CN1597929A

CN1597929A - 能降解秸秆类纤维素细菌的分离方法

Info

Publication number: CN1597929A
Application number: CN 200410043862
Authority: CN
Inventors: 马放; 任南琪; 吴波; 远立江
Original assignee: HARBIN YISHENG ENVIRONMENT TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HARBIN YISHENG ENVIRONMENT TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2004-09-10
Filing date: 2004-09-10
Publication date: 2005-03-23

Abstract

能降解秸秆类纤维素细菌的分离方法，它涉及一种从土壤中分离秸秆类纤维素降解菌中细菌的方法。本发明是这样实现的：a.将赫奇逊无机盐固体培养基倒在无菌平皿中，待培养基凝固后在上面放一张灭菌后的草纸，然后用移液管吸取赫奇逊无机盐液体培养基润湿草纸，取筛好的土粒进行点种，点种后放培养箱中保湿培养，采用平板划线法分离和纯化菌苔；b.把菌苔放入含有玻璃珠的生理盐水中，进行无菌稀释，吸取稀释菌液到赫奇逊无机盐平板上摇匀后，在平板上加盖一张无菌滤纸，保湿培养；c.将初筛分离的单株菌分别接入三角瓶中进行液体发酵实验，从中选出产糖量相对高的菌。本发明可以高效率筛选出降解纤维素的细菌，它具有工艺简单、成本低的优点。

Description

能降解秸秆类纤维素细菌的分离方法

技术领域：

本发明是一种从土壤中分离秸秆类纤维素降解菌的方法。

背景技术：

由于世界人口的迅猛增加和人类对有限能源的利用与破坏，开发利用新的、可再生的能源已引起了世界各国科学家的重视。纤维素是地球表面最丰富的可利用的再生有机资源，绿色植物纤维素原料再生速度快，它占植物界碳含量的50％以上。纤维素是植物的支持组织，是植物细胞壁的重要成分，它是由β-1.4葡萄糖苷键所连接成的长链，每个纤维素分子中大约含一万个以上的葡萄糖残基。由于纤维素具有水不溶性的高度结晶构造，其外围又被木质素层包围着，要把它水解成小分子物质是有一定困难的。我国是一个资源十分紧张的国家，土地少，人口多，人畜争粮的矛盾非常突出。另外，不少发酵产品都是以粮食为底物。要保持我国工农业的可持续性发展，必须解决好粮食问题，降低生产成本，开发更廉价的原材料。从能源和资源的角度来看，植物纤维是一种可再生的清洁能源和资源。可是目前，大部分植物纤维都被当作柴火烧掉了。这样做是燃烧不完全的，热值底，造成严重的浪费；二是对环境造成了严重污染。所以，开发利用这种物质具有深远的意义和现实价值。现在世界各地已经有不少人开始研究天然可再生的有机资源。

发明内容：

本发明的目的是提供一种工艺简单、低成本的能降解秸秆类纤维素细菌的分离方法，该方法是这样实现的：a、富集驯化：将赫奇逊无机盐固体培养基倒在无菌平皿中，待培养基凝固后在上面放一张灭菌后的草纸，然后用移液管吸取赫奇逊无机盐液体培养基润湿草纸，取筛好的土粒进行点种，点种后放培养箱中30℃～50℃保湿培养6～7天，从出现透明圈的土粒周围挑取菌苔，采用平板划线法纯化菌苔；b、初筛：把上述被纯化的菌苔放入含有玻璃珠的生理盐水中，在120～160转的摇床上摇2～5个小时，然后进行无菌稀释，稀释到1～10个菌/ml，吸取稀释菌液到赫奇逊无机盐平板上摇匀后，在平板上加盖一张无菌滤纸，30℃～50℃保湿培养5～7天，长出的菌落再进行稀释培养2～3次；c、复筛：称取1～2g羧甲基纤维素、100～200ml赫奇逊无机盐液体培养基加入三角瓶中，调pH＝7.0～7.5，在120～130℃灭菌10～20min，将初筛分离的单株菌分别接入三角瓶中进行液体发酵实验，每天测其产糖量变化，跟踪10天，从中选出产糖量相对高的菌。细菌产生的纤维素酶多为胞内酶，在纤维素刚果红培养基上并不会产生明显的透明圈，不易于鉴别分离，而霉菌产生的纤维素酶多是胞外酶，利用纤维素刚果红培养基进行分离就是很好的办法。本方法以草纸和滤纸直接作为植物纤维素降解菌中细菌的分离的唯一碳源，通过反复富集驯化、初筛和复筛，可以高效率筛选出能降解纤维素，同时又能产生还原糖的菌株，使产酶和酶水解可以在同一体系中完成。降解后的产物再用作其他发酵产品的原料，使秸秆类纤维素从生物的角度实现资源化和能源化。此方法只是在原来传统的方法的基础上进行了改进，操作比较简单，费用花费小，一般的微生物实验室都可完成。此方法分离出的细菌比传统方法分离的霉菌具有以下两点优势：(1)生长速度快，纤维素降解时间短；(2)以往多数的研究都集中在霉菌纤维素酶的提取与结构分析上，产酶与酶水解是分开进行的，而本发明分离的细菌可使产酶和酶水解在同一体系中进行。此方法分离出来的细菌直接利用纤维素产生还原糖，这样就可省去酶提取这一步，从而减少了工艺，也节约了研究费用，又避免了酶活在提取中的部分丧失，具有很好的应用价值。本发明分出的纤维素降解菌已经在微生物絮凝剂的研究中进行了试验，取得了很好的应用效果。

具体实施方式：

具体实施方式一：本实施方式是这样实现的：a、富集驯化：将赫奇逊无机盐固体培养基倒在无菌平皿中，待培养基凝固后在上面放一张灭菌后的草纸，然后用无菌移液管吸取赫奇逊无机盐液体培养基润湿草纸，取筛好的土粒进行点种，点种后放培养箱中30℃～50℃保湿培养6～7天，从出现透明圈的土粒周围挑取菌苔，采用平板划线法分离和纯化菌苔；b、初筛：把上述被纯化的菌苔放入含有玻璃珠的生理盐水中，在120～160转的摇床上摇2～5个小时，然后进行无菌稀释，稀释到1～10个菌/ml，吸取稀释菌液到赫奇逊无机盐平板上摇匀后，在平板上加盖一张无菌滤纸，30℃～50℃保湿培养5～7天，长出的菌落再进行稀释培养2～3次；c、复筛：称取1～2g羧甲基纤维素、100～200ml赫奇逊无机盐液体培养基加入三角瓶中，调pH＝7.0～7.5，在120～130℃灭菌10～20min，将初筛分离的单株菌分别接入三角瓶中进行液体发酵实验，每天测其产糖量变化，跟踪10天，从中选出产糖量相对高的菌。所述赫奇逊无机盐固体培养基是这样制备的：称取0.5～5g KH₂PO₄、0.1～0.5g CaCl₂、0.1g NaCl、0.1～1g MgSO₄·7H₂O、1.0～5g NaNO₃、0.01～0.05gFeCl₃、15～20g琼脂，然后加入1000ml蒸馏水，调节pH＝7.0～7.2，在121℃蒸汽灭菌20min。所述赫奇逊无机盐液体培养基是这样制备的：称取0.5～5g KH₂PO₄、0.1～0.5g CaCl₂、0.1g NaCl、0.1～1g MgSO₄·7H₂O、1.0～5gNaNO₃、0.01～0.05g FeCl₃，然后加入1000ml蒸馏水，调节pH＝7.0～7.5，在121℃蒸汽灭菌20min。

具体实施方式二：本实施方式是这样实现的：

a、富集驯化：(1)把取自四川成都市、黑龙江省七台河市、东北农业大学、哈尔滨工业大学的土壤进行风干，取20目和40目筛子个一只，把20目筛子放上面，两筛子落在一起，把土壤倒在20目筛子上筛土，取两筛中间的土壤备用；(2)称取1.0g KH₂PO₄、0.1g CaCl₂、0.1g NaCl、0.3g MgSO₄·7H₂O、2.5g NaNO₃、0.01g FeCl₃、18g琼脂，然后加入1000ml蒸馏水，调节pH＝7.0～7.2，在121℃蒸汽灭菌20min得到赫奇逊无机盐固体培养基，赫奇逊无机盐液体培养基不加琼脂，其余配方相同；(3)把上述赫奇逊无机盐固体培养基倒在无菌平皿中，待培养基凝固后在上面放一张灭菌后的草纸，然后用无菌1ml移液管吸取1ml赫奇逊无机盐液体培养基润湿草纸，取筛好的土粒进行点种，每皿均匀点9个土粒，点种后放培养箱中30℃保湿培养，每天观察土粒周围变化情况，2～3天可见有菌生长，6～7天时土粒周围的草纸被降解，出现一透明圈，有个别土粒周围有霉菌生长，这样的土粒不再用于下一步的分离。从出现透明圈的土粒周围挑取菌苔在赫奇逊无机盐平板上划线，然后盖一层灭菌草纸，在加1ml赫奇逊无机盐液体培养基润湿草纸，待草纸上有透明圈出现，再重复划线2～3次。这是一个驯化的过程，使能降解秸秆类纤维素的细菌被进一步纯化出来。

b、初筛：分别把上述被纯化的菌苔挑取1～2环到100ml待有玻璃珠的生理盐水中(每瓶同时加灭菌的土温80两滴，目的是使菌团能被充分打散)，放在140转的摇床上摇3个小时，然后进行无菌稀释，稀释到1～10个菌/ml，吸取1ml稀释菌液到赫奇逊无机盐平板上，把稀释菌液摇匀后，在平板上加盖一张无菌滤纸，30℃保湿培养7天，长出的菌落再进行稀释培养2～3次就可完成分离工作了，在初筛中采用玻璃珠打散稀释法与传统的划线法易于使菌株分离，因为纤维素降解菌中的细菌都比较粘稠，滤纸本身具有吸附性，很难通过划线把它们分纯。

c、复筛：取250ml三角瓶，称取1.5g羧甲基纤维素加入其中，再加入赫奇逊无机盐液体培养基150ml，调pH＝7.2，121℃灭菌20min。初筛分离的单株菌分别接入三角瓶中进行液体发酵实验，每天测其产糖量变化，跟踪10天，从中选出产糖量相对高的菌。

通过此法筛选的菌具有很高的纤维素降解能力，降解后的产物还原糖含量可达1.65g/L，从而说明纤维素降解菌中的一些细菌可以让产酶和酶水解在同一体系进行。经筛选过的菌株已在生物絮凝剂的两段式发酵中得到了很好的应用。

Claims

1、能降解秸秆类纤维素细菌的分离方法，其特征在于它是这样实现的：

a、富集驯化：将赫奇逊无机盐固体培养基倒在无菌平皿中，待培养基凝固后在上面放一张灭菌后的草纸，然后用无菌移液管吸取赫奇逊无机盐液体培养基润湿草纸，取筛好的土粒进行点种，点种后放培养箱中30℃～50℃保湿培养6～7天，从出现透明圈的土粒周围挑取菌苔，采用平板划线法分离和纯化菌苔；b、初筛：把上述被纯化的菌苔放入含有玻璃珠的生理盐水中，在120～160转的摇床上摇2～5个小时，然后进行无菌稀释，稀释到1～10个菌/ml，吸取稀释菌液到赫奇逊无机盐平板上摇匀后，在平板上加盖一张无菌滤纸，30℃～50℃保湿培养5～7天，长出的菌落再进行稀释培养2～3次；c、复筛：称取1～2g羧甲基纤维素、100～200ml赫奇逊无机盐液体培养基加入三角瓶中，调pH＝7.0～7.5，在120～130℃灭菌10～20min，将初筛分离的单株菌分别接入三角瓶中进行液体发酵实验，每天测其产糖量变化，跟踪10天，从中选出产糖量相对高的菌。

2、根据权利要求1所述的能降解秸秆类纤维素细菌的分离方法，其特征在于所述赫奇逊无机盐固体培养基是这样制备的：称取0.5～5g KH₂PO₄、0.1～0.5gCaCl₂、0.1gNaCl、0.1～1gMgSO₄·7H₂O、1.0～5gNaNO₃、0.01～0.05gFeCl₃、15～20g琼脂，然后加入1000ml蒸馏水，调节pH＝7.0～7.2，在121℃蒸汽灭菌20min。

3、根据权利要求1所述的能降解秸秆类纤维素细菌的分离方法，其特征在于所述赫奇逊无机盐固体培养基是这样制备的：称取1.0gKH₂PO₄、0.1gCaCl₂、0.1gNaCl、0.3gMgSO₄·7H₂O、2.5gNaNO₃、0.01gFeCl₃、18g琼脂，然后加入1000ml蒸馏水，调节pH＝7.0～7.2，在121℃蒸汽灭菌20min。

4、根据权利要求1所述的能降解秸秆类纤维素细菌的分离方法，其特征在于所述赫奇逊无机盐液体培养基是这样制备的：称取0.5～5g KH₂PO₄、0.1～0.5gCaCl₂、0.1gNaCl、0.1～1gMgSO₄·7H₂O、1.0～5gNaNO₃、0.01～0.05g FeCl₃，然后加入1000ml蒸馏水，调节pH＝7.0～7.5，在121℃蒸汽灭菌20min。

5、根据权利要求1所述的能降解秸秆类纤维素细菌的分离方法，其特征在于所述赫奇逊无机盐液体培养基是这样制备的：称取1.0gKH₂PO₄、0.1gCaCl₂、0.1gNaCl、0.3gMgSO₄·7H₂O、2.5gNaNO₃、0.01gFeCl₃，然后加入1000ml蒸馏水，调节pH＝7.0～7.5，在121℃蒸汽灭菌20min。