CN113185660B - 一种基于柱芳烃的共价有机骨架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于A1/A2‑双官能化柱[5]芳烃的共价有机骨架及其制备和在肿瘤治疗中的应用，属于医药技术领域。所述共价有机骨架A1/A2‑双官能化柱[5]芳烃和5,10,15,20‑四(4‑氨基苯基)卟啉制备得到。柱芳烃单元的富电子空腔可与含有缺电子基团的肿瘤靶向分子发生主客体络合；卟啉单元在近红外光照射时不仅能产生单线态氧，还能将近红外光的光能转变为热能，负载化疗药物，可实现COFs在肿瘤光动力治疗、光热治疗、化学协同治疗方面的应用。

Description

一种基于柱芳烃的共价有机骨架及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于A1/A2-双官能化柱[5]芳烃的共价有机骨架 及其制备和在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
抗肿瘤药物在直接递送至肿瘤组织时存在诸多的限制，如药物的不可控释放、药物分子 的稳定性和分散性较差以及缺乏靶向性。纳米药物递送系统具有较大的表面积、合适的孔径、 出色的药物负载能力和高渗透长滞留效应，可以实现有效的药物输送，在抗肿瘤纳米药物领域得到了广泛关注。迄今为止，将纳米材料应用于药物载体已被广泛研究。最近，共价有机 骨架(COFs)作为新兴的多孔纳米材料引起了越来越多的关注。2005年Yaghi首次报道了 COFs，此后，多种COFs相继出现。COFs由轻元素(H,C,N,O,B)组成，并通过强共价键连 接。其因为多孔网络的周期性而具有一些固有特性，包括低密度、高孔隙率、巨大的比表面 积、良好的结晶度、高热稳定性以及可设计的有序结构，这些特性使COFs被广泛用于气体 吸附和分离、能量存储、有机多相催化、化学/生物传感器和药物递送等方面。
作为多孔纳米材料，COFs在药物递送领域中得到了越来越广泛的应用。2015年，Qiu 合成了两种多孔聚酰亚胺COFs(PI-COFs)，然后利用其大而均匀的孔隙率和良好的稳定性实 现了布洛芬(IBU)模板分子的负载和可控释放。此后，越来越多的研究报道了将COFs用作新 型药物载体。COFs由于结构与近年来在药物递送领域广泛应用的金属有机骨架(MOF)相似， 还具有出色的载药量和可修饰性。与MOF相比，尽管COFs在生物降解和磁响应方面存在不 足，但它们在生物应用中显示出独特的优势。首先，体内和体外毒性研究表明，MOF由于其 金属络合物的性质而具有较高的生物毒性，这降低了它们的生物相容性。但是，COFs完全由 轻元素组成，在这方面没有限制。其次，MOF由弱配位键组装而成，在复杂的生理环境中其 稳定性仍然不够，而COFs由共价键组成，具有更高的稳定性。这些特性为COFs在药物递 送领域提供了广阔的应用前景。但是，COFs仍有一些局限性，例如分散性和亲水性相对较差。 因此，对作为药物载体的COFs而言，探索有效的控释方法、研究其生物相容性和抗肿瘤作用仍具有重要意义。
大环化合物，例如环糊精、冠醚，杯芳烃、葫芦素和环烷，已经成为主体-客体化学中不 可或缺的部分。柱芳烃是该领域中一类相对较新的大环化合物，其结构与杯芳烃类似，由在 对位上与亚甲基桥连接的n个对苯二酚醚或对苯二酚单元组成。自从Ogoshi及其同事于2008 年首次报道柱[5]芳烃以来，柱芳烃一直稳步发展，已在液晶、人工跨膜通道、纳米颗粒合成及感应中得到应用。在本发明中，利用交叉偶联反应合成了具有刚性支柱的A1/A2-双官能化 柱[5]芳烃P5CHO，并利用该柱芳烃与5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉(TAPP)制备了可作为药 物载体的共价且具有光热和光动力治疗效果的有机骨架(P5COFs)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基于A1/A2-双官能化柱[5]芳烃和5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉(TAPP)的共价有机骨架(P5COFs)。
本发明的另一目的是提供所述共价有机骨架P5COFs在制备肿瘤治疗药物中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于柱芳烃的共价有机骨架，其结构式如下式所示：
上述基于柱芳烃的共价有机骨架，由下式所示的A1/A2-双官能化柱[5]芳烃和5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉制备得到，
其合成路线具体如下式所示：
上述基于柱芳烃的共价有机骨架在制备肿瘤治疗药物中的应用。
叶酸(FA)是叶酸受体(FRs)高表达肿瘤细胞的靶向基团。由于叶酸和FRs之间具有很强 的结合亲和力，用叶酸修饰的纳米颗粒可以更有效地被肿瘤细胞内化。由于叶酸与FRs之间 具有很强的结合亲和力，因此叶酸修饰的纳米颗粒可以更有效地被肿瘤细胞内化。从现有研 究中得知柱[5]芳烃可以与带正电荷的客体分子(例如季铵盐客体和吡啶-1-鎓客体)络合。本 发明的一个实施例中通过多步有机合成得到吡啶鎓共轭叶酸(FA-Py)，并采用FA-Py与 P5COFs协同负载化疗药物DOX，制成药物载体P5COPs/FA-Py/DOX。由于FA-Py中含有一 个吡啶-1-鎓基团，一方面能够利用主客体相互作用与P5CHO络合，另一方面可以利用叶酸 的作用更有效被肿瘤细胞内化。
本发明中的新型共价有机骨架(P5COFs)由A1/A2-双官能化柱[5]芳烃P5CHO和5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉(TAPP)制备得到。柱芳烃单元的富电子空腔可与含有缺电子基 团的肿瘤靶向分子发生主客体络合；卟啉单元在近红外光照射时不仅能产生单线态氧，还能将近红外光的光能转变为热能，负载化疗药物，可实现COFs在肿瘤光动力治疗、光热治疗、 化学协同治疗方面的应用。
附图说明
图1为P5CHO的X射线结构图。
图2为P5COF的扫描电子显微镜图片。
图3为P5COF的投射电镜图片，其中：(a)为P5COF的透射电子显微镜图片；(b)为P5COF晶体结构域的高分辨率透射电子显微镜图像；(c)为P5COF的透射电镜映射图。
图4为P5COF的DLS图。
图5为TAPP、P5COF和P5CHO的NMR谱图。其中：(a)为TAPP的13C NMR谱(CDCl3,400MHz,RT)；(b)为P5COF的固态13C CP MAS NMR谱；(c)为P5CHO的13C NMR 谱(DMSO-d6,400MHz,RT)。
图6为DOX的紫外检测结果。其中：(a)为不同浓度DOX的紫外-可见吸收光谱(H2O,RT)；(b)为不同浓度的DOX溶液在480nm处的吸光度强度；(c)为DOX负载后上清的紫外-可见吸收度。
图7为P5COF/FA-Py/DOX在不同pH值的PBS溶液中的药物释放曲线。
图8为P5COF溶液的光热检测结果。其中：(a)为P5COF溶液和水的红外热成像图片；(b)为不同浓度的P5COF溶液在波长660nm功率密度为1W/cm2的激光下照射5分钟的温 度变化；(c)为P5COF溶液在波长660nm功率密度为1W/cm2的激光下照射五周期的光热 效果曲线。
图9为P5COF溶液的光热检测结果。其中：(a)为P5COF在功率密度为1W/cm2的660nm激光照射下的光热效应曲线；(b)为光热效应曲线冷却段的冷却时间与ln(θ)的线性 拟合。
图10为P5COF单态氧检测的ESR结果。
图11为用P5COF/FA-Py/DOX孵育HeLa细胞0、2、4、6h后的荧光图像，Hoechst 33342染色细胞核为蓝色，DOX荧光为红色。
图12为用DCFH-DA检测经不同处理后HeLa中ROS生成的荧光图像，包括：对照、P5COF/FA-Py、P5COF/FA-Py+660nm激光照射10min。
图13为不同处理对HeLa细胞的光热消融作用，包括：对照、660nm激光照射(1W/cm2) 10min、仅P5COF、仅P5COPs/FA-Py、P5COPs+660nm激光照射10min、P5COPs/FA-Py+660nm激光照射10min。
图14为用游离DOX、P5COPs/DOX、P5COPs/FA-Py/DOX和P5COPs/FA-Py/DOX加660 nm近红外激光(1W/cm2)10min培养HeLa细胞48h后的细胞存活率。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。 在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属 于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
1、A1/A2双官能化柱[5]芳烃P5CHO的合成
化合物1的合成：在250mL的圆底烧瓶中加入(4.45g,5mmol)乙氧基柱[5]芳烃和100mL 二氯甲烷，再缓慢滴加20mL硝酸铈铵水溶液(0.25M)，室温搅拌20min。反应结束后加入 饱和NaHCO3水溶液萃取，无水Na2SO4干燥有机层，减压旋转除去有机溶剂，柱层析(体积比：乙酸乙酯:石油醚＝1:80)得到化合物1。
化合物2的合成：在250mL的圆底烧瓶中加入化合物1(1g,1.2mmol)、100mL二氯甲烷和20mL连二亚硫酸钠水溶液(0.15M)，室温搅拌4h。反应结束后加入饱和NaCl水溶液 萃取，无水Na2SO4干燥有机层，减压旋转除去有机溶剂，得到化合物2。
化合物3的合成：在250mL的圆底烧瓶中加入化合物2(1g,1.2mmol)，100mL二氯甲烷和4mL吡啶，冰浴，再缓慢滴加4mL三氟甲磺酸酐，30℃过夜反应。反应结束后减压旋 转除去有机溶剂，柱层析(体积比：乙酸乙酯:石油醚＝1:50)得到化合物3。
化合物P5CHO的合成：在250mL的圆底烧瓶中加入化合物3(1.10g,1mmol)、4-甲酰基苯硼酸(0.89g,5.55mmol)、Pd(PPh3)4(180mg,0.16mmol)、30mL K2CO3水溶液(0.2M)和50mL THF，80℃反应24h。反应结束后用水(2×100mL)和盐水(100mL)洗，无水Na2SO4干燥有机层。减压旋转除去有机溶剂，柱层析(体积比：乙酸乙酯:石油醚＝1:30)得到化合 物P5CHO。
图1为P5CHO的X射线结构图。
P5CHO:White solid,45％；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:10.07(s,2H,CHO),7.76(d,J＝ 8.1Hz,4H,phH),7.20(d,J＝7.8Hz,4H,phH),7.00(s,2H,phH),6.79(d,J＝14.6Hz,4H,phH), 6.59(s,2H,phH),5.82(s,2H,phH),3.99-3.59(m,22H,CH2),3.52-3.47(m,4H,CH2),1.46-1.43 (m,7H,CH3),1.25-1.20(m,7H,CH3),1.16-1.12(m,5H,CH3),0.99-0.96(m,5H,CH3)；13C NMR (100MHz,CDCl3)δ:192.0,149.9,149.7,149.5,149.4,148.8,139.6,136.8,134.8,132.0,130.3, 129.4,129.2,128.9,128.5,127.0,114.8,114.7,114.4,114.0,77.4,77.0,76.7,63.9,63.7,63.5,63.2,58.3,39.9,32.8,29.6,29.0,18.3,15.4,15.2,15.0,14.8；IR(KBr)υ:2973,2930,1702,1604,1569, 1503,1477,1439,1407,1392 1306,1206,1111,1052,957,916,876,834,774,745,726,708,694, 669,556,514,450cm-1；MS(m/z):HRMS(ESI)Calcd.for C65H70O10Na([M+Na]+):1033.4867, found:1033.4853.
2、共价有机骨架P5COFs的合成
在带螺帽的耐热玻璃管中加入5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉(TAPP)(6.75mg,0.01mmol) 和P5CHO(20.26mg,0.02mmol)。再向该混合物中加入3mL正丁醇，1mL均三甲苯和0.1ml乙酸水溶液(6.0M)。将反应混合物超声处理五分钟，使所有反应物均匀分散。用螺帽密封反 应容器，120℃反应五天。反应结束后，离心收集沉淀，并用无水DCM和丙酮洗涤3次，然 后真空干燥，以获得深色粉末状的P5COFs。
利用粉末X射线衍射(PXRD)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、红外分光光度计(IR)以及固体核磁对所制备的P5COFs进行了详细的表征。
通过图2和图3的扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)可以看到由P5CHO和TAPP制备得到的P5COF是球形纳米颗粒，形貌规则且尺寸均一，直径约为250nm左右。 高分辨率TEM显示P5COF具有周期性的菱形骨架。透射电镜映射图像清楚地显示C、O、N 三元素在纳米球中均匀分布，其中O元素来自于P5CHO而N元素来自于TAPP，表明该纳 米球是P5CHO和TAPP反应生成的聚合物。
利用固体13C NMR对P5COF的分子结构进行研究。如图5所示，通过与P5CHO和TAPP的13C NMR谱图对比，P5COF的固体13C NMR谱图中没有峰大于140ppm，表明P5CHO上 的醛基全部都参与了反应，114.5、129.8和150.2ppm处的吸收峰是P5CHO和TAPP芳香区 的碳，119.7ppm处是卟啉单元中碳碳双键的吸收峰，15.0、30.6和51.4ppm处的吸收峰都来 自柱芳烃单元中的烷基碳。
实施例2
1、Fa-Py的合成
化合物4的合成：将1,4-二溴丁烷(10.80g,50mmol)和邻苯二甲酰亚胺钾(1.86g,10mmol) 加入到10mL DMF中，90℃反应24h。减压旋转除去有机溶剂，柱层析(体积比：乙酸乙酯: 石油醚＝1:30)得到化合物4。
化合物5的合成：将化合物4(2.81g,10mmol)溶于10mL吡啶，加热回流反应3h。待反应冷却后倒入30mL乙醚，抽滤并用乙醚(3×30mL)洗涤，得到白色固体5。
化合物6的合成：将化合物5(3.46g,10mmol)溶于30mL 40％HBr水溶液，加热回流反 应3h。待反应结束后利用冰浴将反应冷却，抽滤除去析出的固体，在滤液中加入30mL异丙 醇，离心收集固体并用异丙醇(3×30mL)洗涤，得到白色固体6。
化合物FA-Py的合成:将叶酸(441mg,1mmol)、EDCI(230mg,1.2mmol)和NHS(230mg,2mmol)加入到20mL DMSO中，50℃反应6h。再加入化合物6(310mg,1mmol)和200μL Et3N，室温反应6h。待反应结束后，抽滤除去析出的固体，在滤液中加入30mL丙酮。离心 收集固体并用丙酮(3×30mL)洗涤，得到黄色固体FA-Py。
4:White solid,85％；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):7.87-7.83(m,2H,phH),7.75-7.70 (m,2H,phH),3.73(t,J＝6.6Hz,2H,CH2),3.45(t,J＝6.3Hz,2H,CH2),1.95-1.82(m,4H,CH2).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ(ppm):168.3,134.0,132.0,123.2,77.4,77.1,76.8,36.9,32.8,29.8, 27.2.
5:White solid,90％；1H NMR(400MHz,D2O)δ(ppm):8.73(d,J＝5.7Hz,2H,ArH),8.42(t, J＝7.9Hz,1H,ArH),7.94(t,J＝7.1Hz,2H,ArH),7.64(s,4H,ArH),4.55(t,J＝7.5Hz,2H,CH2), 3.56(t,J＝6.9Hz,2H,CH2),1.98-1.90(m,2H,CH2),1.64-1.57(m,2H,CH2).13C NMR(100 MHz,D2O)δ(ppm):169.9,145.7,144.2,134.7,130.7,128.3,123.1,61.0,36.8,28.0,24.5.
6:White solid,80％；1H NMR(400MHz,D2O)δ(ppm):8.78(d,J＝6.3Hz,2H,ArH),8.46(t, J＝7.9Hz,1H,ArH),7.99(t,J＝7.0Hz,2H,ArH),4.58(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),2.98-2.94(m,2H, CH2),2.06-1.98(m,2H,CH2),1.70-1.62(m,2H,CH2).13C NMR(100MHz,D2O)δ(ppm):143.1, 141.5,125.6,58.2,36.0,24.9,20.8.
Fa-Py:White solid,87％；1H NMR(400MHz,DMSO)δ(ppm):9.13-9.04(m,2H,ArH),8.65-8.62(m,1H,ArH),8.59-8.54(m,1H,NH),8.17-8.08(m,2H,ArH),8.02-7.83(m,2H,ArH),7.66-7.57(m,2H,NH),7.46-7.27(m,2H,NH),7.00-6.90(m,2H,ArH),6.63-6.57(m,2H,ArH), 4.64-4.57(m,2H,CH2),4.45-4.46(m,2H,CH2),4.27-4.12(m,H,CH),3.11-3.01(m,2H,CH2), 2.32-2.19(m,1H,CH2),2.15-2.09(m,1H,CH2),2.05-1.86(m,4H,CH2),1.43-1.33(m,2H,CH2).13C NMR(100MHz,DMSO)δ(ppm):175.3,175.1,174.9,172.6,172.5,172.3,166.8,166.2, 161.9,156.8,155.1,155.0,154.8,151.2,151.1,148.9,148.7,145.9,145.2,145.1,129.5,129.2,128.5,128.5,128.4,122.2,121.7,111.7,111.6,60.9,60.8,53.4,53.0,46.4,40.9,40.6,40.6,40.4, 40.2,40.0,39.8,39.5,39.3,37.9,32.6,31.9,28.7,28.5,28.1,26.2,26.1,26.0.FT-IR(cm-1):3304, 3060,1633,1602,1484,1374,1296,1174,1097,945,840,822,767,681,575,511,441.
2、P5COFs/FA-Py/DOX的制备
叶酸(FA)是叶酸受体(FRs)高表达肿瘤细胞的靶向基团。由于叶酸和FRs之间具有很强 的结合亲和力，用叶酸修饰的纳米颗粒可以更有效地被肿瘤细胞内化。由于叶酸与FRs之间 具有很强的结合亲和力，因此叶酸修饰的纳米颗粒可以更有效地被肿瘤细胞内化。从现有研 究中得知柱[5]芳烃可以与带正电荷的客体分子(例如季铵盐客体和吡啶-1-鎓客体)络合。本 实施例通过多步有机合成得到吡啶鎓共轭叶酸(FA-Py)，FA-Py中含有一个吡啶-1-鎓基团，一方面能够利用主客体相互作用与P5CHO络合，另一方面可以利用叶酸的作用更有效被肿 瘤细胞内化。
具体制备过程为：将0.2mg FA-Py和5mg DOX溶于10mL PBS(pH＝7.4)，再加入10mgP5COFs，超声处理五分钟，使P5COFs均匀分散，室温搅拌24h。离心除去上清液，并用去 离子水洗涤3次，然后真空干燥，以获得深红色粉末状的P5COFs/FA-Py/DOX。
图6为DOX溶液的紫外结果，DOX在480nm处吸光度强度最大，因此选用480nm作为后续的检测波长。
图7为P5COF/FA-Py/DOX在不同pH值的PBS溶液中的药物释放结果。
图8和图9为P5COF溶液的光热条件效果。
图10为P5COF单态氧检测的ESR结果。
3、P5COFs/Fa-Py/DOX的抗肿瘤效果测试
(1)光热-光动力协同治疗和光热-光动力-化学协同治疗
将HeLa细胞接种到6孔板中(1×105个/孔)，在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。在部分孔中加入P5COPs/FA-Py分散液，继续培养4h后，用660nm激光(1W/cm2)照射细胞10min。之后，在每个孔中加入钙黄绿素/PI溶液标记活/死细胞，并用荧光显微镜记录结果。为了评估光热-光动力-化学协同治疗效果，选用不同浓度的DOX溶液和P5COPs/FA-Py/DOX溶液培养HeLa细胞4h后，用660nm激光(1W/cm2)照射细胞10min，继续培养20h，利 用MTT法检测细胞存活率。
(2)P5COPs/FA-Py/DOX的细胞吞噬和细胞内的药物释放：
将HeLa细胞接种到6孔板中(1×105个/孔)，在37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。在孔中加入P5COPs/FA-Py/DOX，37℃培养不同时间。然后，去除P5COPs/FA-Py/DOX分散 液，利用Hoechst 33342标记细胞核，并通过荧光显微镜观察细胞。
为了直接观察多功能超分子纳米材料P5COPs/FA-Py/DOX的给药效果并评价FA-Py的肿 瘤靶向能力，将HeLa细胞在P5COPs/FA-Py/DOX中进行培养，利用荧光显微镜记录了HeLa 细胞内DOX的荧光强度。在P5COPs/FA-Py/DOX中孵育2h后，HeLa细胞中出现了DOX 的红色荧光，且随着孵育时间的延长，红色荧光增强(图11)，表明P5COPs/FA-Py/DOX已 内化到细胞中。DOX的红色荧光与细胞核的蓝色荧光重叠，说明DOX从P5COPs/FA-Py/DOX 中释放进入细胞核。
2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)可被ROS快速氧化，在细胞内发出绿色荧光，因此可利用DCFH-DA作为ROS传感器通过荧光显微镜研究了肿瘤细胞中生成的1O2。如图 12所示对照组和仅用P5COPs/FA-Py孵育过的HeLa细胞显微弱的绿色荧光。相比之下，用P5COPs/FA-Py孵育过且经660nm激光(1W/cm2)照射过的HeLa细胞显示出更强的荧光，证 明了1O2的大量生产。上述实验结果表明P5COPs/FA-Py可作为光敏剂在近红外光的照射下生成1O2以参与肿瘤的光动力治疗。
通过体外肿瘤细胞实验测定了P5COPs/FA-Py对肿瘤细胞的光热-光动力协同治疗效果。 660nm激光照射HeLa细胞10min后，用钙黄绿素/PI对细胞进行染色。仅660nm激光(1W/cm2) 照射10min及P5COPs和P5COPs/FA-Py处理后的HeLa细胞活性无明显波动，说明660nm 激光不会对HeLa细胞造成创伤。相比之下，由于P5COPs/FA-Py的光热-光动力协同治疗效 果，在660nm激光(1W/cm2)照射10min后，大部分HeLa细胞都死亡了(图13)。与此同时，与P5COPs加近红外激光治疗组相比，仅有部分HeLa细胞在660nm激光照射10min后死亡。 此外，还利用MTT法测定了P5COPs和P5COPs/FA-Py对HeLa细胞的光热-光动力协同治 疗效果。实验结果显示(图14)，HeLa细胞在P5COPs和P5COPs/FA-Py分散液中孵育24h 后细胞活力均较好。但在加入660nm激光(1W/cm2)照射10min后，HeLa细胞的存活率降低， 其中P5COPs/FA-Py加近红外激光治疗组的细胞存活率仅有40.7％。上述实验结果表明经 FA-Py修饰的P5COPs/FA-Py可以更有效地被HeLa细胞内化，增强光热-光动力协同治疗效 果。

Claims (3)

1.一种基于柱芳烃的共价有机骨架，其结构式如下式所示：
2.权利要求1所述的共价有机骨架的合成方法，其特征在于，将反应物混合后加入正丁醇、均三甲苯和乙酸水溶液，超声分散后，在120℃反应五天后得到；
反应式如下式所示：
3.权利要求1所述的共价有机骨架在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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