CN111515410B - 一种基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法 - Google Patents

一种基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法，属于材料化学技术领域。本发明包括金纳米粒子手性三维结构的制备，即5nm金纳米粒子的合成、20nm金纳米粒子的合成、30nm金纳米粒子的合成、手性三维结构的组装；手性三维结构的构象转换和透射电镜和圆二色光谱表征。本发明能够制备出结构稳定、高产率的手性三维C30(D)S5‑C20(L)结构；当存在Fox3 mRNA时，会发生构象变化，S5从C30(D)转移到C20(L)形成C30(D)‑C20(L)S5结构，CD信号随之发生反转。

Description

一种基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法，属于材料化学技术领域。
背景技术
近年来，具有手性光学活性的纳米材料因其独特的性质而受到人们广泛的兴趣，并且应用于多种领域中，包括手性光学器件、催化剂和生物传感器等。利用DNA自组装技术制备的三维纳米结构，因为局部等离子体增强的性质，可以提高手性信号，已成为探测细胞内分子的新型生物传感器。Fox3 mRNA是神经干细胞向神经元分化的标志，对细胞水平Fox3mRNA的检测，可精确示踪细胞分化的方向，具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法，将偶联有Fox3 mRNA互补序列的金纳米颗粒与部分互补序列结合形成C30(D)S5-C20(L) 手性三维结构，当存在Fox3 mRNA序列时，组装体的结构发生改变，S5从C30(D)转移到C20(L)形成C30(D) -C20(L)S5结构。此过程可通过CD信号检测。
本发明的技术方案，一种基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法：
（1）手性三维结构的制备：
a、5nm金纳米粒子的合成：首先，将79 mL的超纯水和1 mL 1％HAuCl4溶液混合制备溶液A。将4 mL 1％的柠檬酸钠、0.42 mL 1％的单宁酸和0.1 mL 25 mM的K2CO3溶液加入15.5 mL 超纯水制得溶液B。溶液A和溶液B在缓慢搅拌下加热至60 ℃并维持20 min，在剧烈搅拌下将溶液B迅速加入到溶液A中。再将混合液在60 ℃水浴中保持2h，直到颜色不再改变为止。最后，将溶液在13000×g下离心20 min浓缩10倍，并重悬于10mM Tris-HCl（pH7.5）中备用。
b、20nm金纳米粒子的合成：在剧烈搅拌下将2.5 mL 4g/L的HAuCl4溶液和97.5mL超纯水混匀，并在350 ℃下煮沸3 min。然后在高速搅拌下加入2.6 mL 1％的柠檬酸钠溶液，剧烈搅拌10 min后，溶液的颜色从蓝色变为亮红色。保持30 min，将混合液冷却至室温，然后在7000×g下离心10 min以浓缩10倍，沉淀重悬于10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中备用。
c、30nm金纳米粒子的合成：种子的制备：将20 mL超纯水，1.47mg柠檬酸钠和0.5mL4g/L的HAuCl4溶液混合在一起，在剧烈搅拌下加入0.6mL新配的0.1M NaBH4溶液。5 min后，溶液颜色保持不变，作为种子液。生长液的制备：在剧烈搅拌下将195mL超纯水和5mL 4g/L的HAuCl4溶液混合，并加热至沸腾。在高速搅拌下加入1.5mL的种子液和800μL 1％的柠檬酸钠溶液，直至颜色不变，然后冷却至室温。将制备的溶液在5000×g下离心10 min以浓缩10倍，将沉淀重悬于10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中备用。
d、手性三维结构的组装：首先30 nm金纳米粒子和D型的半胱氨酸 (D-Cys)，以摩尔浓度比为1:1000混合，反应6 h后在5,000×g下离心10 min，得到D-Cys修饰的金纳米粒子﹙C30(D)﹚；20nm金纳米粒子和L型的半胱氨酸 (L-Cys)，以摩尔浓度比为1:1000混合，反应6h后在7000×g下离心10 min，得到L-Cys修饰的金纳米粒子(C20(L))；
在上述制备的D-Cys修饰的金纳米粒子 C30(D)中加入DNA1和DNA7以C30(D)：DNA1：DNA7的摩尔浓度比为1:100:30的比例混合，再加500μL、浓度为100mM，pH3.0的含质量浓度为0.01％的Tween 20的柠檬酸钠溶液，提高DNA的偶联率；反应12 h后，在5000×g下离心10min去除未结合的DNA并重悬在PBS缓冲液中；再以1:20的摩尔浓度比加入DNA5，将混合物在60℃水浴中温育10 min，然后冷却至37℃保持2 h。DNA功能化的金纳米颗粒在5000×g下离心10 min，然后重悬于PBS中。在L-Cys修饰的金纳米粒子 (C20(L)) 中加入DNA2和DNA8以C20(L)：DNA2：DNA8的摩尔浓度比为1:12:4的比例混合，反应12 h后，在7,000×g下离心10min去除未结合的DNA。再以1:20的摩尔浓度比加入DNA6，得到DNA6功能化的金纳米颗粒。在5nm的金纳米粒子 (S5) 中加入DNA3和DNA4以S5：DNA3：DNA4的摩尔浓度比为1：4：4的比例混合，反应12 h后，在13,000×g下离心10min去除未结合的DNA。上述DNA修饰的金纳米粒子重悬在PBS缓冲液中。将DNA功能化的C30(D)、C20(L)和S5以摩尔浓度比为1:1:100的比例混合，混合物在37℃下孵育12h，然后在3000×g下离心10min得到C30(D)S5-C20(L)三维结构。
（2）手性三维结构的构象转换：在1 mL, 浓度为50 nM的C30(D)S5-C20(L)溶液中加入终浓度为0.5 μM 的Fox3 mRNA序列，S5从C30(D)转移到C20(L)形成C30(D) -C20(L)S5结构。
（3）透射电镜和圆二色光谱表征：将手性C30(D)S5-C20(L)三维结构和其转换过程进行电镜和圆二色光谱表征。
所述DNA1序列如SEQ ID NO.1所示，DNA2序列如SEQ ID NO.2所示，DNA3序列如SEQID NO.3所示，DNA4序列如SEQ ID NO.4所示，DNA5序列如SEQ ID NO.5所示，DNA6序列如SEQID NO.6所示，DNA7序列如SEQ ID NO.7所示，DNA8序列如SEQ ID NO.8所示，Fox3 mRNA序列如SEQ ID NO.9所示。具体如表1所示。
表1
Figure 73742DEST_PATH_IMAGE001
本发明的有益效果：本发明制备出结构稳定、高产率的手性三维C30(D)S5-C20(L)结构，CD信号为负值；当存在Fox3 mRNA时，会发生构象变化，S5从C30(D)转移到C20(L)形成C30(D)-C20(L)S5结构，CD信号随之发生反转，从负值变为正值。Fox3 mRNA做为神经元分化的标志，可以有效监控细胞分化的方向，具有广泛的生物应用前景。
附图说明
图1 本发明（a）C30(D)S5–C20(L)和（b）C30(D)–C20(L)S5电镜图。
图2 本发明C30(D)S5–C20(L)和C30(D)–C20(L)S5的CD光谱图。
图3 本发明中添加0.5 μM Fox3 mRNA，C30(D)S5–C20(L)结构随时间变化电镜图。
图4 本发明中添加0.5 μM Fox3 mRNA，CD光谱随时间的变化图。
具体实施方式
实施例1 C30(D)S5–C20(L)手性三维结构的制备
所有的玻璃仪器都用王水浸泡，并用双蒸水清洗，晾干备用。实验中使用的水均为18.2 MΩ的Milli-Q超纯水。
首先30nm金纳米粒子和D型的半胱氨酸 (D-Cys)，以摩尔浓度比为1:1000混合，反应6 h后在5000×g下离心10 min，得到D-Cys修饰的金纳米粒子C30(D)；20nm金纳米粒子和L型的半胱氨酸 (L-Cys)，以摩尔浓度比为1:1000混合，反应6h后在7000×g下离心10 min，得到L-Cys修饰的金纳米粒子C20(L)。
在上述制备的D-Cys修饰的金纳米粒子 (C30(D)) 中加入DNA1和DNA7以C30(D)：DNA1：DNA7的摩尔浓度比为1:100:30的比例混合，再加500μL含0.01％Tween 20的柠檬酸钠溶液 (100mM，pH 3.0) 提高DNA的偶联率。反应12h后，在5000×g下离心10min去除未结合的DNA并重悬在PBS缓冲液中；再以1:20的摩尔浓度比加入DNA5，将混合物在60℃水浴中温育10 min，然后冷却至37℃保持2h。DNA功能化的金纳米颗粒在5000×g下离心10 min，然后重悬于PBS中。在L-Cys修饰的金纳米粒子 (C20(L)) 中加入DNA2和DNA8以C20(L)：DNA2：DNA8的摩尔浓度比为1:12:4的比例混合，反应12 h后，在7000×g下离心10 min去除未结合的DNA。再以1:20的摩尔浓度比加入DNA6，得到DNA6功能化的金纳米颗粒。在5nm的金纳米粒子(S5) 中加入DNA3和DNA4以S5：DNA3：DNA4的摩尔浓度比为1：4：4的比例混合，反应12 h后，在13,000×g下离心10min去除未结合的DNA。上述DNA修饰的金纳米粒子重悬在PBS缓冲液中。将DNA功能化的C30(D)、C20(L)和S5以摩尔浓度比为1:1:100的比例混合，混合物在37℃下孵育12h，然后在3000×g下离心10min得到C30(D)S5-C20(L)三维结构。如图1a所示，得到的C30(D)S5-C20(L)结构分散性良好、产率高、结构完整；并且在524nm处呈现负的CD信号（-63.5 mdeg，图2）。
实施例2 C30(D)S5–C20(L)手性三维结构的构象转换
在1mL, 浓度为50nM的C30(D)S5-C20(L)溶液中加入终浓度为0.5μM 的Fox3 mRNA序列，从图1b可以看到，S5从C30(D)转移到C20(L)形成C30(D) -C20(L)S5结构。同时，CD信号也随之发生变化，从负值转变为正值（37.4 mdeg，图2）。
实施例3电镜和圆二色光谱随添加Fox3 mRNA时间变化的表征
将手性C30(D)S5-C20(L)三维结构和其转换过程进行电镜和圆二色光谱表征。如图3所示，随着时间的增加，S5逐渐从C30(D)转移到C20(L)，60 min时完全转变成C30(D) -C20(L)S5结构。如图4所示，CD信号随着时间发生反转。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> DNA1 (2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
aaaaaaaaaa atggccgatg tatgt 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> DNA2(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
aaaaaaaaaa cgagtgagtg cgacg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> DNA3(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
agaggaaagt aggctaaaaa aaaaa 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> DNA4(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
ggtggcttac agtcaaaaaa aaaaa 25
<210> 5
<211> 51
<212> DNA/RNA
<213> DNA5(DNA5(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum))
<400> 5
agcctacttt cctctcauut taacaagcgt ttgcucacat acatcggcca t 51
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> DNA6(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
tgactgtaag ccacccattg aactcggtga gtcgtcgcac tcactcg 47
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> DNA7(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
caatagccct tggatagtcc aaaaaaaa 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> DNA8(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
ggactatcca agggctattg aaaaaaaa 28
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Fox3 mRNA(Fox3 mRNA(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum))
<400> 9
gagcaaacgc ttgttaaaat g 21

Claims (5)

1.一种基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）5nm金纳米粒子的合成：采用两步法合成5nm的金纳米颗粒；
（2）20nm金纳米粒子的合成：采用柠檬酸钠还原法合成20nm的金纳米颗粒；
（3）30nm金纳米粒子的合成：采用种子生长法合成30nm的金纳米颗粒；
（4）手性三维结构的制备及构象转换：利用DNA自组装技术合成手性三维结构；引入特异性识别的序列诱导构象变化；具体为：
a、按质量浓度计；首先30nm金纳米粒子和D型的半胱氨酸 D-Cys以摩尔比为1:1000混合，反应6h后在5000×g下离心10 min，得到D-Cys修饰的金纳米粒子C30(D)；20nm金纳米粒子和L型的半胱氨酸 L-Cys以摩尔比为1:1000混合，反应6h后在7000×g下离心10 min，得到L-Cys修饰的金纳米粒子C20(L)；
b、在上述制备的D-Cys修饰的金纳米粒子 C30(D)中加入DNA1和DNA7，C30(D)：DNA1：DNA7的摩尔比为1:100:30；再加500μL、浓度为100mM，pH3.0的含质量浓度为0.01％的Tween 20的柠檬酸钠溶液，提高DNA的偶联率；反应12h后，在5000×g下离心10min去除未结合的DNA并重悬在PBS缓冲液中；再以1:20的摩尔浓度比加入DNA5，将混合物在60℃水浴中温育10min，然后冷却至37℃保持2h；DNA功能化的金纳米颗粒在5000×g下离心10 min，然后重悬于PBS中；在L-Cys修饰的金纳米粒子 C20(L)中加入DNA2和DNA8，以C20(L)：DNA2：DNA8的摩尔比为1:12:4的比例混合；反应12h后，在7000×g下离心10min去除未结合的DNA；再以摩尔比1:20加入DNA6，得到DNA6功能化的金纳米颗粒；在5nm的金纳米粒子 S5中加入DNA3和DNA4，以S5：DNA3：DNA4的摩尔比为1：4：4的比例混合，反应12 h后，在13000×g下离心10min去除未结合的DNA；上述DNA修饰的金纳米粒子重悬在PBS缓冲液中；将DNA功能化的C30(D)、C20(L)和S5以摩尔比为1:1:100的比例混合，混合物在37℃下孵育12h，然后在3000×g下离心10min得到C30(D)S5-C20(L)三维结构；
构象转换：在1 mL、浓度为50nM的C30(D)S5-C20(L)溶液中加入终浓度为0.5μM的Fox3 mRNA序列，S5从C30(D)转移到C20(L)形成C30(D) -C20(L)S5结构；
（5）透射电镜和圆二色光谱表征：对合成的手性三维结构及其构象转换过程进行电镜和圆二色谱表征；
所述DNA1序列如SEQ ID NO.1所示，
DNA2序列如SEQ ID NO.2所示，
DNA3序列如SEQ ID NO.3所示，
DNA4序列如SEQ ID NO.4所示，
DNA5序列如SEQ ID NO.5所示，
DNA6序列如SEQ ID NO.6所示，
DNA7序列如SEQ ID NO.7所示，
DNA8序列如SEQ ID NO.8所示，
Fox3 mRNA序列如SEQ ID NO.9所示。
2.根据权利要求1所述基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法，其特征在于步骤（1）5nm金纳米粒子的合成，具体如下：按质量浓度计，首先，将79mL的超纯水和1mL1％的HAuCl4溶液混合制备溶液A；将4mL 1％的柠檬酸钠、0.42mL 1％的单宁酸和0.1mL25mM的K2CO3溶液加入15.5mL 超纯水制得溶液B；溶液A和溶液B在缓慢搅拌下加热至60℃并维持20min，在剧烈搅拌下将溶液B迅速加入到溶液A中；再将混合液在60℃水浴中保持2h，直到颜色不再改变为止；最后，将溶液在13000×g下离心20 min浓缩10倍，并重悬于10mMpH 为7.5的Tris-HCl缓冲液中备用。
3.根据权利要求1所述基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法，其特征在于步骤（2）20nm金纳米粒子的合成具体如下：按质量浓度计，在剧烈搅拌下将2.5mL 4g/L的HAuCl4溶液和97.5mL超纯水混匀，并在350℃下煮沸3min；然后在高速搅拌下加入2.6mL1％的柠檬酸钠溶液，剧烈搅拌10min后，溶液的颜色从蓝色变为亮红色；保持30min，将混合液冷却至室温，然后在7000×g下离心10min以浓缩10倍，沉淀重悬于10mM pH 为7.5的Tris-HCl缓冲液中备用。
4.根据权利要求1所述基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法，其特征在于步骤（3）30nm金纳米粒子的合成具体如下：按质量浓度计；
a、种子的制备：将20mL超纯水，1.47mg柠檬酸钠和0.5mL 4g/L的HAuCl4溶液混合在一起，在剧烈搅拌下加入0.6mL新配的0.1M NaBH4溶液；5 min后，溶液颜色保持不变，作为种子液；
b、生长液的制备：在剧烈搅拌下将195mL超纯水和5mL 4g/L的HAuCl4溶液混合，并加热至沸腾；在高速搅拌下加入1.5mL的种子液和800μL 1％的柠檬酸钠溶液，直至颜色不变，然后冷却至室温；将制备的溶液在5000×g下离心10 min以浓缩10倍，将沉淀重悬于10mM pH为7.5的Tris-HCl缓冲液中备用。
5.根据权利要求1所述基于金纳米粒子手性三维结构构象转换的制备方法，其特征在于步骤（5）透射电镜和圆二色光谱表征，具体如下：将手性C30(D)S5-C20(L)三维结构和其构象转换过程进行电镜和圆二色光谱表征。
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