CN105994379A - 基于放线菌的种子包衣剂及其制备方法和包衣方法 - Google Patents

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Abstract

本发明具体公开了一种基于放线菌的种子包衣剂及其制备方法和包衣方法。该种子包衣剂包括放线菌菌剂和胶结剂；其中，放线菌菌剂的有效成分为娄彻氏链霉菌D74和/或密旋链霉菌SG712100，胶结剂为羧甲基纤维素钠。其制备方法为：挑取活化好的娄彻氏链霉菌D74和/或密旋链霉菌SG712100的斜面培养物，分别接种到已灭菌的固态培养基中，静置培养，干燥后粉碎。其包衣方法为：将胶结剂加入待包衣种子中搅拌，再将放线菌菌剂加入到表面布满胶结剂的待包衣种子中搅拌，最后置于阴凉处风干。本发明种子包衣剂通用性好，可刺激农作物根系发育，提高产量，未添加农药成分，对人畜安全和环境无危害，包衣方法简单，投入产出比大。

Description

基于放线菌的种子包衣剂及其制备方法和包衣方法
技术领域
本发明涉及农用微生物制剂技术领域，具体涉及一种基于放线菌的种子包衣剂及其制备方法和包衣方法。
背景技术
种子包衣是指在农作物或其它植物种子表面包裹的膜状物，由成膜材料和具有防虫防病及促生作用的有效成分组成，成膜材料和有效成分统称为包衣剂。进行农作物种子包衣的主要目的在于防治农作物地下虫害与土传病，促进种子萌发、根系发育及幼苗健康生长。现有种子包衣剂中的主要有效成分为化学杀虫剂、杀菌剂、微量无机元素及植物激素等化学成分，以有益微生物为有效成分的种子包衣剂很少，仅有芽孢细菌用于包衣剂的报道，尚无以放线菌为有效成分的用于农作物生产的种子包衣剂。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种以放线菌活菌作为有效成分的种子包衣剂及其制备方法和包衣方法。该种子包衣剂的有效成分为放线菌活性孢子，可在根系分布区土壤及根系表面土壤中定殖，能显著刺激农作物根系生长、提高作物的光合效率，大幅度提高作物产量；通用性好；未添加化学农药，对人畜和环境无害；包衣方法操作简单，投入产出比大，具有重要的应用价值。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。
(一)一种基于放线菌的种子包衣剂，其特征在于，包括放线菌菌剂和胶结剂；其中，所述放线菌菌剂的有效成分为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)D74和/或密旋链霉菌(Streptomyces pactum)SG712100，所述胶结剂为羧甲基纤维素钠。
所述娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)D74，于2016年3月14日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016123，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌珞珈山，邮编430072；其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
所述密旋链霉菌(Streptomyces pactum)SG712100，于2009年4月7日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 209066，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌珞珈山，邮编430072；其16S rDNA序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：
所述放线菌菌剂的有效成分为放线菌娄彻氏链霉菌D74和/或密旋链霉菌SG712100的粉状活菌制剂。
(二)所述基于放线菌的种子包衣剂的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：挑取活化好的娄彻氏链霉菌D74和/或密旋链霉菌SG712100的斜面培养物，分别接种到已灭菌的固态培养基中，28℃静置培养8d，40℃减压干燥后粉碎，即得所述放线菌娄彻氏链霉菌D74和/或密旋链霉菌SG712100的粉状活菌制剂。
优选地，所述基于放线菌的种子包衣剂的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：挑取活化好的娄彻氏链霉菌D74和密旋链霉菌SG712100的斜面培养物，分别接种到已灭菌的固态培养基中，28℃静置培养8d，40℃减压干燥后粉碎，再按2∶1～1∶2的质量比混匀，即 得所述放线菌娄彻氏链霉菌D74和密旋链霉菌SG712100的粉状活菌制剂。
(三)所述基于放线菌的种子包衣剂的包衣方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将胶结剂加入待包衣种子中搅拌，使种子表面均匀布满胶结剂；(2)将放线菌菌剂加入到表面已布满胶结剂的待包衣种子中搅拌，使种子表面均匀粘附放线菌菌剂，置于阴凉处风干，备用。
优选地，步骤(1)中，所述粘结剂为6g/L的羧甲基纤维素钠溶液。
优选地，步骤(1)中，所述粘结剂的用量为40～60ml/kg，其中，以待包衣种子的质量为基准量。
优选地，步骤(2)中，所述放线菌菌剂为固态发酵制备的活菌孢子粉，用平皿培养法测定的活菌数为1×109～9×109CFU/g。
优选地，步骤(2)中，所述放线菌菌剂的用量为种子质量的1.5％～3.0％。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明引入新的微生物技术，以具有防病促生多种功能的放线菌活菌孢子为种子包衣剂的有效成份，并且未添加其它农药成分；放线菌菌剂可显著促进农作物根系发育，增强农作物的光合作用，促进农作物生长及发育进程，提高农作物的抗病性和抗旱性，进而提高农作物产量；同时，所用多功能放线菌来源于土壤，是从土壤中通过特定方法筛选的具有拮抗土传病害病原菌、刺激农作物根系发育、提高作物抗病抗逆性等多种功能的有益微生物，是土壤中本来就存在的微生物。因此，本发明的种子包衣剂在促进作物生长、提高产量的同时，不会对人畜和环境产生危害和污染。另外，该包衣剂中主要有效成分还有以下显著特点：在干燥状态下可长时间保持有效性；用量少，投入产出比大，使用方便，对玉米、小麦等农作物的增产效果尤为明显。
附图说明
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为基于放线菌的种子包衣剂处理后灌浆期玉米次生根系的生长状况。其中，(1)为毕公村试验区玉米表层次生根生长情况图；(2)为毕公村试验区玉米中层次生根生长情况图；(3)为毕公村试验区玉米底层次生根生长情况图；(4)为元树村试验区玉米表层次生根生长情况图；(5)为元树村试验区玉米中层次生根生长情况图；(6)为元树村试验区玉米底层次生根生长情况图。
图2为基于放线菌的种子包衣剂处理后毕公村小区灌浆期玉米开花及授粉图。其中，(1) 为毕公村试验区基于放线菌的种子包衣剂处理后的雄花情况图；(2)为毕公村试验区对照组的雄花情况图；(3)为毕公村试验区基于放线菌的种子包衣剂处理后的雌花情况图；(4)为毕公村试验区对照组的雌花情况图。
图3为毕公村试验点基于放线菌的种子包衣剂处理与对照灌浆期玉米籽粒的生长情况图。其中，图左为包衣剂处理与对照的玉米果穗生长情况图，图右为包衣剂处理与对照的玉米籽粒生长情况图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域的技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
一种基于放线菌的种子包衣剂，包括6g/L的羧甲基纤维素钠溶液和放线菌菌剂；其中，放线菌菌剂为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)D74和密旋链霉菌(Streptomyces pactum)SG712100的混合菌剂，其粉状活菌制剂的制备方法为：挑取活化好的娄彻氏链霉菌D74和密旋链霉菌SG712100的斜面培养物，分别接种到已灭菌的固态培养基(成分公知)中，28℃静置好氧培养8d，40℃减压干燥后粉碎，过筛，再按1∶1质量比混匀即可。其中，娄彻氏链霉菌D74和密旋链霉菌SG712100的斜面培养物的获取，即将娄彻氏链霉菌D74和密旋链霉菌SG712100接种到高氏一号(成分公知)斜面培养基中，培养获得。
上述基于放线菌的种子包衣剂的包衣方法，按以下步骤进行：(1)将6g/L的羧甲基纤维素钠溶液加入待包衣玉米种子中搅拌，使种子表面均匀布满胶结剂，其中，以待包衣玉米种子的质量为基准量，羧甲基纤维素钠溶液的用量约为50ml/kg；(2)将放线菌菌剂加入到籽粒表面布满液态胶结剂的待包衣玉米种子中搅拌，使种子表面均匀粘附放线菌菌剂，置于阴凉处风干，备用。其中，放线菌菌剂的活菌数为1×109～9×109CFU/g。
本实施例的试验地点为陕西省咸阳市杨陵区毕公村(正大12号)和元树村(华农138)，均为陕西关中灌区，属小麦收获后播种的夏玉米。
试验方案：设对照组(常规种植，不用放线菌包衣剂)和基于放线菌的种子包衣剂处理后的种子种植两种处理，每个处理重复3个小区。毕公村试验，小区面积为8.4×5.0＝42.0m2，株距46cm，行距60cm，密度为2286株/亩，用点播器人工播种，播种深度为7cm，每小区留苗150株，2014-06-12播种；元树村试验，小区面积5.4×2.6＝14m2，株距、行距均为40cm，密度为4169株/亩，播种机播钟，播种深度约8cm，每小区留苗90株，2014-06-10播种。
试验结果：
(1)基于放线菌的种子包衣剂对玉米生物学特性的影响
表1 基于放线菌的种子包衣剂处理后小区玉米的生物学特性
注：同一试验点同行数据后不同小写字母表示菌剂包衣处理与对照组的差异达到显著水平(P＜0.05)。
基于放线菌的种子包衣剂处理(以下简称“菌剂包衣”)后小区玉米的生物学特性如表1。由表1可以看出，基于放线菌的种子包衣剂对玉米生长有明显促进作用。在灌浆期，毕公村基于放线菌的种子包衣剂处理后植株总重、茎叶鲜重及根系重分别较对照提高了28.0％、29.3％及31.6％；元树村基于放线菌的种子包衣剂处理后玉米茎叶鲜重、地径分别较对照提高13.6％、9.3％，与对照组差异均达到显著水平(P＜0.05)。在收获期，毕公村基于放线菌的种子包衣剂处理后植株总重、地径分别较对照提高10.4％、13.3％，元树村基于放线菌的种子包衣剂处理后植株总重、茎叶鲜重、株高及地径分别较对照提高14.7％、14.9％、11.1％及5.0％，与对照组差异均达到显著水平(P＜0.05)。
基于放线菌的种子包衣剂处理后小区玉米灌浆期穗位叶性状如表2所示。由表2可知，基于放线菌的种子包衣剂对灌浆期玉米叶片生长有促进作用。毕公村基于放线菌的种子包衣剂处理后玉米穗位叶片鲜重及干重分别较对照增加45.0％及34.7％；元树村基于放线菌的种子包衣剂处理后玉米穗位叶片干重、长度及叶片绿色度分别较对照增加9.5％、4.3％及5.3％，与对照组差异均达到显著水平(P＜0.05)。
表2 菌剂包衣处理后小区玉米灌浆期穗位叶性状(n＝9片)
注：同一试验点同行数据后不同小写字母表示菌剂包衣处理与对照组的差异达到显著水平(P＜0.05)。
(2)基于放线菌的种子包衣剂对玉米次生根系发育的影响
由图1和表3可以看出，基于放线菌的种子包衣剂对灌浆期玉米根系发育有促进作用。毕公村基于放线菌的种子包衣剂处理后玉米表层次生根的吸收根条数较对照提高30.2％，中层次生根的根系总干重、吸收根干重及吸收根条数分别较对照提高98.3％、122.3％及36.9％，底层次生根的数量较对照提高了26.6％。元树村基于放线菌的种子包衣剂处理后灌浆期的玉米吸收根条数较对照增加60.6％(P＜0.05)，基于放线菌的种子包衣剂处理根系其他指标虽有一定程度增加，但与对照的差异均未达到显著水平(P＞0.05)。此外，元树试验点有些次生根的根系参数呈现基于放线菌的种子包衣剂处理小于对照的现象，但差异均未达到显著水平(P＞0.05)。收获期基于放线菌的种子包衣剂处理根系各种指标与对照的差异与灌浆期类似。
表3 菌剂包衣处理后小区玉米次生根系数量和重量
注：同一试验点同行数据后不同小写字母表示菌剂包衣处理与对照组的差异达到显著水平(P＜0.05)。
(3)基于放线菌的种子包衣剂对玉米光合特性的影响
由表4可以看出，基于放线菌的种子包衣剂处理对灌浆期玉米叶片的光合特性有一定影响。其中，毕公村基于放线菌的种子包衣剂处理玉米叶片的净光合速率、蒸腾速率及单叶水分利用率分别较对照增加13.6％、22.4％及6.5％，元树村基于放线菌的种子包衣剂处理玉米叶片的胞间CO2浓度和蒸腾速率分别较对照增加16.6％和15.5％，两个试验点以上指标处理与对照的差异均达到显著水平(P＜0.05)，其余指标对照与菌剂处理差异不显著(P＞0.05)。
表4 基于放线菌的种子包衣剂处理后小区灌浆期玉米穗位叶光合作用特征(n＝9株)
注：同一试验点同列数据后不同小写字母表示菌剂包衣处理与对照组的差异达到显著水平(P＜0.05)。
(5)基于放线菌的种子包衣剂对玉米叶片诱导酶活性的影响
由表5看出，基于放线菌的种子包衣剂处理对灌浆期玉米穗位叶片诱导酶活有一定影响。其中，毕公村基于放线菌的种子包衣剂处理玉米穗位叶片的多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解酶(PAL)酶活性分别较对照增加15.3％和6.2％，元树村基于放线菌的种子包衣剂处理玉米叶片的过氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)酶活性分别较对照增加4.4％和17.4％，以上差异均达到显著水平(P＜0.05)。多酚氧化酶(PPO)酶活性的提高对玉米抗病性提高具有重要作用。
表5 基于放线菌的种子包衣剂处理后灌浆期玉米穗位叶诱导酶活性(n＝9株)
注：同一试验点同列数据后不同小写字母表示菌剂包衣处理与对照组的差异达到显著水平(P＜0.05)。
(6)基于放线菌的种子包衣剂对玉米果穗的影响
由表6看出，毕公村基于放线菌的种子包衣剂处理对玉米果穗发育及产量有一定影响。其中，毕公村试验点，灌浆期基于放线菌的种子包衣剂处理玉米单个果穗鲜重较对照增加20.8％(P＜0.05)；收获期基于放线菌的种子包衣剂处理玉米穗周长、穗长度及穗鲜重与对照差异均达到显著水平(P＜0.05)，穗干重及穗粒重较对照分别增加10.0％及10.1％，含水量较对照降低4.8％，百粒重较对照增加6.2％，基于放线菌的种子包衣剂处理与对照差异均达到显著水平(P＜0.05)，但基于放线菌的种子包衣剂处理与对照出籽率无显著差异(P＞0.05)。收获期，毕公试验点，小区玉米穗总鲜重及平均穗鲜重较对照分别增加19.5％及15.7％(P＜0.05)，穗个数增加8.1％，但与对照差异不显著(P＞0.05)。基于放线菌的种子包衣剂处理小区实收产量较对照显著增加，其中，实收穗鲜重增加24.3％，亩产籽粒干重增加25.3％。元树村试验点各项参数与毕公试验点类似，其中，实收穗鲜重及亩产籽粒干重分别较对照增加16.4％及19.1(P＜0.05)。
表6 基于放线菌的种子包衣剂处理后小区玉米果穗穗参数及产量
注：同一试验点同行数据后不同小写字母表示菌剂包衣处理与对照组的差异达到显著水平(P＜0.05)。
(7)基于放线菌的种子包衣剂对玉米生育进程的影响
图2为基于放线菌的种子包衣剂处理后毕公村小区灌浆期玉米开花及授粉图。由图可以看出，毕公村基于放线菌的种子包衣剂处理后玉米的抽雄及吐丝时间提前。
图3为基于放线菌的种子包衣剂处理后毕公村灌浆期玉米籽粒的生长情况图。表7为基于放线菌的种子包衣剂处理后毕公村灌浆期玉米籽粒的重量与含水量。由图3和表7可以看出，基于放线菌的种子包衣剂对毕公村灌浆期玉米籽粒灌浆程度有显著影响。其中，基于放线菌的种子包衣剂处理玉米百粒鲜重、百粒干重及单穗籽粒重较对照分别增加了32.5％、83.1％及98.7％，籽粒含水量降低36.1％，基于放线菌的种子包衣剂处理与对照差异均达到显著水平(P＜0.05)。
表7 菌剂包衣处理后毕公小区灌浆期区玉米籽粒重量与含水量(n＝3穗)
注：同一试验点同行数据后不同小写字母表示菌剂包衣处理与对照组的差异达到显著水平(P＜0.05)。
(8)基于放线菌的种子包衣剂对玉米籽粒品质的影响
由表8看出，基于放线菌的种子包衣剂处理对玉米籽粒的蛋白质和淀粉含量均无显著影响。
表8 菌剂包衣处理后小区玉米籽粒品质(n＝3)
注：同一试验点同行数据后相同小写字母表示菌剂包衣处理与对照组的差异未达到显著水平(P＞0.05)。
由本实施例试验结果可以看到，利用基于放线菌的种子包衣剂对玉米种子进行包衣处理，可较大幅度提高玉米产量，增产的主要原因如下：①基于放线菌的种子包衣剂可以促进玉米根系发育。总根量增加及具有吸收功能的须根数量的增加将大幅度提高玉米对土壤中养分和水分的吸收利用能力，为玉米其它器官的生长及高产奠定了基础。②基于放线菌的种子包衣剂可以增强玉米光合作用。玉米叶片光合能力增强是产量提高的直接原因。③基于放线菌的种子包衣剂对玉米的穗性状有显著影响。④基于放线菌的种子包衣剂可以促进玉米生长及发育进程，促进玉米抽雄及吐丝时间提前。⑤基于放线菌的种子包衣剂可提高玉米的抗病性。多酚氧化酶(PPO)活性的显著提高对提高玉米的抗病性具有重要作用。⑥基于放线菌的种子包衣剂对玉米植株的水分生理有一定影响。试验表明，在相同的生态条件下，基于放线菌的种子包衣剂处理玉米叶片的持水及保水能力较强，这表明基于放线菌的种子包衣剂可以提高玉米的抗旱性。基于放线菌的种子包衣剂处理与对照组的玉米籽粒蛋白质及淀粉含量基本相同，表明基于放线菌的种子包衣剂在提高玉米产量的同时并未降低玉米籽粒的营养品质。另外，本发明的相关研究发现，基于放线菌的种子包衣剂中的放线菌可产生多种次级代谢产物，其中已经确定的活性物质有4种：娄彻氏链霉菌的代谢产物中发现吲哚-3-乙酸及6-苄基嘌呤，密旋链霉菌的代谢产物中存在激动素及脱落酸，前 3种激素与根系及茎叶的生长促进有关，表示生长发育进程的玉米抽雄及吐丝时间提前及抗逆性增强与脱落酸产生有关。基于放线菌的种子包衣剂中的放线菌剂均为链霉菌，除具有促生作用外，还具有广谱抗病作用，对多种能引起植物根系病害的病原菌有较强抗性。
本实施例是本发明基于放线菌的种子包衣剂对玉米的促生情况，其对小麦等其它农作物同样具有以上的作用效果。另外，本实施例种子包衣剂的有效成分为娄彻氏链霉菌D74和密旋链霉菌SG712100的混合菌剂，当分别使用娄彻氏链霉菌D74或密旋链霉菌SG712100作为种子包衣剂的有效成分时，也会促进玉米及其他农作物的根系发育，提高农作物产量，但其效果略差于有效成分为娄彻氏链霉菌D74和密旋链霉菌SG712100的混合菌剂的种子包衣剂。
虽然，本说明书中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表

Claims (10)

1.一种基于放线菌的种子包衣剂，其特征在于，包括放线菌菌剂和胶结剂；其中，所述放线菌菌剂的有效成分为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)D74和/或密旋链霉菌(Streptomyces pactum)SG712100，所述胶结剂是羧甲基纤维素钠。
2.根据权利要求1所述的基于放线菌的种子包衣剂，其特征在于，所述娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)D74的保藏号是CCTCC M2016123，其16S rDNA序列为：
所述密旋链霉菌(Streptomyces pactum)SG712100的保藏号是CCTCC M 209066，其16SrDNA序列为：
3.根据权利要求1所述的基于放线菌的种子包衣剂，其特征在于，所述放线菌菌剂的有效成分为所述放线菌娄彻氏链霉菌D74和/或所述密旋链霉菌SG712100的粉状活菌制剂。
4.根据权利要求3所述的基于放线菌的种子包衣剂的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：挑取活化好的娄彻氏链霉菌D74和/或密旋链霉菌SG712100的斜面培养物，分别接种到已灭菌的固态培养基中，28℃静置培养8d，40℃减压干燥后粉碎，再按1∶1质量比混匀，即得所述放线菌娄彻氏链霉菌D74和/或密旋链霉菌SG712100的粉状活菌制剂。
5.根据权利要求4所述的基于放线菌的种子包衣剂的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：挑取活化好的娄彻氏链霉菌D74和密旋链霉菌SG712100的斜面培养物，分别接种到已灭菌的固态培养基中，28℃静置培养8d，40℃减压干燥后粉碎，再按2∶1～1∶2的质量比混匀，即得所述放线菌娄彻氏链霉菌D74和密旋链霉菌SG712100的粉状活菌制剂。
6.根据权利要求1所述的基于放线菌的种子包衣剂的包衣方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将胶结剂加入待包衣种子中搅拌，使种子表面均匀布满胶结剂；(2)将放线菌菌剂加入到布满胶结剂的待包衣种子中搅拌，使种子表面均匀粘附放线菌菌剂，置于阴凉处风干，备用。
7.根据权利要求6所述的基于放线菌的种子包衣剂的包衣方法，其特征在于，步骤(1)中，所述粘结剂为6g/L的羧甲基纤维素钠溶液。
8.根据权利要求6所述的基于放线菌的种子包衣剂的包衣方法，其特征在于，步骤(1)中，所述粘结剂的用量为40～60ml/kg，其中，以待包衣种子的质量为基准量。
9.根据权利要求6所述的基于放线菌的种子包衣剂的包衣方法，其特征在于，步骤(2)中，所述放线菌菌剂为粉状活菌制剂，用平皿培养法测定的活菌数为1×109～9×109CFU/g。
10.根据权利要求6所述的基于放线菌的种子包衣剂的包衣方法，其特征在于，步骤(2)中，所述放线菌菌剂的用量为种子质量的1.5％～3.0％。
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