JP2023536517A

JP2023536517A - マルチプレックス分析物検出

Info

Publication number: JP2023536517A
Application number: JP2023508507A
Authority: JP
Inventors: エー．コウッサ，ムニエ; ウィザム，アーロン
Original assignee: バイタルバイオサイエンシーズインコーポレイテッド
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2023-08-25
Also published as: CA3187378A1; CN116134151A; WO2022029731A1; EP4193147A1

Abstract

生物学的サンプル中の複数の分析物のマルチプレックス検出のための方法およびキットが提供される。マルチプレックス方法は、サンプルを、磁性粒子および対応する分析物を結合するように各々構成された複数の捕捉部分を含む少なくとも１つの磁性コンジュゲート、各々にタグが結合しており、対応する分析物にも各々結合する複数のレポーター結合部分、ならびに対応するタグに結合する対応するタグ結合パートナーを各々有する複数のレポーターと接触させ、これにより、任意により、タグに結合しているレポーター結合部分を対応するレポーターと会合させるステップであって、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと、磁場を印加するステップと、レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、複数の分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップとを含む。【選択図】図４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月７日に出願された「ＭＵＬＴＩＰＬＥＸＥＤＡＮＡＬＹＴＥＤＥＴＥＣＴＩＯＮ」と題する米国仮特許出願第６３／０６３，０２８号の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、とりわけ、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法に関する。

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出されている配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年８月６日に作成されたＡＳＣＩＩコピーの名前は１２４４３６－５０１１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔで、サイズは８，１９２バイトである。

医学、生物医学研究、および他の分野は、生物学的および他の種類のサンプル中のタンパク質、低分子、細菌、全細胞、ウイルス、および他の分析物など、様々な標的分析物の検出、同定、および定量に依存している。信頼性の高い検査では、疾患および状態の診断、治療の進行の監視および評価、ならびに臨床および非臨床用途の様々な他の目的のために、様々な範囲の標的を検出する必要がある。

分析物検出の従来の方法には、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、質量分析、フローサイトメトリー、および高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのアッセイが含まれる。既存の各アプローチは、それぞれ、利点および制限を有する。例えば、抗体検出などの多くの分野で広く使用されているＥＬＩＳＡアッセイは、複数の労力を要する手順を伴うため、時間を要し得る。また、ＥＬＩＳＡアッセイのパラメータは、大きく変動し得、ＥＬＩＳＡは、十分な感度ではない可能性があり、検出品質を損なう可能性がある。

さらに、生物学的サンプルおよび他の異なる種類のサンプルは、多くの場合、複数の標的分析物を含むように複雑であり得る。マルチプレックスアッセイは、様々な生物医学、臨床、疫学、法医学、および他の用途で所望されている。しかし、従来のイムノアッセイは、処理時間が長いこと、および他の欠点を有するため、典型的には、複数の分析物の同時検出には、十分に適していない。例えば、ＥＬＩＳＡは、サンプル中の１つの分析物のみを検出できる。さらに、既存のイムノアッセイシステムでは、分析に必要なサンプルの量は、典型的には、検出される分析物の数に直線的に比例する。したがって、複数の分析物を検出することは困難であり得る。

したがって、サンプル中の複数の分析物の検出のためなど、サンプルの包括的な分析のための信頼性が高く、正確であり、かつ時間効率の良い診断検査が必要である。

したがって、様々な態様では、本発明は、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法、およびそのような方法を実施するためのキットを提供する。本方法により、サンプル中の複数の分析物の多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）検出が可能になる。ある特定の特性を有する（例えば、特定の色のシグナルを生成することができる）レポーター粒子を各分析物にタグにより付着させることにより、記載されたアプローチを、同じサンプル中の複数の分析物の同時検出に使用することができる。この方法では、複数の分析物を検出するためにサンプルの量を増加する必要がないように、多数の分析物に対応させて、効率よく比例させる。また、この方法では、感度、特異性の改善、バックグラウンドノイズの低減、および信号対雑音比の向上をもたらす。

様々な態様では、本発明は、対象から得ることができる生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法を提供する。この方法は、（ａ）サンプルを少なくとも１つの磁性コンジュゲートと接触させるステップであって、磁性コンジュゲートが、磁性粒子と、その磁性粒子に連結され、各々が複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む、ステップと；（ｂ）磁性コンジュゲートを、各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分と接触させるステップであって、各レポーター結合部分が、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている、ステップと；（ｃ）磁性コンジュゲートを、各々が対応するタグを結合するように構成されている結合されている対応するタグ結合パートナーを有する複数のレポーターと接触させて、これにより、任意により、レポーター結合部分を、対応するレポーターと会合させるステップであって、ここで、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；（ｄ）磁場を印加して、少なくとも１つの磁性コンジュゲートを分離するステップであって、磁性コンジュゲートが、複数の分析物のうちの１つの分析物およびタグ－タグ結合パートナー相互作用を介して結合している対応するレポーターと会合している対応するレポーター結合部分と任意により会合している、ステップと；（ｅ）レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、複数の分析物の各分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含む。

態様では、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するためのマルチプレックス方法が提供され、本方法は、（ａ）サンプルを少なくとも１つの磁性コンジュゲートと接触させるステップであって、磁性コンジュゲートが、磁性粒子と、その磁性粒子に連結され、各々が複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む、ステップと；（ｂ）磁性コンジュゲートを、各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分と接触させるステップであって、タグは、デスチオビオチンを含み、各レポーター結合部分が、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている、ステップと；（ｃ）磁性コンジュゲートを、各々が対応するタグを結合するように構成されている対応するタグ結合パートナーを有する複数のレポーターと接触させて、これにより、レポーター結合部分を、対応するレポーターと会合させるステップであって、ここで、タグ結合パートナーは、ストレプトアビジンを含み、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；（ｄ）磁場を印加して、磁性コンジュゲートを分離するステップであって、磁性コンジュゲートが、複数の分析物のうちの１つの分析物およびタグ－タグ結合パートナー相互作用を介して結合している対応するレポーターと会合している対応するレポーター結合部分と会合している、ステップと；（ｅ）レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、複数の分析物の各分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含み、ここで、レポーター結合部分は、それに結合した第１のオリゴヌクレオチドを有し、レポーターは、それに結合した第２のオリゴヌクレオチドを有し、第２のオリゴヌクレオチドは、タグがタグ結合パートナーと相互作用するときに第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成され、これによりレポーター結合部分がレポーターと会合し；第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、約５０ヌクレオチド長以下を有する。

いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法は、（ａ）サンプルを少なくとも１つの磁性コンジュゲートと接触させるステップであって、磁性コンジュゲートが、磁性粒子と、その磁性粒子に連結され、各々が複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む、ステップと；（ｂ）サンプルを、各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分と接触させるステップであって、各レポーター結合部分が、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている、ステップと；（ｃ）各々に結合している対応するタグ結合パートナーを有する複数のレポーターをサンプルと接触させるステップであって、これにより、タグ結合パートナーが対応するタグを結合し、これによって、タグに結合しているレポーター結合部分が、対応するレポーターと会合するようになり、ここで、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；（ｄ）複数の分析物の各分析物を、磁場を印加することによってサンプルから分離するステップであって、分析物が、対応する磁性粒子と、タグ－タグ結合パートナー相互作用を介して結合している対応するレポーターに会合している対応するレポーター結合部分とを有する、ステップと；（ｅ）レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、複数の分析物の各分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）と（ｃ）との間に磁気プルダウンおよび洗浄（再懸濁）を実施し、これにより、サンプルとの反応混合物中に存在し得る過剰なレポーター結合部分を除去することができる。

いくつかの実施形態では、タグ－タグ結合パートナー対は、直交しており、これにより、タグが対応するタグ結合パートナーのみを結合するようになり、逆もまた同様である。したがって、サンプル中の特定の分析物を検出するために、タグ－タグ結合パートナー対は、タグと異なる対のタグ結合パートナーとの間で相互作用が起こらないように選択できる。換言すれば、各タグ－タグ結合パートナー対は、検出される複数の分析物のうちの特定の分析物に特異的になるように選択される。

様々なタグおよび対応するタグ結合パートナーを、本開示の実施形態に従って使用することができる。いくつかの実施形態では、タグは、ビオチンを含み、タグ結合パートナーがストレプトアビジンを含む、またはタグは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含み、タグ結合パートナーが抗ＦＩＴＣ抗体を含む、またはタグは、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）を含み、タグ結合パートナーが抗ＤＮＰ抗体を含む、またはタグは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を含み、タグ結合パートナーが抗ＤＩＧ抗体を含む、またはタグは、Ｅｔａｇ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ（配列番号１））を含み、タグ結合パートナーが抗Ｅｔａｇ抗体を含む、またはタグは、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２））を含み、タグ結合パートナーが抗ＦＬＡＧ抗体を含む、またはタグは、Ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号３））を含み、タグ結合パートナーが抗Ｍｙｃ抗体を含む、またはタグは、ＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４））を含み、タグ結合パートナーが抗ＨＡ抗体を含む、またはタグは、ＳＮＡＰを含み、タグ結合パートナーがベンジルグアニン誘導体を含む、またはタグは、「ＣＬＩＰ」を含み、タグ結合パートナーがベンジルシトシン誘導体を含む。

いくつかの実施形態では、タグ－タグ結合パートナー相互作用は、相補性がある場合、レポーター結合部分が、タグ－タグ結合パートナー相互作用を介して対応するレポーターと会合する場合に、互いにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの使用によって容易になる。このような実施形態では、オリゴヌクレオチド対は、複数の分析物からの特定の分析物の検出に対して固有であるように選択され、したがって、サンプル中の複数の分析物の検出のシミュレーションが可能になる。これらの実施形態では、同一のタグおよびタグ結合パートナーを、複数の分析物のうちの分析物を検出するために使用することができる。タグは、結合半減期が短いタグ（低親和性タグまたは高オフ速度のタグとも呼ぶことができる）であり得る。そのようなタグは、例えばアビジン（例えば、限定するものではないが、ストレプトアビジン）などの対応するタグ結合パートナーを結合するように構成されているデスチオビオチン（またはその誘導体もしくは類似体）であり得る。任意の他のタグおよびタグ結合パートナーを使用できる。

したがって、いくつかの実施形態では、レポーター結合部分は、それに結合している第１のオリゴヌクレオチドを有し、レポーターは、それに結合している第２のオリゴヌクレオチドを有し、ここで、第２のオリゴヌクレオチドは、タグがタグ結合パートナーと相互作用するときに第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成され、これによりレポーター結合部分をレポーターに会合させる。

第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、互いに完全にまたは部分的に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、互いに完全に相補的であり得る。いくつかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、完璧に相補的でない場合もあるが、依然として互いにハイブリダイズ可能であり得る。

いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々は、約５０ヌクレオチド長以下を有する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの磁性コンジュゲートの複数の捕捉部分のうちの１つの捕捉部分は、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている抗体を含む。この磁性粒子に連結されている複数の捕捉部分のすべてまたは少なくとも一部は、抗体であり得る。このような捕捉部分（例えば、血液中のｈＣＧ、ＰＳＡ、ＴＳＨ、およびＣＲＰ）を用いて、様々な分析物を同時に検出することができる。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの磁性コンジュゲートの複数の捕捉部分のうちの１つの捕捉部分は、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている第１の抗体を含み、ここで、レポーター結合部分は、対応する分析物を結合するように構成されている第２の抗体を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、複数の抗体を含むことができ、少なくとも１つの磁性コンジュゲートの捕捉部分は、対応する抗体を結合するように構成されている抗原を含むことができる。いくつかの実施形態では、複数のレポーター結合部分のうちの１つのレポーター結合部分は、抗原を結合するように構成されている二次抗体を含む。この方法は、対象が抗原に対して向けられている抗体を産生しているか否かを示し得る。いくつかの実施形態では、本方法は、サンプル中、任意の量の抗体を提供し得る。

いくつかの実施形態では、レポーター分子は、金属コアおよびシリカシェルまたはレポーターであり；シリカシェルは、任意により、複数の量子ドットを含浸させ、金属コアは、任意により金を含む。いくつかの実施形態では、レポーターは、複数の量子ドット、単一の量子ドット、有機色素、アップコンバージョン型蛍光体、および他の種類を含む。

実施形態では、複数のレポーターの各レポーターは、複数のレポーターのうちの別のレポーターによって生成されたシグナルの特性とは異なる少なくとも１つの特性を有する対応するシグナルを生成することができる。

実施形態では、本方法では、少なくとも４つの分析物、または少なくとも６つの分析物、または他の任意の数の分析物を同時に検出することができる。

実施形態では、本方法は、少なくとも２つの分析物、または少なくとも３つの分析物、または少なくとも４つの分析物、または少なくとも５つの分析物、または少なくとも６つの分析物、または少なくとも７つの分析物、または少なくとも８つの分析物、または少なくとも９つの分析物、または少なくとも１０の分析物を同時に検出することができる。

実施形態では、本方法は、約２つの分析物、または約３つの分析物、または約４つの分析物、または約５つの分析物、または約６つの分析物、または約７つの分析物、または約８つの分析物、または約９つの分析物、または約１０の分析物を同時に検出することができる。

様々な態様では、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれかの方法に好適であるキットを提供する。キットは、少なくとも１つの磁性コンジュゲート、複数のレポーター結合部分、および複数のレポーターを含み得る。

本発明の詳細は、以下の付随する説明に記載されている。本明細書に記載の方法および材料と同様または同等の方法および材料が本発明の実施または試験に使用され得るが、例証的な方法および材料についてこれから説明される。本発明の他の特色、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書および添付の特許請求の範囲では、別段文脈が明示的に示さない限り、単数形はまた、複数形を含む。別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書に開示される任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。

本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の複写は、要請かつ必要な料金の支払により特許庁より提供される。

本開示のいくつかの実施形態による、サンプル中の複数の分析物の検出方法の例を示す。図１Ａは、各々が対応する捕捉部分および目的の分析物に連結されている磁性粒子を示す。図１Ｂは、図１Ａの分析物が、各々、タグが結合しているレポーター結合部分と会合することを示す図である。図１Ｃは、タグ結合パートナーが結合している対応するレポーターが、タグ－タグ結合パートナー相互作用を介して、図１Ａの対応するレポーター結合部分と結合するときに各々が形成される最終的な検出可能な複合体を示す。レポーターの各々は、異なる色のシグナルを生成することができる。図１Ｄは、図１Ｃの複合体がサンプルから分離されるように磁場が印加され得ることを例示している。図１Ｅは、図１Ｄの複合体のレポーターによって生成される異なるシグナルを検出することにより、対応する分析物の検出が可能になることを示している。本開示のいくつかの実施形態による、サンプル中の複数の分析物の検出方法の例を示す。図２Ａは、タグ（例えば、デスチオビオチン）およびそれに結合している第１のオリゴヌクレオチドを有するレポーター結合部分、およびタグ結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）およびそれに結合している第２のオリゴヌクレオチドを有するレポーター（オレンジ色）を示す。図２Ｂは、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが互いに相補的である場合に、それらが互いにハイブリダイズして安定な構造を形成し、これによりレポーター結合部分をレポーターと会合させることを示す。本開示のいくつかの実施形態による、サンプル中の複数の分析物の検出方法の別の例を示す。図３Ａは、タグ（例えば、デスチオビオチン）およびそれに結合している第１のオリゴヌクレオチドを有するレポーター結合部分、およびタグ結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）およびそれに結合している第２のオリゴヌクレオチドを有するレポーター（オレンジ色）を示す。図３Ｂは、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが互いに相補的でない場合、タグ－タグ結合パートナー相互作用が解離し、レポーター結合部分がレポーターと会合しないことを示す。本開示のいくつかの実施形態に従って、ＨＣＧ、ＰＳＡ、ＴＳＨ、およびＣＲＰを検出するマルチプレックスイムノアッセイの性能を示す図である。

本開示は、生物学的サンプル中の複数の分析物の正確な検出の必要性に対処する方法およびシステムを提供する。

対象の診断または治療に関連する多くの状況では、より包括的で信頼性の高い分析のために、短縮した時間で、同じサンプル中の複数の分析物を同時に検出することが望ましい。サンプル中の複数の分析物の検出は、法医学、生体認証、疾患追跡、および他の様々な分野でも重要であり得る。

従来のイムノアッセイシステムは、自動化装置を利用して、並行して動作できる。しかし、多くの従来のイムノアッセイは、処理時間が長い（例えば、３～６時間）、低感度（例えば、ピコモル～ナノモル範囲の検出限界（ＬｏＤ）、および多量（例えば、数百マイクロリットル）のサンプルを必要とすることを欠点として有する。さらに、必要なサンプル量は、プローブされる分析物の数に直線的に比例し得る。例えば、システムが、１つの分析物を検出するために約１００μｌのサンプルを必要とする場合、５つの分析物を検出するには約５００μｌのサンプル量が必要になる。多量のサンプルを必要とすることは、多くの状況で制限となり得る。したがって、複数の分析物を多重化して検出することは依然として課題である。

したがって、本開示の実施形態は、異なるサンプル（例えば、体液）での低いバックグラウンド、高感度、および総アッセイ時間の短縮を特徴とするマルチプレックスイムノアッセイを提供する。また、多重化することは、異なる分析物およびアッセイタイプ間で同一または類似の手順を利用することによって達成され、これにより、費用の削減、ならびに分析の速度、信頼性、および再現性の改善が可能になる。

実施形態では、記載されたマルチプレックスイムノアッセイは、蛍光検出のための磁性粒子およびレポーター系を使用する。検出される各分析物は、異なるレポーター粒子に、タグにより付着させることができるため、記載している方法は、従来のアプローチと比較して、分析物の数と対応させて、より効率的にスケーリングされる。例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の分析物の検出には、同量のサンプルが必要になり得る。レポーター粒子は、特定の色のシグナルを生成することができ得る（例えば、１つ以上の量子ドットを含むレポーター粒子）か、または他の分析物をタグにより付着させる他のレポーター粒子からそのレポーター粒子を区別する別の特性を有することができる。他の特性の非限定的な例としては、表面電荷、電荷密度、散乱特性、ならびにレポーター粒子の他の特性が含まれる。いくつかの実施形態では、レポーター粒子は、核酸ベースのバーコードと会合させる（例えば、コーティングさせる）ことができ、その場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、核酸ベースのバーコードを検出することによってレポーターを検出することができる。直交レポーター粒子は、少量のサンプル量（例えば、１μｌサンプル）中の複数の別々の分析物を同時に測定することが可能になり得る。

様々な態様では、本発明は、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法を提供する。この方法は、（ａ）サンプルを少なくとも１つの磁性コンジュゲートと接触させるステップであって、磁性コンジュゲートが、磁性粒子と、その磁性粒子に連結され、各々が複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む、ステップと；（ｂ）磁性コンジュゲートを、各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分と接触させるステップであって、各レポーター結合部分が、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている、ステップと；（ｃ）磁性コンジュゲートを、各々が対応するタグを結合するように構成されている対応するタグ結合パートナーを有する複数のレポーターと接触させて、これにより、任意により、レポーター結合部分を対応するレポーターと会合させるステップであって、ここで、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；（ｄ）磁場を印加して、少なくとも１つの磁性コンジュゲートを分離するステップであって、磁性コンジュゲートが、複数の分析物のうちの１つの分析物およびタグ－タグ結合パートナー相互作用を介して結合している対応するレポーターと会合している対応するレポーター結合部分と任意により会合している、ステップと；（ｅ）レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、複数の分析物の各分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含む。

実施形態では、磁性コンジュゲートは、分析物がサンプル中に存在する場合、複数の分析物のうちの１つの分析物（分析物は、対応するレポーターに会合している対応するレポーター結合部分を有し、これらは、タグ－タグ結合パートナー相互作用を介して結合している）との会合を有するであろう。分析物がサンプル中に存在しない場合、磁性コンジュゲートは、分析物と会合しない。さらに、いくつかの実施形態では、磁性粒子が、対応する異なる分析物を結合するように構成されている複数の捕捉部分を有する場合、１つ以上の捕捉部分は、それに結合している対応する分析物を有し得る一方で、１つ以上の他の捕捉部分は、サンプルから対応する分析物が存在していないために、分析物（複数可）に結合していなくてもよい。

いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法は、（ａ）サンプルを少なくとも１つの磁性コンジュゲートと接触させるステップであって、磁性コンジュゲートが、磁性粒子と、その磁性粒子に連結され、各々が複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む、ステップと；（ｂ）サンプルを、各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分と接触させるステップであって、各レポーター結合部分が、複数の分析物のうちの対応する分析物に結合するように構成されている、ステップと；（ｃ）各々に結合している対応するタグ結合パートナーを有する複数のレポーターをサンプルと接触させるステップであって、これにより、タグ結合パートナーが対応するタグを結合し、これによって、タグに結合しているレポーター結合部分が、対応するレポーターと会合するようになり、ここで、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；（ｄ）複数の分析物の各分析物を、磁場を印加することによってサンプルから分離するステップであって、分析物が、対応する磁性粒子と、タグ－タグ結合パートナー相互作用を介して結合している対応するレポーターに会合している対応するレポーター結合部分とを有する、ステップと；（ｅ）レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、複数の分析物の各分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含む。

いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）と（ｃ）との間に別々にまたは同時に磁気プルダウンおよび洗浄（再懸濁）を実施し、これにより、サンプルなどの反応混合物中に存在し得る過剰なレポーター結合部分を除去することができる。過剰のレポーター結合部分が除去された後、サンプルを複数のレポーターと共に再懸濁することができ、いくつかの実施形態では、レポーター結合部分の濃度よりも実質的に低い濃度を有することができる。

様々なタグおよび対応するタグ結合パートナーを、本開示の実施形態に従って使用することができる。いくつかの実施形態では、タグは、ビオチンを含み、タグ結合パートナーがアビジンを含む、またはタグは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含み、タグ結合パートナーが抗ＦＩＴＣ抗体を含む、またはタグは、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）を含み、タグ結合パートナーが抗ＤＮＰ抗体を含む、またはタグは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を含み、タグ結合パートナーが抗ＤＩＧ抗体を含む、またはタグは、Ｅｔａｇを含み、タグ結合パートナーが抗Ｅｔａｇ抗体（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ（配列番号１））を含む、またはタグは、ＦＬＡＧを含み、タグ結合パートナーが抗ＦＬＡＧ抗体（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２））を含む、またはタグは、Ｍｙｃを含み、タグ結合パートナーが抗Ｍｙｃ抗体（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号３））を含む、またはタグは、ＨＡを含み、タグ結合パートナーが抗ＨＡ抗体（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４））を含む、またはタグは、ＳＮＡＰを含み、タグ結合パートナーがベンジルグアニン誘導体を含む、またはタグは、「ＣＬＩＰ」を含み、タグ結合パートナーがベンジルシトシン誘導体を含む。

本開示の実施形態による方法およびキットでは、様々なタグを使用することができる。タグは、例えば、ペプチドタグ、共有ペプチドタグ、およびタンパク質タグであり得る。

ペプチドタグの非限定的な例は、生化学的および顕微鏡検査用途のためのｄｅｎｏｖｏ設計ヘリカルペプチドタグ（ＳＲＬＥＥＥＬＲＲＲＬＴＥ（配列番号５））であるＡＬＦＡ－タグを含む。タグは、単一ドメイン抗体のレパートリーによって認識される；ＡｖｉＴａｇ、酵素ＢｉｒＡによるビオチン化が可能になるペプチドであり、ストレプトアビジンによってタンパク質を単離できる（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号６））；Ｃ－ｔａｇ、ファージディスプレイを介して開発された単一ドメインラクダ科抗体に結合するペプチド（ＥＰＥＡ（配列番号７））；カルモジュリンタグ、タンパク質カルモジュリンによって結合されているペプチド（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ（配列番号８））；ポリグルタミン酸タグ、Ｍｏｎｏ－Ｑなどの陰イオン交換樹脂に効率よく結合するペプチド（ＥＥＥＥＥＥ（配列番号９））；ポリアルギニンタグ、陽イオン交換樹脂に効率よく結合するペプチド（５～９の連続するＲ）；Ｅタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ（配列番号１））；ＦＬＡＧタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２））；ＨＡタグ、抗体によって認識されるヘマグルチニン由来のペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４））；Ｈｉｓタグ、ニッケルまたはコバルトキレートによって結合した５～１０個のヒスチジン（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１０））；Ｍｙｃタグ、抗体によって認識されるｃ－ｍｙｃに由来するペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号３））；ＮＥタグ、モノクローナルＩｇＧ１抗体によって認識される１８－アミノ酸合成ペプチド（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ（配列番号１１））；Ｒｈｏ１Ｄ４タグ、ウシロドプシンの細胞内Ｃ末端の最後の９つのアミノ酸（ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ（配列番号１２））を指す；Ｓタグ、リボヌクレアーゼＡ由来のペプチド（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号１３））；ＳＢＰタグ、ストレプトアビジンに結合するペプチド（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ（配列番号１４））；Ｓｐｏｔ－タグ、免疫沈降、アフィニティー精製、免疫蛍光および超解像顕微鏡法のためのナノボディによって認識されるペプチド（ＰＤＲＶＲＡＶＳＨＷＳＳ（配列番号１５））；ストレプタクチンと呼ばれるストレプトアビジンまたは修飾ストレプトアビジンに結合するペプチド（ストレプタグＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号：１６））；Ｔ７タグ、Ｔ７遺伝子のＴ７主要カプシドタンパク質由来のエピトープタグ（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＱＭＧ（配列番号１７））；ＴＣタグ、ＦｌＡｓＨおよびＲｅＡｓＨ二ヒ素化合物によって認識されるテトラシステインタグ（ＣＣＰＧＣＣ（配列番号１８））；Ｔｙｔａｇ（ＥＶＨＴＮＱＤＰＬＤ（配列番号１９））；Ｖ５タグ、抗体によって認識されるペプチド（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号２０））；ＶＳＶタグ、抗体によって認識されるペプチド（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）；およびＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ（配列番号２１））を使用する。

共有結合ペプチドタグの非限定的な例は、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、ピリンＣタンパク質に共有結合により結合するペプチド（ＴＤＫＤＭＴＩＴＦＴＮＫＫＤＡＥ（配列番号２２））；ＳｐｙＴａｇ、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合により結合するペプチド（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ（配列番号２３））；ＳｎｏｏｐＴａｇ、ＳｎｏｏｐＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合により結合するペプチド（ＫＬＧＤＩＥＦＩＫＶＮＫ（配列番号２４））；ＤｏｇＴａｇ、ＳｎｏｏｐＴａｇＪｒに共有結合により結合するペプチドであり、ＳｎｏｏｐＬｉｇａｓｅ（ＤＩＰＡＴＹＥＦＴＤＧＫＨＹＩＴＮＥＰＩＰＰＫ（配列番号２５））によって媒介される；ＳｄｙＴａｇ、ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質に共有結合により結合するペプチド（ＤＰＩＶＭＩＤＮＤＫＰＩＴ（配列番号２６））を含み；ＳｄｙＴａｇ／ＳｄｙＣａｔｃｈｅｒは、ＳｐｙＴａｇ／ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒと速度論依存交差反応性を有する。

タンパク質タグの非限定的な例は、タンパク質タグの非限定的な例は、ＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質）、ストレプトアビジンによる認識が可能になるＢｉｒＡによってビオチン化されたタンパク質ドメイン；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ－タグ、固定化グルタチオンに結合するタンパク質；緑色蛍光タンパク質タグ、自発的に蛍光し、ナノボディによって結合することができるタンパク質；ＨａｌｏＴａｇ、ハロアルカン基質に共有結合により付着する変異細菌ハロアルカンデハロゲナーゼ；ＳＮＡＰ－ｔａｇ、ベンジルグアニン誘導体に共有結合により付着する変異真核生物ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ；ＣＬＩＰ－ｔａｇ、ベンジルシトシン誘導体に共有結合により付着する変異真核生物ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ；ＨＵＨ－ｔａｇ、その標的配列に共有結合により結合する配列特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質；マルトース結合タンパク質タグ、アミロースアガロースに結合するタンパク質；Ｎｕｓ－ｔａｇ；チオレドキシンタグ；Ｆｃ－ｔａｇ、免疫グロブリンＦｃドメインに由来し、二量体化および可溶化を可能にする；炭水化物認識ドメインまたは「ＣＲＤＳＡＴタグ」、ラクトースアガロースまたはセファロースに結合するタンパク質を含む。

いくつかの実施形態では、タグおよび対応するタグ結合パートナーは、複数の分析物の各分析物の検出のために異なるタグ－タグ結合パートナー対が使用されるように、サンプル中の複数の分析物の検出のために選択される。したがって、レポーター結合部分に結合しているタグは、特定の多重化反応においてこのタグに特異的な、対応するタグ結合パートナーとのみ相互作用する。このようにして、特定の分析物に特異的なタグ－タグ結合パートナー対は、レポーター結合部分（タグに結合されている）をレポーター（タグ結合パートナーに結合されている）と会合させるために使用され、これにより、レポーターの特性（例えば、これらに限定されないが、色、蛍光の強度など）を測定することによって、分析物が検出できるようになる。

いくつかの実施形態では、異なる色のシグナルを生成することができるレポーターを使用することができる。異なる好適な技術を採用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、レポーター分子は、有機蛍光色素でコーティングされたビーズまたは他の種類のレポーターであり得る。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、フルオロフォアコードされたマイクロビーズ、例えば、異なる色素をコードするビーズである。

いくつかの実施形態では、レポーターは、蛍光レポーター、リン光性レポーター、または、光の吸光度または散乱（または、例えば、比色分析による特定の色の有無）を測定するように構成され得る着色粒子などの比色レポーターであり得る。

いくつかの実施形態では、レポーターは、１つ以上の量子ドットを含む。量子ドットは、特定の色（波長および周波数）のシグナルを放出するように構成することができる。知られているように、原子は、原子の同一性に依存する色を有する光を放出することができ、すなわち異なる原子は、異なる色の光を生成することができる。これは、原子のエネルギー準位が設定された値を有しているため、すなわち、それらが量子化されているために起こる。量子ドットは、その中に拘束された電子および正孔が同様に離散的で量子化されたエネルギー準位を与えるため、同様の方法で光を生成する。

量子ドットのエネルギー準位は、量子ドットのサイズに依存する。例えば、同じ材料から作られた量子ドットは、そのサイズに応じて異なる色の光を生成する。量子ドットが大きいほど、生成される波長が長くなる（および周波数が低くなる）。より小さいサイズの量子ドットは、より短い波長（およびより高い周波数）を生成する。したがって、使用中、大きい量子ドットは、赤色光を生成し、小さいドットは、青色光を生成し、その一方で、中間サイズのドットは、緑色光、および他の色のスペクトルを生成する。量子ドットの発光スペクトルは、互いと十分に区別することができる。

いくつかの実施形態では、光源を使用して、複数のレポーター（例えば、異なる色を生成することができる量子ドット）を同時に励起することができる。

実施形態では、レポーターが検出されることにより、本開示の実施形態によるアッセイにおいて、そのレポーターに会合する、それぞれの標的分析物の存在、不在、または量を検出することが可能になる。実施形態では、レポーターの検出により、検出される複数の分析物のうちの１つ以上がサンプル中に存在するか否かに応じて、サンプル中の分析物（複数可）の検出が可能になる。

いくつかの実施形態では、複数の色の検出により、サンプル中の複数の分析物の検出がもたらされる。いくつかの実施形態では、複数の色の検出により、サンプル中で検出される複数の分析物のすべての検出がもたらされる。いくつかの実施形態では、複数の色の検出により、サンプル中で検出される複数の分析物のすべてではないが一部の検出もたらされる。

実施形態では、レポーターは、例えば、蛍光顕微鏡、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、または別の技術を用いて検出することができる。

いくつかの実施形態では、同じタグおよびタグ結合パートナーが、タグとタグ結合パートナーとの間で比較的弱い相互作用が生じる場合、サンプル中の複数の分析物を検出するために使用される。このような実施形態では、各分析物に特異的なオリゴヌクレオチド対が、レポーター捕捉部分（タグに会合する）とレポーター（タグ結合パートナーに会合する）との間の選択的相互作用およびその後の結合のために使用される。これらの実施形態では、タグは、結合半減期が短いタグであり得、これらは、低親和性タグまたは高オフ速度のタグとも呼ぶことができる。低親和性タグは、限定することなく、ビオチンよりも１０^２～１０^４倍弱い解離定数を有するアビジン（ストレプトアビジン相同体）に結合するビオチン類似体であるデスチオビオチン（またはその誘導体もしくは等価物）を含むタグであり得る。デスチオビオチンは、同様の低親和性でストレプトアビジンに結合する。タグ結合パートナーは、限定するものではないが、アビジン（例えばストレプトアビジン）、または比較的高い解離定数（Ｋ_ｄ）を有するタグとの相互作用を形成することができる別のタグ結合パートナーを含むことができる。例えば、Ｋ_ｄは、ビオチン／ストレプトアビジン会合のＫ_ｄの少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１００００倍高くあり得る。

レポーター結合部分とレポーターとの間の相互作用は、それぞれのタグおよびタグ結合パートナーが一緒になって、その間に低親和性結合を作り出すときに生じる。結合は、迅速に生じるが、安定していない（高オン速度（Ｋ_ｏｎ）および高オフ速度（Ｋ_ｏｆｆ））。しかし、これらの実施形態では、レポーター結合部分とレポーターとの間の相互作用は、互いにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドの使用によって容易になり、これによりレポーター結合部分をレポーターと会合させる。このような実施形態では、オリゴヌクレオチド対は、複数の分析物から特定の分析物を検出するために固有であるように選択される。

したがって、いくつかの実施形態では、レポーター結合部分は、それに結合している第１のオリゴヌクレオチドを有し、レポーターは、それに結合している第２のオリゴヌクレオチドを有し、ここで、第２のオリゴヌクレオチドは、タグがタグ結合パートナーと相互作用するときに第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成され、これによって、レポーター結合部分をレポーターに会合させる。タグは、低親和性タグ、例えば、限定するものではないが、デスチオビオチンまたはその誘導体もしくは均等物、または任意の他の低親和性タグである。タグ結合パートナーは、例えば、限定するものではないが、アビジン（例えばストレプトアビジン）、または対応するタグとの弱い結合を形成することができる別のタグ結合パートナーを含む。低親和性タグは、対応するパートナーと迅速ではあるが、弱く結合し、高いオン速度および高いオフ速度を有し、レポーター結合部分とレポーターとの間の安定な結合は、第１および第２のオリゴヌクレオチド間に相補性がある場合にのみ作製される。第１および第２のオリゴヌクレオチド間の相互作用は、高親和性であり、オリゴヌクレオチドが互いに相補的であり、かつレポーターとレポーター結合部分が一緒になったときに、レポーターコンジュゲートが形成される。第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチドとの間に相補性がない場合、タグ－タグ結合パートナー結合の強度は急速に低下し、レポーター結合部分は、レポーターと会合しなくなる。

第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、互いに完全にまたは部分的に相補的であり得る。検出される複数の分析物の各分析物について、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイズし、複数の分析物の別の分析物の検出に使用される第１および第２のオリゴヌクレオチドにはハイブリダイズしないように選択することができる。

いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々は、約５０ヌクレオチド長以下を有する。例えば、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド、または約２０ヌクレオチド、または約３０ヌクレオチド、または約４０ヌクレオチド、または約５０ヌクレオチド、または約６０ヌクレオチドの長さを有することができる。

本開示の実施形態による方法では、サンプル中の様々な分析物の検出が可能になる。いくつかの実施形態では、分析物は、抗原を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの磁性コンジュゲートの複数の捕捉部分のうちの１つの捕捉部分は、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている第１の抗体を含み、ここで、レポーター結合部分は、対応する分析物を結合するように構成されている第２の抗体を含む。いくつかの実施形態では、複数の分析物は、複数の抗体を含むことができ、少なくとも１つの磁性コンジュゲートの捕捉部分は、対応する抗体を結合するように構成されている抗原を含むことができる。いくつかの実施形態では、複数のレポーター結合部分のうちの１つのレポーター結合部分は、抗原を結合するように構成されている二次抗体を含む。この方法は、対象が抗原に対して向けられている抗体を産生しているか否かを示し得る。いくつかの実施形態では、本方法は、サンプル中、任意の量の抗体を提供し得る。いくつかの実施形態では、捕捉部分およびレポーター結合部分は、分析物の異なる部分を結合する。いくつかの実施形態では、捕捉部分およびレポーター結合部分は、異なる。いくつかの実施形態では、捕捉部分およびレポーター結合部分は、異なる抗原またはエピトープに結合する。

本開示の実施形態では、様々なレポーターを使用することができる。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、金属コアおよびシリカシェルまたはレポーターであり；シリカシェルは、任意により、複数の量子ドットを含浸させ、金属コアは、任意により金を含む。いくつかの実施形態では、レポーターは、複数の量子ドット、単一の量子ドット、有機色素、アップコンバージョン型蛍光体、および他の種類を含む。

実施形態では、本方法は、比較的少量、例えば、約４００ｐＭ以下、または約３００ｐＭ以下、または約２００ｐＭ以下、または約１００ｐＭ以下、または約５０ｐＭ以下、または約１０ｐＭ以下、例えば、約４００ｐＭ、または約３００ｐＭ、または約２００ｐＭ以下、または約１００ｐＭ、または約５０ｐＭ、または約１０ｐＭの複数の量子ドットを使用する。

いくつかの実施形態では、レポーターは、蛍光レポーター、リン光性レポーター、または比色レポーターである。

本開示の実施形態では、結合しているタグを有し、タグと相互作用することができるタグ結合パートナーを介して（例えば、抗原－抗体相互作用を介して）レポーターと会合するように構成されているレポーター結合部分の使用により、検出の速度を実質的に早めることが可能になる。レポーター結合部分の濃度は、レポーターの濃度よりも実質的に高くてもよく、例えば、レポーター結合部分の濃度は、ナノモル範囲であり得る一方で、レポーターの濃度は、ピコモル範囲であり得る。いくつかの実施形態では、レポーター結合部分の濃度は、約１０^－６Ｍ、または約１０^－７Ｍ、または約１０^－８Ｍであり得る。いくつかの実施形態では、レポーター結合部分の濃度は、少なくとも約１０^－６Ｍ、または少なくとも約１０^－７Ｍ、または少なくとも約１０^－８Ｍであり得る。レポーターの濃度は、約１０^－１１Ｍ未満、または１０^－１１Ｍ以下であり得る。したがって、検出可能な複合体（すなわち、磁性粒子およびレポーターに結合している分析物を含む複合体）の生成の速度論は、劇的に改善され、場合によっては１０００倍速くなる。また、結合している、検出可能な分析物の割合は、サンプル中に存在する未検出の分析物と比較して、大幅に、場合によっては１００％まで改善することができる。これにより、信号対雑音比がさらに改善し、バックグラウンドノイズが減少し、マルチプレックス検出の特異性および感度が改善する。

したがって、いくつかの実施形態では、レポーター結合部分の濃度は、レポーターの濃度よりも高く、任意により、少なくとも５倍高く、または少なくとも１０倍高く、または少なくとも１００倍高く、または少なくとも１０００倍高い。

いくつかの実施形態では、レポーター結合部分の濃度または複数のレポーター結合部分（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポート結合部分）の濃度は、レポーターの濃度または複数のレポーター（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポーター）の濃度より約１０００倍高い。

いくつかの実施形態では、レポーターの濃度または複数のレポーター（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポーター）の濃度は、ピコモル範囲にある。例えば、レポーターの濃度または複数のレポーター（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポーター）の濃度は、約３００ｐＭであり得る。いくつかの実施形態では、レポーターの濃度または複数のレポーター（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポーター）の濃度は、約１０ｐＭ～約１４０ｐＭ、または約４０ｐＭ～約１４０ｐＭ、約４０ｐＭ～約１００ｐＭ、または約６０ｐＭ～約１００ｐＭ、または約８０ｐＭ～約１００ｐＭ、または約１００ｐＭ～約１４０ｐＭである。いくつかの実施形態では、レポーターの濃度または複数のレポーター（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポーター）の濃度は、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭ、または約６０ｐＭ、または約８０ｐＭ、または約１００ｐＭである。いくつかの実施形態では、レポーターの濃度または複数のレポーター（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポーター）の濃度は、約１２０ｐＭである。

いくつかの実施形態では、レポーター結合部分の濃度または複数のレポーター結合部分（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポート結合部分）の濃度は、ナノモル範囲にある。例えば、レポーター結合部分の濃度または複数のレポーター結合部分（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポート結合部分）の濃度は、約１ｎｍを超え得る。いくつかの実施形態では、レポーター結合部分の濃度または複数のレポーター結合部分（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポート結合部分）の濃度（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポート結合部分）は、約１ｎｍ～約６０ｎＭ、または約１ｎｍ～約５０ｎＭ、または約１ｎｍ～約４０ｎＭ、または約１ｎｍ～約３０ｎＭ、または約１ｎｍ～約２０ｎＭ、または約１ｎｍ～約１５ｎＭ、または約１ｎｍ～約１０ｎＭ、または約１ｎｍ～約５ｎＭである。いくつかの実施形態では、レポーター結合部分の濃度または複数のレポーター結合部分（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポート結合部分）の濃度は、約１００ｎｍ～約７００ｎＭ、例えば、約１００ｎＭ、または約２００ｎＭ、または約３００ｎＭ、または約４００ｎＭ、または約５００ｎＭ、または約６００ｎＭ、または約６００ｎＭである。

いくつかの実施形態では、レポーター結合部分の濃度または複数のレポーター結合部分（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポート結合部分）の濃度は、約１ｎＭ～約１０ｎＭの範囲であり、レポーターの濃度は、約１５ｐＭ～約２５ｐＭの範囲である。いくつかの実施形態では、レポーター結合部分の濃度または複数のレポーター結合部分（例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０のレポート結合部分）の濃度は、約５ｎＭであり、レポーターの濃度は、約２０ｐＭである。

実施形態では、本方法では、少なくとも４つの分析物、または少なくとも６つの分析物、または他の任意の数の分析物を同時に検出することができる。いくつかの実施形態では、本方法では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０の分析物、または１０を超える分析物を検出することが可能になる。いくつかの実施形態では、本方法では、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０の分析物、または１０を超える分析物を検出することが可能になる。

本開示の実施形態による方法を使用して、様々な分析物を検出することができる。いくつかの実施形態では、分析物は、タンパク質バイオマーカーであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、分析物は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）／ルトロピン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗体、エストロン－３－グルクロニド（Ｅ３Ｇ）、細菌、ヘモグロビンＡ１Ｃ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、炎症バイオマーカー、トロポニン、ライム病抗原、ライム病抗体、ＬＤＬバイオマーカー、ＨＤＬバイオマーカー、総コレステロールバイオマーカー、甲状腺刺激ホルモンは、Ｃ型肝炎ウイルスバイオマーカー、ライノウイルスバイオマーカー、インフルエンザウイルスバイオマーカー、肝機能バイオマーカー、エストロゲン、プロゲステロン、乳酸、およびこれらの組み合わせ（例えば、前述の少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０）であるか、またはこれらを含む。いくつかの実施形態では、分析物は、追加的または代替的に、Ｎ末端（ＮＴ）－プロホルモンＢＮＰ（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、Ｄ－ダイマー、ビタミン－Ｄ、ビタミンＢ１２、Ｔ３、Ｔ４、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、フェリチン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、プロゲステロン、エストラジオール、テストステロン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、およびホモシステイン、およびこれらの組み合わせ（例えば、前述の少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０）のうちの１つ以上を含む。

いくつかの実施形態では、タンパク質バイオマーカーは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）／ルトロピン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗体、エストロン－３－グルクロニド（Ｅ３Ｇ）、細菌、ヘモグロビンＡ１Ｃ、Ｃ反応性タンパク質、炎症バイオマーカー、トロポニン、ライム病抗原、ライム病抗体、ＬＤＬバイオマーカー、ＨＤＬバイオマーカー、総コレステロールバイオマーカー、甲状腺刺激ホルモンは、Ｃ型肝炎ウイルスバイオマーカー、ライノウイルスバイオマーカー、インフルエンザウイルスバイオマーカー、肝機能バイオマーカー、エストロゲン、プロゲステロン、乳酸、およびこれらの組み合わせ（例えば、前述の少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０）からなる群から選択される。

実施形態では、サンプルの非限定的な例としては、全血、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、発汗、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液、粘液、痰、月経血、月経液、膣粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、尿道球腺液、悪露、粘膜分泌物、リンパ液、膿汁、およびこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血、血漿、血清、または尿である。

いくつかの実施形態では、サンプルは、約１マイクロリットルの量を有する。いくつかの実施形態では、サンプルは、約１マイクロリットルより少ない量を有する。いくつかの実施形態では、サンプルは、約２マイクロリットル、または約３マイクロリットル、または約４マイクロリットル、または約５マイクロリットルの量を有する。

いくつかの実施形態では、例えば、検出された分析物が抗体を含む場合、この方法は、磁性粒子と、夾雑抗体および／または非抗体部分を結合するように構成されている部分と、を含む磁性コンジュゲートでサンプルを前処理するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、夾雑抗体は、対応する抗体を結合するように構成されている抗原に対して向けられていないか、または対応する抗体を結合するように構成されている抗原に対する免疫応答を生成するのに有効でない。いくつかの実施形態では、前処理は、以下のうちの１つ以上を減少させるかまたは排除する：（ａ）異好性抗体；（ｂ）磁性粒子と非特異的に相互作用する抗体；（ｃ）磁性粒子と非特異的に相互作用する非抗体部分。

いくつかの実施形態では、方法は、ポイントオブケア使用に好適である。いくつかの実施形態では、方法は、現場での使用に好適であり、かつ／または、この方法は、家庭での使用に好適である。

いくつかの実施形態では、方法は、世界保健機関のＡＳＳＵＲＥＤ（手頃な価格、高感度、特異的、ユーザーフレンドリー、迅速かつ堅牢、機器不要、および送達可能である）基準と矛盾がない。

いくつかの実施形態では、本方法は、偽陽性を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、本方法は、偽陰性を実質的に含まない。

いくつかの実施形態では、本方法は、固相イムノアッセイ法、ビーズベースのフローサイトメトリー、またはラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイよりも優れた感度および特異性を提供する。

いくつかの実施形態では、本方法は、ビーズベースのフローサイトメトリーベースのアッセイ、任意によりビーズベースのフローサイトメトリーベースのアッセイを用いる方法よりも優れた感度および特異性を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイを用いる方法よりも優れた感度および特異性を提供する。

いくつかの実施形態では、本方法は、ナノモル、またはピコモル、またはフェムトモルスケールの感度を提供する。

実施形態では、本開示による方法は、レポーターを検出することによって抗体の存在、不在、またはレベルを検出するように構成されているナノ粒子ベースのイムノアッセイを使用する。いくつかの実施形態では、イムノアッセイは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１５４４０（ＷＯ２０１８１４０７１９として公開）に記載されているアッセイと同様に、またはそれらのアッセイの変形または組み合わせとして実施することができ、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
イムノアッセイ

本明細書に記載の方法には、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法が含まれる。

図１Ａ～１Ｅは、サンプル中の複数の標的分析物を検出する方法の例を示す。図１Ａは、各々が対応する捕捉部分および目的の分析物（「標的分析物」）に連結されている磁性粒子を示す。この例では、目的の５つの分析物１０２、１０４、１０６、１０８、および１１０が検出されている。ここでは、説明のみを目的として示されている。

図１Ｂは、図１Ａの分析物１０２、１０４、１０６、１０８、および１１０が、各々、タグ（「レポータタグ」）が結合しているレポーター結合部分（「レポータ部分」）と会合できることを示している。図１Ｃでは、最終的な複合体は、各レポーター結合部分に結合している対応するレポーター２０２、２０４、２０６、２０８、および２１０と共に形成され、次に、分析物１０２、１０４、１０６、１０８、および１１０から分析物に結合する。レポーター２０２、２０４、２０６、２０８、および２１０の各々は、異なる色のシグナル－例えば、オレンジ（２０２）、黄色（２０４）、赤（２０６）、緑（２０８）、および青（２１０）を生成することができる。例えば、各レポーターは、異なるサイズの１つ以上の量子ドットを含むことができる。各レポーターは、対応するタグと結合するように構成されているタグ結合パートナーを有し、これによりタグ－タグ結合パートナー相互作用を介して、レポーターを、そのタグに結合されているレポーター結合部分に会合させる。図１Ｄは、磁場を印加し、それにより、図１Ｃの複合体がサンプルから分離されるようにできることを例示している。その後、残りのサンプルを洗い流すことができる（「洗浄」）。

図１Ｅは、レポーター２０２、２０４、２０６、２０８、および２１０によって生成された異なるシグナルを検出することにより、それらのレポーターに会合している対応する抗体の検出が可能になることを示している。この例では、レポーター２０２、２０４、２０６、２０８、および２１０は、それぞれ異なる色を有するシグナル（スペクトル）３０２、３０４、３０６、３０８、および３１０を生成する。このようにして、サンプル中の複数の分析物が検出される。しかし、分析物がサンプル中に存在しているか否かに応じて、レポーターの検出の結果として、それぞれのシグナルが検出される場合と検出されない場合とがあることを認識しておく必要がある。

いくつかの実施形態では、複数の分析物の各分析物を検出するために最終的な検出可能複合体を形成するために、レポーター結合部分は、レポーター結合部分に結合しているそれぞれのオリゴヌクレオチドとレポーターとの間の相互作用を介して、対応するレポーターと会合することができる。

実施形態では、本方法では、１つまたは複数の分析物が存在すること、および１つまたは複数の分析物が存在しないことを検出する。実施形態では、本方法は、複数の分析物の濃度またはレベルを検出する。

図２Ａ～図２Ｂは、本開示のいくつかの実施形態による、サンプル中の複数の分析物の検出方法の例を示す。図２Ａは、タグ（例えば、デスチオビオチン）およびそれに結合している第１のオリゴヌクレオチドを有するレポーター結合部分（一例として、抗体様形状を有する）、およびタグ結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）およびそれに結合している第２のオリゴヌクレオチドを有するレポーター（オレンジ色の円）を示す。図２Ａおよび図２Ｂの例では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、互いに相補的である。

図２Ａに示すとおり、レポーター結合部分は、タグがレポーター結合部分に近接して位置されるようにタグに会合されている。タグは、第１のオリゴヌクレオチドに連結させ得る。いくつかの実施形態では、タグは、他の方法では、レポーター結合部分に会合させ得る。図２Ａにも示すとおり、レポーターは、タグ結合パートナーが、レポーターに連結された末端とは反対側にある第２のオリゴヌクレオチドの末端に位置するように、タグ結合パートナー（例えばストレプトアビジン）と会合されている。このようにして、タグおよびタグ結合パートナーが互いに会合するとき、速いオン速度および速いオフ速度で、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、それらの間に相補性がある場合には、アラインメント可能であるように位置される。図２Ｂは、図２Ａの第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが互いに相補的であるため、それらが互いにハイブリダイズして安定な構造を形成し、これによりレポーター結合部分をレポーターと会合させることを示す。

ハイブリダイゼーションに十分な第１および第２のオリゴヌクレオチド間の相補性は、１００％未満の相補性であり得ることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、互いに、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％、または１００％相補的であり得る。

いくつかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、互いに完璧に相補的である。いくつかの実施形態では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、互いに完璧に相補的でない。完璧な相補性は、第１のオリゴヌクレオチドと第２のオリゴヌクレオチとのハイブリダイゼーションに必要とされない場合もある。

図３Ａ～図３Ｂは、本開示のいくつかの実施形態による、サンプル中の複数の分析物の検出方法の別の例を示す。図３Ａは、タグ（例えば、デスチオビオチン）およびそれに結合している第１のオリゴヌクレオチドを有するレポーター結合部分、およびタグ結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）およびそれに結合している第２のオリゴヌクレオチドを有するレポーター（オレンジ色）を示す。図３Ａおよび図３Ｂの例では、第１および第２のオリゴヌクレオチドは、互いに相補的でない。図３Ｂは、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが互いに相補的でない（または相補性が十分でない）場合、タグ－タグ結合パートナー相互作用が解離し、レポーター結合部分がレポーターと会合しないことを示している。

特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、サンドイッチ法、分別添加法、競合法、三次（３つの結合事象）法、全細胞アッセイ法、またはそれらの組み合わせを包含する。

例えば、サンドイッチ法は、上述の複数の分析物を検出するために、少量の流体サンプルの処理に十分に好適であり得る。本明細書に記載の分別添加方法では、改善された感度を有し、より大きい流体量の処理が可能になり得る。競合アッセイ法は、例えば、分析物に同時に結合するであろう捕捉部分および対応するレポーター結合部分の一致した対が利用できない状況において、分析物をアッセイするために有用であり得る。三次アッセイ法は、本方法で使用される系の速度論を向上させるための３つの結合事象を包含し得る。

いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法は、サンドイッチ法、分別添加法、および／または競合アッセイ法、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。

実施形態では、本明細書に記載の方法では、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量の本発明の検出を実施するように構成されているナノ粒子ベースのイムノアッセイなどのイムノアッセイを用いる。ナノ粒子ベースのイムノアッセイは、ポータブルシステムであり得るマルチプレックス試験プラットフォームの一部として実装することができる。本システムは、本発明の検出を実施するために必要な全ての構成要素を含むキットの形態とすることができる。

サンドイッチイムノアッセイ法に従って実施される方法のいくつかの実施形態では、レポーターは、例えば、１００～６００個の量子ドットを含浸させたシリカシェルを有する１つ以上の金コア粒子（ｎａｎｏＣｏｍｐｏｓｉｘ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、レポーターは、１つ以上の量子ドット、または別のナノ粒子を含む。

いくつかの実施形態では、明るいレポーターであり（すなわち、高品質のシグナルを生成する）、高い表面積を有し、分析中にコロイド的に安定なままであるレポーターを使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、そのようなレポーターは、シグナルの約３００倍までの光増幅を提供する多数の（例えば、数百の）高蛍光量子ドットを含む粒子であり得る。

サンドイッチイムノアッセイは、少なくとも１つの磁性コンジュゲート、目的の分析物、およびタグ－タグ結合パートナー相互作用を介して結合している対応するレポーターに会合しているレポーター結合部分を含む複合体が形成されているか否かを検出することを含む。実施形態では、少なくとも１つの磁性コンジュゲートは、磁性粒子と、磁性粒子に連結され、各々が複数の分析物のうちの対応する分析物と結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む。このようにして、サンプル中に複数の分析物を、同じ磁性粒子を使用して検出することができる。本アッセイは、磁性粒子と、磁性粒子に連結され、各々が複数の分析物のうちの対応する分析物と結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む１つの磁性コンジュゲートを含むことができる。いくつかの実施形態では、本アッセイは、２つ以上の磁性コンジュゲートを含む。さらに、いくつかの実施形態では、本アッセイは、例えば、磁性粒子と、その磁性粒子に連結されている複数の補足部分と、を含む少なくとも１つの磁性コンジュゲート、および磁性粒子と、その磁性粒子に連結されている１つの捕捉部分と、を含む少なくとも１つの磁性コンジュゲートなど、様々な種類の磁性コンジュゲートを含むことができる。
複合体（「サンドイッチ」）は、分析物の存在下でのみ形成される。分析物が存在する場合、得られた複合体は、磁石によって引き付けられ得、分析物濃度が上昇するにつれて、その強度を増大させる光シグナルを提供する。

サンドイッチ複合体は、レポーター結合部分／レポーター系が磁性コンジュゲートと結合しないため、分析物がない場合には形成できない。磁性粒子に会合していない場合には、レポーターは、洗浄され、サンプルの分析時にシグナルを生成しない。

サンドイッチイムノアッセイ法のいくつかの実施形態では、磁性コンジュゲート（磁性粒子と、磁性粒子に連結され、各々が複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む）、複数のレポーター結合部分（各々に対応するタグが結合しており、各レポーター結合部分は、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている）、および複数のレポーター（各々に結合している対応するタグ結合パートナーを有し、これにより、タグ結合パートナーが対応するタグを結合し、これによって、タグに結合しているレポーター結合部分が、対応するレポーターと会合するようになり、ここで、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている）を分析チャンバに添加し、目的の１つ以上の分析物を含む生物学的サンプルと混合してもよい。磁石によって磁場を印加（「プルダウン」）して、分析物をサンプルから分離することができる。プルダウンは、ある一定期間（例えば、約１分、約２分、または約３分、または約４分、または約５分、または約６分、または約７分）、サンプル（他の成分を添加して）に磁場を印加することによって実施することができる。いくつかの実施形態では、磁場は、約５分間印加される。しかし、磁場は、任意の好適な期間、サンプルに印加され得ることを理解されたい。

レポーターが、蛍光シグナルレポーター（例えば、有機色素、ナノ材料、または共役ポリマー）である場合、光は、分析チャンバの少なくとも一部分を透過して、レポーターに蛍光を発生させてもよい。このような蛍光は、好適な検出器によって検出され得る。実施形態では、対応する異なる分析物に会合するレポーターは、異なる色のシグナルを生成することができ、その結果、レポーターが検出されることにより、検出される複数の分析物のうちの分析物の存在または量を決定することができるようになる。目的の分析物（複数可）が存在しない場合、レポーターは、分析物と一緒にプルダウンされないため、蛍光は発生しない。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のこの方法は、（ａ）磁性粒子と、その磁性粒子に連結され、各々が複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む磁性コンジュゲートとサンプルを接触させるステップと；（ｂ）磁性コンジュゲートを、各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分と接触させるステップであって、各レポーター結合部分が、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている、ステップと；（ｃ）磁性コンジュゲートを、各々が対応するタグを結合するように構成されている対応するタグ結合パートナーを有する複数のレポーターと接触させて、これにより、任意により、タグに結合しているレポーター結合部分を対応するレポーターと会合させるステップであって、ここで、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；（ｄ）磁場を印加して、磁性コンジュゲートを分離するステップであって、磁性コンジュゲートは、複数の分析物のうちの１つと任意により会合し、タグ－タグ結合パートナー相互作用を介して結合している対応するレポーターと会合している対応するレポーター結合部分を有する、ステップと；（ｅ）レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、複数の分析物の各分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含み得る。

上記実施形態では、磁性コンジュゲートは、磁性粒子に連結され、各々が複数の分析物のうちの対応する分析物と結合するように構成されている複数の捕捉部分を有する磁性粒子を含む。いくつかの実施形態では、磁性コンジュゲートは、連結されている１つの捕捉部分を有する磁性粒子を含む。したがって、いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法は、（ａ）各々が、磁性粒子と、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている捕捉部分と、を含む複数の磁性コンジュゲートとサンプルを接触させるステップと；（ｂ）磁性コンジュゲートを、各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分と接触させるステップであって、各レポーター結合部分が、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている、ステップと；（ｃ）磁性コンジュゲートを、対応するタグを結合するように構成され、各々に対応するタグ結合パートナーが結合している複数のレポーターと接触させて、これにより、任意により、タグに結合されているレポーター結合部分を対応するレポーターと会合させるステップであって、ここで、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；（ｄ）磁場を印加して、磁性コンジュゲートを分離するステップであって、磁性コンジュゲートは、各々が複数の分析物のうちの１つの分析物を任意に有し、分析物が、結合している対応するレポーターに会合している対応するレポーター結合部分を有する、ステップと；（ｅ）レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、複数の分析物の各分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含む。

レポーターが蛍光シグナルレポーターである場合、サンプルを運んでいる分析チャンバの少なくとも一部分を介して光を透過させて、レポーターを蛍光させ得、放出された蛍光を好適な検出器によって測定する。レポーターは、例えば、光源および光検出器を用いて検出することができる。実施形態では、レポーターは、各々がそれぞれの分析物に結合し（分析物がサンプル中に存在する場合）、色など、異なる特性の対応するシグナルを生成し、したがって、方法では、サンプル中の異なる分析物を識別することが可能になる。

いくつかの実施形態では、色に追加的または代替的に、表面電荷、電荷密度、散乱特性、ならびに他の特性などのレポーター粒子特性を使用して、検出される異なる分析物を区別することができる。いくつかの実施形態では、レポーター粒子は、核酸ベースのバーコードと会合させる（例えば、コーティングさせる）ことができ、その場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、核酸ベースのバーコードを検出することによってレポーターを検出することができる。

実施形態では、少なくとも１つの磁性コンジュゲート（磁性粒子および磁性粒子に連結されている複数の捕捉部分を含む）、複数のレポーター結合部分、および複数のレポーターを、同時にまたは異なる時間に分析チャンバに添加することができる。したがって、いくつかの実施形態では、磁性コンジュゲート、複数のレポーター結合部分、および複数のレポーターを別々に添加してもよい。さらに、いくつかの実施形態では、複数のレポーター結合部分および複数のレポーターを互いに予め結合させることができる。

いくつかの実施形態では、イムノアッセイ法は、分別添加方法であり、これは、より多量のサンプルを処理するために使用することができ（しかし、小サンプルも同様に分析することができる）、目的の分析物の濃縮が可能になる。このアプローチにより、感度が向上して、分析物または複数の分析物の同時検出が可能になり得る。分別添加方法では、少なくとも１つの磁性コンジュゲートを分析チャンバに添加して、サンプル（目的の分析物を含んでも、含まなくてもよい）と混合してよい、または検出された複数の分析物の一部（すべてではない）を含むことができる。プルダウンは、磁場を活性化することによって実施され（分析物は、存在する場合には、磁性コンジュゲートの対応する捕捉部分と結合するようになる）、任意の量のサンプル（例えば一部）を除去してもよい。その後、さらなる量のサンプルを添加してもよい。さらなる量のサンプルの添加後（または場合によっては、その前に）、磁場が不活性化され、磁性コンジュゲートを再びサンプルと混合させてもよい。このプロセスは、分析物を濃縮するために一定数繰り返してもよい。分析物を濃縮後、複数のレポーター結合部分および複数のレポーターを添加して、サンプルと混合してもよく、これにより、各レポーター結合部分が、複数の分析物のうちの対応する分析物と結合し、レポーター結合部分に結合しているタグが、対応するタグ結合パートナーに結合し、次に、対応するレポーターに結合するようになり、これによりレポーター結合部分は、対応するレポーターに会合する。次いで、さらなる磁気プルダウンは、（存在する場合）その各々が、対応する磁性粒子およびレポーターに結合している分析物を（レポーター結合部分を介して）分離するように実施してもよい。レポーターが蛍光シグナルレポーターである場合、分析チャンバの少なくとも一部分を介して光を透過させて、レポーターを蛍光させ得、放出された蛍光を好適な検出器によって測定する。分析物が存在しない場合、レポーターは、分析物と一緒にプルダウンされないため、蛍光は検出されない。

いくつかの実施形態では、競合イムノアッセイ法が実施され、これは、２種類の方法を含むことができる。方法はそれぞれ、サンプル中の複数の分析物を同時に検出するために使用することができる。

第１の種類の競合的イムノアッセイ法の方法は、分析物（例えば、限定するものではないが、抗原、抗体、細胞、細菌、ウイルスなど）が、対応する捕捉部分（磁性コンジュゲートの一部として、磁性粒子に連結されている）およびレポーター結合部分（例えば、タグ－タグ結合パートナー相互作用を介して、レポーターに連結されていても、連結されていなくてもよい）と同時に結合するには非常に小さい状況で使用することができる。この方法は、捕捉部分およびレポーター結合部分のいずれかが利用できない場合にも使用され得る。この方法では、磁性コンジュゲートをアッセイチャンバに添加し、生物学的サンプル（目的の分析物を含んでも含まなくてもよい）と混合してもよい。次いで、目的の分析物の不在下で磁性コンジュゲートを結合するように構成されているレポーター標識された第２の分析物（これは、分析物とは異なる形態の分析物である）を添加し、サンプルと混合してもよい。目的の分析物がサンプル中に存在する場合、レポーター標識された第２の分析物は、磁性コンジュゲートの捕捉部分の結合部位が目的の分析物に占有されているため、磁性コンジュゲートに結合しない。しかし、目的の分析物が分析サンプルに存在しない場合には、磁性コンジュゲートは、レポーター標識された第２の分析物に結合する。磁気プルダウンを実施して、（存在する場合）目的の分析物をサンプルから分離させる。レポーターが蛍光シグナルレポーターである場合、分析チャンバの少なくとも一部分を介して光を透過させて、レポーターを蛍光させ得、放出された蛍光を好適な検出器によって測定する。目的の分析物が存在しない場合、レポーター標識された分析物は、磁性コンジュゲートと一緒にプルダウンされ、蛍光は検出されない。

したがって、いくつかの実施形態では（例えば、第１の種類の競合的イムノアッセイ法が実施される場合）、本明細書に記載の方法は、以下のステップを含み得る：（ａ）磁性粒子と、サンプルに目的の分析物を結合するように構成されている少なくとも１つの捕捉部分と、を含む磁性コンジュゲートとサンプルを接触させるステップと；（ｂ）サンプル中に分析物の不在下で、磁性コンジュゲートを、磁性コンジュゲートを結合するように構成されているレポーター標識された第２の分析物と接触させるステップと；（ｄ）分析チャンバに磁場を印加して、任意により分析物と会合している磁性コンジュゲートをプルダウンさせるステップと；（ｅ）光源および光検出器でレポーターを検出することによって、分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップとを含み得る。

第２の種類の競合的イムノアッセイ法では、磁性粒子（例えば、磁気ビーズ）を、それに結合している第２の競合分析物（例えば、抗原、抗体、または別のタイプ）と共に使用してもよい。第２の分析物は、目的の分析物とは異なり得る。第２の分析物は、例えば、目的の分析物を結合するように構成されているレポーター結合部分を結合するように構成されている抗原であり得る。目的の分析物が存在しない場合、（磁性粒子に結合している）第２の分析物は、レポーターに会合しているレポーター結合部分に結合する。得られた複合体は、磁石によって引き付けられ得、サンプル中の目的の分析物の濃度が上昇するにつれて、強度を低下させる光シグナルを提供する。目的の分析物がサンプル中に存在する場合、これにより、複合体の形成がブロックされる。特に、目的の分析物がサンプル中に存在する場合、レポーター結合部分を先制的に結合させることができ、これにより、磁性粒子に結合している第２の分析物との完全な複合体の形成について競合する。例えば、目的の分析物が抗原である場合、レポーター結合部分（すなわち、抗体）上の利用可能な結合部位に結合し、したがって（磁性粒子に結合している）第２の分析物のレポーター結合部分（レポーターに結合）への結合を妨げる。このようにして、レポーター結合部分上の抗体結合部位は、目的の分析物が占有し、したがって、目的の分析物は、完全な複合体の形成のために競合する。したがって、磁場が印加されたときに、磁性粒子に結合し、レポーターには結合していない第２の分析物がプルダウンされる。レポーター結合部分を介してレポーターに結合している目的の分析物（レポーターおよびレポーター結合部分は、タグ－タグ結合パートナー相互作用を介して相互作用し得る）は洗い流される。したがって、レポーターによって生成される光シグナルは、目的の分析物の濃度が上昇するにつれて強度が低下する。

第２の種類の競合的イムノアッセイ法では、アッセイが実施される前に、磁性粒子を第２の分析物に連結させることができる（磁性粒子標識分析物と呼ばれるものが形成される）。いくつかの実施形態では、方法は、レポーターおよびレポーター結合部分を含むレポーターコンジュゲートの使用を含む。レポーターコンジュゲートは、生物学的サンプルを含む分析チャンバに添加し、目的の分析物を含み得るサンプルと混合する。第２の分析物が結合している磁性粒子は、分析チャンバに添加し、サンプルと混合する。次に、磁気プルダウンを実施して、第２の分析物が結合している磁性粒子をサンプルから分離する。レポーターが蛍光シグナルレポーターである場合、サンプルを介して光を透過させて、レポーターを蛍光させ得、放出された蛍光を好適な検出器によって測定する。目的の分析物の存在下では、第２の分析物が結合しているが、レポーターとは会合していない磁性粒子がプルダウンされ、その結果、蛍光が存在しない。サンプル中の目的の分析物の濃度に応じて、レポーターによって生成されるシグナルの強度は、分析物の濃度が上昇するにつれて低下する。

したがって、いくつかの実施形態（例えば、第２の種類の競合イムノアッセイ法が実施される）では、本明細書に記載の方法は、（ａ）レポーターと、サンプル中の目的の分析物を結合するように構成されているレポーター結合部分と、を含むレポーターコンジュゲートとサンプルを接触させるステップと；（ｂ）サンプル中に目的の分析物が存在しない場合に、レポーターコンジュゲートを結合するように構成されている磁性粒子で標識された第２の分析物とサンプルを接触させるステップと；（ｃ）サンプルに磁場を印加することにより、磁性粒子標識分析物をサンプルから分離するステップと；（ｄ）レポーターを検出することにより、分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含み得る。レポーターは、例えば、上記の実施形態に記載のとおり、光源および光検出器を使用して検出することができる。

上で論じたように、本開示の実施形態では、レポーターコンジュゲート（すなわち、レポーター結合部分およびそれに結合しているレポーター）を使用する代わりに、マルチプレックス検出方法は、（レポーターの代わりに）タグが結合しているレポーター結合部分の使用を含むことができる。タグが結合しているレポーター結合部分および対応するタグ結合パートナーが結合しているレポーターを、２つのそれぞれの別のステップで反応混合物に添加することができる。タグが結合しているレポーター結合部分の使用（およびタグ結合パートナーを有するレポーターの使用）により、レポーター結合部分の濃度を上昇させることが可能になり、レポーターの濃度は、レポーター結合部分の濃度よりも実質的に低い。最終的な複合体形成速度は、劇的に上昇し、６時間ほど要し得る従来のアッセイと比較して、全アッセイを２０分未満（例えば、約１５分）で実施できるようになる。

したがって、いくつかの実施形態では、第２の種類の競合的イムノアッセイ法は、サンプル中の複数の分析物を検出するためのタグおよび対応するタグ結合パートナーの使用を含むマルチプレックスイムノアッセイである。タグおよびタグ結合パートナーは、複数の分析物のうちの特定の分析物の検出のために、固有のタグ－タグ結合パートナー対が使用されるように選択することができる。この対は、検出アッセイの文脈において固有であり、例えば、互いに結合することができるタグおよびタグ結合パートナーは、複数の分析物のうちの他の分析物の検出のためにそのアッセイにおいて使用される他のいずれのタグおよびタグ結合パートナーにも結合しない。

したがって、いくつかの実施形態では、検出方法は、（ａ）各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分とサンプルを接触させるステップであって、ここで、各レポーター結合部分は、複数の分析物のうちの対応する目的の分析物を結合するように構成されている、ステップと；（ｂ）タグ結合パートナーが対応するタグに結合するように、各々に対応するタグ結合パートナーが結合している複数のレポーターとサンプルを接触させて、これによりタグに結合しているレポーター結合部分を対応するレポーターと会合させるステップであって、ここで、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；（ｃ）各々が複数の分析物のうちの対応する目的の分析物の不在下で、対応するレポーター結合部分を結合するように構成されている複数の磁性粒子標識された第２の分析物とサンプルを接触させるステップと；（ｄ）サンプルに磁場を印加することにより、複数の磁性粒子標識分析物をサンプルから分離するステップと；（ｅ）レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含む。レポーターは、例えば、上記の実施形態に記載のとおり、光源および光検出器を使用して検出することができる。

実施形態では、複数の目的の分析物を、競合イムノアッセイ法を用いて、マルチプレックス様式で生物学的サンプル中に検出することができる。上で論じたように、方法は、以下の使用を含み得る：各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分の使用であって、ここで、各レポーター結合部分は、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている、使用；および各々に対応するタグ結合パートナーが結合している複数のレポーターの使用であって、これによりタグ結合パートナーが、対応するタグを結合するようになり、ここで、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、使用。

いくつかの実施形態では、上で論じたとおり、レポーター結合部分（例えば、低親和性タグ）およびレポーターは、互いにハイブリダイズすることができ、これによりレポーター結合部分とレポーターとの間の相互作用を容易にすることができる、結合している各第１および第２のオリゴヌクレオチドを有することができる。第１および第２のオリゴヌクレオチドは、相補性がある場合、それらが互いに結合し、これによりタグとタグ結合パートナーとの結合が容易になるように、互いに相補的であり得る。タグは、タグに結合している第１のオリゴヌクレオチドとタグ結合パートナーに結合している第２のオリゴヌクレオチドとの間の結合が、タグ－タグ結合パートナーの会合およびレポーター結合部分とレポーターとの間のそれぞれの会合に必要とされるように、タグ結合パートナーに対して低い親和性を有することができる。

いくつかの実施形態では、タグは、ビオチンを含み、タグ結合パートナーがストレプトアビジンを含む、またはタグは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含み、タグ結合パートナーが抗ＦＩＴＣ抗体を含む、またはタグは、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）を含み、タグ結合パートナーが抗ＤＮＰ抗体を含む、またはタグは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を含み、タグ結合パートナーが抗ＤＩＧ抗体を含む、またはタグは、Ｅｔａｇを含み、タグ結合パートナーが抗Ｅｔａｇ抗体（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ（配列番号１））を含む、またはタグは、ＦＬＡＧを含み、タグ結合パートナーが抗ＦＬＡＧ抗体（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２））を含む、またはタグは、Ｍｙｃを含み、タグ結合パートナーが抗Ｍｙｃ抗体（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号３））を含む、またはタグは、ＨＡを含み、タグ結合パートナーが抗ＨＡ抗体（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４））を含む、またはタグは、ＳＮＡＰを含み、タグ結合パートナーがベンジルグアニン誘導体を含む、またはタグは、「ＣＬＩＰ」を含み、タグ結合パートナーがベンジルシトシン誘導体を含む。

いくつかの実施形態では、レポーター結合部分は、結合半減期が短いタグ（例えば、デスチオビオチン）およびそれに結合している第１のオリゴヌクレオチドを有し、レポーターは、アビジン（例えば、ストレプトアビジン）を含むタグ結合パートナーおよびそれに結合している第２のオリゴヌクレオチドを有し、ここで、第２のオリゴヌクレオチドは、レポーター結合部分に結合している短い結合半減期を有するタグとレポーターに結合しているアビジンとの間の結合を介して、レポーター結合部分が、対応するレポーターと会合する場合、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成されている。

いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法は、（ａ）複数のレポーター結合部分をサンプルと接触させるステップであって、各レポーター結合部分は、結合している対応するタグを有し、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている、ステップと；（ｂ）タグ結合パートナーが対応するタグに結合するように、各々に対応するタグ結合パートナーが結合している複数のレポーターとサンプルを接触させて、これによりタグに結合しているレポーター結合部分を対応するレポーターと会合させるステップであって、ここで、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；（ｃ）各々が対応するレポーター結合部分を結合するように構成されている複数の第２の分析物が結合している磁性粒子をサンプルと接触させるステップと；（ｄ）磁場を印加して、磁性粒子を分離するステップであって、磁性粒子は、結合している複数の第２の分析物を任意により有する、ステップと；（ｅ）対応するレポーターを検出することにより、複数の分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含み得る。レポーターは、例えば、上記の実施形態に記載のとおり、光源および光検出器を使用して検出することができる。

いくつかの実施形態では、三次イムノアッセイ法が実施され、これは、本発明で使用される系の速度論を向上させるために３つの結合事象を利用する。三次結合法は、サンドイッチ法、分別添加法、および競合アッセイ（第１および第２の方法）に適用することができるか、またはそれらを含むことができる。三次様式は、タグ結合パートナーが結合しているレポーター（例えば、ストレプトアビジンで官能基化されている蛍光量子ドット）と、タグが結合しているレポーター結合部分（例えば、ビオチンで標識された抗体）と、磁性粒子および複数の捕捉部分を含む磁性コンジュゲートとを含む、レポーターコンジュゲートの使用を含み得る。サンプルは、分析チャンバ内で廃棄できる。

三次結合法は、磁性コンジュゲート（磁性粒子および複数の捕捉部分を含む）を分析チャンバに添加することと、磁性コンジュゲートを、目的の少なくとも１つの分析物を含み得るサンプルと混合することと、を含み得る。磁場を印加（「プルダウン」）して、目的の分析物をサンプルから分離することができる。任意の量のサンプルを除去してよく、分析物濃縮ステップを上記のとおり１回以上実施してもよい。磁場は、不活性化されてもよく、レポーター結合部分（例えば、タグが結合している抗体）が分析チャンバに添加されてもよく、これにより、次に、磁性コンジュゲートに結合している目的の分析物に結合し得る。次いで、レポーター（タグ結合パートナーが結合している）を分析チャンバに添加してもよく、次いで、例えば、タグ結合パートナー－タグ相互作用（例えば、ストレプトアビジン－ビオチン結合相互作用）を介して、レポーター結合部分に結合してもよい。ここでも、磁気プルダウンを実施して、目的の分析物をサンプルから分離させてもよい。レポーターが蛍光シグナルレポーターである場合、分析チャンバの少なくとも一部分を介して光を透過させて、レポーターを蛍光させ得、放出された蛍光を好適な検出器によって測定する。目的の分析物が存在しない場合、蛍光は発生しない。

いくつかの実施形態では（三次イムノアッセイ法が実施される）、本明細書に記載のこの方法は、（ａ）磁性粒子と、サンプル中の複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている捕捉部分と、を含む少なくとも１つの磁性コンジュゲートをサンプルと接触させるステップと；（ｂ）磁場を印加して、サンプルから複数の分析物のうちの分析物の各々を分離するためのステップと；（ｃ）磁性コンジュゲートを、各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分と接触させるステップであって、各レポーター結合部分は、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている、ステップと；（ｄ）磁性コンジュゲートを、各々が対応するタグを結合するように構成されている結合されている対応するタグ結合パートナーを有する複数のレポーターと接触させて、これにより、任意により、タグに結合しているレポーター結合部分を対応するレポーターと会合させるステップであって、ここで、各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；（ｅ）磁場を印加して、任意により複数の分析物のうちの分析物を有し、結合している対応するレポーターに会合している対応するレポーター結合部分を有する、磁性コンジュゲートを分離させるステップと；（ｆ）レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、複数の分析物の各分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含み得る。

上記実施形態では、ステップ（ｂ）（磁石によりプルダウンして、分析物をサンプルから分離させる）を実施後、ステップ（ｃ）の前に磁場を不活性化させてもよい。また、いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）の後およびステップ（ｃ）の前に、ある量のサンプルを除去して、分析物濃縮ステップを上記で論じるとおり実施してもよい。

いくつかの実施形態では、マルチプレックス検出方法は、異なる種類の複数の全細胞分析物（例えば、異なる細菌）を同じサンプル中で同時に検出することができる全細胞イムノアッセイを含む。全細胞イムノアッセイでは、目的の細胞上に存在する表面分析物（例えば、細胞表面受容体などのバイオマーカー）を標的とし、これにより細胞全体（例えば、細菌）を検出する。全細胞を測定できることにより、適合度、免疫障害、がん、および細菌感染に関する洞察がもたらされ得る。連鎖球菌性咽頭炎の場合、例えば化膿レンサ球菌の検出は、成人および小児におけるこの感染症の有病率の理由から、非常に貴重である。マルチプレックス全細胞検出は、複合体サンプル中の細菌を検出することを有利に可能にし、臨床、疫学、および環境用途での使用が見出されている。

実施形態では、全細胞イムノアッセイは、各分析物の検出のために、磁性コンジュゲート、複数のレポーター結合部分、および複数のレポーターの使用を含む。本明細書に記載の他の実施形態と同様に、磁性コンジュゲートは、磁性粒子と、磁性粒子に連結され、複数の分析物のうちの対応する分析物と結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む。いくつかの実施では、磁性コンジュゲートは、磁性粒子に連結され、各々が複数の分析物のうちの対応する分析物と結合するように構成されている複数の捕捉部分を有する磁性粒子を含む。複数のレポーター結合部分は、各々に結合している対応するタグを有し、各レポーター結合部分は、複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている。磁性コンジュゲートのうちの１つ以上の捕捉部分およびレポーター結合部分は、目的の細胞上の表面分析物に特異的な抗体であり得、検出される細胞分析物の表面上のマーカー、例えば、細胞受容体を結合するように構成することができる。捕捉部分およびレポーター結合部分は、同一または異なる細胞表面受容体に結合するように構成することができる。

複数のレポーターは、各々に結合している対応するタグ結合パートナーを有し、これにより、タグ結合パートナーが対応するタグを結合できるようになり、これによって、タグに結合しているレポーター結合部分を対応するレポーターに会合することができる。各レポーターは、対応する異なるシグナル、例えば、異なる色を有するシグナルを生成するように構成される。アッセイは、検出される細胞の種類ごとに、複数の磁性粒子およびレポーターを（それぞれの捕捉およびレポーター結合部分を介して）細胞と会合させるように設計することができる。複数の分析物をマルチプレックス方法で検出するために、異なる種類の捕捉およびレポーター結合部分、ならびに異なるレポーターが、異なる種類の細胞、例えば異なる細菌などの検出のために選択される。

全細胞マルチプレックスイムノアッセイにおいて、目的の細胞が存在する場合、アッセイ成分は、細胞の表面上の細胞受容体を結合する。得られた複合体は、磁石によって引き付けられ得、分析物濃度が上昇するにつれて、強度を増大させる光シグナルを提供することができる。目的の細胞がサンプルに存在しない場合、複合体は形成されず、レポーター系は、磁気プルダウン中に洗い流され、その結果、負のシグナルが発生する。

様々な実施形態では、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法としては、上記サンドイッチ法のいずれか、分別添加法、競合法（２つの種類を含む）、三次（三つの結合事象）法、全細胞、またはこれらの方法の組み合わせおよび／または変形が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、サンドイッチ法、分別添加法、競合法、および三次法のうちの１つ以上は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１５４４０（ＷＯ２０１８１４０７１９として公開）に記載されているそれぞれのアッセイと同様に実施することができ、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の方法によって検出できる分析物の非限定的な例としては、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）／ルトロピン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）抗体、エストロン－３－グルクロニド（Ｅ３Ｇ）、細菌、ヘモグロビンＡ１Ｃ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、炎症バイオマーカー、トロポニン、ライム病抗原、ライム病抗体、ＬＤＬバイオマーカー、ＨＤＬバイオマーカー、総コレステロールバイオマーカー、甲状腺刺激ホルモンは、Ｃ型肝炎ウイルスバイオマーカー、ライノウイルスバイオマーカー、インフルエンザウイルスバイオマーカー、肝機能バイオマーカー、エストロゲン、プロゲステロン、乳酸、およびこれらの組み合わせのうちの１つ以上が挙げられる。いくつかの実施形態では、分析物は、追加的または代替的に、Ｎ末端（ＮＴ）－プロホルモンＢＮＰ（ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、Ｄ－ダイマー、ビタミン－Ｄ、ビタミンＢ１２、Ｔ３、Ｔ４、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、フェリチン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、プロゲステロン、エストラジオール、テストステロン、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、およびホモシステイン、およびこれらの組み合わせ（例えば、前述の少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも１０）のうちの１つ以上を含む。

いくつかの実施形態では、分析物は、全細胞、例えば、細菌、腫瘍細胞、または任意の他の細胞型、例えば複数の全細胞、もしくは１つの型もしくは様々な型である。本開示の実施形態はまた、ウイルスまたはその構成要素、例えば、複数のウイルスまたはその構成要素を検出するためにも使用することができる。

本開示の実施形態は、任意の好適な分析物を検出するための技術を提供することを理解されたい。

実施形態では、検出される複数の分析物の各分析物は、存在する場合、対応するレポーターと会合することになる。異なる特性を有するレポーターは、特定の分析物と会合するために使用される。例えば、レポーターによって生成された異なる色のシグナルを検出することにより、異なる色がそれぞれの分析物に対応する異なるそれぞれの分析物を区別できるようになる。分析物の存在、不在、または量は、レポーターの存在、不在、または異なる強度（または他の特性）を検出することによって識別できる。

いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の複数の目的の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法は、分別添加方法に関連して上述したとおり、目的の分析物を濃縮することを含むことができる。いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の複数の目的の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法は、競合法、および三次（３つの結合事象）法のうちの一方または両方のステップの一部または全部を含むことができる。

本開示の実施形態による方法は、本明細書で使用される分析装置またはシステムの好適な分析チャンバ内で実施することができる。いくつかの実施形態では、分析チャンバは、好適な数のウェルを備えるウェルプレートを含むか、またはウェルプレートである。実施形態では、マルチプレックス検出分析は、単一のウェル内で実施できる。これにより、ウェルプレート内の各ウェルを複数の分析物の検出に用いることができる。

分析システムは、他の構成要素の中でも、内部に生物学的サンプルを受け入れるように構成されている分析チャンバ、磁石、光源、および検出器（例えば、光検出器）を含むことができる。分析システムは、分析チャンバに磁場を印加するために分析チャンバから分離され得る永久磁石であり得る磁石を含むか、または磁石と会合させ得る。いくつかの実施形態では、磁石は、分析チャンバに磁場を印加するために、活性化または非活性化されるように制御され得る電磁石であってもよい。本開示の実施形態による分析装置またはシステムは、生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するように構成されている任意の好適な構成および任意の好適な構成要素を有することができることを理解されたい。

いくつかの実施形態では、分析システムは、分析チャンバに接続されている、または分析チャンバに別の方法で結合されている光源を含む。光源は、分析チャンバの少なくとも一部分を介した光を透過するように構成される。

いくつかの実施形態では、分析チャンバは、１つのチャンバ、または２つのチャンバ、または３つのチャンバ、または４つのチャンバであり得る。分析チャンバは、複数のチャンバを含んでもよく、これは、５つ以上のチャンバであり得る。いくつかの実施形態では、複数のチャンバは、互いに流体連通していてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の生物学的サンプル、複数のレポーター、複数のレポーター結合部分、複数のレポーター結合部分（各々が、レポーターおよびレポーター結合部分を含む）、および磁性コンジュゲート（磁性粒子およびそれに会合している１つ以上の捕捉部分を含む）を、複数のチャンバのうちの第１のチャンバ内で混合してもよい。いくつかの実施形態では、磁場は、複数のチャンバのうちの第２のチャンバに印加されてもよく、分析チャンバに連結されている光源は、第２のチャンバを介して光を透過するように構成される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法ステップは、それぞれ、分析チャンバの別のチャンバ内で実施され得る。いくつかの実施形態では、分析チャンバは、１つのチャンバであってもよく、すべての方法ステップが同じチャンバ内で実施され得る。

いくつかの実施形態では、光検出器は、分析チャンバに接続されるか、他の方法で結合され（例えば、光源と対向するように、一直線に、反対側に、または他の方法で配置して）、光源によって分析チャンバを介して透過させた光を検出し、これにより光の透過率および／または吸光度を測定するように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、光検出器は、光検出器が光源に対して直交するように分析チャンバに対して配置されてもよく（直交照明）、分析チャンバの一部分におけるレポーターまたはレポーターコンジュゲートの蛍光および／またはリン光を検出するように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、光検出器は、光検出器が光源に対して反対になるように分析チャンバに対して配置されてもよく（透過照明）、分析チャンバの一部分におけるレポーターまたはレポーターコンジュゲートの蛍光および／またはリン光を検出するように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、光検出器は、光源に沿って（例えば、ダイクロイックミラー（シス照明）によって）分析チャンバに接続されてもよく、分析チャンバの一部分において、レポーターまたはレポーターコンジュゲートの蛍光および／またはリン光を検出するように構成されてもよい。

本開示の実施形態で使用される光検出器は、様々な構成を有することができる。いくつかの実施形態では、光検出器は、１つ以上の光電子増倍管検出器およびフォトダイオード検出器を備え得る。本明細書で使用される場合、「光電子増倍管（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）」または「光電子増倍管（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒｔｕｂｅ）」という用語は、入射光子を光電効果および二次電子放出を介して電子に変換する光検出構成要素を指す。光電子増倍管という用語は、電流増倍のための別のダイノードを含むデバイス、および１つ以上のチャネル電子増倍管を含むデバイスを備えることを意味する。本明細書で使用される場合、「光学検出器」または「光検出器」という用語は、光エネルギーを照射したときに出力シグナルを生成するデバイスを指す。したがって、その最も広い意味で、光学検出器システムという用語は、物理量の測定または情報伝達の目的で、エネルギーをある形態から別の形態に変換するためのデバイスを定義するために取られる。光学検出器としては、これらに限定されないが、光電子増倍管およびフォトダイオードが挙げられる。本明細書で使用される場合、用語「フォトダイオード」は、限定するものではないが、ＰＮ、ＰＩＮ、ＡＰＤ、ＣＭＯＳ、およびＣＣＤなど、固体光検出器タイプを指す。いくつかの実施形態では、光検出器は、ＰＮベース検出器、ＰＩＮベース検出器、ＡＰＤベース検出器、ＣＭＯＳベース検出器、およびＣＣＤベース検出器のうちの１つ以上を含み得る。

いくつかの実施形態では、分析チャンバは、本明細書に記載の光検出器を備える。いくつかの実施形態では、分析チャンバは、ＰＮベース検出器、ＰＩＮベース検出器、ＡＰＤベース検出器、ＣＭＯＳベース検出器、およびＣＣＤベース検出器のうちの１つ以上を含み得る。

様々な実施形態では、キットの形態とすることができる分析装置またはシステムは、対象から得られた生物学的サンプルを受け取るように構成されているサンプル収集装置を備える。様々な実施形態では、本開示による方法は、対象から得たサンプルを分析チャンバに添加することを含み得る。いくつかの実施形態では、サンプルを分析チャンバに添加することは、サンプルをサンプル収集装置に送達することを含み得る。サンプルは、血液、血漿または血清であることができ、サンプル収集装置は、針刺し（例えば、ランセット）、シリンジ、または血液もしくは別の体液にアクセスするように構成された別の形態のサンプル収集装置であり得るか、または本装置を含むことができる。いくつかの実装形態では、サンプル収集装置は、生物学的サンプル（例えば血液、血漿または血清）の収集時にサンプル収集チューブまたは別のコンパートメントに安全に格納することができる格納型要素（例えば、バネ式であり得る）であり得る。いくつかの実施形態では、安全なサンプル収集のためのデバイスは、針刺し（例えば、ランセット）またはシリンジを備え、ここで、針刺しまたはシリンジは、キャップに取り付けられ、キャップは、サンプル収集チューブに着脱可能に取り付けられ得る。いくつかの実施形態では、針刺し、シリンジ、または別のタイプのサンプル収集装置は、使用されていないときにサンプル収集装置を覆うように構成されている取り外し式カバー（これは、装置に取り付けることができる）に配置される。取り外し式カバーおよび／またはサンプル収集装置は、サンプル収集装置を引っ込める、または別の方法でサンプル収集装置をサンプル収集に使用できるようにするために作動させるように構成されているバルブまたは別の構成要素に連結できる。いくつかの実施形態では、カバーは、自動的に開くように構成することができ、かつ／またはサンプル収集装置は、自動的に開くように構成することができる。

いくつかの実施形態では、サンプル収集装置（例えば、シリンジ）は、分析装置またはシステムから分離される。別のサンプル収集装置は、分析システムを備えるキットの一部であり得る。

針刺し、シリンジ、または別のタイプのサンプル収集装置は、分析チャンバの内部と流体連通させ得る。したがって、サンプル収集装置は、内部で受け取ったサンプルを分析チャンバに提供してもよい。いくつかの実施形態では、サンプル収集装置は、吸収剤および／またはウィッキング材料、または収集されたサンプル（例えば、血液、血漿または血清）の分析チャンバへの送達を容易にする別の種類の材料を含み得る。

分析デバイスまたはシステムは、使い捨て可能であり得る。いくつかの実施形態では、システムの一部（例えば、サンプル収集装置）は、使い捨て可能であり得、他の部分は再利用可能であり得る。いくつかの実施形態では、システムのいくつかの構成要素は、取り外し可能および／または使い捨て可能であり得る。

いくつかの実施形態では、磁性コンジュゲート、レポーター、レポーター結合部分、およびレポーターコンジュゲート（レポーターおよびレポーター結合部分を含む）のうちの１つ以上は、サンプル収集装置に配置されてもよく、サンプルと磁性コンジュゲート、レポーター、レポーター結合部分、またはレポーターコンジュゲートとの接触が、サンプル収集装置で生じてもよい。いくつかの実施形態では、磁性コンジュゲート、レポーター、レポーター結合部分、およびレポーターコンジュゲートのうちの１つ以上は、サンプルがサンプル収集装置に添加される前に、サンプル収集装置の一部分に埋め込まれてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、分析チャンバ内のサンプルを磁性コンジュゲート、レポーター、レポーター結合部分、および／またはレポーターコンジュゲートと接触させることを含み得る。

いくつかの実施形態では、レポーターは、蛍光レポーター、リン光性レポーター、または、光の吸光度または散乱（または、例えば、比色分析による特定の色の有無）を測定するように構成され得る着色粒子などの比色レポーターであり得る。レポーターは、本明細書中で上述したタグ結合パートナーのいずれかなどのタグ結合パートナー、またはそれぞれのタグに結合するように構成されている他の結合パートナーを有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、サンプルを磁性コンジュゲートと接触させた後に、分析チャンバに磁場を印加し、次いで分析チャンバ内のサンプルの量を減少させることによって、サンプル中の目的の分析物を濃縮することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、サンプルをレポーターコンジュゲートと接触させる前に磁場を不活性化することをさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、分析チャンバ内のサンプルの量を減少させることは、例えば、量の一部をサイフォンで吸い上げることによって、または、サンプル全体を除去して、サンプルを新しい、より少量に再懸濁することによって実施され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、サンプルを磁性コンジュゲートと接触させた後に、分析チャンバに磁場を印加すること、分析チャンバからある量のサンプルを除去すること、ならびにある量の緩衝液および／または追加の量のサンプルを分析チャンバに添加することによって、サンプル中の目的の分析物を濃縮するステップをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、サンプルをレポーターコンジュゲートと接触させる前に磁場を不活性化するステップを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ある量の緩衝液および／または追加の量のサンプルを分析チャンバに添加するステップを含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、磁性コンジュゲートのプルダウン（すなわち、磁場の印加）後、およびサンプルをレポーター結合部分と接触させる前または後に、分析チャンバからある量のサンプルを除去するステップを含み得る。

いくつかの実施形態では、レポーター結合部分は、ビオチンで標識されているレポーター抗体を含み、レポーターは、ストレプトアビジンで官能基化されている。いくつかの実施形態では、例えばレポーター抗体などのレポーター結合部分は、ストレプトアビジンで官能基化され、レポーターは、ビオチンで標識される。

本明細書に記載されるアッセイのいずれかを利用することができる本開示による実施形態（または他の好適なアッセイ）のいずれかにおいて、タグおよびタグ結合パートナー（リンカーと呼ばれることもある）は、複数の分析物のうちのある特定の分析物の検出に使用されるタグおよびタグ結合パートナーが（そのアッセイ内で）固有であるように、直交させることができる。

さらに、本明細書に記載のアッセイ（または他の好適なアッセイ）のいずれかを利用することができる本開示による実施形態のいずれかにおいて、タグが会合しているレポーター結合部分は、結合している第１のオリゴヌクレオチドも有し、タグ結合パートナーが会合しているレポーターは、結合している第２のオリゴヌクレオチドも有し、ここで、第２のオリゴヌクレオチドは、タグがタグ結合パートナーと相互作用するときに、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成され、これによりレポーター結合部分をレポーターと会合させる。このような実施形態では、タグは、短い結合半減期を有するタグ（例えば、限定するものではないが、デスチオビオチン、その誘導体または類似体）である。タグ結合パートナーは、アビジン（例えばストレプトアビジン）、または比較的低い解離定数（Ｋ_ｄ）を有するタグとの相互作用を形成することができる任意の他の好適なタグ結合パートナーを含み得る。例えば、Ｋ_ｄは、ビオチン／ストレプトアビジン会合のＫ_ｄよりも少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍、または少なくとも約１００００倍低くあり得る。

様々な実施形態では、本明細書に記載される方法は、例えば、レポーターシグナルを検出するための様々な検出技術を含むか、またはこれらを利用する。検出技術には、顕微鏡、分光光度計、蛍光計、チューブルミノメーターまたはプレートルミノメーター、Ｘ線技術、磁場、シンチレーター、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）装置、マイクロ流体装置、ビーズベースの装置などの使用が挙げられ得る。

いくつかの実施形態では、磁性コンジュゲートの磁性粒子は、常磁性粒子である。いくつかの実施形態では、常磁性粒子は、ナノ粒子であり、これは、例えば、ナノビーズであり得る。いくつかの実施形態では、常磁性粒子は、微粒子である。いくつかの実施形態では、微粒子は、マイクロビーズである。常磁性粒子は、様々な実施形態では、磁性ナノまたはマイクロビーズであり、これは、粒子が磁石によって保持および／または操作されることが可能になる。いくつかの実施形態では、常磁性粒子は、薄い（例えば、直径約２ｎｍ）グラフェン様炭素層でコーティングされた金属ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、常磁性粒子は、コーティングされる、例えば、ストレプトアビジンまたはＰＥＧコーティングされる。使用できる磁性粒子の例は、ＤＹＮＡＢＥＡＤ（サーモフィッシャー）、ＭＡＣＳビーズ（ミルテニーバイオテック）、ＴＵＲＢＯＢＥＡＤＳ（ＴＵＲＢＯＢＥＡＤＳ）、ＡＢＳＯＬＵＴＥＭＡＧストレプトアビジン磁性粒子（ＣＲＥＡＴＩＶＥＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ）、および金ナノ粒子（ＳＩＧＭＡＡＬＤＲＩＣＨ）である。

いくつかの実施形態では、磁気ビーズは、超常磁性Ｆｅ_２Ｏ_３コアおよび生体適合性外側コーティングを有するナノ粒子である。ビーズの表面は、例えば、カルボキシル基で活性化することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるレポーター粒子は、アミド連結を容易にするためにアミン基またはカルボキシル基で活性化され得る生体適合性コーティングを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のレポーター粒子は、アミド連結を容易にするためにアミン基またはカルボキシル基で活性化され得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子は、直径が１マイクロメートル未満（例えば約５～約５００ナノメートル、例えば約５ナノメートル、または約１０ナノメートル、または約５０ナノメートル、または約１００ナノメートル、または約２５０ナノメートル、または約５００ナノメートル）であるナノ粒子（例えばナノビーズ）であり得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、ナノビーズ）は、平均粒径２５～５００ｎｍ＋／－５ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－１０ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－１５ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－２０ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－２５ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－３０ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－３５ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－４０ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－４５ｎｍ、または２５～５００ｎｍ＋／－５０ｎｍを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、ナノビーズ）は、平均粒径約２０～約２００ｎｍを有する。

いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、ナノビーズ）は、直径が１マイクロメートル未満（例えば約５～約５００ナノメートル、例えば約５ナノメートル、または約１０ナノメートル、または約５０ナノメートル、または約１００ナノメートル、または約２５０ナノメートル、または約５００ナノメートル）であり得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、ナノビーズ）は、平均粒径２５～５００ｎｍ＋／－５ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－１０ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－１５ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－２０ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－２５ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－３０ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－３５ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－４０ｎｍ、２５～５００ｎｍ＋／－４５ｎｍ、または２５～５００ｎｍ＋／－５０ｎｍを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、ナノビーズ）は、平均粒径約２０～約２００ｎｍを有する。いくつかの実施形態では、磁性粒子は、フェライト、マグヘマイト、マグネタイト、または酸化鉄などの酸化物で構成され、界面活性剤、シリカ、シリコーンまたはリン酸誘導体によって任意により修飾された磁性ナノ粒子（例えば、ナノビーズ）であってもよい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子（例えば、ナノビーズ）は、シェル（例えばシリカシェル、任意により修飾されている）を有するフェライトから構成される。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は、金属（例えば、鉄、コバルトなど）である。いくつかの実施形態では、磁性ナノ粒子は、シェル（例えば、穏やかな酸化、界面活性剤、ポリマーおよび金属（例えば、金、グラフェン、パラジウム、白金など））を含む金属ナノ粒子である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される粒子は、１つ以上の量子ドットを含むナノ粒子であり得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、金属コアおよび１つ以上の量子ドットを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１つ以上の量子ドットが点在し得る金属コアを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、複数の量子ドットが点在し得る金属コアを含む。量子ドットは、バルク半導体と同様の特性を有する別個のナノ粒子であり、電磁エネルギーにさらされたときに、エネルギーを放出する。量子ドットは、サイズおよび組成の変化により、赤外領域、可視スペクトル、さらには紫外線領域のエネルギーに高感度になるように操作され得る。さらに、それらは、それぞれ光またはエネルギーのいずれかを生成する光ルミネッセンスまたは光起電性のいずれかになるように設計することができる。

いくつかの実施形態では、レポーターは、１つ以上の量子ドットを含み得るナノ粒子（例えば、ナノビーズ）であり得る。いくつかの実施形態では、レポーターは、金属コアおよび１つ以上の量子ドットを含む。いくつかの実施形態では、レポーターは、１つ以上の量子ドットが点在し得る金属コアを含む。いくつかの実施形態では、レポーターは、複数の量子ドットが点在し得る金属コアを含む。

いくつかの実施形態では、レポーターは、１つ以上の量子ドットを含み得る。いくつかの実施形態では、レポーターは、１つ以上の量子ドットを含み得る。いくつかの実施形態では、レポーターは、複数の量子ドットを含み得る。

例えばコロイド法によって産生された量子ドットの例としては、限定するものではないが、カドミウム－セレン化物（ＣｄＳｅ）、カドミウム－硫化物（ＣｄＳ）、インジウム－ヒ化物（ＩｎＡｓ）、およびインジウム－リン化物（ＩｎＰ）カドミウム－テルル－硫化物（ＣｄＴｅＳ）が挙げられる。量子ドットを構成する原子の数は、１００～１００，０００の範囲であり得、典型的には、２～２０ｎｍの範囲（例えば、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、１９ｎｍ、２０ｎｍ、２．５ｎｍ、３．５ｎｍ、４．５ｎｍ、５．５ｎｍ、６．５ｎｍ、７．５ｎｍ、８．５ｎｍ、９．５ｎｍ、１０．５ｎｍ、１１．５ｎｍ、１２．５ｎｍ、１３．５ｎｍ、１４．５ｎｍ、１５．５ｎｍ、１６．５ｎｍ、１７．５ｎｍ、１８．５ｎｍ、１９．５ｎｍ、２０．５ｎｍ）の直径を有する。

いくつかの実施形態では、量子ドット材料などの粒子材料は、限定するものではないが、炭素、コロイド金、ゲルマニウム、ヒ化シンジウム、アンチモン化インジウム、ガリウムヒ素、窒化ガリウム、カドミウム／セレン／テルル化物、鉛、酸化鉛、硫化鉛、セレン化鉛、リン化インジウムガリウム、ケイ素、コロイド銀、テルル化カドミウム水銀、鉄、酸化鉄、コバルト、グラフェン、ランタン、セリウム、炭酸ストロンチウム、マンガン、酸化マンガン、酸化ニッケル、白金、リチウム、チタン酸リチウム、タンタル、銅、パラジウム、モリブデン、炭化ホウ素、炭化ケイ素、炭化チタン、酸化タングステン、アルミニウム、ニオブ、ツリウム、窒化アルミニウム、スズ、酸化アルミニウム、酸化スズ、アンチモン、ジスプロシウム、プラセオジム（ｐａｓｅｏｄｙｎｉｕｍ）、酸化アンチモン、エルビウム、レニウム、バリウム、ルテニウム、ベリリウム、サマリウム、酸化ビスマス、ホウ素、ガドリニウム、窒化ホウ素、酸化バナジウム、ストロンチウム、イッテルビウム、ジルコニウム、ダイヤモンド（Ｃ）、ケイ素（Ｓｉ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、ケイ素ゲルマニウム（ＳｉＧｅ）、アンチモン化アルミニウム（ＡｌＳｂ）、ヒ化アルミニウム（ＡｌＡｓ）、窒化アルミニウム（Ａ１Ｎ）、リン化アルミニウム（Ａ１Ｐ）、窒化ホウ素（ＢＮ）、リン化ホウ素（ＢＰ）、ヒ化ホウ素（ＢＡｓ）、アンチモン化ガリウム（ＧａＳｂ）、ヒ化ガリウム（ＧａＡｓ）、窒化ガリウム（ＧａＮ）、リン化ガリウム（ＧａＰ）、アンチモン化インジウム（ＩｎＳｂ）、ヒ化インジウム（ＩｎＡｓ）、窒化インジウム（ＩｎＮ）、リン化インジウム（ＩｎＰ）、ヒ化アルミニウムガリウム（ＡｌＧａＡｓ）、ヒ化インジウムガリウム（ＩｎＧａＡｓ、ＩｎｘＧａｉ＿ｘＡｓ）、リン化インジウムガリウム（ＩｎＧａＰ）、ヒ化アルミニウムインジウム（ＡｌＩｎＡｓ）、アンチモン化アルミニウムインジウム（ＡｌｌｎＳｂ）、窒化ヒ化ガリウム（ＧａＡｓＮ）、ガリウムヒ素リン（ＧａＡｓＰ）、窒化アルミニウムガリウム（ＡｌＧａＮ）、アルミニウムガリウムリン（ＡｌＧａＰ）、窒化インジウムガリウム（ＩｎＧａＮ）、インジウムヒ素アンチモン化物（ＩｎＡｓＳｂ）、アンチモン化インジウムガリウム（ＩｎＧａＳｂ）、リン化アルミニウムガリウムインジウム（ＡｌＧａｌｎＰ、またＩｎＡｌＧａＰ、ＩｎＧａＡｌＰ、ＡｌＩｎＧａＰ）、アルミニウムガリウムヒ素リン（ＡｌＧａＡｓＰ）、インジウムガリウムヒ素リン（ＩｎＧａＮ）、アルミニウムインジウムヒ素リン（ＡｌＩｎＡｓＰ）、窒化アルミニウムガリウムヒ素（ＡｌＧａＡｓＮ）、窒化インジウムガリウムヒ素（ＩｎＧａＡｓＮ）、窒化インジウムアルミニウムヒ素（ＩｎＡｌＡｓＮ）、窒化ガリウムヒ素アンチモン（ＧａＡｓＳｂＮ）、ガリウムインジウム窒素ヒ素アンチモン（ＧａＩｎＮＡｓＳｂ）、ガリウムインジウム砒素アンチモンリン（ＧａｌｎＡｓＳｂＰ）、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、セレン化亜鉛（ＺｎＳｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）、テルル化亜鉛（ＺｎＴｅ）、テルル化亜鉛カドミウム（ＣｄＺｎＴｅ、「ＣＺＴ」）、テルル化カドミウム水銀（ＨｇＣｄＴｅ）、テルル化水銀亜鉛（ＨｇＺｎＴｅ）、セレン化水銀亜鉛（ＨｇＺｎＳｅ）、塩化第一銅（ＣｕＣｌ）、セレン化鉛（ＰｂＳｅ）、硫化鉛（ＰｂＳ）、テルル化鉛（ＰｂＴｅ）、硫化スズ（ＳｎＳ）、テルル化スズ（ＳｎＴｅ）、テルル化鉛スズ（ＰｂＳｎＴｅ）、テルル化タリウムスズ（Ｔｉ２ＳｎＴｅ５）、テルル化タリウムゲルマニウム（Ｔｌ２ＧｅＴｅ５）、テルル化ビスマス（Ｂｉ２Ｔｅ３）、リン化カドミウム（Ｃｄ３Ｐ２）、ヒ化カドミウム（Ｃｄ３Ａｓ２）、アンチモン化カドミウム（Ｃｄ３Ｓｂ２）、リン化亜鉛（Ｚｎ３Ｐ２）、ヒ化亜鉛（Ｚｎ３Ａｓ２）、アンチモン化亜鉛（Ｚｎ３Ｓｂ２）、ヨウ化鉛（ＩＩ）（Ｐｂｌ２）、二硫化モリブデン（ＭｏＳ２）、セレン化ガリウム（ＧａＳｅ）、硫化スズ（ＳｎＳ）、硫化ビスマス（Ｂｉ２Ｓ３）、セレン化銅インジウムガリウム（ＣＩＧＳ）、ケイ化白金（ＰｔＳｉ）、ヨウ化ビスマス（ＩＩＩ）（Ｂｉｌ３）、ヨウ化水銀（ＩＩ）（Ｈｇｌ２）、臭化タリウム（Ｉ）（ＴＩＢｒ）、二酸化チタン：アナターゼ（ＴｉＯ２）、酸化銅（Ｉ）（Ｃｕ２Ｏ）、酸化銅（ＩＩ）（ＣｕＯ）、二酸化ウラン（ＵＯ２）、三酸化ウラン（ＵＯ３）などが挙げられる。

様々な実施形態では、磁場は、外部磁石を用いて印加される。様々な実施形態では、磁石は、永久磁石（例えば、ネオジム鉄ホウ素（ＮｄＦｅＢ）、サマリウムコバルト（ＳｍＣｏ）、アルニコ、およびセラミックまたはフェライト磁石）である。様々な実施形態では、磁石は、一時磁石である。様々な実施形態では、磁石は、電磁石である。

様々な実施形態では、レポーターの検出は、磁場の近くで行われる。様々な実施形態では、レポーターの検出は、例えば、磁気プルダウンステップが実施されるチャンバからは分離しているチャンバ内で実施されるように、磁場から離れて行われる。

様々な実施形態では、レポーターは、蛍光レポーター、リン光性レポーター、または、光の吸光度または散乱（または、例えば、比色分析による特定の色の有無）を測定するための着色粒子などの比色レポーターであり得る。いくつかの実施形態では、当該技術分野において公知であるような任意の好適な検出可能なレポーターを使用することができる。例えば、検出可能なレポーターは、放射性レポーター（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、および３３Ｐ）、酵素レポーター（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼなど）、化学発光レポーター（例えば、アクリジニウムエステル、チオエステル、またはスルホンアミド；ルミノール、イソルミノール、フェナントリジニウムエステルなど）、蛍光レポーター（例えば、フルオレセイン（例えば、５－フルオレセイン、６－カルボキシフルオレセイン、３’－６－カルボキシフルオレセイン、５（６）－カルボキシフルオレセイン、６－ヘキサクロロフルオレセイン、６－テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートなど）、ローダミン、フィコビリタンパク質、Ｒ－フィコエリスリン、量子または金属（Ｍｃ）ドット（例えば、硫化亜鉛キャップドセレン化カドミウム）、温度測定レポーター、または免疫ポリメラーゼ連鎖反応レポーターであり得る。様々な実施形態では、レポーターは、これらに限定されないが、フルオロフォア、発色団、放射性同位元素、磁性粒子、金粒子、酵素基質などが挙げられる。いくつかの実施形態では、レポーターは、化学発光または蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、レニラレニフォルミス緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰｍｕｔ２、ＧＦＰｕｖ４、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、増強青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、シトリンおよびディスコソーマ由来の赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）、ルシフェラーゼ、ウンベリフェロン、ローダミン、フルオレセイン、ジクロロトリアジニルフルオレセイン、ダンシルクロリド、フィコエリスリンなどである。いくつかの実施形態では、レポーターは、以下のファミリーのいずれかの非タンパク質有機フルオロフォアである：キサンテン誘導体、例えばフルオレセイン、ローダミン、オレゴングリーン、エオシン、およびテキサスレッド；シアニン誘導体、例えばシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、およびメロシアニン；スクアライン誘導体および環置換スクワライン（ｓｑｕａｒａｉｎｅ）（Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕ、およびスクエア染料など）；ナフタレン誘導体（ダンシルおよびプロダン誘導体）；クマリン誘導体；オキサジアゾール誘導体、例えばピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾールおよびベンゾオキサジアゾール；アントラキノンなどのアントラセン誘導体、例えば、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７およびＣｙＴＲＡＫオレンジ；カスケードブルーなどのピレン誘導体；オキサジン誘導体、例えばナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０など；アクリジン誘導体、例えばプロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエローなど；アリールメチン誘導体、例えばオーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン；テトラピロール誘導体、例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン。様々な実施形態では、レポーターは、これらに限定されないが、酵素レポーター、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素が挙げられる。いくつかの実施形態では、レポーターは、本明細書に記載の量子ドットであり得る。いくつかの実施形態では、レポーターは、本明細書に記載の量子ドットを含み得る。いくつかの実施形態では、レポーターは、シリカシェルを有する金属コア（すなわち、金コア）を含んでもよく、ここで、シリカシェルは、複数（例えば、１００～６００）の量子ドットを含浸させる。

様々な態様では、本発明は、本明細書に開示される実施形態のいずれか１つの方法に好適であるキットを提供する。このキットは、サンプル中の複数の分析物を同時に検出できるイムノアッセイ用である。キットは、複数の磁性コンジュゲート、複数のレポーター結合部分、および複数のレポーターを含み得る。

任意により、本技術のキットの上述の構成要素は、好適な容器に詰められ、対応する疾患または状態の診断のために標識されるか、または対応する他の目的のために標識される。上記の構成要素は、ユニットまたは多目的容器、例えば、密封アンプル、バイアル、ボトル、シリンジ、および試験管に、水性、好ましくは滅菌の溶液として、または再構成のために凍結乾燥され、好ましくは滅菌の製剤として貯蔵され得る。例えば、本技術のアッセイ試薬は、コールドチェーン輸送および貯蔵のための要件をなくすために凍結乾燥され得る。例えば、いくつかの実施形態では、酢酸マグネシウムＭｇ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２を除く全ての試薬が、アッセイチューブの底部で凍結乾燥され、Ｍｇ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２は、蓋上で凍結乾燥される：これにより、Ｍｇ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_２が他のアッセイ試薬と混合されるまで、５’～３’のＤＮＡポリメラーゼの生成が防止される。

キットは、サンプルをより高い量に向けて希釈するのに好適である緩衝液または他の成分を保持する第２の容器をさらに含んでもよい。さらに、キットは、アッセイを実施するための説明書を含んでもよい。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得、滅菌アクセス部を有し得る。キットは、許容される緩衝液を含む複数の容器をさらに含んでもよい。キットは、生物学的サンプルを収集するためのデバイスをさらに備えていてもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザの立場から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。キットは、任意により、診断製品の市販パッケージに慣習的に含まれる説明書を含み得、例えば、そのような診断製品の使用に関する適応症、使用法、製造、および／または警告に関する情報を含む。キットは、診断のために比較するための色または蛍光スケールをさらに含んでもよい。キット構成要素（例えば、試薬）は、好適な容器内にパッケージ化され得る。キットは、複数の分析物を検出するためにキットを使用するための説明書をさらに含むことができる。

いくつかの実施形態では、キットは、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、血漿、尿、または別の種類のサンプル）を安全な方法で収集するデバイスをさらに備える。いくつかの実施形態では（例えば、血液含有物の分析のために）、本デバイスは、針および安全シリンジ（例えばルアー型シリンジ）を備える。いくつかの実施形態では、本デバイスは、バネ式格納型針とシリンジとを備える。本デバイスは、全血、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、発汗、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液、粘液、痰、月経血、月経液、膣粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、尿道球腺液、悪露、粘膜分泌物、リンパ液、および膿汁のいずれかであり得るサンプルを収集するためのあらゆる種類のデバイスであり得ることが理解されるものとする。また、いくつかの実施形態では、キットは、サンプル収集デバイスを含まない。

いくつかの実施形態では、キットはまた、例えば、緩衝剤、防腐剤、またはタンパク質安定化剤を含むことができる。キットは、検出可能なレポーターを検出するために必要な構成要素を更に含むことができる。キットは、アッセイし、試験サンプルと比較することができる、対照サンプルまたは一連の対照サンプルを含むこともできる。本キットの各構成要素は個別の容器内に封入され得、様々な容器の全ては、キットを使用して行われたアッセイの結果を解釈するための説明書と共に単一のパッケージ中にあり得る。本技術のキットは、キット容器上またはキット容器内に記載されている製品を含んでもよい。記載されている製品は、キットに含まれている試薬の使用方法を説明している。

様々な態様では、サンプルは、ヒト対象である対象から得ることができる。さらに、いくつかの実施形態では、対象は、ヒトとは異なる哺乳動物である。

定義
以下の定義は、本明細書に開示の発明に関連して使用される。別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」は、１つ、または２つ以上を意味し得る。

更に、参照された数値表示に関連して使用される場合の「約」という用語は、その参照された数値表示に、その参照された数値表示の最大１０％を加算または減算することを意味する。例えば、「約５０」という言葉は、４５から５５の範囲を包含する。

本明細書で使用される場合、薬剤または刺激の存在下で、そのような調節のない場合と比較して、活性および／または効果の読取値が相当な量、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、またはそれを超えて（少なくとも約１００％まで）低減した場合、あるものは「減少」する。当業者によって理解されるように、いくつかの実施形態では、活性は減少し、いくつかの下流の読み出しは減少するが、他のものは増加することができる。

逆に、活性および／または効果の読み出しが、薬剤または刺激の存在下で、そのような薬剤または刺激の不在下に対して、有意な量、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、またはそれ以上、少なくとも約１００％またはそれ以上まで、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、増加した場合、活性は「増加」している。

本明細書で言及される場合、全ての組成パーセンテージは、別段の指定がない限り、組成物の総重量によるものである。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語およびその変形は、リスト内のアイテムの列挙が、本技術の組成物および方法でも有用であり得る他の同様のアイテムを除外するものではないように、非限定的であることを意図する。同様に、「し得る（ｃａｎ）」および「し得る（ｍａｙ）」という用語、ならびにそれらの変形は、一実施形態が、ある特定の要素または特色を含み得る（ｃａｎ）かまたは含み得る（ｍａｙ）列挙が、それらの要素または特色を含まない本技術の他の実施形態を除外しないように、非限定的であることを意図する。

本明細書で使用される場合、用語「サンプル」は、目的の分析物を含んでも含まなくてもよい体液または別の種類の流体の溶液、懸濁液、混合物、または希釈されていない量を指し得る。本明細書で使用されるサンプルは、水および／または緩衝液を含み得る。

本明細書において使用される場合、用語「体液」は、個体の身体から単離することができる任意の体液を指してもよく、これらに限定されないが、全血、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、発汗、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液、スワブサンプル（例えば、頬スワブ、咽頭スワブなど）、粘液、痰、月経血、月経液、膣粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、尿道球腺液、悪露、粘膜分泌物、リンパ液、膿汁などが挙げられる。いくつかの実施形態では、体液は、より具体的には、全血、血清、尿、唾液、スワブサンプル、粘液、または精液を指し得る。特定の実施形態では、体液は、より具体的には、全血、血清、尿、または唾液を指し得る。いくつかの実施形態では、体液は、目的の分析物（例えば、バイオマーカー）を含み得る。

含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有すること、または有すること等の同義語としての「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という開放的な用語は、発明、本発明、または本発明の実施形態について記載および特許請求するために本明細書で使用され、代替的に、「からなること」または「から本質的になること」等の代替的な用語を使用して記載され得る。

本明細書で使用される場合、「好ましい」および「好ましくは」という単語は、ある特定の状況下である特定の利益をもたらす技術の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態も、同じかまたは他の状況下で好ましい場合がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用でないことを意味せず、本技術の範囲から他の実施形態を除外することを意図しない。

本明細書の実施例は、本技術の利点および利益を説明し、本技術のがんを治療するための方法を実践することにおいて当業者をさらに支援するために提供される。本明細書の実施例はまた、本技術の特定の態様をより完全に説明するために提示される。実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義されるとおり、本技術の範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。実施例は、上述した本技術の変形例、態様または実施形態のいずれかを含むかまたは組み込むことができる。上述の変形例、態様または実施形態はまた、本技術の任意のまたは全ての他の変形例、態様または実施形態の変形例をさらに含むかまたは組み込んでもよい。

実施例１マルチプレックス分析物検出
図４は、４つの分析物を同時に分析するために多重化できることを明示している。この実施例では、ｈＣＧ、ＰＳＡ、ＴＳＨ、およびＣＲＰをそれぞれ全血サンプルのみに、同じ濃度で同時にスパイクした（すべて）。図４には、４つのチャネル（左から右へ：ｈＣＧ、ＰＳＡ、ＴＳＨ、およびＣＲＰ）がある。「すべて」条件は、ｈＣＧ、ＰＳＡ、ＴＳＨ、およびＣＲＰのすべてを含むサンプルを反映しており、本実施例は、１回の実験でこれらの分析物をすべて検出する。単一分析物条件の対照は、とりわけ、多重化検出がシグナルの損失をもたらさないことを示すために提供される。

図４に示すとおり、本開示によるマルチプレックスアッセイは、同一の生物学的サンプル中の複数の分析物を同時に検出することができる。
参照による援用

本明細書で参照される全ての特許および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。

本明細書で使用される場合、全ての見出しは単に本明細書の構成のためのものであり、いかなる様式においても開示を制限することを意図したものではない。あらゆる個々のセクションの内容は、すべてのセクションに等しく適用可能であり得る。

均等物
本発明は、その特定の実施形態に関連して開示したが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変型、使用、または適応を網羅するものであり、本発明が属する技術分野において知られているか、または慣行に含まれるような本開示からの逸脱、および前述される本質的な特徴に適用され得るもの、ならびに添付の請求項の範囲に含まれるような本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。

Claims

生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するための方法であって、
（ａ）前記サンプルを少なくとも１つの磁性コンジュゲートと接触させるステップであって、前記磁性コンジュゲートが、磁性粒子と、前記磁性粒子に連結され、各々が前記複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む、ステップと；
（ｂ）前記磁性コンジュゲートを、各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分と接触させるステップであって、前記各レポーター結合部分が、前記複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている、ステップと；
（ｃ）各々が、対応するタグを結合するように構成されている対応するタグ結合パートナーを有する複数のレポーターと前記磁性コンジュゲートを接触させて、これにより、任意により、レポーター結合部分を、対応するレポーターと会合させるステップであって、ここで、前記各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；
（ｄ）磁場を印加して、前記磁性コンジュゲートを分離するステップであって、磁性コンジュゲートは、前記複数の分析物のうちの１つの分析物およびタグ－タグ結合パートナー相互作用を介して結合している前記対応するレポーターと会合している前記対応するレポーター結合部分と任意により会合している、ステップと；
（ｅ）前記レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、前記複数の分析物の各分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含む、方法。
前記タグは、ビオチンを含み、前記タグ結合パートナーが、アビジンを含む、または前記タグは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を含み、前記タグ結合パートナーが抗ＦＩＴＣ抗体を含む、または前記タグは、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）を含み、前記タグ結合パートナーが抗ＤＮＰ抗体を含む、または前記タグは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を含み、前記タグ結合パートナーが抗ＤＩＧ抗体を含む、または前記タグは、Ｅｔａｇ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ（配列番号１））を含み、前記タグ結合パートナーが抗Ｅｔａｇ抗体を含む、または前記タグは、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２））を含み、前記タグ結合パートナーが抗ＦＬＡＧ抗体を含む、または前記タグは、Ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号３））を含み、前記タグ結合パートナーが抗Ｍｙｃ抗体を含む、または前記タグは、ＨＡ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４））を含み、前記タグ結合パートナーが抗ＨＡ抗体を含む、または前記タグは、ＳＮＡＰを含み、前記タグ結合パートナーがベンジルグアニン誘導体を含む、または前記タグは、「ＣＬＩＰ」を含み、前記タグ結合パートナーがベンジルシトシン誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
前記レポーター結合部分が、それに結合している第１のオリゴヌクレオチドを有し、前記レポーターが、それに結合している第２のオリゴヌクレオチドを有し、ここで、前記第２のオリゴヌクレオチドは、前記タグが前記タグ結合パートナーと相互作用するときに前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成され、これにより前記レポーター結合部分を前記レポーターに会合させる、請求項１に記載の方法。
前記タグが、短い結合半減期を有するタグ、任意により例えばデスチオビオチンである、請求項３に記載の方法。
前記タグ結合パートナーが、アビジン、任意により例えばストレプトアビジンを含む、請求項３または請求項４に記載の方法。
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、約５０ヌクレオチド長以下を有する、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
前記少なくとも１つの磁性コンジュゲートの前記複数の捕捉部分のうちの１つの捕捉部分が、前記複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている抗体を含む、請求項１に記載の方法。
前記少なくとも１つの磁性コンジュゲートの前記複数の捕捉部分のうちの１つの捕捉部分が、前記複数の分析物のうちの前記対応する分析物を結合するように構成されている第１の抗体を含み、ここで、レポーター結合部分は、前記対応する分析物を結合するように構成されている第２の抗体を含む、請求項１に記載の方法。
前記複数の分析物が、複数の抗体を含み、前記少なくとも１つの磁性コンジュゲートの捕捉部分が、対応する抗体を結合するように構成されている抗原を含むか、または前記複数の分析物が、複数のタンパク質バイオマーカーを含み、前記少なくとも１つの磁性コンジュゲートの捕捉部分が、前記タンパク質バイオマーカーを結合するように構成されている抗体を含む、請求項１に記載の方法。
前記複数のレポーター結合部分のうちの１つのレポーター結合部分が、前記抗原を結合するように構成されている二次抗体を含む、請求項１に記載の方法。
前記方法が、前記対象が抗原に対して向けられている抗体を産生しているか否かを示す、請求項１に記載の方法。
前記方法が、前記サンプル中のある量の抗体を提供する、請求項１に記載の方法。
前記レポーター分子が、金属コアおよびシリカシェルまたはレポーターであり；前記シリカシェルは、任意により、複数の量子ドットを含浸させ、前記金属コアは、任意により金を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記レポーターが、複数の量子ドットを含む、先記請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記レポーターが、蛍光レポーター、リン光性レポーター、または比色レポーターである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記レポーター結合部分の濃度が、前記レポーターの濃度よりも高く、任意により、少なくとも５倍高く、または少なくとも１０倍高く、または少なくとも１００倍高く、または少なくとも１０００倍高く、任意により約１０００倍高い、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記複数のレポーターの各レポーターは、前記複数のレポーターのうちの別のレポーターによって生成されたシグナルの特性とは異なる少なくとも１つの特性を有する対応するシグナルを生成することができる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記サンプルが、全血、血漿、血清、胆汁、唾液、尿、涙、発汗、脳脊髄液（ＣＳＦ）、精液、粘液、痰、月経血、月経液、膣粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、尿道球腺液、悪露、粘膜分泌物、リンパ液、および膿汁から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記サンプルが、約１マイクロリットルの量を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記複数の分析物が、少なくとも４つの分析物を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記複数の分析物が、少なくとも６つの分析物を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、磁性粒子と、夾雑抗体および／または非抗体部分を結合するように構成されている部分と、を含む磁性コンジュゲートで前記サンプルを前処理するステップをさらに含む、請求項９～２１のいずれか一項に記載の方法。
前記夾雑抗体が、前記対応する抗体を結合するように構成されている前記抗原に対して向けられていないか、または前記対応する抗体を結合するように構成されている前記抗原に対する免疫応答を生成するのに有効でない、請求項２２に記載の方法。
前記前処理が、以下のうちの１つ以上を減少させるかまたは排除する、請求項２２または請求項２３に記載の方法：
（ａ）異好性抗体；
（ｂ）前記磁性粒子と非特異的に相互作用する抗体；および
（ｃ）前記磁性粒子と非特異的に相互作用する非抗体部分。
前記方法が、ポイントオブケア使用に好適である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、現場での使用に好適である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、家庭での使用に好適である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、世界保健機関のＡＳＳＵＲＥＤ（手頃な価格、高感度、特異的、ユーザーフレンドリー、迅速かつ堅牢、機器不要、および送達可能である）基準と矛盾がない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、偽陽性を実質的に含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、偽陰性を実質的に含まない、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、固相イムノアッセイを用いる方法よりも優れた感度および特異性を提供する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、ビーズベースのフローサイトメトリーベースのアッセイ、任意によりビーズベースのフローサイトメトリーベースのアッセイを用いる方法よりも優れた感度および特異性を提供する、および／または前記方法が、ラテラルフローイムノクロマトグラフィーアッセイを用いる方法よりも優れた感度および特異性を提供する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
磁場を印加することによって前記サンプル中の前記分析物を前記サンプルから分離し、次いで前記磁性コンジュゲートを前記複数のレポーター結合部分に接触させる前に前記磁場を低減するステップをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記捕捉部分および前記レポーター結合部分が、前記分析物の異なる部分に結合する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
生物学的サンプル中の複数の分析物の存在、不在、または量を検出するためのマルチプレックス方法であって、
（ａ）前記サンプルを少なくとも１つの磁性コンジュゲートと接触させるステップであって、前記磁性コンジュゲートが、磁性粒子と、前記磁性粒子に連結され、各々が前記複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている複数の捕捉部分と、を含む、ステップと；
（ｂ）前記磁性コンジュゲートを、各々に対応するタグが結合している複数のレポーター結合部分と接触させるステップであって、
前記タグが、デスチオビオチンを含み、
前記各レポーター結合部分が、前記複数の分析物のうちの対応する分析物を結合するように構成されている、ステップと；
（ｃ）各々が、対応するタグを結合するように構成されている対応するタグ結合パートナーを有する複数のレポーターと前記磁性コンジュゲートを接触させて、これにより、レポーター結合部分を、対応するレポーターと会合させるステップであって、
前記タグ結合パートナーが、ストレプトアビジンを含み、
各レポーターは、対応する異なるシグナルを生成するように構成されている、ステップと；
（ｄ）磁場を印加して、前記磁性コンジュゲートを分離するステップであって、前記磁性コンジュゲートが、前記複数の分析物のうちの１つの分析物およびタグ－タグ結合パートナー相互作用を介して結合している前記対応するレポーターと会合している前記対応するレポーター結合部分と会合している、ステップと；
（ｅ）前記レポーターの各々によって生成されたシグナルの検出に基づいて、前記複数の分析物の各分析物の存在、不在、またはレベルを検出するステップと、を含み、
前記レポーター結合部分が、それに結合している第１のオリゴヌクレオチドを有し、前記レポーターが、それに結合している第２のオリゴヌクレオチドを有し、ここで、前記第２のオリゴヌクレオチドは、前記タグが前記タグ結合パートナーと相互作用するときに前記第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように構成され、これにより前記レポーター結合部分を前記レポーターに会合させ、
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々は、約５０ヌクレオチド長以下を有する、方法。
先行請求項のいずれか一項に記載の、少なくとも１つの磁性コンジュゲート、複数のレポーター結合部分、および複数のレポーターを含む、キット。