CN116391126A

CN116391126A - 磁性分析物检测的动力学调节

Info

Publication number: CN116391126A
Application number: CN202180065763.2A
Authority: CN
Inventors: M·A·库萨
Original assignee: Vita Biotechnology
Current assignee: Vita Biotechnology
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2021-08-07
Publication date: 2023-07-04
Also published as: EP4193148A1; JP2023536527A; WO2022029732A1; CA3187399A1; US20230324416A1

Abstract

提供了用于检测生物样品中的分析物的方法和试剂盒。所述方法包括使样品与以下接触：磁性缀合物，所述磁性缀合物包含磁性颗粒和结合所述分析物的捕获部分；报告物结合部分，所述报告物结合部分具有与其结合的标签并且也结合所述分析物；和报告物，所述报告物具有标签结合配偶体，所述标签结合配偶体结合所述标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与所述报告物缔合；施加磁场；以及基于对所述报告物产生的信号的检测，检测所述分析物的存在、不存在或水平。通过调整所述报告物结合部分和所述报告物的浓度来调节检测的动力学。通过利用显著大于所述报告物的浓度的所述报告物结合部分的浓度，所述方法提供改进的灵敏度和特异性。

Description

磁性分析物检测的动力学调节

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年8月7日提交的标题为“KINETIC MODULATION FOR MAGNETICANALYTE DETECTION”的美国临时专利申请第63/063,029号的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明尤其涉及以改进的检测动力学检测生物样品中分析物的存在、不存在或数量的方法。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式通过EFS-Web提交并且特此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2021年8月6日，名为124436-5012_Sequence_Listing_ST25.txt，且大小为4,096字节。

背景技术

为了诊断疾病和疾患，监测和评估治疗进展，以及执行各种其他与医疗保健相关的任务，通常需要可靠的测试来检测和D定量各种各样的靶标，包括但不限于蛋白质、细菌、全细胞、病毒和小分子。

分析物检测在医学和生物学研究以及环境科学等各个行业中具有各种临床和非临床应用。用于分析物检测的传统方法涉及诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、质谱和高压液相色谱(HPLC)的测定。HPLC和质谱可用于基于电荷和/或大小来检测分析物，而ELISA可用于基于分析物上可被捕获剂和检测剂(例如，抗体、适体等)识别的抗原来检测分析物。特别地，ELISA测定已成为一种常见的检测方法。然而，传统的ELISA因为涉及各种孵育和洗涤步骤，可能非常耗时。此外，用于进行ELISA测定的参数是高度可变的，传统的ELISA平台可能无法提供足够的灵敏度和特异性。

已开发了各种诊断方法来检测抗体和抗原，这些方法包括ELISA、凝集、沉淀、补体固定、荧光抗体和化学发光。例如，血清学测试是用于鉴定患者样品中的抗体和抗原的诊断方法。了解一个人在某种感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏等方面的血清学状况，对各种应用都很有用，这些应用包括诊断、治疗选择、治疗监测、建立检疫、法医学决策、生物特征识别等。血清学测试也可用于确定一个人的血型。

现有的每一种方法都有其优点和缺点，有待解决的问题涉及测试的可靠性、速度和成本。此外，常规免疫测定可能需要较长的处理时间，而且往往达不到理想的灵敏度和特异性。使用常规方法执行分析物检测所需的延长时间对于许多需要迅速处理样品的临床应用来说可能是一个重大限制。减少样品分析时间对流行病学应用可能至关重要。例如，正如COVID-19(SARS-CoV-2或2019-nCoV)大流行所表明的那样，快速且可靠地处理大量样品可以成为识别受感染对象、追踪接触者并最终恢复正常的拯救生命的方法。

因此，需要对生物样品进行全面分析的快速且准确的诊断测试。

发明内容

因此，在各个方面，本发明提供了用于检测生物样品中分析物的存在、不存在或数量的方法，或实现这些方法的试剂盒。所述方法允许以大大改进的动力学来检测样品中的一种或多种分析物，使得可以在约1分钟至约20分钟的范围内执行根据本公开的实施方案的整个测定。相比之下，传统测定需要约1.5小时至约6小时。

在实施方案中，提供了一种用于检测生物样品中分析物的存在、不存在或数量的方法。所述方法包括：(a)使所述样品与磁性缀合物接触，所述磁性缀合物包含磁性颗粒和被配置为结合所述样品中的分析物的捕获部分；(b)使所述磁性缀合物与报告物结合部分接触，所述报告物结合部分具有与其结合的标签，所述报告物结合部分被配置为结合所述分析物；(c)使所述磁性缀合物与报告物接触，所述报告物具有标签结合配偶体，所述标签结合配偶体被配置为结合所述标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与所述报告物缔合，其中所述报告物结合部分的浓度显著大于所述报告物的浓度；(d)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物任选地具有分析物，所述分析物具有与所述报告物缔合的所述报告物结合部分，所述报告物与所述报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物产生的信号的检测，检测所述分析物的存在、不存在或水平。取决于报告物的类型，可以通过各种方式检测报告物。

在一些实施方案中，用于检测生物样品中分析物的存在、不存在或数量的所述方法包括：(a)使所述样品与磁性缀合物接触，所述磁性缀合物包含磁性颗粒和被配置为结合所述样品中的分析物的捕获部分；(b)使所述样品与报告物结合部分接触，所述报告物结合部分具有与其结合的标签，所述报告物结合部分被配置为结合所述分析物；(c)使所述样品与报告物接触，所述报告物具有与其结合的标签结合配偶体，使得所述标签结合配偶体结合所述标签，从而将与所述标签结合的报告物结合部分与所述报告物缔合，其中所述报告物结合部分的浓度显著大于所述报告物的浓度；(d)通过施加磁场从所述样品中分离所述分析物，所述分析物具有所述磁性缀合物和与所述报告物缔合的所述报告物结合部分，所述报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物产生的信号的检测，检测所述分析物的存在、不存在或水平。

在本公开的实施方案中，代替如在常规免疫测定中使用报告缀合物(即，报告物结合部分和与其结合的报告物)，报告物结合部分具有与其结合的标签而不是报告物。报告物结合部分通过与该报告物结合部分结合的标签和与该报告物结合的相应标签结合配偶体之间的相互作用与报告物相互作用。该系统允许使用显著大于报告物浓度的增大的报告物结合部分浓度。因此，在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度是报告物的浓度的至少约5倍大，或至少约10倍大，或至少约100倍大，或至少约1000倍大。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度是报告物的浓度的约1000倍大。

在一些实施方案中，报告物的浓度在皮摩尔范围内。例如，报告物的浓度可低于约300pM。在一些实施方案中，报告物的浓度为约10pM至约100pM，任选地为约40pM至约120pM。在一些实施方案中，报告物的浓度为约20pM。在一些实施方案中，报告物的浓度为约120pM。

在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度在纳摩尔范围内。例如，报告物结合部分的浓度可大于约1nm。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度为约1nm至约60nM，约1nm至约50nM，或约1nm至约40nM，或约1nm至约30nM，或约1nm至约20nM，或约1nm至约15nM，或约1nm至约10nM，或约1nm至约5nM。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度为约100nm至约800nM(例如，约600nM)。

在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度范围为约1nM至约10nM，并且报告物的浓度范围为约15pM至约25pM。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度为约5nM并且报告物的浓度为约20pM。

在一些实施方案中，报告物包含金属芯和二氧化硅壳或所述报告物；其中所述二氧化硅壳任选地浸渍有多个量子点；并且其中所述金属芯任选地包含金。报告物还可包含多个量子点。在一些实施方案中，报告物是荧光报告物、磷光报告物或比色报告物。

在一些实施方案中，标签包含生物素并且标签结合配偶体包含链霉亲和素。可以使用任何其他类型的标签和标签结合配偶体。

本公开的实施方案允许检测各种类型的分析物。因此，在一些实施方案中，分析物选自由以下组成的组：人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促黄体激素(LH)/黄体生成素、前列腺特异性抗原(PSA)、单纯疱疹病毒(HSV)抗体、雌酮-3-葡糖苷酸(E3G)、细菌、血红蛋白A1C、C反应蛋白(CRP)、炎症生物标志物、肌钙蛋白、莱姆病抗原、莱姆病抗体、LDL生物标志物、HDL生物标志物、总胆固醇生物标志物、促甲状腺激素、丙型肝炎病毒生物标志物、鼻病毒生物标志物、流感病毒生物标志物、肝功能生物标志物、雌激素、孕酮、乳酸以及它们的组合。

样品可以是全血、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液、脑脊液(CSF)、精液、粘液、痰液、月经血、月经液、阴道粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、射精前液、恶露、发炎性分泌物、淋巴液和脓液，或任何其他类型的样品。

在一些实施方案中，分析物包含抗体，并且磁性缀合物的捕获部分包含被配置为结合所述抗体的抗原。报告物结合部分可包含被配置为结合所述抗原的第二抗体。在一些实施方案中，生物样品可获自受试者，并且所述方法指示受试者是否产生针对抗原的抗体。在一些实施方案中，所述方法提供样品中抗体的数量。

在一些实施方案中，根据本公开的实施方案的方法的灵敏度随着报告物结合部分的浓度的增加以及随着报告物的浓度的降低而增加。

与使用报告物结合部分的浓度与报告物的浓度无显著差异的测定的方法相比，根据本公开的实施方案的方法提供各种优点。例如，在一些实施方案中，与使用报告物结合部分的浓度与报告物的浓度无显著差异的测定的方法相比，所述方法提供降低的背景噪声。在一些实施方案中，与使用报告物结合部分的浓度与报告物的浓度无显著差异的测定的方法相比，所述方法提供增大的信噪比。

在一些实施方案中，与使用报告物结合部分的浓度与报告物的浓度无显著差异的测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。

在各个方面，本发明提供了适用于本文公开的任何实施方案的方法的试剂盒。所述试剂盒可包括磁性缀合物、报告物结合部分和报告物。

在以下附随描述中阐述了本发明的细节。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但现在描述了说明性的方法和材料。根据描述和权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将为显而易见的。在说明书和所附权利要求书中，单数形式还包括复数，除非上下文另外清楚地指出。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。

本文公开的任何方面或实施方案可以与如本文公开的任何其他方面或实施方案组合。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。具有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求并支付必要费用后由专利局提供。

图1A至图1E示意性地描绘了根据本公开的一些实施方案的免疫测定的实例。图1A显示了(左图)测定中涉及的组分，以及(右图)各自与捕获部分(抗体#1)结合的磁性颗粒、分析物，和与标签结合的报告物结合部分(抗体#2)。图1B显示了(左图)测定中涉及的组分，并且显示(右图)抗体#1和#2可以同时结合分析物，并且当施加磁场时过量报告物结合部分可被去除。图1C描绘出样品可以与报告颗粒重悬。图1D显示如图1B所示添加的报告颗粒各自与报告物结合部分缔合，形成可检测复合物。图1E示出当施加磁场时过量报告颗粒被去除。

图2是示出在根据本公开的一些实施方案的免疫测定中形成的组分、中间复合物和最终复合物的实例的示意图。

图3是显示在根据本公开的实施方案的测定中具有标签的报告物结合部分(Ab)的滴定结果的图，示出针对不同的报告物结合部分浓度(40pM、80pM、160pM、1nM、5nM、25nM、125nM、625nM和3.125uM)，所得的检测信号(Y轴，相对荧光单位，MM)与目标抗体浓度(hCG，mIU/ml)(X轴)。

图4是显示测定中报告物的滴定结果的图，显示背景噪声(相对荧光单位，MM)随报告物浓度的变化而变化。对于Rep 1、Rep 2、Rep3和AVG，分别有四种浓度，从左到右：20pM、200pM、1000pM和2000pM。

图5是显示使用本发明方法实现对黄体生成素(“LH”)特异性抗体的7.7fM检测限(“LOD”)的图。误差条代表重复测定的标准偏差。

图6是显示使用本发明方法实现对前列腺特异性抗原(“PSA”)特异性抗体的15.7fM检测限(“LOD”)的图。误差条代表重复测定的标准偏差。

具体实施方式

本公开提供了满足准确检测生物样品中的分析物这一需求的方法和系统。

在与诊断或治疗受试者有关的各种临床和非临床应用中，希望快速且准确地检测样品中的分析物。然而，常规免疫测定通常需要较长的样品分析时间，可能需要6小时或更长时间。此外，许多常规免疫测定不仅需要相对较长的时间来检测分析物，而且还存在灵敏度差(例如，检测限(LoD)在皮摩尔-纳摩尔范围内)、灵敏度差以及要求大样品体积(例如，数百微升)等问题。

因此，本公开的实施方案提供了一种经设计使得检测动力学得到调节的免疫测定。所述方法允许实现显著更快地检测分析物——例如检测可能需要约1至约20分钟，平均约15分钟。在一些实施方案中，免疫测定可以在低至约1分钟、或约2分钟、或约3分钟、或约4分钟、或约5分钟内完成。此外，根据本公开的实施方案的免疫测定可具有跨不同样品(例如，体液)的低背景和高灵敏度。

在各个方面，提供了一种用于检测生物样品中分析物的存在、不存在或数量的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)使所述样品与磁性缀合物接触，所述磁性缀合物包含磁性颗粒和被配置为结合所述样品中的分析物的捕获部分；(b)使所述磁性缀合物与报告物结合部分接触，所述报告物结合部分具有与其结合的标签，所述报告物结合部分被配置为结合所述分析物；(c)使所述磁性缀合物与报告物接触，所述报告物具有标签结合配偶体，所述标签结合配偶体被配置为结合所述标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与所述报告物缔合，其中所述报告物结合部分的浓度显著大于所述报告物的浓度；(d)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物任选地具有分析物，所述分析物具有与所述报告物缔合的所述报告物结合部分，所述报告物与所述报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物产生的信号的检测，检测所述分析物的存在、不存在或水平。

磁性缀合物可具有或不具有与其缔合的分析物，所述分析物可通过检测由报告物产生的信号或通过检测报告物来检测，这取决于样品中是否存在分析物。当生物样品中存在分析物时，磁性缀合物可具有与其缔合的分析物，所述分析物具有与报告物缔合的报告物结合部分，所述报告物与所述报告物结合部分结合。当样品中不存在分析物时，磁性缀合物将不会与分析物缔合。

在一些实施方案中，所述方法包括：(a)使所述样品与磁性缀合物接触，所述磁性缀合物包含磁性颗粒和被配置为结合所述样品中的分析物的捕获部分；(b)使所述样品与报告物结合部分接触，所述报告物结合部分具有与其结合的标签，所述报告物结合部分被配置为结合所述分析物；(c)使所述样品与报告物接触，所述报告物具有与其结合的标签结合配偶体，使得所述标签结合配偶体结合所述标签，从而将与所述标签结合的报告物结合部分与所述报告物缔合。报告物结合部分的浓度显著大于报告物的浓度。所述方法还包括：(d)通过施加磁场从所述样品中分离分析物，所述分析物具有磁性缀合物和与报告物缔合的报告物结合部分，所述报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述报告物结合部分结合，以及(e)基于对所述报告物产生的信号的检测，检测所述分析物的存在、不存在或水平。

在本发明方法中，报告物结合部分的浓度显著大于报告物的浓度。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度是报告物的浓度的至少约5倍大，或至少约10倍大，或至少约100倍大，或至少约1000倍大。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度是报告物的浓度的约1000倍大。

在一些实施方案中，报告物的浓度在皮摩尔范围内。例如，报告物的浓度可低于约300pM。在一些实施方案中，报告物的浓度为约10pM至约140pM，或约40pM至约140pM、约40pM至约100pM，或约60pM至约100pM，或约80pM至约100pM，或约100pM至约140pM。在一些实施方案中，报告物的浓度为约20pM，或约40pM，或约60pM，或约80pM，或约100pM。在一些实施方案中，报告物的浓度为约120pM。

在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度在纳摩尔范围内。例如，报告物结合部分的浓度可大于约1nm。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度为约1nm至约60nM，约1nm至约50nM，或约1nm至约40nM，或约1nm至约30nM，或约1nm至约20nM，或约1nm至约15nM，或约1nm至约10nM，或约1nm至约5nM。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度为约100nm至约700nM，例如约100nM，或约200nM，或约300nM，或约400nM，或约500nM，或约600nM，或约600nM。

可以根据本公开的实施方案使用各种标签和相应标签结合配偶体。在一些实施方案中，标签包含生物素并且标签结合配偶体包含亲和素(例如链霉亲和素)。在一些实施方案中，标签包含生物素并且标签结合配偶体包含链霉亲和素。在一些实施方案中，标签包含异硫氰酸荧光素(FITC)且标签结合配偶体包含抗FITC抗体，或者标签包含二硝基苯酚(DNP)且标签结合配偶体包含抗DNP抗体，或者标签包含地高辛(DIG)且标签结合配偶体包含抗DIG抗体，或者标签包含Etag且标签结合配偶体包含抗Etag抗体(GAPVPYPDPLEPR(SEQID NO:1))，或者标签包含FLAG且标签结合配偶体包含抗FLAG抗体(DYKDDDDK(SEQ ID NO:2))，或者标签包含Myc且标签结合配偶体包含抗Myc抗体(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:3))，或者标签包含HA且标签结合配偶体包含抗HA抗体(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:4))，或者标签包含SNAP且标签结合配偶体包含苄基鸟嘌呤衍生物，或者标签包含“CLIP”且标签结合配偶体包含苄基胞嘧啶衍生物。

各种标签可用于根据本公开的实施方案的方法和试剂盒中。标签可以是各种肽标签、共价肽标签、蛋白质标签和其他合适类型的标签。

各种报告物可用于本公开的实施方案中。在一些实施方案中，报告分子是金属芯和二氧化硅壳或所述报告物；其中所述二氧化硅壳任选地浸渍有多个量子点；并且其中所述金属芯任选地包含金。在一些实施方案中，报告物包含多个量子点、散布有量子点的颗粒、单个量子点、散布有单个量子点的颗粒、有机染料、上转换荧光粉(upconvertingphosphor)和其他类型。

在一些实施方案中，报告物是荧光报告物、磷光报告物或比色报告物。

在一些实施方案中，报告物可以是用于测量光的吸收和/或散射(或者，例如通过比色分析测量某种颜色的存在、不存在)的荧光报告物、磷光报告物或比色报告物(诸如有色颗粒)。在一些实施方案中，可以使用本领域已知的任何合适的可检测报告物。例如，可检测报告物可以是放射性报告物(例如像，3H、125I、35S、14C、32P和33P)、酶报告物(例如像，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等)、化学发光报告物(例如像，吖啶酯、硫酯或磺酰胺；鲁米诺、异鲁米诺、菲啶鎓酯等)、荧光报告物(诸如荧光素(例如，5-荧光素、6-羧基荧光素、3′6-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素、6-六氯荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等))、罗丹明、藻胆蛋白、R-藻红蛋白、含量子或含金属(Mc)点(例如，硫化锌加帽的硒化镉)、测温报告物或免疫聚合酶链反应报告物。在各个实施方案中，报告物可以包括但不限于荧光团、发色团、放射性同位素、磁性颗粒、金颗粒、酶底物等。在一些实施方案中，报告物是化学发光或荧光蛋白，例如像，绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、海肾(Renilla Reniformis)绿色荧光蛋白、GFPmut2、GFPuv4、黄色荧光蛋白(YFP)、增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、青色荧光蛋白(CFP)、增强型青色荧光蛋白(ECFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)、柠檬色(citrine)荧光蛋白和来自香菇珊瑚的红色荧光蛋白(dsRED)、荧光素酶、伞形酮、罗丹明、荧光素、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白等。在一些实施方案中，报告物是以下任何家族的非蛋白质有机荧光团：呫吨衍生物，诸如荧光素、罗丹明、俄勒冈绿(Oregon green)、伊红和德克萨斯红(Texas red)；花菁衍生物，诸如花菁、吲哚菁、氧碳菁(oxacarbocyanine)、硫碳菁(thiacarbocyanine)和部花菁；方酸衍生物和环取代的方酸，包括Seta、SeTau和Square染料；萘衍生物(丹磺酰和氟硅酸钠(prodan)衍生物)；香豆素衍生物；噁二唑衍生物，诸如吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑；蒽衍生物，诸如蒽醌，包括DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙；芘衍生物，诸如级联蓝(cascade blue)等；噁嗪衍生物，诸如尼罗红(Nile red)、尼罗蓝(Nile blue)、甲酚紫、噁嗪170等；吖啶衍生物，诸如原黄素、吖啶橙、吖啶黄等；芳基次甲基衍生物，诸如金胺、结晶紫、孔雀石绿；以及四吡咯衍生物，诸如卟吩、酞菁、胆红素。在各个实施方案中，报告物包括但不限于酶报告物，例如诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、6-磷酸葡糖脱氢酶等的酶。在一些实施方案中，报告物可以是一个或多个量子点或散布有量子点的颗粒。在一些实施方案中，报告物可以包括具有二氧化硅壳的金属芯(即，金芯)，其中二氧化硅壳浸渍有多个(例如，100-600个)量子点(例如散布有量子点的颗粒)。可以使用任何其他数目的量子点。

在实施方案中，所述方法采用相对少量的量子点或散布有量子点的颗粒，例如约400pM或更少，或约300pM或更少，或约200pM或更少，或约100pM或更少，或约50pM或更少，或约10pM或更少，例如约400pM，或约300pM，或约200pM或更少，或约100pM，或约50pM，或约10pM。使用根据本公开实施方案的方法可以检测各种分析物。在一些实施方案中，分析物包括以下一项或多项：人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促黄体激素(LH)/黄体生成素、前列腺特异性抗原(PSA)、单纯疱疹病毒(HSV)抗体、雌酮-3-葡糖苷酸(E3G)、细菌、血红蛋白A1C、C反应蛋白(CRP)、炎症生物标志物、肌钙蛋白、莱姆病抗原、莱姆病抗体、LDL生物标志物、HDL生物标志物、总胆固醇生物标志物、促甲状腺激素、丙型肝炎病毒生物标志物、鼻病毒生物标志物、流感病毒生物标志物、肝功能生物标志物、雌激素、孕酮、乳酸以及它们的组合。在一些实施方案中，分析物另外或替代地包含以下一项或多项：N末端(NT)-前激素BNP(NT-proBNP)、C反应蛋白(CRP)、D-二聚体、维生素D、维生素B12、T3、T4、促甲状腺激素(TSH)、甲状旁腺激素(PTH)、促卵泡激素(FSH)、铁蛋白、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、孕酮、雌二醇、睾酮、前列腺特异性抗原(PSA)和同型半胱氨酸。

在一些实施方案中，分析物可以是或可以包含抗原和/或生物事件的生物标志物。在一些实施方案中，生物事件可包括疾病事件(例如疾病生物标志物)、炎症事件(例如炎症生物标志物)、生殖事件(例如生殖生物标志物)和/或老化事件(例如老化生物标志物)。疾病生物标志物可包括与患者的疾病发作、疾病消退和/或疾病状态的存在有关或相关联的一种或多种疾病生物标志物。疾病生物标志物可包括病毒生物标志物、细菌生物标志物、癌症生物标志物或症状生物标志物中的一者或多者。病毒生物标志物可包括但不限于普通感冒(例如鼻病毒)、流感、疱疹、寨卡病毒(Zika)和/或HIV的生物标志物。在一些实施方案中，病毒生物标志物可包括单纯疱疹病毒(HSV)、一种或多种鼻病毒蛋白、一种或多种甲/乙/丙型流感蛋白、一种或多种HSF-1/2蛋白和/或一种或多种HIV病毒蛋白。细菌生物标志物可包括但不限于链球菌性喉炎(即A组链球菌(Streptococcus-A/Strep-A))的生物标志物、衣原体的生物标志物和/或淋病的生物标志物。在一些实施方案中，细菌生物标志物可包括但不限于一种或多种链球菌蛋白、一种或多种沙眼衣原体蛋白和/或一种或多种淋病奈瑟氏菌蛋白。症状生物标志物可包括但不限于咳嗽、喘息、流鼻涕、恶心、痉挛、胸闷、头晕、喉咙痛和/或胸痛的生物标志物。疾病生物标志物还可包括但不限于心脏痛楚和/或糖尿病的生物标志物。在一些实施方案中，疾病生物标志物可包括肌钙蛋白、CRP和/或ha1c。癌症生物标志物可包括前列腺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、GIST、白血病/淋巴瘤、肺癌、黑素瘤和/或胰腺癌的生物标志物。在一些实施方案中，前列腺癌生物标志物可包括PSA。在一些实施方案中，乳腺癌生物标志物可包括ER/PR和HER-2/neu中的一者或多者。在一些实施方案中，结直肠癌生物标志物可包括EGFR、KRAS和UGT1A1中的一者或多者。在一些实施方案中，胃癌生物标志物可包括HER-2/neu。在一些实施方案中，GIST生物标志物可包括c-KIT。在一些实施方案中，白血病/淋巴瘤生物标志物可包括CD20抗原、CD30、FIP1L1-PDGRFα、PDGFR、PML/RARα、TPMT和UGT1A1中的一者或多者。在一些实施方案中，肺癌生物标志物可包括ALK、EGFR和KRAS中的一者或多者。在一些实施方案中，黑素瘤生物标志物可包括BRAF。可包括抗炎生物标志物的炎症生物标志物可包括美国专利申请公布第2010/0275282号中描述的一种或多种炎症生物标志物，所述专利申请公布的全部内容以引用的方式并入本文。生殖生物标志物可包括排卵、受精、植入和/或胚胎发育的生物标志物。在一些实施方案中，生殖生物标志物可包括β人绒毛膜促性腺激素(β-hCG或hCG)、高糖基化hCG、黄体生成素(LH)、雌酮-3-葡糖苷酸(E3G)、早孕因子(EPF)和/或预植入因子。老化生物标志物或年龄相关的生物标志物包括美国专利申请公布第2008/0124752号中描述的一种或多种生物标志物，所述专利申请公布的全部内容以引用的方式并入本文。其他目标抗原/生物标志物包括但不限于与以下相关的任何抗原/生物标志物：SARS-CoV-2、MERS、SARS、手足口病、心脏生物标志物、甲状腺激素、肥胖症生物标志物、与出血性病症有关的生物标志物(诸如vWF、因子8、因子10)、第五病(fifths disease)、感冒、流感、埃博拉、大肠杆菌、李斯特菌和沙门氏菌。

在实施方案中，样品是或包括全血、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液、脑脊液(CSF)、精液、粘液、痰液、月经血、月经液、阴道粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、射精前液、恶露、发炎性分泌物(Rheum)、淋巴液、脓液以及它们的组合。在一些实施方案中，样品是全血、血浆、血清或尿液。此外，样品可具有任何其他性质，因为实施方案不局限于可在其中检测到一种或多种分析物的任何特定类型的样品。

根据本公开实施方案的方法允许检测样品中的各种分析物。在一些实施方案中，目标分析物包含抗原。在一些实施方案中，磁性缀合物的捕获部分包含被配置为结合分析物的抗体。抗原的非限制性实例包括感染性疾病抗原，例如像冠状病毒抗原、流感抗原(例如表面蛋白血凝素(H和神经氨酸苷酶(NA))等)。

在一些实施方案中，目标分析物包含抗体。在实施方案中，被检测抗体的非限制性实例包括IgG、IgM、IgD、IgA和IgE抗体中的一者或多者。

在实施方案中，被检测抗体是针对病原体抗原的抗体，例如但不限于冠状病毒抗原。冠状病毒抗原可以是例如IgG抗体。在一些实施方案中，目标抗体包括IgG和/或IgM抗体。冠状病毒是冠状病毒科的成员，任选地选自(a)乙型冠状病毒，任选地选自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、HCoV-HKU1和HCoV-OC43；以及(b)甲型冠状病毒，任选地选自HCoV-NL63和HCoV-229E。在实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV-2。

在一些实施方案中，磁性缀合物的捕获部分包含被配置为结合分析物的第一抗体，其中报告物结合部分包含被配置为结合分析物的第二抗体。在此类实施方案中，分析物可包含抗体，并且磁性缀合物的捕获部分可包含被配置为结合抗体的抗原。所述方法可以指示受试者是否产生针对抗原的抗体。在一些实施方案中，所述方法可以提供样品中抗体的数量。

在一些实施方案中，捕获部分和报告物结合部分结合分析物的不同部分。在一些实施方案中，捕获部分和报告物结合部分是不同的。在一些实施方案中，捕获部分和报告物结合部分结合至不同的抗原或表位。

在本公开的实施方案中，使用报告物结合部分允许显著提高检测速度，所述报告物结合部分具有与其结合的标签，并且被配置为通过可与标签相互作用(例如，通过抗原-抗体相互作用)的标签结合配偶体与报告物缔合。报告物结合部分的浓度可以显著大于报告物的浓度–例如，报告物结合部分的浓度可以在纳摩尔范围内，而报告物的浓度可以在皮摩尔范围内。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度可以为约10^-6M，或约10^-7M，或约10^-8M。在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度可以为至少约10^-6M，或至少约10^-7M或至少约10^-8M。报告物的浓度可以小于约10^-11M，或不大于10^-11M。因此，可检测复合物(即，包含与磁性颗粒和报告物结合的分析物的复合物)的产生动力学得到显著改善，在一些情况下快了1000倍。

此外，与样品中分析物总量(包括样品中存在的可检测和未检测分析物)相比，结合的可检测分析物的比例可以显著提高，在一些情况下高达100％。在一些实施方案中，结合的可检测分析物的比例为至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少98％，或至少99％，或约100％。

在实施方案中，信噪比增大，背景噪声降低，并且特异性和灵敏度增加。

在一些实施方案中，样品具有约1微升的体积。在一些实施方案中，样品具有小于1微升的体积。在一些实施方案中，样品具有约2微升、或约3微升、或约4微升、或约5微升的体积。

在一些实施方案(例如，其中所检测分析物包含抗体)中，所述方法还包括用包含磁性颗粒和被配置为结合污染物抗体和/或非抗体部分的部分的磁性缀合物对所述样品进行预处理的步骤。在一些实施方案中，污染物抗体不针对被配置为结合所述抗体的抗原，或者在针对被配置为结合所述抗体的抗原产生免疫应答方面无效。在一些实施方案中，其中预处理减少或消除以下一项或多项：(a)嗜异性抗体；(b)与磁性颗粒非特异性相互作用的抗体；以及(c)与磁性颗粒非特异性相互作用的非抗体部分。

在一些实施方案中，所述方法适于即时使用。在一些实施方案中，所述方法适于现场使用和/或所述方法适于家庭使用。

在一些实施方案中，所述方法与世界卫生组织的ASSURED(经济、灵敏、特异、易使用、快速且稳定、无需设备和可传送)标准兼容。

在一些实施方案中，所述方法基本上无假阳性。在一些实施方案中，所述方法基本上无假阴性。

在一些实施方案中，与固相免疫测定方法、基于珠粒的流式细胞术或侧流免疫色谱测定相比，所述方法提供更好(即更大)的灵敏度和特异性。

在一些实施方案中，与使用以基于珠粒的流式细胞术为基础的测定、任选地是基于珠粒的基于流式细胞术的测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。在一些实施方案中，与使用侧流免疫色谱测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。

在一些实施方案中，与使用固相免疫测定的方法相比，所述方法提供增大的信噪比。

在一些实施方案中，与使用报告物结合部分的浓度与报告物的浓度无显著差异的测定的方法相比，所述方法提供降低的背景噪声。

在一些实施方案中，与使用报告物结合部分的浓度与报告物的浓度无显著差异的测定的方法相比，所述方法提供增大的信噪比。

在各个方面，本发明提供了适用于本文公开的任何实施方案的方法的试剂盒。所述试剂盒可包括磁性缀合物、报告物结合部分和报告物。所述试剂盒可被配置为使得报告物结合部分的浓度显著大于报告物的浓度。

在实施方案中，根据本公开的方法采用基于纳米颗粒的免疫测定，所述免疫测定被配置为通过检测报告物来检测抗体的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，免疫测定可以类似于PCT/US2018/015440(公布为WO2018140719)中描述的测定或作为这些测定的变型或组合实现，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。

免疫测定

本文所述的方法包括用于检测生物样品中分析物的存在、不存在或数量的方法。

在某些实施方案中，本文所述的方法涵盖夹心法、分次添加法、竞争测定法、三级(三结合事件)法、全细胞测定法或它们的任何组合。

例如，夹心法可能非常适于处理小流体样品体积。本文所述的分次添加法使得能够以提高的灵敏度处理更大的流体体积。竞争测定法可用于例如在没有匹配的捕获部分和相应报告物结合部分(它们可同时与分析物结合)对的场景下测定分析物。三级测定法可以涵盖三个结合事件，以增强用于本发明方法的系统的动力学。

图1A至图1E示意性地示出了根据本公开实施方案的测定中涉及的组分。图1A至图1E所示的测定是夹心测定，并且目标分析物仅作为示例显示为HCG。然而应当理解，可以使用所描述的方法检测任何其他目标分析物。

图1A左图示出了目标分析物(HCG，仅作为示例显示，绿色)、对目标分析物具有特异性的显示为抗体#1的捕获部分(蓝色)和对目标分析物也具有特异性的显示为抗体#2的报告物结合部分(橙色)。图1A(左图)还显示抗体#1和2能够同时结合目标分析物。该测定还包括报告物(“有色报告物”，显示为黄色太阳符号)、磁性颗粒和标签(仅作为示例显示为生物素)。虽然在图1A至图1E中未示出，但报告物具有与其结合并且被配置为结合与报告物结合部分结合的标签的标签结合配偶体。

图1A在右图中进一步显示了与抗体#1结合的磁性颗粒、与抗体#2结合的生物素，和分析物。

图1B进一步示出(在右图中，左图与图1A的左图相同)抗体#1和#2可以同时结合分析物，从而形成包含具有与其结合的抗体#1的磁性颗粒和具有与其结合的标签(生物素，在该实例中)的报告物结合部分的复合物。图1B(右图)所示的复合物形成可以在一个步骤中发生(当磁性颗粒和报告物结合部分都添加到反应混合物中时)或在两个步骤中发生(当磁性颗粒和报告物结合部分单独添加到反应混合物中时)。

在如图1B所示的复合物形成后，可以执行磁向下牵引以将分析物与样品的其余部分分离。可以去除过量的报告物结合部分，并且可以将样品(包括分析物)与相对低浓度的报告物重悬，如图1C所示意性显示。报告物结合部分的浓度显著大于报告物的浓度。应当理解，即使本公开在整个测定中提及“样品”，样品也可能不是从受试者或其他来源获得的原始形式。样品将处于包含其他成分的反应混合物中，并且可以对样品混合物进行超声处理、去除一部分混合物、重悬和其他操作。包括至少一部分样品的反应混合物可能包括或不包括目标分析物。

如图1D所示，每个报告物与报告物结合部分缔合。报告物可具有标签结合配偶体(例如，链霉亲和素)。在将报告物添加到反应混合物中时，最终复合物(在此实例中，可称为“夹心”)是限量试剂，报告物相对于该夹心复合物大大过量，但报告物的浓度比报告物结合部分的浓度低几个数量级。

图1E示出，当施加磁场以从样品中分离分析物(在具有磁性缀合物、报告物结合部分和报告物的最终可检测复合物中)时，去除过量的报告物(即未结合的报告物颗粒)(洗掉)。

在所示实例中，在最终复合物形成过程中，分析物是限量试剂，其他结合部分的较高浓度允许部分分析物被结合，并使这种结合发生的速度最大化。

在实施方案中，报告物结合部分与标签结合且报告物与标签结合配偶体结合，并且标签和标签结合配偶体被配置为相互作用。报告物结合部分的浓度显著大于报告物的浓度。

在常规免疫测定中，具有捕获部分(例如抗原)的磁性颗粒结合分析物(例如抗体)，所示分析物还与由报告物和报告物结合部分形成的报告缀合物的报告物结合部分结合。通过这种方式，形成复合物(例如，“夹心”)。传统测定(例如ELISA)中复合物形成的动力学描述如下。

具有与其结合的捕获部分(例如抗体)的磁性颗粒(即磁性缀合物)可以首先结合样品中的分析物(例如抗原)，或者报告缀合物(“RC”)可以首先结合分析物。在以下图示中，假设磁性缀合物首先结合分析物，形成磁性缀合物和与其结合的分析物的复合物(“C1”)。报告缀合物(“RC”)然后可以结合复合物C1。然而，应当理解，报告缀合物可以在磁性缀合物结合分析物之前替代地结合分析物。

如下式(1)所示，在典型的免疫测定中，最终复合物的形成速率

定义为磁性缀合物和与其结合的分析物的浓度([C1])乘以报告缀合物(“RC”)的浓度并乘以报告物结合部分的缔合速率常数/>

具有结合的分析物的磁性缀合物的[C1]浓度与样品中分析物的浓度成比例，并且这是在测定中测量的值。报告物的[RC]浓度通常为10^-11M，但也可使用其他值(例如，10^-9M或10^-10M)。报告缀合物的浓度受各种因素(例如报告颗粒的胶体稳定性)的限制。/>

通常为10⁵M。

报告缀合物可以一定的解离速率(报告物结合部分的解离速率常数

)从分析物脱落，这样所形成的复合物将以/>

的浓度损失。通常，/>

为1.5-6小时。在典型的免疫测定(例如ELISA)中，存在长的孵育步骤和长的洗涤步骤，因此/>

变得有意义。下面的等式(2)说明了平衡态(即，当复合物的形成没有发生变化时)。报告物结合部分的解离常数，K_D，然后可以如等式(3)所示表示。等式(3)的右侧部分是由报告物结合部分(例如抗体)的/>

或K_D决定的平衡比。这定义了可检测形式的分析物的部分与不可检测形式的分析物的部分。

上文等式(1)到(3)大体上说明了典型免疫测定的局限性，包括由报告物结合部分动力学的缓慢性质驱动的长孵育时间，以及受到增大报告物结合部分的浓度而不降低信号质量(即获得非特异性信号)的能力的限制。

为了克服本公开的局限性，在根据本公开的实施方案的方法中，将使报告缀合物与目标分析物结合的步骤用使报告物结合部分和与其结合的标签结合的步骤以及使报告物和与其结合的标签结合配偶体结合的步骤替代。图2示意性地示出了根据本公开的一些实施方案的免疫测定的组分，以及作为免疫测定的一部分形成的中间复合物和最终复合物。在此实例中，分析物100包含抗原(其仅作为示例显示)。磁性缀合物102的捕获部分和报告物结合部分103(具有与其结合的标签)都是抗体，其可以是相同的或不同的抗体。

如图2所示，也如下面的等式(4)所示，在所示实例中，测定的第一步可与常规测定相同–磁性缀合物102和与其结合的的分析物100结合形成复合物C1(104)，浓度表示为[C1]。使用具有与其结合的标签的报告物结合部分允许报告物结合部分的浓度大于报告物的浓度(103，图2中)。图2进一步显示了报告物105，其具有与其结合的标签结合配偶体。图2还示出了可以在反应混合物中形成的复合物，诸如包含分析物和具有标签的报告物结合部分的复合物107，以及包含通过标签-标签结合配偶体相互作用缔合的报告物结合部分和报告物的复合物109(无分析物)。

如下面的等式(4)和图2所示，最终复合物(图2中的120)的形成速率取决于复合物106的浓度([C3])，该复合物包含与分析物100结合的磁性缀合物102和报告物结合部分103。复合物106的形成如等式(5)所示，其中[TAB]表示标记的报告物结合部分103(即，在此实例中，“标记的抗体”)的浓度。C3的浓度([C3])，在反应中与分析物(即，在此实例中，抗原)的量成比例。

在等式(4)中，代替项

和/>

使用项/>

和/>

它们是“接头”的缔合和解离速率常数，即，报告物结合部分103的标签与报告物105的标签结合配偶体之间的相互作用。

/>

参考等式(5)，如同传统测定(参见等式(1))，

可为约10⁵M。然而，在等式(4)中，虽然[RC]为约10^-11M，但对于接头而言，/>

可为约10⁸M。因此，根据等式(4)的复合物的形成比根据等式(1)(显示了常规测定的动力学)的复合物的形成快一千倍。

因此，即使在根据本公开的实施方案的图示方法中，报告物的浓度可与常规测定中的浓度大致相同，但复合物的形成速率也比常规测定中的形成速率快得多。此外，与常规测定相比，标记的报告物结合部分103(图2)的浓度(在等式(5)中显示为[TAB])可增大，例如它可为约10^-6M。在一些实施方案中，标记的报告物结合部分的浓度可为约10^-7M或10^-8M。因此，在根据本公开的实施方案的方法中，标记的报告物结合部分的浓度远高于常规测定中报告物的[RC]浓度(例如约10^-11M)。此外，即使不是像在常规测定中那样使用报告缀合物，本发明方法利用单独的结合事件(具有与其结合的标签的报告物结合部分的结合事件和具有与其结合的标签结合配偶体的报告物的结合事件)，这两个单独的步骤与传统测定中结合报告缀合物的步骤为一个数量级，或相比之下多一个数量级或快一个数量级。这种增强的动力学允许在约1分钟至约20分钟的范围内执行整个测定。此外，等式(4)中的项

和等式(5)中的项/>

变得可忽略(近似为零)。该测定可具有约100％的结合率，使得，参考图2，分析物100的大部分或全部在最终可检测复合物120中呈结合形式。

在一些实施方案中，报告物结合部分的浓度为约数百皮摩尔至数百纳摩尔。在一些实施方案中，报告物的浓度为约1pM至约600pM，例如，在一些实施方案中，为约40pM至约120pM。

在实施方案中，免疫测定中使用的磁性颗粒的浓度可与样品中分析物分子的预期浓度大致相同。在一些实施方案中，免疫测定中使用的磁性颗粒的浓度可大于样品中分析物分子的预期浓度。此外，在磁性颗粒具有超过一个与其结合的捕获部分(例如，3-4个捕获部分或任何其他数目的捕获部分，例如像抗体)的实施方案中，磁性颗粒上结合位点的数目可高于样品中分析物分子的预期浓度。

在一些实施方案中，可以检测超过一种分析物。这可以例如在单独的反应(例如，但不限于，孔板的单独孔)中平行进行。

在一些实施方案中，根据本公开的方法可用于在同一样品中同时检测生物样品中多种分析物的存在、不存在或数量。通过用具有某种性质(例如，能够产生特定颜色的信号)的报告颗粒标记每种分析物，所述方法可用于同时检测同一样品中的多种分析物。

在一些实施方案中，此类多重化方法包括：(a)使所述样品与至少一种磁性缀合物接触，所述至少一种磁性缀合物包含磁性颗粒和多个捕获部分，所述多个捕获部分与所述磁性颗粒偶联并且各自被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(b)使所述磁性缀合物与多个报告物结合部分接触，所述多个报告物结合部分各自具有与其结合的相应标签，每个报告物结合部分被配置为结合所述多种分析物中的相应分析物；(c)使所述磁性缀合物与多个报告物接触，所述多个报告物各自具有与其结合的相应标签结合配偶体，所述相应标签结合配偶体被配置为结合相应标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合，其中每个报告物被配置为产生相应的不同信号；(d)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物任选地具有所述多种分析物中的分析物，所述分析物具有与相应报告物缔合的相应报告物结合部分，所述相应报告物与所述相应报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物中每一者产生的信号的检测，检测所述多种分析物中每种分析物的存在、不存在或水平。

在可以在同一样品中检测超过一种分析物的多重化实施方案中，标签-标签结合配偶体对可以是正交的，使得标签仅结合相应标签结合配偶体，反之亦然。因此，为了检测样品中的某些分析物，可以选择标签-标签结合配偶体对，使得来自不同对的标签与标签结合配偶体之间不会发生相互作用。换句话讲，每个标签-标签结合配偶体对经选择而对待检测的多种分析物中的特定分析物具有特异性。

在多重化实施方案中，与对应分析物结合(如果样品中存在分析物)的每个报告物产生具有不同性质(诸如颜色)的相应信号，因此所述方法允许区分样品中的不同分析物。

在实施方案中，本文所述的方法采用基于纳米颗粒的免疫测定，所述免疫测定被配置为对生物样品中分析物的存在、不存在或数量进行本发明的检测。基于纳米颗粒的免疫测定可以作为测试平台的一部分来实现，所述多重测试平台在一些实现方式中可以是便携式系统。所述系统可以是试剂盒的形式，包括执行本发明检测所需的所有组分。

在根据夹心免疫测定法实现的方法的一些实施方案中，报告物可以是例如具有浸渍有100-600个量子点的二氧化硅壳的一个或多个金芯颗粒(例如，来自nanoComposix,SanDiego,CA)。在一些实施方案中，报告物包含一个或多个量子点或散布有量子点的颗粒，或另一种纳米颗粒。

在一些实施方案中，可使用的报告物是明亮的报告物(即，产生高质量的信号)，具有高表面积，并且在分析过程中保持胶体稳定。例如，在一些实施方案中，这种报告物可以是包括大量(例如，几百个)高荧光量子点的颗粒或是散布有量子点的颗粒，提供高达约300倍的信号光学放大。

夹心免疫测定涉及检测是否形成包含磁性缀合物、目标分析物和与相应报告物缔合的报告物结合部分(所述相应报告物通过标签-标签结合配偶体相互作用与所述报告物结合部分结合)的复合物。在实施方案中，磁性缀合物包含磁性颗粒和捕获部分，所述捕获部分与磁性颗粒偶联并且被配置为结合样品中的目标分析物。

复合物(“夹心”)仅在存在分析物时形成。当存在分析物时，所得复合物可以被磁铁吸引并提供光信号，光信号的强度随着分析物浓度的增加而增加。

在不存在分析物时，夹心复合物无法形成，因为报告物结合部分/报告系统不与磁性缀合物结合。当不与磁性颗粒缔合时，报告物被洗掉，并且在分析样品时不会产生信号。

在夹心免疫测定法的一些实施方案中，可将磁性缀合物(包含磁性颗粒和与磁性颗粒偶联并且被配置为结合分析物的捕获部分)、报告物结合部分(具有与其结合的相应标签，报告物结合部分被配置为结合分析物)，以及报告物(具有与其结合的相应标签结合配偶体，使得标签结合配偶体可以结合相应标签，从而将与标签结合的报告物结合部分与相应报告物缔合)添加到分析腔室中并与可能包含目标分析物的生物样品混合。可以通过磁体施加磁场(“向下牵引”)以将分析物从样品中分离。可以通过向样品(添加有其他成分)施加磁场持续一定时间(例如，约1分钟，或约2分钟，或约3分钟，或约4分钟，或约5分钟，或约6分钟，或约7分钟)来进行向下牵引。在一些实施方案中，施加磁场持续约5分钟。然而，应当理解，可以持续任何合适的持续时间向样品施加磁场。

如果报告物是荧光信号报告物(例如，有机染料、纳米材料或共轭聚合物)，则光随后可以透射通过分析腔室的至少一部分以使报告物发出荧光。这种荧光可以通过合适的检测器检测到。在不存在目标分析物时，报告物不会与分析物一起被向下牵引，也不会发生荧光。

在一些实施方案中，本文所述的方法可包括：(a)使样品与磁性缀合物接触，所述磁性缀合物包含磁性颗粒和捕获部分，所述捕获部分与所述磁性颗粒偶联并且被配置为结合所述样品中的分析物；(b)使所述磁性缀合物与报告物结合部分接触，所述报告物结合部分具有与其结合的标签，所述报告物结合部分被配置为结合所述分析物；(c)使所述磁性缀合物与报告物接触，所述报告物具有与其结合的标签结合配偶体，所述标签结合配偶体被配置为结合所述标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与所述报告物缔合，其中所述报告物结合部分的浓度显著大于所述报告物的浓度；(d)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物任选地具有与其缔合的分析物和与所述报告物缔合的所述报告物结合部分，所述报告物与所述报告物结合部分结合；以及(e)基于对所述报告物产生的信号的检测，检测所述分析物的存在、不存在或水平。

在上述实施方案中，磁性缀合物包含磁性颗粒，所述磁性颗粒具有与磁性颗粒偶联并且被配置为结合样品中的分析物的捕获部分。在一些实施方案中，磁性缀合物包含磁性颗粒，所述磁性颗粒具有与其偶联的超过一个捕获部分，使得超过一种分析物(例如，抗原)可以与同一磁性颗粒结合。

如果报告物是荧光信号报告物，则光可以透射通过携带样品的分析腔室的至少一部分以使报告物发出荧光，并且发射的荧光通过合适的检测器来测量。可以使用例如光源和光电检测器检测报告物产生的信号。

在实施方案中，可以同时或在不同时间将磁性缀合物(包含磁性颗粒和与所述磁性颗粒偶联的捕获部分)、报告物结合部分和报告物添加到分析腔室中。因此，在一些实施方案中，可以单独添加磁性缀合物、报告物结合部分和报告物。此外，在一些实施方案中，报告物结合部分和报告物可以彼此预先结合。

在一些实施方案中，免疫测定法是一种分次添加法，其可用于处理更大的样品体积(但也可以分析小样品)，并且允许浓缩目标分析物。这种方法可允许以提高的灵敏度检测样品中的分析物。在分次添加法中，可以将磁性缀合物添加到分析腔室中，并与可能包括也可能不包括目标分析物的样品混合。可以通过激活磁场(使得分析物(如果存在)与磁性缀合物的捕获部分结合)来进行向下牵引，并且可以去除一定体积(例如，一部分)的样品。然后可以添加另外体积的样品。在添加另外体积的样品之后(或在一些情况下，在添加之前)，可以使磁场解除激活，磁性缀合物可以再次与样品混合。该过程可重复一定次数(例如，一次、两次、三次、四次或超过四次)以浓缩分析物。在浓缩分析物之后，可以添加报告物结合部分和报告物并将其与样品混合，使得报告物结合部分结合分析物，并且与报告物结合部分结合的标签与标签结合配偶体结合，所述标签结合配偶体与报告物结合，从而将报告物结合部分与报告物缔合。然后可以再次进行磁向下牵引以从样品中分离分析物，所述分析物(如果存在)与磁性颗粒和报告物(通过报告物结合部分)结合。如果报告物是荧光信号报告物，则光可以透射通过分析腔室的至少一部分以使报告物发出荧光，并且发射的荧光通过合适的检测器来测量。在不存在分析物时，报告物将不会与分析物一起被向下牵引，也不会检测到荧光。

在一些实施方案中，执行竞争免疫测定法，所述方法可以包括两种类型的方法。

第一类竞争免疫测定法的方法可用于以下场景：分析物(例如，但不限于，抗原、抗体、细胞、细菌、病毒等)太小而无法同时结合相应捕获部分(其偶联至磁性颗粒，作为磁性缀合物的一部分)和报告物结合部分(其可能或可能不偶联至报告物，例如，通过标签-标签结合配偶体相互作用)。此方法也可用于捕获部分和报告物结合部分中任一者不可用的情况中。在此方法中，可以将磁性缀合物添加到测定腔室中，并与可能包括也可能不包括目标分析物的生物样品混合。然后可以添加报告物标记的第二分析物(一种形式与目标分析物不同的分析物，其被配置为在不存在目标分析物时结合磁性缀合物)并将其与样品混合。当样品中存在目标分析物时，报告物标记的第二分析物不与磁性缀合物结合，因为磁性缀合物的捕获部分的结合位点被目标分析物占据。但是，如果分析样品中不存在目标分析物，则磁性缀合物将与报告物标记的第二分析物结合。进行磁向下牵引以将目标分析物(如果存在)从样品中分离。如果报告物是荧光信号报告物，则光可以透射通过分析腔室的至少一部分以使报告物发出荧光，并且发射的荧光通过合适的检测器来测量。在不存在目标分析物时，报告物标记的分析物将与磁性缀合物一起被向下牵引，并且不会检测到荧光。

因此，在一些实施方案(例如，其中实现第一类竞争免疫测定法)中，本文所述的方法可以包括以下步骤：(a)使样品与包含磁性颗粒和捕获部分的磁性缀合物接触，所述捕获部分被配置为结合样品中的目标分析物；(b)使样品与报告物标记的第二分析物接触，所述第二分析物被配置为在样品中不存在所述分析物时结合磁性缀合物；(d)向分析腔室施加磁场以向下牵引磁性缀合物，所述磁性缀合物任选地具有与其缔合的分析物；以及(e)通过用光源和光电检测器检测报告物来检测分析物的存在、不存在或水平。在所述方法中，报告物结合部分的浓度可显著大于报告物的浓度。

在第二类竞争免疫测定法中，磁性颗粒(例如，磁性珠粒)可以同与其结合的第二竞争分析物(例如，抗原、抗体或另一种类型)一起使用。第二分析物可以不同于目标分析物。第二分析物可以是，例如，被配置为结合报告物结合部分的抗原，所述报告物结合部分被配置为结合目标分析物。在不存在目标分析物时，第二分析物(与磁性颗粒结合)结合与报告物缔合的报告物结合部分。所得复合物可以被磁铁吸引并提供光信号，光信号的强度随着样品中目标分析物浓度的增加而降低。如果样品中存在目标分析物，则会阻止复合物的形成。特别地，当目标分析物存在于样品中时，它可以抢先结合报告物结合部分，与结合至磁性颗粒的第二分析物竞争形成完整复合物。例如，当目标分析物是抗原时，它会结合报告物结合部分(即，抗体)上的可用结合位点，从而阻止第二分析物(结合至磁性颗粒)与报告物结合部分(结合至报告物)结合。通过这种方式，报告物结合部分上的抗体结合位点被目标分析物占据，并且所述目标分析物因此竞争形成完整复合物。因此，当施加磁场时，与磁性颗粒结合且未与报告物结合的第二分析物被向下牵引。通过报告物结合部分与报告物结合的目标分析物(报告物和报告物结合部分可通过标签-标签结合配偶体相互作用)被洗掉。因此，由报告物产生的光信号的强度随着目标分析物浓度的增加而降低。

在第二类竞争免疫测定法中，在进行测定之前，可以将磁性颗粒与第二分析物偶联(以形成所谓的磁性颗粒标记的分析物)。在一些实施方案中，所述方法涉及使用包含报告物和报告物结合部分的报告缀合物。将报告缀合物添加到包含生物样品的分析腔室中，并将其与可能包含目标分析物的样品混合。将磁性颗粒和与其结合的第二分析物添加到分析腔室中并与样品混合。然后进行磁向下牵引以将磁性颗粒和与其结合的第二分析物从样品中分离。如果报告物是荧光信号报告物，则光可以透射通过样品以使报告物发出荧光，并且发射的荧光通过合适的检测器来测量。在存在目标分析物时，与第二分析物结合但不与报告物缔合的磁性颗粒被向下牵引，导致不存在荧光。取决于样品中目标分析物的浓度，由报告物产生的信号的强度随着分析物浓度增加而降低。

因此，在一些实施方案中(例如，其中实现第二类竞争免疫测定法)，本文所述的方法可以包括以下步骤：(a)使样品与报告物和报告物结合部分接触，所述报告物结合部分被配置为结合样品中的目标分析物；(b)使样品与磁性颗粒标记的第二分析物接触，所述第二分析物被配置为在样品中不存在目标分析物时结合报告缀合物；(c)通过向样品施加磁场将磁性颗粒标记的分析物从样品中分离；以及(d)通过检测报告物来检测分析物的存在、不存在或水平。报告物结合部分的浓度显著大于报告物的浓度。可以例如，如上述实施方案所述，使用光源和光电检测器检测报告物。

如上文所讨论，在本公开的实施方案中，代替如在常规免疫测定中使用报告缀合物(即，报告物结合部分和与其结合的报告物)，检测方法可以涉及使用具有与其结合的标签(而不是报告物)的报告物结合部分。可以将具有与其结合的标签的报告物结合部分和具有与其结合的相应标签结合配偶体的报告物通过两个单独的步骤添加到反应混合物中。使用具有与其结合的标签的报告物结合部分(以及使用具有相应标签结合配偶体的报告物)允许增加报告物结合部分的浓度，并且报告物的浓度基本上低于报告物结合部分的浓度。最终复合物形成的速度显著提高，使得整个测定可以在不到20分钟的时间内(例如，在约15分钟内)进行，而传统测定可能需要长达6小时。

在一些实施方案中，所述检测方法包括：(a)使样品与报告物结合部分接触，所述报告物结合部分具有与其结合的标签并且被配置为结合样品中的目标分析物；(b)使样品与报告物接触，所述报告物具有与其结合的标签结合配偶体，使得标签结合配偶体结合标签，从而使与标签结合的报告物结合部分与报告物缔合，其中报告物结合部分的浓度显著大于报告物的浓度；(c)使样品与磁性颗粒标记的第二分析物接触，所述第二分析物被配置为在不存在目标分析物时结合报告物结合部分；(d)通过向样品施加磁场从样品中分离磁性颗粒标记的第二分析物；以及(e)基于对报告物产生的信号的检测，检测目标分析物的存在、不存在或水平。可以例如，如上述实施方案所述，使用光源和光电检测器检测报告物。

在一些实施方案中，标签包含生物素且标签结合配偶体包含链霉亲和素，或者标签包含异硫氰酸荧光素(FITC)且标签结合配偶体包含抗FITC抗体，或者标签包含二硝基苯酚(DNP)且标签结合配偶体包含抗DNP抗体，或者标签包含地高辛(DIG)且标签结合配偶体包含抗DIG抗体，或者标签包含Etag且标签结合配偶体包含抗Etag抗体(GAPVPYPDPLEPR(SEQ ID NO:1))，或者标签包含FLAG且标签结合配偶体包含抗FLAG抗体(DYKDDDDK(SEQ IDNO:2))，或者标签包含Myc且标签结合配偶体包含抗Myc抗体(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:3))，或者标签包含HA且标签结合配偶体包含抗HA抗体(YPYDVPDYA(SEQ ID NO:4))，或者标签包含SNAP且标签结合配偶体包含苄基鸟嘌呤衍生物，或者标签包含“CLIP”且标签结合配偶体包含苄基胞嘧啶衍生物。

在一些实施方案中，用于检测生物样品中分析物的存在、不存在或数量的方法可以包括：(a)使样品与报告物结合部分接触，所述报告物结合部分具有与其结合的标签并且被配置为结合样品中的分析物；(b)使样品与报告物接触，所述报告物具有与其结合的标签结合配偶体，使得标签结合配偶体结合标签，从而将与标签结合的报告物结合部分与报告物缔合，其中报告物结合部分的浓度显著大于报告物的浓度；(c)使样品与磁性颗粒接触，所述磁性颗粒具有与其结合的第二分析物，所述第二分析物被配置为结合报告物结合部分；(d)通过向样品施加磁场来分离具有与其结合的第二分析物的磁性颗粒；以及(e)通过检测报告物来检测分析物的存在、不存在或水平。可以例如，如上述实施方案所述，使用光源和光电检测器检测报告物。

在一些实施方案中，实现三级免疫测定方法，所述方法利用三个结合事件来增强用于本发明的系统的动力学。三级结合法可以应用于夹心法、分次添加法和竞争测定(第一方法和第二方法)中或包括这些方法。三级模式可涉及使用：报告缀合物，所述报告缀合物包含具有与其结合的标签结合配偶体的报告物(例如，用链霉亲和素官能化的荧光量子点)和具有与其结合的标签的报告物结合部分(例如，用生物素标记的抗体)；以及包含磁性颗粒和捕获部分的磁性缀合物。样品可以置于分析腔室中。

三级结合方法可以包括将磁性缀合物(包含磁性颗粒和捕获部分)添加到分析腔室中，并将磁性缀合物与可能包含目标分析物的样品混合。可以施加磁场(“向下牵引”)以将目标分析物从样品中分离。如上文所述，可以去除一定体积的样品，并且可以执行一次或多次分析物浓缩步骤。可以使磁场解除激活，并且可以将报告物结合部分(例如，具有与其结合的标签的抗体)添加到分析腔室中，所述报告物结合部分可以与目标分析物结合，所述目标分析物进而又与磁性缀合物结合。然后可以将报告物(具有与其结合的标签结合配偶体)添加到分析腔室中，所述报告物随后可以例如通过标签结合配偶体-标签相互作用(例如，链霉亲和素-生物素结合相互作用)与报告物结合部分结合。然后可以再次进行磁向下牵引以将目标分析物从样品中分离。如果报告物是荧光信号报告物，则光可以透射通过分析腔室的至少一部分以使报告物发出荧光，并且发射的荧光通过合适的检测器来测量。在不存在目标分析物时，不会发生荧光。

在一些实施方案(例如，其中实现三级免疫测定法)中，本文所述的方法可以包括以下步骤：(a)使样品与磁性缀合物接触，所述磁性缀合物包含磁性颗粒和被配置为结合样品中的分析物的捕获部分；(b)施加磁场以从所述样品中分离所述分析物；(c)使所述磁性缀合物与报告物结合部分接触，所述报告物结合部分具有与其结合的标签，所述报告物结合部分被配置为结合所述分析物；(d)使所述磁性缀合物与报告物接触，所述报告物具有与其结合的标签结合配偶体，所述标签结合配偶体被配置为结合所述标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与所述报告物缔合，其中所述报告物结合部分的浓度显著大于所述报告物的浓度；(e)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物任选地具有所述分析物和与所述报告物缔合的所述报告物结合部分，所述报告物与所述报告物结合部分结合；以及(f)基于对所述报告物产生的信号的检测，检测所述分析物的存在、不存在或水平。

在上述实施方案中，在执行步骤(b)(通过磁铁向下牵引以将分析物从样品中分离)之后，并且在步骤(c)之前，可以使磁场解除激活。同样，在一些实施方案中，在步骤(b)之后且在步骤(c)之前，可以如上文所讨论去除一定体积的样品并且可以执行分析物浓缩步骤。

在一些实施方案中，检测方法包括全细胞免疫测定，所述全细胞免疫测定靶向目标细胞上存在的表面分析物(例如，生物标志物，诸如细胞表面受体)，从而检测整个细胞(例如，细菌)。测量全细胞的能力可以提供对健康、免疫病症、癌症和细菌感染的见解。就链球菌性咽喉炎而言，例如，检测酿脓链球菌是非常有价值的，因为这种感染在成人在儿童中非常流行。全细胞检测可以有利地允许检测复杂样品中的细菌，这可用于临床、流行病学和环境应用。

在实施方案中，全细胞免疫测定涉及使用磁性缀合物、报告物结合部分和报告物用于检测分析物。如在本文所述的其他实施方案中，磁性缀合物包含磁性颗粒和捕获部分，所述捕获部分与磁性颗粒偶联并且被配置为结合分析物。在一些实施方案中，磁性缀合物包含磁性颗粒，所述磁性颗粒具有与其偶联的捕获部分，所述捕获部分被配置为结合分析物。报告物结合部分具有与其结合的相应标签并且被配置为结合分析物。磁性缀合物的捕获部分，和报告物结合部分(其可以是对目标细胞上的表面分析物具有特异性的抗体)可以被配置为结合被检测细胞表面分析物上的标志物(例如，细胞受体)。捕获部分和报告物结合部分可以被配置为与相同或不同的细胞表面受体结合。

报告物具有与其结合的标签结合配偶体，使得标签结合配偶体可以结合相应标签，从而将与所述标签结合的报告物结合部分与报告物缔合。所述测定可以被设计成使得，对于每种类型的被检测细胞，将多个磁性颗粒和报告物与细胞缔合(通过对应捕获部分和报告物结合部分)。

在全细胞免疫测定中，当目标细胞存在时，测定组分结合细胞表面上的细胞受体。所得复合物可以被磁铁吸引并且可以提供光信号，光信号的强度随着分析物浓度的增加而增加。如果样品中不存在目标细胞，则复合物不会形成，并且在磁向下牵引过程中报告系统被洗掉，从而产生负信号。

在各个实施方案中，用于检测生物样品中分析物的存在、不存在或数量的方法可以包括以下任一项：上述夹心法、分次添加法、竞争法(包括两种类型)、三级(三结合事件)法、全细胞检测或这些方法的组合和/或变型。在一些实施方案中，夹心法、分次添加法、竞争法和三级法中的一者或多者可以类似于PCT/US2018/015440(公布为WO2018140719)中描述的对应测定实现，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。

可检测的分析物的非限制性实例包括以下一项或多项：人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促黄体激素(LH)/黄体生成素、前列腺特异性抗原(PSA)、单纯疱疹病毒(HSV)抗体、雌酮-3-葡糖苷酸(E3G)、细菌、血红蛋白A1C、C反应蛋白(CRP)、炎症生物标志物、肌钙蛋白、莱姆病抗原、莱姆病抗体、LDL生物标志物、HDL生物标志物、总胆固醇生物标志物、促甲状腺激素、丙型肝炎病毒生物标志物、鼻病毒生物标志物、流感病毒生物标志物、肝功能生物标志物、雌激素、孕酮、乳酸以及它们的组合。在一些实施方案中，分析物另外或替代地包含以下一项或多项：N末端(NT)-前激素BNP(NT-proBNP)、C反应蛋白(CRP)、D-二聚体、维生素D、维生素B12、T3、T4、促甲状腺激素(TSH)、甲状旁腺激素(PTH)、促卵泡激素(FSH)、铁蛋白、黄体生成素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、孕酮、雌二醇、睾酮、前列腺特异性抗原(PSA)和同型半胱氨酸。

在一些实施方案中，分析物是或包含全细胞，例如细菌、肿瘤细胞或任何其他类型的细胞。本公开的实施方案还可用于检测病毒。

应当理解，本公开的实施方案提供了用于检测任何合适分析物的技术。

在一些实施方案中，用于检测生物样品中目标分析物的存在、不存在或数量的方法可以包括，如上文所述结合分次添加法，浓缩目标分析物。在一些实施方案中，用于检测生物样品中目标分析物的存在、不存在或数量的方法可以包括竞争法和三级(三结合事件)法中的一者或两者的部分或全部步骤。

根据本公开实施方案的方法可以在本文使用的分析装置或系统的合适分析腔室中实现。在一些实施方案中，分析腔室包括或者是包括适当数量的孔的孔板。

分析系统可以包括被配置用于在其中接收生物样品的分析腔室、磁铁、光源和检测器(例如，光电检测器)等部件。分析系统可以包括磁铁或可以与磁铁相关联，磁铁可以是永磁体，其可以与分析腔室分开，以便向分析腔室施加磁场。在一些实施方案中，磁体可以是电磁铁，可以对其进行控制以将使其激活或解除激活，以便向分析腔室施加磁场。应当理解，根据本公开实施方案的分析装置或系统可以具有被配置为检测生物样品中分析物的存在、不存在或数量的任何合适的配置和任何合适的部件。

在一些实施方案中，分析系统包括连接至分析腔室或以其他方式与分析腔室相关联的光源。在一些实施方案中，光源被配置为使光透射通过分析腔室的至少一部分。

在一些实施方案中，分析腔室可以是一个腔室、或两个腔室、或三个腔室、或四个腔室。分析腔室可以包括多个腔室，这些腔室可以是超过四个腔室。在一些实施方案中，多个腔室可以彼此流体连通。在一些实施方案中，可以将生物样品、报告物、报告物结合部分和磁性缀合物(包含磁性颗粒和与其缔合的捕获部分)中的一者或多者在所述多个腔室中的第一腔室中混合。在一些实施方案中，可以在所述多个腔室中的第二腔室中施加磁场，并且耦合至分析腔室的光源被配置为使光透射通过第二腔室。在一些实施方案中，本文所述的方法步骤可以各自在分析腔室的单独腔室中执行。在一些实施方案中，分析腔室可以是一个腔室，并且所有方法步骤可以在同一腔室中执行。

在一些实施方案中，光电检测器可以连接至分析腔室或以其他方式与分析腔室相关联(例如，定位为面向光源、与光源对齐、与光源相对，或呈其他方式)，并且可以被配置为检测由光源透射通过分析腔室的光，从而测量光的透射和/或吸收。在一些实施方案中，光电检测器可以相对于分析腔室定位，使得光电检测器与光源正交(正交照明)，并且可以被配置为检测分析腔室的一部分中的报告物的荧光和/或磷光。在一些实施方案中，光电检测器可以相对于分析腔室定位，使得光电检测器与光源相对(透射照明)，并且可以被配置为检测分析腔室的一部分中的报告物的荧光和/或磷光。在一些实施方案中，光电检测器可以连接至分析腔室(与光源对齐，例如通过二向色镜(顺光照明))，并且可以被配置为检测分析腔室的一部分中的报告物的荧光和/或磷光。

本公开实施方案中使用的光电检测器可以具有各种配置。在一些实施方案中，光电检测器可包括一个或多个光电倍增管检测器和光电二极管检测器。如本文所用，术语“光电倍增器”或“光电倍增管”是指通过光电效应和二次电子发射将入射光子转换成电子的光学检测部件。术语光电倍增管意指包括含有用于电流倍增的单独倍增电极的器件以及含有一个或多个通道电子倍增器的那些器件。如本文所用，术语“光学检测器”或“光电检测器”是指当用光能照射时产生输出信号的器件。因此，术语光学检测器系统在其最广泛的意义上用于定义出于物理量测量或信息传递目的将能量从一种形式转换为另一种形式的装置。光学检测器包括但不限于光电倍增管和光电二极管。如本文所用，术语“光电二极管”是指固态光检测器类型，包括但不限于PN、PIN、APD、CMOS和CCD。在一些实施方案中，光电检测器可包括基于PN的检测器、基于PIN的检测器、基于APD的检测器、基于CMOS的检测器和基于CCD的检测器中的一者或多者。

在一些实施方案中，分析腔室包括如本文所述的光电检测器。在一些实施方案中，分析腔室包括包括基于PN的检测器、基于PIN的检测器、基于APD的检测器、基于CMOS的检测器和基于CCD的检测器中的一者或多者。

在各个实施方案中，分析装置或系统(其可以是试剂盒的形式)包括样品收集器，所述样品收集器被配置为接收从受试者获得的生物样品。在各个实施方案中，根据本公开的方法可涉及将从受试者获得的样品添加到分析腔室中。在一些实施方案中，将样品添加到分析腔室中可包括将样品递送至样品收集器。样品可以是血液、血浆或血清，并且样品收集器可以是或可以包括针刺(例如，刺血针)、注射器，或被配置为到达血液或另一种体液的另一形式的样品收集器。在一些实现方式中，样品收集器可以是可伸缩元件(可以是，例如，装载弹簧的可伸缩元件)，其可以在收集生物样品(例如，血液、血浆或血清)后安全地缩回样品收集管或其他隔室中。在一些实施方案中，用于安全样品收集的装置包括针刺(例如，刺血针)或注射器，其中针刺或注射器连接至盖子，所述盖子可拆卸地连接至样品收集管。在一些实施方案中，针刺、注射器或其他类型的样品收集器置于可拆卸的盖子(其可以连接至装置)中，所述盖子被配置为在不使用时覆盖样品收集器。可拆卸的盖子和/或样品收集器可以连接至阀门或被配置为激活以缩回样品收集器或以其他方式使样品收集器可用于样品收集的其他部件。在一些实施方案中，盖子可以被配置为自动打开，并且/或者样品收集器可以被配置为自动打开。

在一些实施方案中，样品收集器(例如，注射器)与分析装置或系统是分开的。单独的样品收集器可以是包括分析系统在内的试剂盒的一部分。

针刺、注射器或其他类型的样品收集器可以与分析腔室内部流体连通。因此，样品收集器可以将其中接收到的样品提供给分析腔室。在一些实施方案中，样品收集器可包括吸收剂和/或芯吸材料，或便于将收集的样品(例如，血液、血浆或血清)递送至分析腔室的其他类型的材料。

分析装置或系统可以是一次性的。在一些实施方案中，系统的零件(例如，样品收集器)可以是一次性的，而其他零件可以是可重复使用的。在一些实施方案中，系统的一些部件可以是可拆卸的和/或一次性的。

在一些实施方案中，可以将磁性缀合物、报告物、报告物结合部分和报告缀合物(包含报告物和报告物结合部分)中的一者或多者置于样品收集器处，并且使样品与磁性缀合物、报告物、报告物结合部分或报告缀合物接触的步骤可以在样品收集器处发生。在一些实施方案中，在将样品添加到样品收集器中之前，可以将磁性缀合物、报告物、报告物结合部分和报告缀合物中的一者或多者嵌入样品收集器的一部分中。在一些实施方案中，本文所述的方法可包括使分析腔室中的样品与磁性缀合物、报告物、报告物结合部分和/或报告缀合物接触。

在一些实施方案中，报告物可以是荧光报告物、磷光报告物或比色报告物(诸如有色颗粒)，所述报告物可以被配置为测量光的吸收或散射(或者，例如通过比色分析测量某种颜色的存在/不存在)。报告物可以具有被配置为与对应标签结合的标签结合配偶体，诸如上文所述的任何标签结合配偶体，或其他标签结合配偶体。

在一些实施方案中，本文所述的方法还可包括在使样品与磁性缀合物接触之后，通过向分析腔室施加磁场来浓缩样品中的目标分析物，然后减少分析腔室中样品的体积。在一些实施方案中，本文所述的方法还可包括在使样品与报告缀合物接触之前使磁场失活。

在一些实施方案中，减少分析腔室中样品的体积可以通过例如对一部分体积进行虹吸或通过去除全部样品并以新的较小体积重悬来进行。

在实施方案中，本文所述的方法还可包括以下步骤：在使样品与磁性缀合物接触之后，通过向分析腔室施加磁场来浓缩样品中的目标分析物；从分析腔室中去除一定体积的样品；以及将一定体积的缓冲液和/或另外体积的样品添加到分析腔室中。在一些实施方案中，本文所述的方法可包括在使样品与报告缀合物接触之前使磁场失活的步骤。

在一些实施方案中，本文所述的方法可包括将一定体积的缓冲液和/或另外体积的样品添加到分析腔室中的步骤。

在一些实施方案中，本文所述的方法可包括以下步骤：在将磁性缀合物向下牵引(即，施加磁场)之后以及在使样品与报告物结合部分接触之前或之后，从分析腔室中去除一定体积的样品。

在一些实施方案中，报告物结合部分包括用生物素标记的报告抗体，并且报告物用链霉亲和素功能化。在一些实施方案中，报告物结合部分(例如像报告抗体)用链霉亲和素功能化，并且报告物用生物素标记。

在各个实施方案中，本文所述的方法包括或利用例如用于检测报告信号的各种检测技术。检测技术可包括使用显微镜、分光光度计、荧光计、管式光度计或板式光度计、x射线技术、磁场、闪烁体、荧光激活细胞分选(FACS)设备、微流体设备、基于珠粒的设备等。

在一些实施方案中，磁性缀合物的磁性颗粒是顺磁性颗粒。在一些实施方案中，顺磁性颗粒是纳米颗粒，其可以是例如纳米珠粒。在一些实施方案中，顺磁性颗粒是微粒。在一些实施方案中，微粒是微珠。在各个实施方案中，顺磁性颗粒是磁性纳米珠粒或微珠，其允许颗粒被磁体固持和/或操纵。在一些实施方案中，顺磁性颗粒是涂覆有薄(例如，直径为约2nm)石墨烯类碳层的金属纳米颗粒。在一些实施方案中，顺磁性颗粒是被涂覆的，例如涂覆有链霉亲和素或PEG。可以使用的示例性磁性颗粒是DYNABEADs(THERMOFISHER)、MACS珠粒(MILTENYI BIOTEC)、TURBOBEADS(TURBOBEADS)、ABSOLUTE MAG STREPTAVIDIN MAGNETICPARTICLES(CREATIVE DIAGNOSTICS)和GOLD NANOPARTICLES(SIGMA ALDRICH)。

在一些实施方案中，磁性珠粒是具有超顺磁性Fe₂O₃芯和生物相容性外包衣的纳米颗粒。磁性珠粒的表面可以用例如羧基激活。

在一些实施方案中，本文所述的报告颗粒可包括生物相容性涂层，所述生物相容性涂层可用胺基或羧基激活以促进酰胺偶联。在一些实施方案中，本文所述的报告颗粒可以用胺基或羧基激活以促进酰胺偶联。

在一些实施方案中，本文所述的颗粒可以是纳米颗粒(例如纳米珠粒)，其直径小于1微米(例如约5至约500纳米，例如约5纳米，或约10纳米，或约50纳米，或约100纳米，或约250纳米，或约500纳米)。在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)的平均粒径为25-500nm+/-5nm、25-500nm+/-10nm、25-500nm+/-15nm、25-500nm+/-20nm、25-500nm+/-25nm、25-500nm+/-30nm、25-500nm+/-35nm、25-500nm+/-40nm、25-500nm+/-45nm或25-500nm+/-50nm。在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)的平均粒径为约20至约200nm。

在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)的直径小于1微米(例如约5至约500纳米，例如约5纳米，或约10纳米，或约50纳米，或约100纳米，或约250纳米，或约500纳米)。在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)的平均粒径为25-500nm+/-5nm、25-500nm+/-10nm、25-500nm+/-15nm、25-500nm+/-20nm、25-500nm+/-25nm、25-500nm+/-30nm、25-500nm+/-35nm、25-500nm+/-40nm、25-500nm+/-45nm或25-500nm+/-50nm。在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)的平均粒径为约20至约200nm。在一些实施方案中，磁性颗粒可以是磁性纳米颗粒(例如纳米珠粒)，其由氧化物(诸如铁氧体、磁赤铁矿、磁铁矿或氧化铁)组成，任选地由表面活性剂、二氧化硅、硅氧烷或磷酸衍生物改性。在一些实施方案中，纳米颗粒(例如纳米珠粒)由具有壳(例如二氧化硅壳，任选地被改性)的铁氧体组成。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒是金属的(例如铁、钴等)。在一些实施方案中，磁性纳米颗粒是包含壳(例如温和氧化、表面活性剂、聚合物和金属(例如金、石墨烯、钯、铂等))的金属纳米颗粒。

在一些实施方案中，本文所述的颗粒可以是包含一个或多个量子点的纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒包含金属芯和一个或多个量子点。在一些实施方案中，纳米颗粒包含可散布有一个或多个量子点的金属芯。在一些实施方案中，纳米颗粒包含可散布有多个量子点的金属芯。量子点是离散的纳米颗粒，它们的性质与体半导体类似，使得当暴露于电磁能时它们继而发出能量。通过改变尺寸和组成，量子点可以被设计为对红外区域、可见光谱甚至紫外线范围内的能量敏感。此外，它们可以被设计为光致发光的或光伏的，分别产生光或能量。

在一些实施方案中，报告物可以是纳米颗粒(例如纳米珠粒)，其可以包含一个或多个量子点。在一些实施方案中，报告物包含金属芯和一个或多个量子点。在一些实施方案中，报告物包含可散布有一个或多个量子点的金属芯。在一些实施方案中，报告物包含可散布有多个量子点的金属芯。

在一些实施方案中，报告物可包含一个或多个量子点或散布有量子点的颗粒。在一些实施方案中，报告物可包含一个或多个量子点或散布有量子点的颗粒。在一些实施方案中，报告物可包含多个量子点或散布有量子点的颗粒。

例如通过胶体方法产生的量子点的实例包括但不限于硒化镉(CdSe)、硫化镉(CdS)、砷化铟(InAs)和磷化铟(InP)硫化镉碲(CdTeS)。构成量子点的原子的数目范围可以为100至100,000，通常直径范围为2至20nm(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、1 1、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、1 1.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5、18.5、19.5、20.5nm)。

在一些实施方案中，包括量子点材料的颗粒材料包括但不限于碳、胶体金、锗、砷化铟、锑化铟、砷化镓、氮化镓、镉/硒/碲化物、铅、氧化铅、硫化铅、硒化铅、磷化铟镓、硅、胶体银、碲化汞镉、铁、氧化铁、钴、石墨烯、镧、铈、碳酸锶、锰、氧化锰、氧化镍、铂、锂、钛酸锂、钽、铜、钯、钼、碳化硼、碳化硅、碳化钛、氧化钨、铝、铌、铥、氮化铝、锡、氧化铝、氧化锡、锑、镝、镨(paseodynium)、氧化锑、铒、铼、钡、钌、铍、钐、氧化铋、硼、钆、氮化硼、氧化钒、锶、镱、锆、金刚石(C)、硅(Si)、锗(Ge)、碳化硅(SiC)、硅-锗(SiGe)、锑化铝(AlSb)、砷化铝(AlAs)、氮化铝(AlN)、磷化铝(AlP)、氮化硼(BN)、磷化硼(BP)、砷化硼(BAs)、锑化镓(GaSb)、砷化镓(GaAs)、氮化镓(GaN)、磷化镓(GaP)、锑化铟(InSb)、砷化铟(InAs)、氮化铟(InN)、磷化铟(InP)、砷化铝镓(AlGaAs)、砷化铟镓(InGaAs，InxGai_xAs)、磷化铟镓(InGaP)、砷化铝铟(AlInAs)、锑化铝铟(AllnSb)、氮化砷化镓(GaAsN)、磷化砷化镓(GaAsP)、氮化铝镓(AlGaN)、磷化铝镓(AlGaP)、氮化铟镓(InGaN)、锑化砷化铟(InAsSb)、锑化铟镓(InGaSb)、磷化铝镓铟(AlGalnP，也称为InAlGaP、InGaAlP、AlInGaP)、磷化砷化铝镓(AlGaAsP)、磷化砷化铟镓(InGaAsP)、磷化砷化铝铟(AlInAsP)、氮化砷化铝镓(AlGaAsN)、氮化砷化铟镓(InGaAsN)、氮化砷化铟铝(InAlAsN)、氮化锑化砷化镓(GaAsSbN)、锑化砷化氮化镓铟(GalnNAsSb)、磷化锑化砷化镓铟(GalnAsSbP)、硒化镉(CdSe)、硫化镉(CdS)、碲化镉(CdTe)、氧化锌(ZnO)、硒化锌(ZnSe)、硫化锌(ZnS)、碲化锌(ZnTe)、碲化镉锌(CdZnTe，“CZT”)、碲化汞镉(HgCdTe)、碲化汞锌(HgZnTe)、硒化汞锌(HgZnSe)、氯化亚铜(CuCl)、硒化铅(PbSe)、硫化铅(PbS)、碲化铅(PbTe)、硫化锡(SnS)、碲化锡(SnTe)、碲化铅锡(PbSnTe)、碲化铊锡(Ti2SnTe5)、碲化铊锗(Tl2GeTe5)、碲化铋(Bi2Te3)、磷化镉(Cd3P2)、砷化镉(Cd3As2)、锑化镉(Cd3Sb2)、磷化锌(Zn3P2)、砷化锌(Zn3As2)、锑化锌(Zn3Sb2)、碘化铅(II)(Pbl2)、二硫化钼(MoS2)、硒化镓(GaSe)、硫化锡(SnS)、硫化铋(Bi2S3)、硒化铜铟镓(CIGS)、硅化铂(PtSi)、碘化铋(III)(Bil3)、碘化汞(II)(Hgl2)、溴化铊(I)(TIBr)、二氧化钛(锐钛矿)(TiO2)、氧化铜(I)(Cu2O)、氧化铜(II)(CuO)、二氧化铀(UO2)、三氧化铀(UO3)等。

在各个实施方案中，使用外部磁体施加磁场。在各个实施方案中，磁体是永磁体(例如钕铁硼(NdFeB)、钐钴(SmCo)、铝镍钴合金，以及陶瓷或铁氧体磁体)。在各个实施方案中，磁体是暂时磁体。在各个实施方案中，磁体是电磁体。

在各个实施方案中，报告物的检测在磁场附近进行。在各个实施方案中，报告物的检测远离磁场进行，例如在与执行磁向下牵引步骤的腔室分开的腔室中进行。

在一些实施方案中，所述方法提供纳摩尔、或皮摩尔、或飞摩尔级的灵敏度。

在各个方面，本发明提供了适用于本文公开的任一实施方案的方法的试剂盒。所述试剂盒可用于免疫测定，其中报告物结合部分的浓度显著大于报告物的浓度。所述试剂盒可包含磁性缀合物、报告物结合部分和报告物，并且报告物结合部分的浓度显著大于报告物的浓度。

任选地，将本发明技术的试剂盒的上述组分包装在合适的容器中并标记用于诊断相应的疾病或病症，或者标记用于相应的其他目的。上述组分可以作为水性(优选无菌)溶液或冻干(优选无菌)复溶制剂储存在单元容器或多用途容器，例如密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和试管中。例如，本发明技术的测定试剂可以被冻干，以消除冷链运输和储存的要求。例如，在一些实施方案中，除乙酸镁Mg(CH₃COO)₂外的所有试剂冻干于测定管底部，而Mg(CH₃COO)₂冻干于盖子上：这阻止5’至3’DNA聚合酶的发生，直至Mg(CH₃COO)₂与其他测定试剂混合。

所述试剂盒还可包括第二容器，所述容器容纳缓冲液或其他适于将样品稀释至更高体积的成分。此外，所述试剂盒可包括用于实施测定的说明书。所述容器可由诸如玻璃或塑料的各种材料制成并且可以具有无菌入口。所述试剂盒还可包括包含可接受缓冲液的更多容器。所述试剂盒还可包括用于收集生物样品的装置。它还可包括在商业和使用者看来所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。试剂盒可以任选地包括通常包含在诊断产品商业包装中的说明书，其中包括有关例如此类诊断产品的适应症、用法、制造和/或警告的信息。所述试剂盒还可包括用于比较以进行诊断的颜色或荧光量表。试剂盒组分(例如，试剂)可以包装在合适的容器中。所述试剂盒还可包括使用该试剂盒的说明书。

在一些实施方案中，试剂盒还包括以安全方式收集生物样品(例如，血液、血清、血浆、尿液或其他类型的样品)的装置。在一些实施方案(例如，用于分析血液含量的实施方案)中，所述装置包括针头和安全注射器(例如鲁尔型注射器)。在一些实施方案中，实施装置包括装载弹簧的可伸缩针头和注射器。应当理解，所述装置可以是用于收集样品的任何类型的装置，所述样品可以是以下任一项：全血、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液、脑脊液(CSF)、精液、粘液、痰液、月经血、月经液、阴道粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、射精前液、恶露、发炎性分泌物、淋巴液和脓液。同样，在一些实施方案中，试剂盒不包括样品收集装置。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包括例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可包括检测可检测标记所必需的组分，例如酶或底物。试剂盒还可以包含一个对照样品或一系列对照样品，可以对所述样品进行测定并与测试样品进行比较。试剂盒的各组分可以封装在单独的容器中，且所有不同的容器可以处于一个包装中，连同解释使用所述试剂盒进行的测定的结果的说明书。本发明技术的试剂盒可以在试剂盒容器上或容器中含有书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒中包含的试剂。

在各个方面，可以从为人受试者的受试者获得样品。此外，在一些实施方案中，受试者是不同于人的哺乳动物。

定义

以下定义结合本文所公开的发明来使用。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常所理解的相同的含义。

如本文所用，“一个/种(a/an)”或“所述(the)”可以意指一个或超过一个。

另外，当与参考数字指示结合使用时，术语“约”意指参考数字指示加上或减去该参考数字指示的多至10％。例如，语言“约50”涵盖了45至55的范围。

如本文所用，在存在剂或刺激物的情况下，相对于不存在这种调节的情况如果活性和/或效果的读数减少了显著量，诸如减少了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多(最多至且包括至少约100％)，则某物“降低”。如本领域普通技术人员将理解的，在一些实施方案中，活性降低并且一些下游读数将降低但是其他读数可以增加。

相反，在存在这种剂或刺激物的情况下，相对于不存在剂或刺激物的情况如果活性和/或效果的读数增加了显著量，例如增加了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多(最直至且包括至少约100％或更多)、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍，则活性“增加”。

如本文所提及，除非另外指定，否则所有组成百分比均按总组合物的重量计。如本文所用，单词“包括”及其变型意图为非限制性的，以使得列表中的项目的详述不排除也可适用于此技术的组合物和方法的其他类似项目。类似地，术语“可以(can)”和“可(may)”以及其变型意图为非限制性的，以使得实施方案可以或可包括某些要素或特征的详述不排除不包含那些要素或特征的本发明技术的其他实施方案。

如本文所用，术语“样品”可以指可包含或不包含目标分析物的溶液、悬浮液、混合物或未稀释量的体液或其他液体。如本文所用，样品可包括水和/或缓冲液。

如本文所用，术语“体液”可以指可从个体体内分离的任何流体，且包括但不限于全血、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液、脑脊液(CSF)、精液、拭子样品(例如面颊拭子、咽喉拭子等)、粘液、痰液、月经血、月经液、阴道粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、预射精液、恶露、发炎性分泌物、淋巴液、脓液等。在一些实施方案中，体液可以更具体地指全血、血清、尿液、唾液、拭子样品、粘液或精液。在某些实施方案中，体液可以更具体地指全血、血清、尿液或唾液。在一些实施方案中，体液可包括目标分析物(例如，生物标志物)。

尽管作为诸如包括、含有或具有等术语的同义词的开放式术语“包含”在本文中用于描述并要求保护本发明，可替代地可使用诸如“由……组成”或“基本上由……组成”的替代性术语来描述本发明或其实施方案。

如本文所用，词语“优选的”和“优选地”是指本发明技术在某些情况下提供某些益处的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方案的详述并不意味着其他实施方案不是有用的，并且并不意图从本发明技术的范围内排除其他实施方案。

实施例

本文提供实施例是为了说明本发明技术的优点和益处，并进一步帮助本领域普通技术人员实践治疗本发明技术的癌症的方法。为了更充分地说明本发明技术的某些方面，本文还提供了实施例。这些实施例绝不应被解释为限制所附权利要求所定义的本发明技术的范围。这些实施例可以包括或包含上文描述的本发明技术的任何变型、方面或实施方案。上文描述的变型、方面或实施方案还可以各自包括或包含本发明技术的任何或所有其他变型、方面或实施方案的变化。

实施例1.免疫测定性能对报告物结合部分浓度的依赖性

图3示出在根据本公开的实施方案的测定中具有标签的报告物结合部分(在此实施例中，抗体)的滴定结果。显示了对于不同的报告物结合部分浓度(40pM、80pM、160pM、1nM、5nM、25nM、125nM、625nM和3.125uM)，检测到的信号(Y轴，荧光单位，MM)与目标分析物浓度(hCG，mIU/ml)(X轴)。如图3所示，约5nM的报告物结合部分浓度实现了整个报告物浓度范围的较高信号。同样如图所示，分别代表报告物结合部分160pM和1nM浓度的曲线之间的信号值有明显跳跃，而分别代表报告物结合部分1nM和5nM浓度的曲线之间的跳跃较小。图3表明，纳摩尔范围内的报告物结合部分浓度显著提高性能(即荧光强度增加)。

实施例2.免疫测定性能对报告物浓度的依赖性

图4示出了测定中报告物的滴定结果，显示非特异性和/或脱靶结合产生的信号(荧光单位，MM)随报告物(量子点)浓度的变化而变化。显示了三次重复测定以及重复测定的平均值。在此实施例中，提供最低背景(即最佳性能)的报告物浓度为20pM。图4表明，与报告物处于皮摩尔范围(0.01-0.18MM荧光单位)时相比，当报告物处于纳摩尔范围(约5MM荧光单位)时，非特异性信号(背景噪声)更大(且因此更差)。图4所示的数据是针对阴性对照样品使用黄体生成素(LH)系统获得的，该阴性对照样品应该没有或有很少LH。

实施例3：提高的检测限··

在此实施例中，使用浓度差(本文所述的“动力学工程化”方法)对针对LH的抗体对进行了分析。抗体对的KD分别为2.3pM和6.3pM(KA为4.4x10¹¹和1.6x10¹¹)。

Claims

1.一种用于检测生物样品中分析物的存在、不存在或数量的方法，所述方法包括：

(a)使所述样品与磁性缀合物接触，所述磁性缀合物包含磁性颗粒和被配置为结合所述样品中的分析物的捕获部分；

(b)使所述磁性缀合物与报告物结合部分接触，所述报告物结合部分具有与其结合的标签，所述报告物结合部分被配置为结合所述分析物；

(c)使所述磁性缀合物与报告物接触，所述报告物具有标签结合配偶体，所述标签结合配偶体被配置为结合所述标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与所述报告物缔合，其中所述报告物结合部分的浓度显著大于所述报告物的浓度；

(d)施加磁场以分离所述磁性缀合物，所述磁性缀合物任选地具有分析物，所述分析物具有与所述报告物缔合的所述报告物结合部分，所述报告物与所述报告物结合部分结合；以及

(e)基于对所述报告物产生的信号的检测，检测所述分析物的存在、不存在或水平。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述报告物结合部分的所述浓度是所述报告物的所述浓度的至少约5倍大，至少约10倍大，或至少约100倍大，或至少约1000倍大。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述报告物结合部分的所述浓度是所述报告物的所述浓度的约1000倍大。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述报告物结合部分的所述浓度是所述报告物的所述浓度的超过1000倍大。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述报告物的所述浓度在皮摩尔范围内。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述报告物的所述浓度小于约300pM。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述报告物的所述浓度为约10pM至约140pM，任选地为约40pM至约120pM。

8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述报告物的所述浓度为约20pM。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述报告物结合部分的所述浓度在纳摩尔范围内。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述报告物结合部分的所述浓度大于约1nm。

11.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述报告物结合部分的所述浓度为约1nm至约600nM。

12.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述报告物结合部分的所述浓度为约1nm至约50nM，或约1nm至约40nM，或约1nm至约30nM，或约1nm至约20nM，或约1nm至约15nM，或约1nm至约10nM，或约1nm至约5nM。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述报告物结合部分的所述浓度为约5nM。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述报告物结合部分的所述浓度为约5nM并且所述报告物的所述浓度为约20pM。

15.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述报告物包含金属芯和二氧化硅壳或所述报告物；其中所述二氧化硅壳任选地浸渍有多个量子点；并且其中所述金属芯任选地包含金。

16.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述报告物包含多个量子点。

17.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述报告物是荧光报告物、磷光报告物或比色报告物。

18.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标签包含生物素并且所述标签结合配偶体包含链霉亲和素。

19.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分析物选自由以下组成的组：人绒毛膜促性腺激素(hCG)、促黄体激素(LH)/黄体生成素、前列腺特异性抗原(PSA)、单纯疱疹病毒(HSV)抗体、雌酮-3-葡糖苷酸(E3G)、细菌、血红蛋白A1C、C反应蛋白(CRP)、炎症生物标志物、肌钙蛋白、莱姆病抗原、莱姆病抗体、LDL生物标志物、HDL生物标志物、总胆固醇生物标志物、促甲状腺激素、丙型肝炎病毒生物标志物、鼻病毒生物标志物、流感病毒生物标志物、肝功能生物标志物、雌激素、孕酮、乳酸以及它们的组合。

20.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品选自全血、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、泪液、汗液、脑脊液(CSF)、精液、粘液、痰液、月经血、月经液、阴道粘液、羊水、滑液、母乳、耳垢、射精前液、恶露、发炎性分泌物、淋巴液和脓液。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述分析物包含抗体，并且其中所述磁性缀合物的所述捕获部分包含被配置为结合所述抗体的抗原。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述报告物结合部分包含被配置为结合所述抗原的第二抗体。

23.如权利要求21所述的方法，其中所述生物样品获自受试者，并且所述方法指示所述受试者是否产生针对抗原的抗体。

24.如权利要求21所述的方法，其中所述方法提供所述样品中抗体的数量。

25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用包含磁性颗粒和被配置为结合污染物抗体和/或非抗体部分的部分的磁性缀合物对所述样品进行预处理的步骤。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述污染物抗体不针对被配置为结合相应抗体的所述抗原，或者在针对被配置为结合所述相应抗体的所述抗原产生免疫应答方面无效。

27.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法适于即时使用。

28.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法适于现场使用。

29.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法适于家庭使用。

30.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法与世界卫生组织的ASSURED(经济、灵敏、特异、易使用、快速且稳定、无需设备和可传送)标准兼容。

31.如上权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法基本上无假阳性。

32.如上权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法基本上无假阴性。

33.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中与使用固相免疫测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。

34.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法的灵敏度随着所述报告物结合部分的所述浓度的增加以及随着所述报告物的所述浓度的降低而增加。

35.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中与使用固相免疫测定的方法相比，所述方法提供降低的背景噪声。

36.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中与使用固相免疫测定的方法相比，所述方法提供增大的信噪比。

37.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中与使用以基于珠粒的流式细胞术为基础的测定、任选地是基于珠粒的基于流式细胞术的测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。

38.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中与使用侧流免疫色谱测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。

39.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中与使用所述报告物结合部分的浓度与所述报告物的浓度无显著差异的测定的方法相比，所述方法提供降低的背景噪声。

40.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中与使用所述报告物结合部分的浓度与所述报告物的浓度无显著差异的测定的方法相比，所述方法提供增大的信噪比。

41.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中与使用所述报告物结合部分的浓度与所述报告物的浓度无显著差异的测定的方法相比，所述方法提供更好的灵敏度和特异性。

42.一种用于检测生物样品中分析物的存在、不存在或数量的方法，所述方法包括：

(b)使所述磁性缀合物与报告物结合部分接触，所述报告物结合部分具有与其结合的标签，所述报告物结合部分被配置为结合所述分析物并且以约5nM的浓度存在；

(c)使所述磁性缀合物与报告物接触，所述报告物具有标签结合配偶体，所述标签结合配偶体被配置为结合所述标签，从而任选地将与所述标签结合的报告物结合部分与所述报告物缔合，其中所述报告物的浓度为约20pM；

43.一种试剂盒，所述试剂盒包括上述权利要求中任一项所述的磁性缀合物、报告物结合部分和报告物。