CN109097356B - 一种基于金壳-上转换纳米颗粒手性五聚组装体的制备方法 - Google Patents

一种基于金壳-上转换纳米颗粒手性五聚组装体的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种基于金壳‑上转换纳米颗粒手性五聚组装体的制备方法，属于材料化学技术领域。本发明通过金纳米粒子的合成、金壳的合成、上转换纳米粒子的准备、金壳‑上转换手性五聚体的组装；透射电镜表征和圆二色光谱检测，将手性五聚体的形成过程进行电镜和圆二色光谱表征。本发明制备出了结构均一的金壳一上转换手性五聚体，同时，其有较高的圆二色信号，具有良好的应用前景。

Description

一种基于金壳-上转换纳米颗粒手性五聚组装体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于金壳-上转换纳米颗粒手性五聚组装体的制备方法，属于材料化学技术领域。
背景技术
近年来，对等离子体纳米材料的光学活性的研究引起了广泛的兴趣，因为它们具有可控的形状、独特的性能和生物相容性等特点，广泛应用于各个领域。在这些纳米材料中，出现越来越多的基于DNA自组装技术制备的纳米组装体，这种通过可控方式获得的新型纳米材料具有各个组成基体的光电性质，包括荧光、催化等。手性组装体已成为探测细胞内分子的新型生物传感器；此外，利用圆二色（CD）光谱对手性组装体的作用有助于细胞分化。所以，开发一种新型的具有圆二色信号的手性组装体尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于金壳-上转换纳米颗粒手性五聚组装体的制备方法，首先在金纳米粒子的表面包上一层银壳层，再将银置换出来覆盖上金壳层，形成金壳纳米粒子；金壳和上转换纳米粒子分别修饰DNA，通过杂交，形成金壳-上转换五聚体结构。通过圆二色光谱可以发现，该五聚组装体具有较强的手性。
本发明的技术方案，一种基于金壳-上转换纳米颗粒手性五聚组装体的制备方法，步骤如下：
（1）金纳米粒子的合成：采用丹宁酸还原法合成10nm的金纳米颗粒；
（2）金壳的合成：先在金纳米颗粒中加入柠檬酸钠、硝酸银和抗坏血酸溶液合成金包银纳米颗粒，再加入氯金酸溶液合成金壳纳米粒子；
（3）上转换纳米粒子的准备：由北京万德高科技发展有限公司购买；
（4）金壳-上转换手性五聚体的组装：利用DNA自组装技术合成金壳-上转换纳米颗粒手性五聚体结构；
（5）透射电镜表征和圆二色光谱检测：对合成的组装体进行电镜和圆二色光谱表征。
具体步骤如下：
（1）手性组装体的制备
a、金纳米粒子的合成：将1mL 1％的氯金酸溶液和79mL的超纯水混合制备溶液A；将4mL 1％柠檬酸钠溶液、0.1 mL 1％丹宁酸溶液和0.1 mL 25mM 的碳酸钾溶液加入到15.8mL超纯水中以制备溶液B。将溶液A和溶液B分别加热至60℃，然后在高速搅拌下将溶液B快速加入到溶液A中，A和B混合溶液在60℃下保持2h，直到颜色没有进一步变化为止，然后冷却至室温。将溶液在13000 rpm下离心10min，除去上清液，将沉淀浓缩10倍重悬于10mL10mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液中，备用。
b、金壳的合成：取上述制备好的金纳米颗粒2mL加入到20mL超纯水中，然后加入30mg柠檬酸钠和10mg硝酸银，逐滴加入1mL 2mg/mL的抗坏血酸溶液直至溶液变黄。反应完全后，将溶液以9000rpm离心10min，除去上清将沉淀重悬于10 mL 10mM Tris-HCl（pH7.5）缓冲液中，得到金包银纳米粒子。然后在剧烈搅拌下将3.5mL 1mM的氯金酸水溶液滴加到该溶液中，待溶液的颜色变为蓝紫色后，加入200μL 2mg/mL的抗坏血酸溶液。最终在9000rpm下离心10min，并重悬于2mL 10mM的Tris-HCl（pH 7.5）中。为了提高组装体的圆二色信号，将手性分子谷胱甘肽加入到溶液中，使其终浓度为5μM，反应4h后，将混合物在9000rpm下离心10min，除去上清液并将得到的沉淀重悬于10mL 10mM Tris-HCl（pH7.5）缓冲液中。
c、上转换纳米粒子的准备：由北京万德高科技发展有限公司购买，基本组成单位是NaGdF4，掺杂Yb3+，Er3+，大小为20±3nm，用浓度为10mM，pH为7.5的Tris-HCl缓冲液稀释100倍后使用。
d、金壳-上转换手性五聚体的组装：将用马来酰亚胺修饰的UCNP稀释100倍，然后用巯基修饰的单链DNA5以UCNP：DNA5的摩尔浓度比为1：5的比例混合，并在含有50mM氯化钠的10mM Tris-HCl（pH 7.5）中孵育10h进行功能化。反应结束后，在7500rpm离心10min得到纳米颗粒-DNA缀合物，并重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中。将制备好的金壳纳米粒子分别用巯基修饰的单链DNA（DNA1、DNA2、DNA 3-3和DNA4），以金壳纳米粒子：DNA以摩尔浓度为1：5的比例混合，并在含有50mM NaCl的10mM Tris-HCl（pH7.5）溶液中温育10h而进行功能化。然后将样品在9000rpm下离心10min后，吸出上清液除去溶液中未偶联上的DNA，再将沉淀重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中。
通过混合两种不同DNA修饰的金壳颗粒制备金壳二聚体，每种金壳用互补的DNA序列（DNA1和DNA2）在90℃下反应5 min并缓慢冷却至室温。然后将样品在5000 rpm下离心10min，以从溶液中除去未偶联的单个金壳颗粒，并将沉淀重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中。
通过将DNA3-3、DNA4修饰的金壳纳米粒子加入到用DNA5修饰的UCNP中，通过DNA互补杂交制备金壳-上转换三聚体，然后将DNA3-1与它们混合。将DNA混合物在90℃下加热5min，然后冷却至室温。最后，将样品以4500 rpm离心10min以除去未偶联的单个颗粒，并将沉淀重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中。将上述制备好的金壳二聚体、金壳-上转换三聚体与DNA3-2混合反应8 h组装，然后在3500 rpm离心10 min得到金壳-上转换手性五聚体。
（2）透射电镜表征和圆二色光谱检测：将手性五聚体的形成过程进行电镜和圆二色光谱表征。
所述DNA1序列如SEQ ID NO.1所示，DNA2序列如SEQ ID NO.2所示， DNA3-1序列如SEQ ID NO.3所示，DNA3-2序列如SEQ ID NO.4所示，DNA3-3序列如SEQ ID NO.5所示，DNA4序列如SEQ ID NO.6所示，DNA5序列如SEQ ID NO.7所示。具体如表1所示。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
本发明的有益效果：本发明制备出了组装产率高，性质稳定的金壳-上转换纳米颗粒手性五聚体，同时有较高的圆二色信号，具有非常好的实际应用前景。
附图说明
图1本发明的金壳形成过程和单一上转换纳米粒子的透射电镜图。
a、金纳米粒子；b、金包银纳米粒子；c、金壳纳米粒子；d、金壳上转换纳米粒子。
图2本发明的金壳-上转换纳米颗粒手性五聚体形成过程的透射电镜图。
a、金壳二聚体；b、金壳上转换三聚体；c、金壳上转换五聚体；
图3本发明中金壳-上转换纳米颗粒手性五聚体圆二色光谱的变化图。
具体实施方式
实施例1金壳-上转换手性五聚组装体的制备
所有的玻璃仪器都用王水浸泡，并用双蒸水清洗，晾干备用。实验中使用的水均为18.2 MΩ的Milli-Q超纯水。
（1）金纳米粒子的合成：将1mL 1％的氯金酸溶液和79mL的超纯水混合制备溶液A；将4mL 1％柠檬酸钠溶液、0.1mL 1％丹宁酸溶液和0.1mL 25mM的碳酸钾溶液加入到15.8mL超纯水中以制备溶液B。将溶液A和溶液B分别加热至60℃，然后在高速搅拌下将溶液B快速加入到溶液A中，A和B混合溶液在60℃下保持2h，直到颜色没有进一步变化，然后冷却至室温。将溶液在13000 rpm离心10min，除去上清液，将沉淀浓缩10倍重悬于10 mL 10mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液中，得到的金纳米粒子透射电镜照片如图1a所示。
（2）金壳的合成：取上述制备好的金纳米颗粒2mL加入到20mL超纯水中，然后加入30mg柠檬酸钠和10mg硝酸银，逐滴加入1mL 2mg/mL的抗坏血酸溶液直至溶液变黄。反应完全后，将溶液以9000rpm离心10min，除去上清将沉淀重悬于10 mL 10mM Tris-HCl（pH7.5）缓冲液中，得到金包银纳米粒子，其电镜照片如图1b所示。然后在剧烈搅拌下将3.5 mL 1mM的氯金酸水溶液滴加到该溶液中，待溶液的颜色变为蓝紫色后，加入200μL 2mg / mL的抗坏血酸溶液。最终在9000 rpm下离心10min，并重悬于2 mL 10 mM的Tris-HCl（pH 7.5）中。为了提高组装体的圆二色信号，将手性分子谷胱甘肽加入到溶液中，使其终浓度为5μM，反应4 h后，将混合物在9000 rpm离心10 min，除去上清液并将得到的沉淀重悬于10 mL 10mM Tris-HCl（pH7.5）缓冲液中，电镜照片如图1c所示。
（3）上转换纳米粒子的准备：由北京万德高科技发展有限公司购买，用浓度为10mM，pH为7.5的Tris-Hcl缓冲液稀释100倍后使用，电镜如图1d所示。
（4）金壳-上转换手性五聚体的组装：将用马来酰亚胺修饰的UCNP稀释100倍，然后用巯基修饰的单链DNA5以UCNP：DNA5的摩尔浓度为1：5的比例混合，并在含有50 mM氯化钠的10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中孵育10 h进行功能化。反应结束后，在7500 rpm离心10 min得到纳米颗粒-DNA缀合物，并重悬于1mL 10mM Tris-HCl中。
将制备好的金壳纳米粒子分别用巯基修饰的单链DNA（DNA1、DNA2、DNA 3-3和DNA4），以金壳纳米粒子：DNA以摩尔浓度为1：5的比例混合，并在含有50 mM NaCl的10 mMTris-HCl（pH7.5）溶液中温育10 h而进行功能化。然后将样品在9000 rpm离心10 min后，吸出上清液除去溶液中未偶联上的DNA，再将沉淀重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中。
通过混合两种不同DNA修饰的金壳颗粒制备金壳二聚体，每种金壳用互补的DNA序列（DNA1和DNA2）在90℃下反应5 min并缓慢冷却至室温。然后将样品在5000 rpm离心10min以从溶液中除去未偶联的单个金壳颗粒，并将沉淀重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中，电镜照片如图2a所示。
通过将DNA3-3、DNA4修饰的金壳纳米粒子加入到用DNA5修饰的UCNP中，通过DNA互补杂交制备金壳-上转换三聚体，然后将DNA3-1与它们混合。将DNA混合物在90℃下加热5min，然后冷却至室温。最后，将样品以4500 rpm离心10min以除去未偶联的单个颗粒，并将沉淀重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中，如图2b所示。
将上述制备好的金壳二聚体、金壳-上转换三聚体与DNA3-2混合反应8 h组装，然后在3500 rpm离心10 min得到金壳-上转换手性五聚体，如图2c所示，该组装体产率高、结构完整、分散性良好。
实施例2金壳-上转换手性五聚组装体的圆二色光谱检测：
将手性五聚体的形成过程进行圆二色（CD）光谱表征。从图3可以看到，单一的上转换纳米粒子和金壳纳米粒子没有CD信号，金壳二聚体和金壳-上转换三聚体的CD信号较弱，而金壳-上转换五聚体具有较强的CD信号。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
无锡迪腾敏生物科技有限公司
<120> 一种基于金壳-上转换纳米颗粒手性五聚组装体的制备方法
<141> 2018-09-07
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 210
<212> DNA
<213> DNA1序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
gcttagcagt aacgtagctg atagttaggc acagaatcgg tacagaccgt tgcggaatca 60
gctcacgatt tcctgatcct gaatgcatgc ttgatagcct aggtacaatc gcgatctaag 120
cctggactca ggtcgagcct ttggcatgaa tcgatccgat agctacgact gatgcacttc 180
agctccaatc cgtaactagc aggacgtagc 210
<210> 2
<211> 193
<212> DNA
<213> DNA2序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
cgtatgccta gtatagcaat cgatggcact agcgatgcat cagcgctgag cataatccga 60
tagcttcctt tcgaatcgtc attgcatcga ctatcaatcc gtgtcttagc catgtctggc 120
aacgccttag tcgagtgctt ttgtagagcg tgcatctgcg tacgagtgct gcatccagca 180
tgctatgcgc aac 193
<210> 3
<211> 83
<212> DNA
<213> DNA3-1序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
gatctgcttc ggataaccta ttccgccatt tgcatacgga tcatatcgtt agctaccgtg 60
atcgctttag ttacatcgat atg 83
<210> 4
<211> 103
<212> DNA
<213> DNA3-2序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
cgtagtcgcg actcgtatta ggctatcgaa ggtttgctac gtcctgctag ttacggattg 60
gagctgaagt gcatcagtcg tagctatcgg atcgattcat gcc 103
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> DNA3-3序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
cacatcgtca ctaagcagct gtgattcgac ggatacgcgt ttagttacat cgatatg 57
<210> 6
<211> 211
<212> DNA
<213> DNA4序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
gttgcgcata gcatgctgga tgcagcactc gtacgcagat gcacgctcta ccggtatagc 60
tacattgatt tctagacgaa gcctattgga taaggcggta tcgcgtatcc gtcgaatcac 120
agctgcttag tgacgatgtg tttggctcga cctgagtcca ggcttagatc gcgattgtac 180
ctaggctatc aagcatgcat tcaggatcag g 211
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> DNA5序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
catatcacct gggggagtat tgcggaggaa ggtgtaact 39

Claims (3)

1.一种基于金壳-上转换纳米颗粒手性五聚组装体的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）金纳米粒子的合成：采用丹宁酸还原法合成10nm的金纳米颗粒；
（2）金壳的合成：在金纳米颗粒中加入柠檬酸钠、硝酸银和抗坏血酸溶液合成金包银纳米颗粒，再加入氯金酸溶液合成金壳纳米粒子；
（3）上转换纳米粒子的准备：由北京万德高科技发展有限公司购买；基本组成单位是NaGdF4，掺杂Yb3+，Er3+，大小为20±3nm，用浓度为10mM，pH为7.5的Tris-HCl缓冲液稀释100倍后使用；
（4）金壳-上转换手性五聚体的组装：利用DNA自组装技术合成金壳-上转换纳米颗粒手性五聚体结构；具体步骤为：
将用马来酰亚胺修饰的UCNP稀释100倍，然后用巯基修饰的单链DNA5以UCNP：DNA5的摩尔浓度比为1：5的比例混合，并在含有50mM氯化钠的10mM Tris-HCl中孵育10h进行功能化；反应结束后，在7500rpm离心10min得到纳米颗粒-DNA缀合物，并重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中；
将制备好的金壳纳米粒子分别用巯基修饰的单链DNA，即DNA1、DNA2、DNA3-3和DNA4，以金壳纳米粒子：DNA以摩尔浓度为1：5的比例混合，并在含有50mM NaCl的10mM Tris-HCl溶液中温育10h而进行功能化；然后将样品在9000rpm离心10min后，吸出上清液除去溶液中未偶联上的DNA，再将沉淀重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中；
通过混合两种不同DNA修饰的金壳颗粒制备金壳二聚体：每种金壳用互补的DNA序列，即DNA1和DNA2，在90℃下反应5min并缓慢冷却至室温；然后将样品在5000rpm离心10min，以从溶液中除去未偶联的单个金壳颗粒，并将沉淀重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中；
通过将DNA3-3、DNA4修饰的金壳纳米粒子加入到用DNA5修饰的UCNP中，通过DNA互补杂交制备金壳-上转换三聚体，然后将DNA3-1与它们混合；将DNA混合物在90℃加热5 min，然后冷却至室温；最后，将样品以4500 rpm离心10min以除去未偶联的单个颗粒，并将沉淀重悬于1mL 10mM Tris-HCl中；
将上述制备好的金壳二聚体、金壳-上转换三聚体与DNA3-2混合反应8h组装，然后在3500 rpm离心10min得到金壳-上转换手性五聚体；
（5）透射电镜表征和圆二色光谱检测：对合成的五聚组装体进行电镜和圆二色光谱表征；
所述DNA1序列如SEQ ID NO.1所示，DNA2序列如SEQ ID NO.2所示， DNA3-1序列如SEQID NO.3所示，DNA3-2序列如SEQ ID NO.4所示，DNA3-3序列如SEQ ID NO.5所示，DNA4序列如SEQ ID NO.6所示，DNA5序列如SEQ ID NO.7所示。
2.根据权利要求1所述基于金壳-上转换纳米颗粒手性五聚组装体的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）金纳米粒子的合成：将1mL 1％的氯金酸溶液和79mL的超纯水混合制备溶液A；将4mL 1％柠檬酸钠溶液、0.1mL 1％丹宁酸溶液和0.1mL 25mM的碳酸钾溶液加入到15.8mL超纯水中以制备溶液B；
将溶液A和溶液B分别加热至60℃，然后在高速搅拌下将溶液B快速加入到溶液A中，A和B混合溶液在60℃下保持2h，直到颜色没有进一步变化，然后冷却至室温；将溶液在13000rpm离心10min，除去上清液，将沉淀浓缩10倍重悬于10mL 10mM Tris-HCl缓冲液中，备用；
（2）金壳的合成：取步骤（1）制备好的金纳米颗粒2mL加入到20mL超纯水中，然后加入30mg柠檬酸钠和10mg硝酸银，逐滴加入1mL 2mg/mL的抗坏血酸溶液直至溶液变黄；反应完全后，将溶液以9000rpm离心10min，除去上清将沉淀重悬于10 mL 10mM Tris-HCl缓冲液中，得到金包银纳米粒子；然后在剧烈搅拌下将3.5mL 1mM的氯金酸水溶液滴加到该溶液中，待溶液的颜色变为蓝紫色后，加入200μL 2mg/mL的抗坏血酸溶液；最终在9000rpm离心10min，并重悬于2mL 10mM的Tris-HCl中；为了提高组装体的圆二色信号，将手性分子谷胱甘肽加入到溶液中，使其终浓度为5μM，反应4h后，将混合物在9000rpm离心10min，除去上清液并将得到的沉淀重悬于10 mL 10mM Tris-HCl缓冲液中；
（3）上转换纳米粒子的准备：将由北京万德高科技发展有限公司购买的上转换纳米粒子，用浓度为10mM，pH为7.5的Tris-HCl缓冲液稀释100倍后使用；
（4）金壳-上转换手性五聚体的组装：将用马来酰亚胺修饰的UCNP稀释100倍，然后用巯基修饰的单链DNA5以UCNP：DNA5的摩尔浓度比为1：5的比例混合，并在含有50mM氯化钠的10mM Tris-HCl中孵育10h进行功能化；反应结束后，在7500rpm离心10min得到纳米颗粒-DNA缀合物，并重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中；
将制备好的金壳纳米粒子分别用巯基修饰的单链DNA，即DNA1、DNA2、DNA3-3和DNA4，以金壳纳米粒子：DNA以摩尔浓度为1：5的比例混合，并在含有50mM NaCl的10mM Tris-HCl溶液中温育10h而进行功能化；然后将样品在9000rpm离心10min后，吸出上清液除去溶液中未偶联上的DNA，再将沉淀重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中；
通过混合两种不同DNA修饰的金壳颗粒制备金壳二聚体：每种金壳用互补的DNA序列，即DNA1和DNA2，在90℃下反应5min并缓慢冷却至室温；然后将样品在5000rpm离心10min，以从溶液中除去未偶联的单个金壳颗粒，并将沉淀重悬于1 mL 10mM Tris-HCl中；
通过将DNA3-3、DNA4修饰的金壳纳米粒子加入到用DNA5修饰的UCNP中，通过DNA互补杂交制备金壳-上转换三聚体，然后将DNA3-1与它们混合；将DNA混合物在90℃加热5 min，然后冷却至室温；最后，将样品以4500 rpm离心10min以除去未偶联的单个颗粒，并将沉淀重悬于1mL 10mM Tris-HCl中；
将上述制备好的金壳二聚体、金壳-上转换三聚体与DNA3-2混合反应8h组装，然后在3500 rpm离心10min得到金壳-上转换手性五聚体；
（5）透射电镜表征和圆二色光谱检测：将手性五聚体的形成过程进行电镜和圆二色光谱表征。
3.根据权利要求1所述基于金壳-上转换纳米颗粒手性五聚组装体的制备方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.5。
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