CN110527640B - 一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法 - Google Patents
一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110527640B CN110527640B CN201810515019.8A CN201810515019A CN110527640B CN 110527640 B CN110527640 B CN 110527640B CN 201810515019 A CN201810515019 A CN 201810515019A CN 110527640 B CN110527640 B CN 110527640B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cellulose
- magnetic nanoparticles
- magnetic
- degrading bacteria
- anaerobic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 title claims abstract description 107
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 title claims abstract description 89
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 title claims abstract description 89
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 74
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 239000000835 fiber Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 claims description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 claims description 5
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 4
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N ferrosoferric oxide Chemical compound O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 241000194049 Streptococcus equinus Species 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 241000186321 Cellulomonas Species 0.000 description 6
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000029586 bacterial cell surface binding Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229910021577 Iron(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
- B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
- B01J20/24—Naturally occurring macromolecular compounds, e.g. humic acids or their derivatives
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
- B01J20/28002—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their physical properties
- B01J20/28009—Magnetic properties
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法。在磁性纳米表面包被纤维素制备纤维素化磁性纳米颗粒，细菌与纤维素化磁性纳米颗粒结合，厌氧纤维降解菌分解纤维素后脱离纤维素化磁性纳米颗粒，通过磁铁分离获得厌氧纤维降解菌，磁性纳米分离技术能够作为一种新的高效分离厌氧纤维降解菌的技术使用。本发明中富集和分离厌氧纤维降解菌的方法具有快速、分离效率高、操作方便、使用的设备价格低、对细菌的捕获效率强、对细菌的富集范围广，而不单单局限于某种细菌、灵敏度高、结果的准确性高等优点，具有工业化的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法。
背景技术
纤维素是人体或动物一种必需的营养素，而纤维素的降解是由胃肠道中厌氧纤维降解菌来完成。前期研究发现，胃肠道中厌氧纤维降解菌群多样性高且90％以上仍未被分离和培养。常见的微生物分离培养方法主要包括稀释培养法、微生物共培养法等。然而，这些方法在存在分离效率低、操作复杂、设备昂贵或缺乏群体交互作用等缺点，难以分离新的特定功能的厌氧纤维降解菌。
发明内容
为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法；
本发明的另一目的在于提供所述方法中使用的纤维素化磁性纳米颗粒的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法制备得到的纤维素化磁性纳米颗粒。
本发明的另一目的在于提供上述纤维素化磁性纳米颗粒的用途，该纤维素化磁性纳米颗粒可用于厌氧纤维降解菌的富集以及厌氧纤维降解菌的分离。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法，所述方法包括如下步骤：
向纤维素化磁性纳米颗粒中加入细菌，所述细菌中含厌氧纤维降解菌；进行混合和孵育；然后利用磁铁吸附，进行分离，得到厌氧纤维降解菌；
其中，所述纤维素化磁性纳米颗粒包括磁性纳米颗粒和包被于颗粒表面的纤维素层。
根据本发明，所述磁性纳米颗粒选自四氧化三铁纳米颗粒。
根据本发明，所述磁性纳米颗粒的平均粒径为10-30nm，例如18nm、20nm、22nm。
根据本发明，所述纤维素化磁性纳米颗粒的浓度为0.1-10mg/mL，例如8.70mg/mL、5.80mg/mL、4.35mg/mL、1.74mg/mL、0.87mg/mL、0.44mg/mL，优选为4.35-10mg/mL，进一步优选为8.70mg/mL。
根据本发明，所述细菌的浓度为(0.8-1.2)×108CFU/mL，优选为1.0×108CFU/mL。
根据本发明，所述混合的时间可以为5分钟-60小时，优选为5-15分钟，例如5分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟。
根据本发明，所述孵育的时间不超过60小时，可以为0-60小时，优选为12-60小时，例如12小时、24小时、48小时、60小时。
根据本发明，在所述混合和孵育过程中，实现了细菌的粘附、厌氧纤维降解菌分解纤维素化磁性纳米颗粒表面的纤维素以及厌氧纤维降解菌的游离。由于纤维素对细菌细胞壁有高效亲和作用，因此纤维素化磁性纳米颗粒表面可以粘附细菌。厌氧纤维降解菌对纤维素有分解作用，可使纤维素化磁性纳米颗粒表面的纤维素逐渐分解，进而厌氧纤维降解菌游离于液体环境中。
根据本发明，所述利用磁铁吸附，进行分离可以具体为：利用磁铁吸附，然后吸取上清并加入厌氧稀释液，清洗后再加入厌氧稀释液。所述清洗的次数可以为1-3次，例如1次、2次、3次。
本发明还提供一种上述方法中使用的纤维素化磁性纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将纤维素分散在碱性溶液中，得到纤维素分散液；
(2)将磁性纳米颗粒和上述纤维素分散液混合，进行反应，得到纤维素化磁性纳米颗粒，所述纤维素化磁性纳米颗粒包括磁性纳米颗粒和包被于颗粒表面的纤维素层。
根据本发明，磁性纳米颗粒和纤维素分散液的混合体系中，所述磁性纳米颗粒浓度为7-28mg/mL，优选10-25mg/mL，例如约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/mL。
根据本发明，所述磁性纳米颗粒的平均粒径为10-30nm，例如18nm、20nm、22nm。
根据本发明，所述磁性纳米颗粒的制备方法包括但不限于：将FeCl2和FeCl3的混合物在碱性条件下进行超声反应，得到磁性纳米颗粒。优选地，所述碱性条件使用的碱可以为NaOH。优选地，超声反应结束后，还包括磁分离和清洗的步骤；其中，所述磁分离步骤中磁铁捕获的时间可以为2-8分钟，例如3分钟、5分钟、7分钟；所述清洗使用的溶剂为水，例如超纯水；所述清洗优选洗至pH＝7。
根据本发明，所述纤维素分散液中的碱性溶液可以为氢氧化钠、尿素或二者的混合溶液。
根据本发明，步骤(2)中，所述反应的温度可以为室温。
根据本发明，步骤(2)中，所述反应的时间可以为5-15分钟，例如5分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟。
根据本发明，所述制备方法还包括在反应完成后，对纤维素化磁性纳米颗粒进行磁分离，清洗的步骤。其中，所述磁分离步骤中磁铁捕获的时间可以为2-8分钟，例如3分钟、5分钟、7分钟。所述清洗使用的溶剂为水，例如超纯水。所述清洗优选洗至pH＝7。
本发明中，申请人利用DNS方法对磁性纳米颗粒表面是否包被了纤维素进行了评价，见图3。图3表明磁性纳米颗粒表面成功包被纤维素。
本发明还提供使用上述制备方法制备得到的纤维素化磁性纳米颗粒，其包括磁性纳米颗粒和包被于颗粒表面的纤维素层。
本发明还提供上述纤维素化磁性纳米颗粒的用途，该纤维素化磁性纳米颗粒可用于富集和分离厌氧纤维降解菌。
本发明的机理如图1所示，具体是：本发明的纤维素化磁性纳米颗粒包括磁性纳米颗粒和包被于颗粒表面的纤维素层，其中的纤维素对细菌细胞壁有高效亲和作用，可以对细菌进行定向粘附；粘附完成后，利用厌氧纤维降解菌对纤维素的分解作用，使纤维素化磁性纳米颗粒表面的纤维素逐渐分解，直至厌氧纤维降解菌与纤维素化磁性纳米颗粒失去连接，进而游离于液体环境中，非厌氧纤维降解菌仍粘附在相应的纤维素化磁性纳米颗粒表面；磁性纳米颗粒具有超顺磁性质，在外加磁场的作用下会聚集，从而实现厌氧纤维降解菌和非厌氧纤维降解菌分离与富集。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)用磁性富集的方法相对于培养基增菌的方法更加快速，分离效率高，操作也更为方便，使用的设备价格低，节省了大量时间和人力、物力、财力。
(2)用纤维素对磁性纳米颗粒进行表面修饰后，其对细菌的捕获效率更强。所述纤维化磁性纳米颗粒的细菌结合效率达到90％以上，甚至95％以上，当细菌浓度为1.0×108CFU/mL，纤维素化磁性纳米颗粒浓度为8.7mg/mL时，细菌结合效率达到99％。细菌在纤维素化磁性纳米颗粒上稳定粘附60h时，稳定性达到80％以上，甚至85％以上，最优高达90.24％。本发明同时能实现对大量细菌的富集，而不是单单局限于某种细菌。
(3)基于qPCR的核酸检测分析方法相对于传统的分析方法更加快速，灵敏度也更高，结果的准确性也得到提高。
附图说明
图1是基于纤维素化磁性纳米颗粒对厌氧纤维降解菌进行富集和分离的方法原理图。
图2是磁性纳米颗粒的透射电镜图(A)、透射电镜图下的粒径统计(B)、磁滞回曲线图(C)、X射线衍射图的表征(D)。
图3是纤维素化磁性纳米颗粒表面纤维素定量的评价结果图。
图4是纤维素化磁性纳米颗粒与细菌结合比例与效率评价图。
图5是纤维素化磁性纳米颗粒与细菌结合稳定性图。
图6是纤维素化磁性纳米颗粒与厌氧纤维降解菌结合特异性评价图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可轻易地从商业公司获取。
实施例1
厌氧培养基的配制。所述培养基的配方为：1g葡萄糖，1g蛋白胨，6.0g/L K2HPO4,1.21g/L CaCl2,6.0g/L KH2PO4,12.0g/L NaCl,6.0g/L(NH4)2SO4,12.5g/L MgSO4·7H2O,0.5mL血红素；按所述配方准备所述组分并混合，煮沸后连续通入CO2 4小时，调整pH为6.8后，加入0.125g半胱氨酸盐酸盐后迅速盖盖。将配置好的培养基放入厌氧手套箱分装至厌氧培养管，高压灭菌121MPa，15分钟，制得所述厌氧培养基备用。
厌氧稀释液的配制。所述稀释液的配方为：6.0g/L K2HPO4,1.21g/L CaCl2,6.0g/LKH2PO4,12.0g/L NaCl,6.0g/L(NH4)2SO4,12.5g/L MgSO4·7H2O,0.5mL血红素；按所述配方准备所述组分并混合，煮沸后连续通入CO2 4小时，调整pH为6.8后，加入0.125g半胱氨酸盐酸盐后迅速盖盖。将配置好的培养基放入厌氧手套箱分装至厌氧培养管，高压灭菌121MPa，15分钟，制得所述厌氧稀释液备用。
牛链球菌(非纤维降解菌)和纤维单胞菌(纤维降解菌)的培养。牛链球菌和纤维单胞菌均为严格厌氧细菌，将实验室保存的牛链球菌和纤维单胞菌分别接种到含厌氧培养基的厌氧培养管中，37℃厌氧培养48h。
将0.4970g FeCl2和2.7030g FeCl3混合，然后逐滴加入25ml NaOH(1.0mol/L)，使用超声机超声反应30分钟，再利用永久性磁铁底部分离。吸取上清并用等体积超纯水替换，重复数次直到pH＝7，得到磁性纳米颗粒备用。对磁性纳米颗粒分别进行透射电子显微镜，磁滞回曲线，X射线衍射表征，结果见图2。从图2可见，磁性纳米颗粒平均直径20nm，磁性为3.3-24.9emu/g。
将8g纤维素溶解在400ml的碱性溶液(14g NaOH，24g尿素溶于162g水中配得)中充分混匀并在4℃过夜保存，得到纤维素分散液备用。将磁性纳米颗粒与纤维素分散液轻摇混合10分钟，使用永久性磁铁捕获5分钟，再使用超纯水清洗直至pH＝7，得到所述纤维素化磁性纳米颗粒。
实施例2
为了评价纤维素化磁性纳米颗粒表面的纤维素包被情况，取3ml纤维素化磁性纳米颗粒(17.4mg/ml)、水(阴性对照)和羟甲基纤维素钠(阳性对照,5mg/ml)，分别加入1ml纤维素酶液(1mg/ml)，50℃水浴30min，沸水浴10min，冷却至室温后，加入3ml DNS溶液，沸水浴10min，冷却至室温后定容至25ml，利用分光光度计在550nm波长下检测OD值。结果见图3，从图3可见，经过纤维素酶处理后，纤维素化磁性纳米颗粒释放出了还原糖，表明磁性纳米颗粒表面成功包被纤维素。
为了获得纤维素化磁性纳米颗粒与细菌结合的最优浓度，评价对细菌的捕获效率，分别将纤维素化磁性纳米颗粒稀释至8.70、5.80、4.35、1.74、0.87、0.44mg/mL与牛链球菌(1.0×108CFU/mL)按照体积比为5：5(总体积为1mL)混合10分钟后，放置用磁铁吸附纤维素化磁性纳米颗粒，弃液体，利用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)提取纤维素化磁性纳米颗粒吸附的细菌DNA，对牛链球菌定量，计算细菌与纤维素化磁性纳米颗粒的结合效率。结果见图4，从图4可见，随着纤维素化磁性纳米颗粒浓度的增加，牛链球菌吸附量增加，纤维素化磁性纳米颗粒浓度应至少4.35mg/ml，当纤维素化磁性纳米颗粒浓度为8.7mg/mL时，与细菌结合效率达到99％。
为了评价纤维素化磁性纳米颗粒与细菌结合的长期稳定性，将0.5mL纤维素化磁性纳米颗粒(8.70mg/mL)与0.5mL牛链球菌(1.0×108CFU/mL)结合，充分混合10分钟后利用磁铁吸附纤维素化磁性纳米颗粒，然后吸取上清并加入等体积的厌氧稀释液，清洗2次后再加入厌氧稀释液，置于4℃进行孵育，分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h通过磁铁吸附，取悬液提取DNA，对牛链球菌进行qPCR定量。结果见图5，从图5可见，随着孵育时间的增加，牛链球菌有从纤维素化磁性纳米颗粒表面脱落的趋势，孵育60h时牛链球菌从纤维素化磁性纳米颗粒上脱落了9.76％。
为了评价纤维素化磁性纳米颗粒的分离的特异性，将牛链球菌与纤维单胞菌等体积混合后取0.5mL与0.5mL纤维素化磁性纳米颗粒结合，充分混合10分钟后，使用磁铁吸取纤维素化磁性纳米颗粒，弃液体，使用等体积厌氧稀释液替换，重复操作两次，30℃培养，分别在0h、12h、24h、36h、48h、60h取悬液提取DNA，对牛链球菌(非纤维降解菌)和纤维单胞菌(纤维降解菌)进行qPCR定量。结果见图6，从图6可见，随着孵育时间的增加，纤维单胞菌(纤维降解菌)逐渐从纤维素化磁性纳米颗粒表面脱落进入溶液，而牛链球菌(非纤维降解菌)基本未从纤维素化磁性纳米颗粒表面脱落进入溶液，特异性分离纤维降解菌的效率为99.95％。
将上述产物用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技有限公司)进行DNA提取。
通过设计的引物对提取的细菌基因组进行qPCR定量。
在包被化方面，磁性纳米颗粒表面成功包被纤维素；在结合比例方面，当细菌浓度为1.0×108CFU/mL时，纤维素化磁性纳米颗粒浓度应调整至8.7mg/mL，细菌结合效率达到99％。在稳定性方面，细菌在纤维素化磁性纳米颗粒上稳定粘附60h，稳定性达90.24％，所以孵育时间优选为不超过60h。在特异性方面，纤维素化磁性纳米颗粒特异性分离厌氧纤维降解菌的效率为99.95％。
qPCR体系：
| 上游引物 | 1 |
| 下游引物 | 1 |
| TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×) | 12.5 |
| DNA模板 | 2 |
| 灭菌水 | 8.5 |
| 总共 | 25μL |
qPCR反应程序为：95℃预变性30s，95℃5s，60℃30s，72℃34s，40个循环。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (17)
1.一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
向纤维素化磁性纳米颗粒中加入细菌，所述细菌中含厌氧纤维降解菌；进行混合和孵育；然后利用磁铁吸附，进行分离，得到厌氧纤维降解菌；其中，所述纤维素化磁性纳米颗粒包括磁性纳米颗粒和包被于颗粒表面的纤维素层。
2.根据权利要求1所述富集和分离厌氧纤维降解菌的方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒选自四氧化三铁纳米颗粒。
3.根据权利要求1或2所述富集和分离厌氧纤维降解菌的方法，其特征在于，所述磁性纳米颗粒的平均粒径为10-30nm。
4.根据权利要求1或2所述富集和分离厌氧纤维降解菌的方法，其特征在于，所述纤维素化磁性纳米颗粒的浓度为0.1-10mg/mL；
所述细菌的浓度为(0.8-1.2)×108CFU/mL。
5.根据权利要求1所述富集和分离厌氧纤维降解菌的方法，其特征在于，所述混合的时间为5分钟-60小时。
6.根据权利要求1所述富集和分离厌氧纤维降解菌的方法，其特征在于，所述孵育的时间不超过60小时。
7.根据权利要求1所述富集和分离厌氧纤维降解菌的方法，其特征在于，所述利用磁铁吸附，进行分离具体为：利用磁铁吸附，然后吸取上清并加入厌氧稀释液，清洗后再加入厌氧稀释液。
8.纤维素化磁性纳米颗粒的用途，其特征在于，所述纤维素化磁性纳米颗粒用于富集和分离厌氧纤维降解菌；
所述纤维素化磁性纳米颗粒包括磁性纳米颗粒和包被于颗粒表面的纤维素层；
所述纤维素化磁性纳米颗粒通过包括以下步骤的制备方法制备得到：
(1)将纤维素分散在碱性溶液中，得到纤维素分散液；
(2)将磁性纳米颗粒和上述纤维素分散液混合，进行反应，得到纤维素化磁性纳米颗粒。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，磁性纳米颗粒和纤维素分散液的混合体系中，所述磁性纳米颗粒浓度为7-28mg/mL；
所述磁性纳米颗粒的平均粒径为10-30nm。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述磁性纳米颗粒的制备方法包括：将FeCl2和FeCl3的混合物在碱性条件下进行超声反应，得到磁性纳米颗粒。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，超声反应结束后，还包括磁分离和清洗的步骤。
12.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述纤维素分散液中的碱性溶液为氢氧化钠、尿素或二者的混合溶液。
13.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，步骤(2)中，所述反应的温度为室温；
步骤(2)中，所述反应的时间为5-15分钟。
14.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于，所述制备方法还包括在反应完成后，对纤维素化磁性纳米颗粒进行磁分离，清洗的步骤。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述磁分离步骤中磁铁捕获的时间为2-8分钟。
16.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述清洗使用的溶剂为水。
17.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述清洗洗至pH＝7。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810515019.8A CN110527640B (zh) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | 一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法 |
| US17/058,991 US12031119B2 (en) | 2018-05-25 | 2018-07-12 | Method for enriching and separating anaerobic fiber-degrading bacterium on the basis of cellulosic magnetic nanoparticles |
| PCT/CN2018/095478 WO2019223081A1 (zh) | 2018-05-25 | 2018-07-12 | 一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810515019.8A CN110527640B (zh) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | 一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110527640A CN110527640A (zh) | 2019-12-03 |
| CN110527640B true CN110527640B (zh) | 2021-01-26 |
Family
ID=68617352
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810515019.8A Active CN110527640B (zh) | 2018-05-25 | 2018-05-25 | 一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US12031119B2 (zh) |
| CN (1) | CN110527640B (zh) |
| WO (1) | WO2019223081A1 (zh) |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7329638B2 (en) * | 2003-04-30 | 2008-02-12 | The Regents Of The University Of Michigan | Drug delivery compositions |
| US7754444B2 (en) * | 2004-06-24 | 2010-07-13 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Biofunctional magnetic nanoparticles for pathogen detection |
| CN1597929A (zh) * | 2004-09-10 | 2005-03-23 | 哈尔滨益生环境技术有限公司 | 能降解秸秆类纤维素细菌的分离方法 |
| WO2008121069A1 (en) | 2007-03-29 | 2008-10-09 | Swetree Technologies Ab | Magnetic nanoparticle cellulose material |
| CN101402925A (zh) * | 2008-11-12 | 2009-04-08 | 哈尔滨工业大学 | 嗜热厌氧纤维素产氢菌的分离方法 |
| CN101789295B (zh) * | 2009-12-22 | 2012-07-04 | 湖南大学 | 金壳磁性纳米颗粒及其制备和应用 |
| EP2410061A1 (en) * | 2010-07-20 | 2012-01-25 | Wolfgang Schwarz | Artificial cellulosome and the use of the same for enzymatic breakdown of resilient substrates |
| CN101979633B (zh) * | 2010-07-29 | 2012-12-26 | 天津科技大学 | 一种Fe3O4磁性细菌纤维素球的制备方法 |
| CN102533580B (zh) * | 2010-12-22 | 2013-08-28 | 北京有色金属研究总院 | 一株高温、厌氧的纤维素分解细菌菌种和培养基及其培养产物的应用 |
| CN102517368A (zh) * | 2011-12-15 | 2012-06-27 | 河南理工大学 | 一种利用微生物降解煤以制取生物气的方法 |
| CN102424812B (zh) * | 2011-12-30 | 2013-04-10 | 黑龙江八一农垦大学 | 从纤维素分解复合菌系中分离分解纤维素的厌氧菌的方法 |
| CN103184586B (zh) * | 2011-12-31 | 2015-02-11 | 中原工学院 | 细菌纤维素纤维基纳米碳纤维的制备方法 |
| CN102533716B (zh) * | 2012-01-20 | 2013-06-12 | 安徽农业大学 | 一种用于有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球制备方法 |
| WO2013119179A1 (en) * | 2012-02-10 | 2013-08-15 | Swetree Technologies Ab | Cellulose nanofibril decorated with magnetic nanoparticles |
| CN102633872A (zh) * | 2012-03-31 | 2012-08-15 | 西安交通大学 | 一种磁性高分子水凝胶富集回收丝胶蛋白质的方法 |
| KR101523822B1 (ko) * | 2012-11-26 | 2015-05-28 | 포항공과대학교 산학협력단 | 자성 나노입자와 고점성(高粘性) 용액을 이용한 식중독균 검출방법 |
| CN103525405B (zh) * | 2013-10-21 | 2015-02-18 | 北京理工大学 | 基于天然高分子的磁性荧光双功能纳米材料及其制备方法 |
| CN105435753B (zh) * | 2014-08-29 | 2018-08-24 | 四川大学 | 一种介孔磁性高分子复合球及其制备方法与应用 |
| CN104313130B (zh) * | 2014-09-23 | 2017-10-13 | 华南师范大学 | 一种高效富集微生物的功能化磁性纳米粒子及制备与应用 |
| US20170369924A1 (en) * | 2016-06-22 | 2017-12-28 | Linda Pilarski | Method for microbial enrichment |
| WO2018064150A1 (en) * | 2016-09-29 | 2018-04-05 | The University Of Memphis Research Foundation | Microbead compositions and methods for delivering an agent |
| CN106987581A (zh) * | 2017-02-20 | 2017-07-28 | 南昌大学 | 一种蜡样芽孢杆菌快速磁分离的方法 |
| CN106967709A (zh) * | 2017-02-20 | 2017-07-21 | 南昌大学 | 抗生素修饰的磁性纳米粒子快速富集分离单增李斯特菌的方法 |
| CN106957841A (zh) * | 2017-02-20 | 2017-07-18 | 南昌大学 | 万古霉素结合聚乙二醇修饰的磁性纳米粒子快速富集分离单增李斯特菌的方法 |
| CN107354469A (zh) * | 2017-07-25 | 2017-11-17 | 马鞍山联邦机电工程有限公司 | 一种磁性海藻酸钠微球固定降解菌复合型粉末清洗剂及清洗工艺 |
| CN107746842B (zh) * | 2017-12-05 | 2022-02-11 | 天津科技大学 | 一种磁性纤维素微球固定化酶的制备方法 |
-
2018
- 2018-05-25 CN CN201810515019.8A patent/CN110527640B/zh active Active
- 2018-07-12 US US17/058,991 patent/US12031119B2/en active Active
- 2018-07-12 WO PCT/CN2018/095478 patent/WO2019223081A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20210214674A1 (en) | 2021-07-15 |
| WO2019223081A1 (zh) | 2019-11-28 |
| US12031119B2 (en) | 2024-07-09 |
| CN110527640A (zh) | 2019-12-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110538630B (zh) | 一种耐酸型油茶壳基磁性活性炭及其制备方法 | |
| AU2020102420A4 (en) | Composite material of magnetic mycelium sphere loaded with reduced graphene oxide and preparation method thereof | |
| CN102258978A (zh) | 纳米Fe3O4包覆凹凸棒土磁性复合吸附剂的制备方法 | |
| CN110283811B (zh) | 利用Fe3O4磁性纳米粒子固定溶磷菌溶解中低品位磷矿的方法 | |
| CN113713774B (zh) | 一种高效可再生的纳米除锰剂及其制备方法与应用 | |
| CN109628547B (zh) | 一种改性磁珠、制备方法及其应用 | |
| CN102745683B (zh) | 一种生物氧化石墨及其制备方法 | |
| CN112191233A (zh) | 一种用于污水处理的三维网状复合磁性材料及制备方法 | |
| CN110527640B (zh) | 一种基于纤维素化磁性纳米颗粒富集和分离厌氧纤维降解菌的方法 | |
| CN111575271A (zh) | 一种碳纳米管杂化微囊材料的制备方法和应用 | |
| CN105483110B (zh) | Fe3O4磁性纳米颗粒固定化硫碱弧菌及其脱硫工艺 | |
| CN1568367A (zh) | 非特异性富集细菌细胞的方法 | |
| CN108993425A (zh) | 一种复合型的生物吸附剂及其应用 | |
| Azevedo et al. | Morphological study of Saccharomyces cerevisiae cells treated with magnetic fluid | |
| CN101397544B (zh) | 锰氧化细菌芽孢杆菌菌株wh4及其应用 | |
| CN112296075A (zh) | 土壤重金属污染修复材料 | |
| CN115927114A (zh) | 一种亚硒酸盐还原菌及其合成纳米硒的方法与应用 | |
| CN114437999A (zh) | 一种铁还原菌群及其应用 | |
| CN108841742B (zh) | 一种耐盐碱芽孢杆菌属菌株zh-1及其制备方法和应用 | |
| KR101085104B1 (ko) | 슈와넬라 오네이덴시스 ｍｒ－１의 산화아연 나노입자 생성 | |
| CN115739042B (zh) | 一种表面修饰磁性纳米颗粒及分离水中多价噬菌体的方法 | |
| CN111208192A (zh) | 环境中磁性Fe3O4纳米颗粒分离、提取的循环富集装置及其检测方法 | |
| CN111036171A (zh) | 一种磁性粘土矿物材料及其制备方法和应用 | |
| CN103657608B (zh) | 磁性包硅酵母嫁接聚乙烯亚胺生物复合材料的制备方法及其应用 | |
| CN113862320B (zh) | 从抗生素菌渣中分离蛋白质的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |