗粒包含可以散布有多个量子点的金属芯。量子点是离散的纳米颗粒，它们的性质与体半导体类似，使得当暴露于电磁能时它们继而发出能量。通过改变尺寸和组成，量子点可以被设计为对红外区域、可见光谱甚至紫外线范围内的能量敏感。此外，它们可以被设计为光致发光的或光伏的，分别产生光或能量。

在一些实施方案中，报告物可以是纳米颗粒(例如纳米珠粒)，其可以包含一个或多个量子点。在一些实施方案中，报告物包含金属芯和一个或多个量子点。在一些实施方案中，报告物包含可以散布有一个或多个量子点的金属芯。在一些实施方案中，报告物包含可以散布有多个量子点的金属芯。

在一些实施方案中，报告物可以包含一个或多个量子点。在一些实施方案中，报告物可以包含一个或多个量子点。在一些实施方案中，报告物可以包含多个量子点。

例如通过胶体方法产生的量子点的实例包括但不限于硒化镉(CdSe)、硫化镉(CdS)、砷化铟(InAs)和磷化铟(InP)硫化镉碲(CdTeS)。构成量子点的原子的数目范围可以为100至100,000，通常直径范围为2至20nm(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、19.5、20.5nm)。

在一些实施方案中，包括量子点材料的颗粒材料包括但不限于碳、胶体金、锗、砷化铟、锑化铟、砷化镓、氮化镓、镉/硒/碲化物、铅、氧化铅、硫化铅、硒化铅、磷化铟镓、硅、胶体银、碲化汞镉、铁、氧化铁、钴、石墨烯、镧、铈、碳酸锶、锰、氧化锰、氧化镍、铂、锂、钛酸锂、钽、铜、钯、钼、碳化硼、碳化硅、碳化钛、氧化钨、铝、铌、铥、氮化铝、锡、氧化铝、氧化锡、锑、镝、镨(paseodynium)、氧化锑、铒、铼、钡、钌、铍、钐、氧化铋、硼、钆、氮化硼、氧化钒、锶、镱、锆、金刚石(C)、硅(Si)、锗(Ge)、碳化硅(SiC)、硅-锗(SiGe)、锑化铝(AlSb)、砷化铝(AlAs)、氮化铝(AlN)、磷化铝(AlP)、氮化硼(BN)、磷化硼(BP)、砷化硼(BAs)、锑化镓(GaSb)、砷化镓(GaAs)、氮化镓(GaN)、磷化镓(GaP)、锑化铟(InSb)、砷化铟(InAs)、氮化铟(InN)、磷化铟(InP)、砷化铝镓(AlGaAs)、砷化铟镓(InGaAs，InxGai_xAs)、磷化铟镓(InGaP)、砷化铝铟(AlInAs)、锑化铝铟(AllnSb)、氮化砷化镓(GaAsN)、磷化砷化镓(GaAsP)、氮化铝镓(AlGaN)、磷化铝镓(AlGaP)、氮化铟镓(InGaN)、锑化砷化铟(InAsSb)、锑化铟镓(InGaSb)、磷化铝镓铟(AlGalnP，也称为InAlGaP、InGaAlP、AlInGaP)、磷化砷化铝镓(AlGaAsP)、磷化砷化铟镓(InGaAsP)、磷化砷化铝铟(AlInAsP)、氮化砷化铝镓(AlGaAsN)、氮化砷化铟镓(InGaAsN)、氮化砷化铟铝(InAlAsN)、氮化锑化砷化镓(GaAsSbN)、锑化砷化氮化镓铟(GalnNAsSb)、磷化锑化砷化镓铟(GalnAsSbP)、硒化镉(CdSe)、硫化镉(CdS)、碲化镉(CdTe)、氧化锌(ZnO)、硒化锌(ZnSe)、硫化锌(ZnS)、碲化锌(ZnTe)、碲化镉锌(CdZnTe，“CZT”)、碲化汞镉(HgCdTe)、碲化汞锌(HgZnTe)、硒化汞锌(HgZnSe)、氯化亚铜(CuCl)、硒化铅(PbSe)、硫化铅(PbS)、碲化铅(PbTe)、硫化锡(SnS)、碲化锡(SnTe)、碲化铅锡(PbSnTe)、碲化铊锡(Ti2SnTe5)、碲化铊锗(Tl2GeTe5)、碲化铋(Bi2Te3)、磷化镉(Cd3P2)、砷化镉(Cd3As2)、锑化镉(Cd3Sb2)、磷化锌(Zn3P2)、砷化锌(Zn3As2)、锑化锌(Zn3Sb2)、碘化铅(II)(Pbl2)、二硫化钼(MoS2)、硒化镓(GaSe)、硫化锡(SnS)、硫化铋(Bi2S3)、硒化铜铟镓(CIGS)、硅化铂(PtSi)、碘化铋(III)(Bil3)、碘化汞(II)(Hgl2)、溴化铊(I)(TIBr)、二氧化钛(锐钛矿)(TiO2)、氧化铜(I)(Cu2O)、氧化铜(II)(CuO)、二氧化铀(UO2)、三氧化铀(UO3)等。

在各个实施方案中，使用外部磁体施加磁场。在各个实施方案中，磁体是永磁体(例如钕铁硼(NdFeB)、钐钴(SmCo)、铝镍钴合金，以及陶瓷或铁氧体磁体)。在各个实施方案中，磁体是暂时磁体。在各个实施方案中，磁体是电磁体。

在各个实施方案中，报告物的检测在磁场附近进行。在各个实施方案中，报告物的检测远离磁场进行，例如在与执行磁向下牵引步骤的腔室分开的腔室中进行。

在各个实施方案中，报告物可以是用于测量光的吸收和/或散射(或者，例如通过比色分析测量某种颜色的存在、不存在)的荧光报告物、磷光报告物或比色报告物(诸如有色颗粒)。在一些实施方案中，可以使用本领域已知的任何合适的可检测报告物。例如，可检测报告物可以是放射性报告物(例如像，3H、125I、35S、14C、32P和33P)、酶报告物(诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光报告物(例如像，吖啶酯、硫酯或磺酰胺；鲁米诺、异鲁米诺、菲啶鎓酯等)、荧光报告物(诸如荧光素(例如，5-荧光素、6-羧基荧光素、3′6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、含量子或含金属(Mc)点(例如，硫化锌加帽的硒化镉)、测温报告物或免疫聚合酶链反应报告物。在各个实施方案中，报告物包括但不限于荧光团、发色团、放射性同位素、磁性颗粒、金颗粒、酶底物等。在一些实施方案中，报告物是化学发光或荧光蛋白，例如像，绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、海肾(Renilla Reniformis)绿色荧光蛋白、GFPmut2、GFPuv4、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、青色荧光蛋白(CFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、柠檬色(citrine)荧光蛋白和来自香菇珊瑚的红色荧光蛋白(dsRED)、荧光素酶、伞形酮、罗丹明、荧光素、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白等。在一些实施方案中，报告物是以下任何家族的非蛋白质有机荧光团：呫吨衍生物，诸如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿(Oregon green)、伊红和德克萨斯红(Texas red)；花菁衍生物，诸如花菁、吲哚菁、氧碳菁(oxacarbocyanine)、硫碳菁(thiacarbocyanine)和部花菁；方酸衍生物和环取代的方酸，包括Seta、SeTau和Square染料；萘衍生物(丹磺酰和氟硅酸钠(prodan)衍生物)；香豆素衍生物；噁二唑衍生物，诸如吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑；蒽衍生物，诸如蒽醌，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙；芘衍生物，诸如级联蓝(cascade blue)等；噁嗪衍生物，诸如尼罗红(Nile red)、尼罗蓝(Nile blue)、甲酚紫、噁嗪170等；吖啶衍生物，诸如原黄素、吖啶橙、吖啶黄等；芳基次甲基衍生物，诸如金胺、结晶紫、孔雀石绿；以及四吡咯衍生物，诸如卟吩、酞菁、胆红素。在各个实施方案中，报告物包括但不限于酶报告物，例如诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、6-磷酸葡糖脱氢酶等的酶。在一些实施方案中，报告物可以是如本文所述的量子点。在一些实施方案中，报告物可以包含如本文所述的量子点。在一些实施方案中，报告物可包括具有二氧化硅壳的金属芯(即，金芯)，其中二氧化硅壳浸渍有多个(例如，100-600个)量子点。

在各个方面，本发明提供了适用于本文公开的任一实施方案的方法的试剂盒。所述药盒可用于可同时检测样品中的多种分析物的免疫测定。所述试剂盒可包括多种磁性缀合物、多个报告物结合部分和多个报告物。

任选地，将本发明技术的试剂盒的上述组分包装在合适的容器中并标记用于诊断相应的疾病或病症，或者标记用于相应的其他目的。上述组分可以作为水性(优选无菌)溶液或冻干(优选无菌)复溶制剂储存在单元容器或多用途容器，例如密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管中。例如，本发明技术的测定试剂可以被冻干，以消除冷链运输和储存的要求。例如，在一些实施方案中，除乙酸镁Mg(CH₃COO)₂外的所有试剂冻干于测定管底部，而Mg(CH₃COO)₂冻干于盖子上：这阻止5’至3’DNA聚合酶的发生，直至Mg(CH₃COO)₂与其他测定试剂混合。

所述试剂盒还可包括第二容器，所述容器容纳缓冲液或其他适于将样品稀释至更高体积的成分。此外，所述试剂盒可包括用于实施测定的说明书。所述容器可由诸如玻璃或塑料的各种材料制成并且可以具有无菌入口。所述试剂盒还可包括包含可接受缓冲液的更多容器。所述试剂盒还可包括用于收集生物样品的装置。它还可包括在商业和使用者看来所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。试剂盒可以任选地包括通常包含在诊断产品商业包装中的说明书，其中包括有关例如此类诊断产品的适应症、用法、制造和/或警告的信息。所述试剂盒还可包括用于比较以进行诊断的颜色或荧光量表。试剂盒组分(例如，试剂)可以包装在合适的容器中。试剂盒还可以包括使用该试剂盒来检测多种分析物的说明书。

在一些实施方案中，试剂盒还包括以安全方式收集生物样品(例如，血液、血清、血浆、尿液或其他类型的样品)的装置。在一些实施方案(例如，用于分析血液含量的实施方案)中，所述装置包括针头和安全注射器(例如鲁尔型注射器)。在一些实施方案中，实施装置包括装载弹簧的可伸缩针头和注射器。应当理解，所述装置可以是用于收集样品的任何类型的装置，所述样品可以是以下任一项：全血、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液、脑脊液(CSF)、精液、粘液、痰液、月经血、月经液、阴道粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、射精前液、恶露、发炎性分泌物、淋巴液和脓液。同样，在一些实施方案中，试剂盒不包括样品收集装置。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包括检测可检测报告物所需的组分。试剂盒还可以包含一个对照样品或一系列对照样品，可对所述样品进行测定并与测试样品进行比较。试剂盒的各组分可以封装在单独的容器中，且所有不同的容器可以处于一个包装中，连同解释使用所述试剂盒进行的测定的结果的说明书。本发明技术的试剂盒可以在试剂盒容器上或容器中含有书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中包含的试剂。

在各个方面，可以从为人受试者的受试者获得样品。此外，在一些实施方案中，受试者是不同于人的哺乳动物。

定义

以下定义结合本文所公开的发明来使用。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同的含义。

如本文所用，“一个/种(a/an)”或“所述(the)”可以意指一个或超过一个。

另外，当与参考数字指示结合使用时，术语“约”意指参考数字指示加上或减去该参考数字指示的多至10％。例如，语言“约50”涵盖了45至55的范围。

如本文所用，在存在剂或刺激物的情况下，相对于不存在这种调节的情况如果活性和/或效果的读数减少了显著量，诸如减少了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多(最多至且包括至少约100％)，则某物“降低”。如本领域普通技术人员将理解的，在一些实施方案中，活性降低并且一些下游读数将降低但是其他读数可以增加。

相反，在存在这种剂或刺激物的情况下，相对于不存在剂或刺激物的情况如果活性和/或效果的读数增加了显著量，例如增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多(最直至且包括至少约100％或更多)、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍，则活性“增加”。

如本文所提及，除非另外指定，否则所有组成百分比均按总组合物的重量计。如本文所用，单词“包括”及其变型意图为非限制性的，以使得列表中的项目的详述不排除也可适用于此技术的组合物和方法的其他类似项目。类似地，术语“可以(can)”和“可(may)”以及其变型意图为非限制性的，以使得实施方案可以或可以包括某些要素或特征的详述不排除不包含那些要素或特征的本发明技术的其他实施方案。

如本文所用，术语“样品”可指可包含或不包含目标分析物的溶液、悬浮液、混合物或未稀释量的体液或其他类型的液体。如本文所用，样品可包括水和/或缓冲液。

如本文所用，术语“体液”可以指可从个体体内分离的任何流体，且包括但不限于全血、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液、脑脊液(CSF)、精液、拭子样品(例如面颊拭子、咽喉拭子等)、粘液、痰液、月经血、月经液、阴道粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、预射精液、恶露、发炎性分泌物、淋巴液、脓液等。在一些实施方案中，体液可以更具体地指全血、血清、尿液、唾液、拭子样品、粘液或精液。在某些实施方案中，体液可以更具体地指全血、血清、尿液或唾液。在一些实施方案中，体液可包括目标分析物(例如，生物标志物)。

尽管作为诸如包括、含有或具有等术语的同义词的开放式术语“包含”在本文中用于描述并要求保护本发明，可替代地可使用诸如“由…组成”或“基本上由…组成”的替代性术语来描述本发明或其实施方案。

如本文所用，词语“优选的”和“优选地”是指本发明技术在某些情况下提供某些益处的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的详述并不意味着其他实施方案不是有用的，并且并不意图从本发明技术的范围内排除其他实施方案。

实施例

本文提供实施例是为了说明本发明技术的优点和益处，并进一步帮助本领域普通技术人员实践治疗本发明技术的癌症的方法。为了更充分地说明本发明技术的某些方面，本文还提供了实施例。这些实施例绝不应被解释为限制所附权利要求所定义的本发明技术的范围。这些实施例可以包括或包含上文描述的本发明技术的任何变型、方面或实施方案。上文描述的变型、方面或实施方案还可以各自包括或包含本发明技术的任何或所有其他变型、方面或实施方案的变化。

实施例1.多重分析物检测

图4示出，可以将四种分析物多重化以进行同时分析。在此实施例中，将hCG、PSA、TSH和CRP分别单独加标到全血液样品中，以及同时以相同的浓度加标(全部)。在图4中，有四个通道(从左到右：hCG、PSA、TSH和CRP)。“全部”条件反映了含有hCG、PSA、TSH和CRP全部的样品，并且本实施例在单一实验中检测到所有这些分析物。提供了单一分析物条件对照，表明，除其他外，多重检测不导致信号丢失。

如图4所示，根据本公开的多重测定可以同时检测同一生物样品中的多种分析物。

以引用的方式并入

本文所提及的所有专利和公布特此以引用的方式整体并入。

本文所讨论的出版物仅为其在本申请的申请日之前的公开内容而提供。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。

如本文所用，所有标题仅用于组织并且不旨在以任何方式限制本公开。任何单独部分的内容可能同样适用于所有部分。

等效方案

尽管已经结合本发明具体的实施方案描述了本发明，但应理解本发明能够具有另外的修改，并且本申请意图涵盖通常遵循本发明原理并包括虽然不属于本发明所公开内容范围但属于本发明所属领域的公知技术或常用的技术手段并可以应用于本文中阐述和所附权利要求的范围所列出的必要特征的任何变型、使用或变更。

                         序列表

<110>  维塔生物科技公司(Vital Biosciences, Inc.)

       M·A·库萨(Koussa, Mounir A)

       A·威瑟姆(WITHAM, Aaron)

<120>  多重分析物检测

<130>  124436-5011-WO

<150>  US 63/063,028

<151>  2020-08-07

<160>  26

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  13

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  1

Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg

1               5                   10

<210>  2

<211>  8

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  2

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1               5

<210>  3

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  3

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1               5                   10

<210>  4

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  4

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1               5

<210>  5

<211>  13

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  5

Ser Arg Leu Glu Glu Glu Leu Arg Arg Arg Leu Thr Glu

1               5                   10

<210>  6

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  6

Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu

1               5                   10                  15

<210>  7

<211>  4

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  7

Glu Pro Glu Ala

1

<210>  8

<211>  26

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  8

Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn Arg

1               5                   10                  15

Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu

            20                  25

<210>  9

<211>  6

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  9

Glu Glu Glu Glu Glu Glu

1               5

<210>  10

<211>  6

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  10

His His His His His His

1               5

<210>  11

<211>  18

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  11

Thr Lys Glu Asn Pro Arg Ser Asn Gln Glu Glu Ser Tyr Asp Asp Asn

1               5                   10                  15

Glu Ser

<210>  12

<211>  9

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  12

Thr Glu Thr Ser Gln Val Ala Pro Ala

1               5

<210>  13

<211>  15

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  13

Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp Ser

1               5                   10                  15

<210>  14

<211>  38

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  14

Met Asp Glu Lys Thr Thr Gly Trp Arg Gly Gly His Val Val Glu Gly

1               5                   10                  15

Leu Ala Gly Glu Leu Glu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Glu His His Pro

            20                  25                  30

Gln Gly Gln Arg Glu Pro

        35

<210>  15

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  15

Pro Asp Arg Val Arg Ala Val Ser His Trp Ser Ser

1               5                   10

<210>  16

<211>  8

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  16

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1               5

<210>  17

<211>  11

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  17

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly

1               5                   10

<210>  18

<211>  6

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  18

Cys Cys Pro Gly Cys Cys

1               5

<210>  19

<211>  10

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  19

Glu Val His Thr Asn Gln Asp Pro Leu Asp

1               5                   10

<210>  20

<211>  14

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  20

Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr

1               5                   10

<210>  21

<211>  8

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  21

Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys

1               5

<210>  22

<211>  16

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  22

Thr Asp Lys Asp Met Thr Ile Thr Phe Thr Asn Lys Lys Asp Ala Glu

1               5                   10                  15

<210>  23

<211>  13

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  23

Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys

1               5                   10

<210>  24

<211>  12

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  24

Lys Leu Gly Asp Ile Glu Phe Ile Lys Val Asn Lys

1               5                   10

<210>  25

<211>  23

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  25

Asp Ile Pro Ala Thr Tyr Glu Phe Thr Asp Gly Lys His Tyr Ile Thr

1               5                   10                  15

Asn Glu Pro Ile Pro Pro Lys

            20

<210>  26

<211>  13

<212>  PRT

<213>  人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>  合成序列

<400>  26

Asp Pro Ile Val Met Ile Asp Asn Asp Lys Pro Ile Thr

1               5                   10

Claims (36)

1.一种用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的方法，所述方法包括：

(a)使所述样品与至少一种磁性缀合物接触，所述至少一种磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与所述磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；

(b)使所述磁性缀合物与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；

(c)使所述磁性缀合物与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有相应标签结合配偶体，所述相应标签结合配偶体被配置为结合相应标签，从而任选地将报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；

(d)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物任选地具有与其缔合的所述多种分析物中的分析物和与所述相应报告物缔合的所述相应报告物结合部分，所述相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述相应报告物结合部分结合；以及

(e)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物中每种分析物的存在、不存在或水平。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述标签包含生物素且所述标签结合配偶体包含亲和素，或者所述标签包含异硫氰酸荧光素(FITC)且所述标签结合配偶体包含抗FITC抗体，或者所述标签包含二硝基苯酚(DNP)且所述标签结合配偶体包含抗DNP抗体，或者所述标签包含地高辛(DIG)且所述标签结合配偶体包含抗DIG抗体，或者所述标签包含Etag(GAPVPYPDPLEPR(SEQ ID NO:1))且所述标签结合配偶体包含抗Etag抗体，或者所述标签包含FLAG(DYKDDDDK(SEQ ID NO:2))且所述标签结合配偶体包含抗FLAG抗体，或者所述标签包含Myc(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:3))且所述标签结合配偶体包含抗Myc抗体，或者所述标签包含HA(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:4))且所述标签结合配偶体包含抗HA抗体，或者所述标签包含SNAP且所述标签结合配偶体包含苄基鸟嘌呤衍生物，或者所述标签包含“CLIP”且所述标签结合配偶体包含苄基胞嘧啶衍生物。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述报告物结合部分具有与其结合的第一寡核苷酸，并且所述报告物具有与其结合的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸被配置为在所述标签与所述标签结合配偶体相互作用时与所述第一寡核苷酸杂交，从而将所述报告物结合部分与所述报告物缔合。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述标签是具有短结合半衰期的标签，任选地是例如脱硫生物素。

5.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中所述标签结合配偶体包含亲和素，任选地是例如链霉亲和素。

6.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自具有约50个核苷酸或更少的长度。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种磁性缀合物的所述多个捕获部分中的捕获部分包含被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物的抗体。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种磁性缀合物的所述多个捕获部分中的捕获部分包含被配置为结合所述多种分析物中的所述相应分析物的第一抗体，并且其中报告物结合部分包含被配置为结合所述相应分析物的第二抗体。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述多种分析物包含多种抗体，并且其中所述至少一种磁性缀合物的捕获部分包含被配置为结合相应抗体的抗原，或者其中所述多种分析物包含多种蛋白质生物标志物，并且其中所述至少一种磁性缀合物的捕获部分包含被配置为结合所述蛋白质生物标志物的抗体。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述多个报告物结合部分中的报告物结合部分包含被配置为结合所述抗原的第二抗体。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述方法指示受试者是否产生针对抗原的抗体。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述方法提供所述样品中抗体的数量。

13.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中报告分子是金属芯和二氧化硅壳或所述报告物；其中所述二氧化硅壳任选地浸渍有多个量子点；并且其中所述金属芯任选地包含金。

14.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述报告物包含多个量子点。

15.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述报告物是荧光报告物、磷光报告物或比色报告物。

16.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述报告物结合部分的浓度大于所述报告物的浓度，任选地是至少5倍大，或至少10倍大，或至少100倍大，或至少1000倍大，任选地是约1000倍大。

17.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个报告物中的每个报告物能够产生相应的信号，所述信号具有至少一种与由所述多个报告物中的另一报告物产生的信号的性质不同的性质。

18.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品选自全血、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液、脑脊液(CSF)、精液、粘液、痰液、月经血、月经液、阴道粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、射精前液、恶露、发炎性分泌物、淋巴液和脓液。

19.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品具有约1微升的体积。

20.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种分析物包含至少四种分析物。

21.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种分析物包含至少六种分析物。

22.如权利要求9至21中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用包含磁性颗粒和被配置为结合污染物抗体和/或非抗体部分的部分的磁性缀合物对所述样品进行预处理的步骤。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述污染物抗体不针对被配置为结合所述相应抗体的所述抗原，或者在针对被配置为结合所述相应抗体的所述抗原产生免疫应答方面无效。

24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述预处理减少或消除以下一项或多项：

(a)嗜异性抗体；

(b)与所述磁性颗粒非特异性相互作用的抗体；和

(c)与所述磁性颗粒非特异性相互作用的非抗体部分。

25.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法适于即时使用。

26.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法适于现场使用。

27.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法适于家庭使用。

28.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法与世界卫生组织的ASSURED(经济、灵敏、特异、易使用、快速且稳定、无需设备和可传送)标准兼容。

29.如上权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法基本上无假阳性。

30.如上权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法基本上无假阴性。

31.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中与使用固相免疫测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。

32.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中与使用以基于珠粒的流式细胞术为基础的测定、任选地是基于珠粒的基于流式细胞术的测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性，并且/或者其中与使用侧流免疫色谱测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。

33.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：通过施加磁场将所述样品中的所述分析物从所述样品中分离，接着降低所述磁场，随后使所述磁性缀合物与所述多个报告物结合部分接触。

34.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述捕获部分和所述报告物结合部分结合所述分析物的不同部分。

35.一种用于检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量的多重方法，所述方法包括：

(a)使所述样品与至少一种磁性缀合物接触，所述至少一种磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与所述磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；

(b)使所述磁性缀合物与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，

所述标签包含脱硫生物素，并且

每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；

(c)使所述磁性缀合物与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有相应标签结合配偶体，所述相应标签结合配偶体被配置为结合相应标签，从而将报告物结合部分与相应报告物缔合，其中

所述标签结合配偶体包含链霉亲和素，并且

每个报告物被配置为产生相应的不同信号；

(d)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物具有与其缔合的所述多种分析物中的分析物和与所述相应报告物缔合的所述相应报告物结合部分，所述相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述相应报告物结合部分结合；以及

(e)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物中每种分析物的存在、不存在或水平，其中：

所述报告物结合部分具有与其结合的第一寡核苷酸，并且所述报告物具有与其结合的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸被配置为在所述标签与所述标签结合配偶体相互作用时与所述第一寡核苷酸杂交，从而将所述报告物结合部分与所述报告物缔合；并且

所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自具有约50个核苷酸或更少的长度。

36.一种试剂盒，所述试剂盒包括上述权利要求中任一项所述的至少一种磁性缀合物、多个报告物结合部分和多个报告物。

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