CN107779424A - 一种以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法及其应用，以自然干燥的秸秆为菌源样品，加入富集培养基，在富集过程中以滤纸条为纤维素降解指示物，待培养基内指示物崩解，形成菌群，即为稳定的秸秆降解菌系，通过上述方式，本发明能够有效地筛选到秸秆降解菌系。

Description

一种以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法及其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法及其应用。
背景技术
我国是农业大国，每年有大量作物秸秆被闲置或焚烧，不仅浪费资源，也造成了严重的空气污染。秸秆还田不但可以有效增加土壤有机质、提高土壤肥力和改善土壤结构，而且在一定程度上还解决了农用废弃物的再利用及环境污染问题。但是，因富含纤维素的秸秆在还田土壤中腐解缓慢并影响下茬作物的耕作，秸秆还田的方式不易被广大农户所接受，推广亦困难。
秸秆降解菌系可以加快还田秸秆的腐解，为秸秆还田方式的推广和实施带来希望。目前，市场上的秸秆降解菌系多是由几种纯菌复配而成的复合菌系，菌种来源不同，菌种之间的协同作用效果欠佳，撒施到还田秸秆中后秸秆腐解的效果并不理想。近年来，许多研究以腐烂秸秆、腐烂落叶、朽木、烂草、动物粪便、堆肥、锯末、食用菌栽培下脚料、麦田土、树林土、多年秸秆还田土壤、菜园土、草原土等多种样品为菌源，以秸秆为目标降解物，经驯化和富集培养得到了多组秸秆降解菌系，这类菌系组成菌种在天然环境中经长期自然选择和进化，菌种间已能相互适应，因而能协同发挥降解作用，降解效果亦较好。但多数研究可能忽略了秸秆本身携有秸秆降解菌的现象，因而很少有研究以自然干燥的秸秆为菌源筛选秸秆降解菌或菌系。以秸秆为菌源筛选的该类秸秆降解菌系因其来源于秸秆本身的土著菌，在制备成降解菌系后施用到该类秸秆上进行秸秆降解是时不会受到秸秆自身的土著菌的拮抗，因而秸秆降解会更快。以自然腐烂的秸秆为菌源亦是常规的秸秆降解菌系筛选方法，秸秆在自然腐烂过程中，其中的降解菌系菌种组成在不断地发生变化，在样品采集过程中不易采集到降解活力最强时的菌系。
发明内容
本发明目的在于提供一种以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法，以自然干燥的秸秆为菌源样品，加入富集培养基，在富集过程中以滤纸条为纤维素降解指示物，待培养基内指示物崩解，形成菌群，即为稳定的秸秆降解菌系。
所述富集培养基配方为每升培养基中含有下列成分：K2HPO4 1.0-3.0g，(NH4)2SO41.0-3.0g，NaNO3 1.0-3.0g，MgSO4·7H2O 0.5-1.5g,FeSO4·7H2O 0.01-0.05g,,KCl 0.5-1.5g,丙酮酸钠0.3-1.2g,酵母浸出粉0.5-1.5g,蛋白胨0.5-1.5g,可溶性淀粉0.5-1.5g,秸秆粉5-10g,D-山梨醇0.5-1.5g,微量元素混合液1-3ml,钙溶液1-3ml，滤纸条2张，调pH值7.0～7.5。
所述培养富集培养基中的微量元素混合液配方如下(g/L)：ZnSO4·7H2O 1.5-3.5g，CoCl2·6H2O 0.15-0.50g，Na2MoO4·2H2O 0.10-0.50g，MnSO4 ·H2O 1.5-3.0g，CuSO4·5H2O 0.15-0.35g，H3BO3 0.3-0.12g，NiCl2·6H2O 0.06-0.15g，KI 0.06-0.15g；所述钙溶液为CaCl2的水溶液，浓度为3％。
进一步的说，所述筛选方法具体为：
1)采集自然干燥的秸秆样品，加入至含有以滤纸条作为纤维素降解指示物的富集培养基中，进行富集培养；
2)待富集培养物中的滤纸条崩解时，将富集培养物转接到新鲜的含有以纤维素降解作为指示物的滤纸条的富集培养基中，进行传代培养，如此传代培养，直至出现在连续5代以上的传代培养中，每一代均能将培养基中的滤纸条于15天以内崩解的培养物即为稳定的秸秆降解菌系。
所述样品秸秆是成熟农作物在收获籽实后剩余的茎叶(穗)部分，收获后自然干燥、未经腐烂的样品；其中农作物为水稻、玉米、麦类作物、豆类作物、油菜、棉花、高粱等。所述秸秆粉为样品秸秆自然干燥并粉碎后过40目筛，待用。
一种以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法所获得菌系，以自然干燥的秸秆为菌源样品，加入富集培养基，在富集过程中以滤纸条为纤维素降解指示物，待培养基内指示物崩解，形成菌群，即为稳定的秸秆降解菌系。
所述富集培养基配方为每升培养基中含有下列成分：K2HPO4 1.0-3.0g，(NH4)2SO41.0-3.0g，NaNO3 1.0-3.0g，MgSO4·7H2O 0.5-1.5g,FeSO4·7H2O 0.01-0.05g,,KCl 0.5-1.5g,丙酮酸钠0.3-1.2g,酵母浸出粉0.5-1.5g,蛋白胨0.5-1.5g,可溶性淀粉0.5-1.5g,秸秆粉5-10g,D-山梨醇0.5-1.5g,微量元素混合液1-3ml,钙溶液1-3ml，滤纸条2张，调pH值7.0～7.5。
所述培养富集培养基中的微量元素混合液配方如下(g/L)：ZnSO4·7H2O 1.5-3.5g，CoCl2·6H2O 0.15-0.50g，Na2MoO4·2H2O 0.10-0.50g，MnSO4 ·H2O 1.5-3.0g，CuSO4·5H2O 0.15-0.35g，H3BO3 0.3-0.12g，NiCl2·6H2O 0.06-0.15g，KI 0.06-0.15g；所述钙溶液为CaCl2的水溶液，浓度为3％。
进一步的说，菌系的获得：
1)采集自然干燥的秸秆样品，加入至含有以滤纸条作为纤维素降解指示物的富集培养基中，进行富集培养；
2)待富集培养物中的滤纸条崩解时，将富集培养物转接到新鲜的含有以纤维素降解作为指示物的滤纸条的富集培养基中，进行传代培养，如此传代培养，直至出现在连续5代以上的传代培养中，每一代均能将培养基中的滤纸条于15天以内崩解的培养物即为稳定的秸秆降解菌系。
所述样品秸秆是成熟农作物在收获籽实后剩余的茎叶(穗)部分，收获后自然干燥、未经腐烂的隔年样品；其中农作物为水稻、玉米、麦类作物、豆类作物、油菜、棉花、高粱等。所述秸秆粉为样品秸秆自然干燥并粉碎后过40目筛，待用。
所述以秸秆为菌源的秸秆降解菌系、菌系的培养物或培养物离心沉淀在作为降解菌系中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明针对以待降解的目标作物秸秆为菌源，具体是采用在不同地域采集的大量同种作物自然干燥的秸秆样品，以秸秆自身作为样品菌源进行富集和驯化，能够在此种条件下生存的菌群，即为以秸秆为菌源秸秆降解菌系，该种筛选方法快速、大量，所得菌系来源于秸秆本体，该菌系制备成菌剂后再施用到秸秆上时，不会受到秸秆本身携带土著菌的拮抗，对于秸秆的腐解是有益的。相比采集腐烂秸秆为菌源，腐烂的秸秆样本较少，不易大量采集，且采集的时间点不易把握，较难采集到降解活力最强时的菌群。而本发明采集的是自然干燥的秸秆样本，该类样本量大，可以大量采集，且在富集驯化过程中，可通过培养基中的降解指示物滤纸条的崩解情况来采取降解活力最佳时的菌群进行传代培养，如此，可以提高降解菌系的筛选成功率。因此，本发明对于筛选秸秆降解菌系是快速有效的，且成功率亦较高，降解效果亦较好。
附图说明
图1为本发明实施例提供的初步筛选到的水稻秸秆降解菌系图。
图2为本发明实施例提供的筛选获得降解菌系对水稻秸秆的降解效果图。
图3为本发明实施例提供的筛选获得降解菌系对水稻秸秆的降解效果实物图。
图4为本发明实施例提供的不同降解菌系对黑龙江讷河水稻秸秆的降解图。
图5本发明实施例提供的不同降解菌系对辽宁丹东水稻秸秆的降解图。
图6本发明实施例提供的不同降解菌系对湖北潜江水稻秸秆的降解图。
具体实施方式
下面结合实施例记载的方式对本发明作进一步的解释说明。
实施例1
水稻秸秆降解菌系的筛选
1)样品采集
秋季，于东北三省采集自然干燥的水稻秸秆样品36个，采样点介于东经123—125°之间，由南至北分别是丹东、沈阳、双辽、前郭、龙江、讷河及嫩江七个地区。采集往年干燥的稻草(含水率＜10％)并放入无菌袋内密封保存。水稻秸秆样品信息见表1。
表1水稻秸秆样品信息表
2)富集培养
选取上述获得的每个水稻秸秆样品中完整的水稻秸秆3根，将上述不同样品分别剪成3cm的小段放入含有100ml富集培养基的250ml三角瓶中，瓶中加入2条1cm*5cm的滤纸作为降解指示物，25℃静置培养，等到瓶中的滤纸条变软、断裂及最后崩解无形时证明瓶中以纤维素酶为代表的三素酶(纤维素、半纤维素、木质素)活性较高，秸秆降解菌系已经形成。取5ml培养物转接入新鲜的含有2条1cm*5cm的滤纸作为降解指示物的富集培养基中进行传代培养，如此传代培养直至连续5代以上滤纸条在每代培养过程中的崩解时间稳定(该实施例传代培养15次)。
所述每次传代培养条件相同即为含有100ml富集培养基的250ml三角瓶中，瓶中加入2条1cm*5cm的滤纸作为降解指示物，25℃静置培养；每次传代培养均是在滤纸条崩解之后进行转接传代，在传代培养过程中滤纸崩解的时间越来越短，直至连续5次以上，并在每次传代培养过程中滤纸条均能于15天以内崩解，此时的培养物即确定为稳定的秸秆降解菌系。
所述滤纸的成分是100％天然纤维素，滤纸在纤维素酶的作用下的降解过程是滤纸条变软、滤纸条组织变松散、滤纸条断裂成碎片、滤纸条崩解无形。
3)秸秆降解菌系确定
经过12个月的传代培养，将连续5代以上均能将培养基中的滤纸条于15天以内崩解的培养物确定为稳定的秸秆降解菌系。最后筛选出7个培养物即秸秆降解菌系能在15天内使滤纸条崩解(参见图1)。
如图1所示，三角瓶中的培养物即为以自然干燥的秸秆样品为菌源的秸秆降解菌系。菌系编号分别是D12、D04、D36、D02(DCO2)、D08、D09、D26，菌源分别来自对应的水稻秸秆样品(见表1)。
实施例2
玉米秸秆降解菌系的筛选
1)样品采集
秋季，于东北三省采集自然干燥的玉米秸秆样品36个，采样点介于东经123—125°之间，由南至北分别是丹东、沈阳、双辽、前郭、齐齐哈尔、大庆、讷河、嫩江及呼伦贝尔9个地区。采集自然干燥的玉米秸秆(含水率＜10％)放入无菌袋内密封保存。玉米秸秆样品信息见表2。
表2玉米秸秆样品信息表
2)富集培养
每个玉米秸秆样品剪成1cm的小段，称取3克放入含有100ml富集培养基的250ml三角瓶中，瓶中加入2条1cm*5cm的滤纸作为降解指示物，25℃静置培养，等到瓶中的滤纸条变软、断裂及最后崩解无形时证明瓶中以纤维素酶为代表的三素酶(纤维素、半纤维素、木质素)活性较高，秸秆降解菌系已经形成。取5ml培养物转接入新鲜的含有2条1cm*5cm的滤纸作为降解指示物的富集培养基中进行传代培养，如此传代培养直至滤纸条在每代培养过程中的崩解时间稳定。将连续5代以上均能将培养基中的滤纸条于15天以内崩解的培养物确定为稳定的秸秆降解菌系(该实施例传代培养10次)。
所述每次传代培养条件相同即为含有100ml富集培养基的250ml三角瓶中，瓶中加入2条1cm*5cm的滤纸作为降解指示物，25℃静置培养。
所述滤纸的成分是100％天然纤维素，滤纸在纤维素酶的作用下的降解过程是滤纸条变软、滤纸条组织变松散、滤纸条断裂成碎片、滤纸条崩解无形。
3)秸秆降解菌系确定
经过7个月的传代培养，将连续5代以上均能将培养基中的滤纸条于15天以内崩解的培养物确定为稳定的秸秆降解菌系。最后由自然干燥玉米秸秆样品富集并筛选出菌系能在11天内使滤纸条崩解的培养物为稳定的秸秆降解菌系，且均为连续5代以上崩解时间稳定。最后筛选出5个培养物即秸秆降解菌系均能在11天内使滤纸条崩解,菌系编号分别是404、1104、402、01、301，菌源分别来自对应的玉米秸秆样品(见表2)。
实施例3
秸秆降解菌系对水稻秸秆的降解效果研究
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1供试土壤
供试土壤采集于中国科学院沈阳应用生态研究所沈阳生态实验站，试验用地原位表层土壤(0-20cm)。将土壤样品剔除石砾和植物根系，过2cm筛后，备用。
1.1.2供试秸秆
供试秸秆于秋季采集于中国科学院沈阳应用生态研究所沈阳生态实验站。水稻收获后，采集其地上部分，自然干燥后剪成2-3cm长的小段，备用。
1.1.3供试秸秆降解菌系
供试菌系DC02为实施例1筛选出秸秆降解菌系。
1.2试验设计
本试验在春季进行，试验地块为长、宽、高为1.5m×1.5m×0.3m的小区，共5个小区，分布方式为W形分布。试验共2个处理，每个处理5次重复。
称取10.00g自然干燥的秸秆，处理组喷施菌系DC02 7.5mL，对照组喷施等体积无菌水，搅拌混匀后，装入长、宽为20cm×15cm，孔径为0.150mm(100目)的尼龙网袋中。将尼龙网袋竖直放入试验小区中，网袋周围用土壤填充后，在上方覆盖5cm的土壤。
在试验期间，试验样地正常进行水稻耕种。试验开始后，分别在第1、2、3、5个月取样1次，取出尼龙网袋中的秸秆样品，用清水洗净，在85℃过夜烘至恒重，测其干重，并计算其失重率。
2.试验结果
在水稻自然生长条件下，处理组与空白组的水稻秸秆失重率变化的情况如图2所示以及降解菌系对水稻秸秆的降解效果实物图如图3所示。
由图2中可见在第1个月，处理组和对照组的秸秆失重率均有较大提高，在第2个月有明显上升趋势，在第3个月后秸秆失重率的上升速度有所减缓。在第1、2、3、5个月，处理组的水稻秸秆失重率分别为26.8％、62％、70％和73％，比对照组的水稻秸秆失重率分别高9.2％、7％、7.6％和8.5％。由上述结果可见秸秆降解菌系可明显加快秸秆的降解。
实施例4秸秆降解菌系对不同来源水稻秸秆的降解效果研究
1.材料与方法
1.3材料
1.1.4供试秸秆
供试自然干燥秸秆分别采集于辽宁丹东、黑龙江讷河、湖北潜江，剪成1-2cm长的小段，备用。
1.1.5供试菌系
供试菌系D04和D36为实施例1中筛选自辽宁丹东和黑龙江嫩江县的水稻秸秆降解菌系，供试菌系HD12是按照本发明方法筛选自湖北潜江的水稻秸秆降解菌系。
1.1.6培养基
CRS培养基：K2HPO4 1.0g，NaNO3 1.0g，FeSO4·7H2O 0.01g，丙酮酸钠0.3g，蛋白胨0.5g，(NH4)2SO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，酵母浸出粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，D-山梨醇0.5g，1000mL水，添加SL10微量元素液和钙溶液终浓度均为0.1％。
SL10微量元素液：ZnSO4·7H2O 1.5g，CoCl2·6H2O 0.15g，Na2MoO4·2H2O 0.1g，MnSO4·H2O 1.5g，CuSO4·5H2O 0.15g，H3BO3 0.3g，NiCl2·6H2O 0.06g，KI 0.06g。
钙溶液：3％CaCl2溶液。
1.4试验设计
将100mL CRS培养基，分装至250mL三角瓶中，并加入2条滤纸条，121℃灭菌20分钟。精确称取三种供试秸秆1.00g，按下表所示，在无菌条件下加至三角瓶中，并将三种秸秆降解菌系D04、D36和HD12以3％的分别接种至三角瓶中，25℃条件下静置培养，分别在第2、4、6、8周取样，用清水洗净秸秆，在85℃过夜烘至恒重，测其干重，并计算其失重率，每个处理三次重复(参见下表)。
如图4所示，采用三种菌系分别降解辽宁丹东秸秆，秸秆失重率在第4周起呈D04>HD12>D36趋势，菌系D04降解秸秆，在第4、第8周的失重率分别为约50.5％和58％，比菌系HD12降解的秸秆失重率分别高约12％和10.5％，比菌系D36降解的秸秆失重率分别高约19％和10％，可见采用本发明筛选的菌系与对照相比，降解同源水稻秸秆的效果要好于异源的水稻秸秆。
如图5所示，采用三种菌系分别降解黑龙江嫩江秸秆，秸秆失重率在第4周起呈D36>D04>HD12趋势，菌系D36降解秸秆，在第8周的失重率为约55％，比菌系D04和菌系HD12降解的秸秆失重率分别高约3％和10％。
如图6所示，采用三种菌系分别降解湖北潜江的水稻秸秆，秸秆失重率在第2周起呈HD12>D36>D04趋势，菌系HD12降解秸秆，在第2、第4、第8周的失重率分别为约47％、48.5％和57％，比菌系D36降解的秸秆失重率分别高约5.5％、6％％和1.5％，比菌系D04降解的秸秆失重率分别高约6.5％、6.5％和1％。
上述实验结果表明，秸秆降解菌系对相同来源的水稻秸秆的降解效果是最好的。

Claims (10)

1.一种以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法，其特征在于：以自然干燥的秸秆为菌源样品，加入富集培养基，在富集过程中以滤纸条为纤维素降解指示物，待培养基内指示物崩解，形成菌群，即为稳定的秸秆降解菌系。
2.按权利要求1所述的以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法，其特征在于：所述富集培养基配方为每升培养基中含有下列成分：K2HPO4 1.0-3.0g，(NH4)2SO4 1.0-3.0g，NaNO31.0-3.0g，MgSO4·7H2O 0.5-1.5g,FeSO4·7H2O 0.01-0.05g,,KCl 0.5-1.5g,丙酮酸钠0.3-1.2g,酵母浸出粉0.5-1.5g,蛋白胨0.5-1.5g,可溶性淀粉0.5-1.5g,秸秆粉5-10g,D-山梨醇0.5-1.5g,微量元素混合液1-3ml,钙溶液1-3ml，滤纸条2张，调pH值7.0～7.5。
3.按权利要求2所述的以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法，其特征在于：所述培养富集培养基中的微量元素混合液配方如下(g/L)：ZnSO4·7H2O 1.5-3.5g，CoCl2·6H2O0.15-0.50g，Na2MoO4·2H2O 0.10-0.50g，MnSO4·H2O 1.5-3.0g，CuSO4·5H2O 0.15-0.35g，H3BO3 0.3-0.12g，NiCl2·6H2O 0.06-0.15g，KI 0.06-0.15g；
所述钙溶液为CaCl2的水溶液，浓度为3％。
4.按权利要求1-3任意一项所述的以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法，其特征在于：
1)采集自然干燥的秸秆样品，加入至含有以滤纸条作为纤维素降解指示物的富集培养基中，进行富集培养；
2)待富集培养物中的滤纸条崩解时，将富集培养物转接到新鲜的含有以纤维素降解作为指示物的滤纸条的富集培养基中，进行传代培养，如此传代培养，直至出现在连续5代以上的传代培养中，每一代均能将培养基中的滤纸条于15天以内崩解的培养物即为稳定的秸秆降解菌系。
5.按权利要求4所述的以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法，其特征在于：所述样品秸秆是成熟农作物在收获籽实后剩余的茎叶(穗)部分，收获后自然干燥、未经腐烂的样品；所述秸秆粉为样品秸秆自然干燥并粉碎后过40目筛，待用。
6.一种权利要求1所述的以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法所获得菌系，其特征在于：以自然干燥的秸秆为菌源样品，加入富集培养基，在富集过程中以滤纸条为纤维素降解指示物，待培养基内指示物崩解，形成菌群，即为稳定的秸秆降解菌系。
7.按权利要求6所述的以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法所获得菌系，其特征在于：所述富集培养基配方为每升培养基中含有下列成分：K2HPO4 1.0-3.0g，(NH4)2SO4 1.0-3.0g，NaNO3 1.0-3.0g，MgSO4·7H2O 0.5-1.5g,FeSO4·7H2O 0.01-0.05g,,KCl 0.5-1.5g,丙酮酸钠0.3-1.2g,酵母浸出粉0.5-1.5g,蛋白胨0.5-1.5g,可溶性淀粉0.5-1.5g,秸秆粉5-10g,D-山梨醇0.5-1.5g,微量元素混合液1-3ml,钙溶液1-3ml，滤纸条2张，调pH值7.0～7.5。
8.按权利要求6或7所述的以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法，其特征在于：
1)采集自然干燥的秸秆样品，加入至含有以滤纸条作为纤维素降解指示物的富集培养基中，进行富集培养；
2)待富集培养物中的滤纸条崩解时，将富集培养物转接到新鲜的含有以纤维素降解作为指示物的滤纸条的富集培养基中，进行传代培养，如此传代培养，直至出现在连续5代以上的传代培养中，每一代均能将培养基中的滤纸条于15天以内崩解的培养物即为稳定的秸秆降解菌系。
9.按权利要求8所述的以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法，其特征在于：所述样品秸秆是成熟农作在收获籽实后剩余的茎叶(穗)部分，收获后自然干燥、未经腐烂的样品；所述秸秆粉为样品秸秆自然干燥并粉碎后过40目筛，待用。
10.按权利要求6所述的以秸秆为菌源筛选秸秆降解菌系的方法所获得菌系的应用，其特征在于：所述以秸秆为菌源的秸秆降解菌系、菌系的培养物或培养物离心沉淀在作为降解菌系中的应用。
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