CN110462059A - 用于核酸样品标准化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种样品标准化的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)使样品与识别靶序列的、限定量的单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述靶序列的核酸分子以产生标准化量的第一切割产物；(b)分离、转录或选择性扩增所述标准化量的第一切割产物。在所述方法中，因为使用限定量的核酸内切酶，所以第一切割产物的标准化量通过步骤(a)中使用的限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶来确定。

Description

用于核酸样品标准化的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年1月19日提交的英国专利申请No.1700941.6的权益，该申请通过引用并入本发明。
背景技术
许多分子学实验方案，例如制备测序文库、片段化、接头连接、片段化的同时添加标签(tagmentation)等，都需要样品的浓度在可接受的工作范围内。在实验室中，通常通过测量样品中核酸的浓度，然后在实验方案的下个步骤中仅使用适当量的样品(等分试样或其稀释样)来实现。该过程称为“标准化”，由此产生的样品具有基本上等量的核酸分子。在许多情况下，样品在合并之前被标准化，以确保在该方法的下一步骤中处理相同量的每种样品。
常规的标准化方法涉及物理测量样品中核酸的量、进行计算，然后对样品进行适当调整。这些方法通常耗时、费力，并且容易出现人为的错误。此外，某些方法会损失掉一些样品、发生样品变性和/或需要专用的实验室设备。由于不能自动化，在许多情况下(特别是在高通量实验室中)标准化步骤为限速步骤。
因此，需要更好的样品标准化的方法。
发明概述
本发明提供了用于样品标准化的各种方法。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)使样品与限定量的识别靶序列的单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述靶序列的核酸分子并产生标准化量的第一切割产物；(b)分离、转录或选择性扩增所述标准化量的第一切割产物。在所述方法中，因为使用限定量的核酸内切酶，所以通过步骤(a)中使用的限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶来确定第一切割产物的标准化量。在进行所述方法时，切割产物(可含有目的序列)的量的增加或减少与所用核酸内切酶的量成正比。例如，如果反应中核酸内切酶的量加倍，那么产物的量也应该加倍(当然，假设存在过量的起始原料)。
所述方法特别适用于标准化样品内或样品间的两种或更多种核酸(例如，基因或扩增产物等)的量。具体地，如以下将更加详细讨论的内容，单个样品可以与限定量的两种或更多种识别不同靶序列的单周转序列特异性核酸内切酶反应。在这些实施方案中，所产生的不同切割产物的相对量应该与所述反应中所述核酸内切酶的相对量成正比。例如，如果想要产生摩尔比为1:1的两种切割产物，则可以使用相同限定量的两种或多种单周转序列特异性核酸内切酶。在另一个实施例中，两种或多种不同的样品可以与相同的单周转序列特异性核酸内切酶反应。在这些实施方案中，反应中产生的切割产物的相对量应该与反应中使用的核酸内切酶的相对量成正比。在该实施例中，如果想要从两个不同的反应中产生相同摩尔量的切割产物，则可以在反应中使用相同限定量的单周转序列特异性核酸内切酶。
其他标准化的方法(例如，涉及在进行反应之前测量样品中核酸的量的方法，或涉及将样品与限定量的寡核苷酸杂交的方法)劳动强度大，需要极好的设备，通常需将样品变性，和/或是不准确的。因此，本方法被认为是对本领域的重要贡献。此外，本方法可用于标准化样品内(不仅仅是样品之间)的特定序列的量。因此，本方法特别适用于需要在分析之前标准化来自单个样品的多个序列(例如，多个基因座或扩增产物等)的方法。
可以使用本标准化的方法中所用的样品或本标准化方法的产物，而无需使用例如，荧光测定法或光密度测定法来量化样品中核酸的确切含量，尽管可以检查所述样品或产物以确定其是否其含有核酸。另外，因为所述核酸内切酶是序列特异性的，所以该方法可用于富集特定序列(例如，特定基因座)。因此，在一些实施方案中，所述方法标准化并且富集了所述样品中的特定序列(例如，特定基因座)。
通过以下描述，其他实施、实施方案和优势可以是显而易见的。
附图说明
本领域技术人员将理解，以下描述的附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。
图1示意性地说明了本方法的一个实施例，其在四个样品中对由粗线和细线表示的两种扩增子进行标准化。在该实施例中，生物素由白色圆圈表示，孔的底部包被有链霉亲和素。如图所示，初始样品中扩增子的分子数量不同。如图的上部所示，双链扩增子通过5'生物素与链霉亲和素包被的平板结合。如图所示，四个孔具有不同数量的粗线和细线的扩增子分子。在下一步骤中，拴系的扩增子与单周转、序列特异性核酸内切酶(例如Cas9-RNA)反应，所述单周转、序列特异性核酸内切酶经过特别设计以用于识别粗线和细线的扩增子。在该实施例中，将一个分子的识别细线的扩增子的单周转、序列特异性核酸内切酶和两个分子的识别粗线的扩增子的单周转、序列特异性核酸内切酶添加到每个孔中，并完成反应。接下来，分离所得的切割产物。在所示方法中，将上清液移至新板中。将反应标准化并获得所需浓度的粗线/细线的扩增子。在所示的实施例中，每个标准化的样品含有相同数量的分子，并且每个样品仅包含一个细线的扩增子和两个粗线的扩增子。
定义
在进一步描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以有所变化。还应理解，本发明使用的术语仅仅为的是用于描述特定实施方案，而不是限制性的，因此本发明的范围仅受所附权利要求的限制。
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管任何与本发明描述的那些类似或等同的方法和材料均可用于本发明的实践或测试，但现在只描述了优选的方法和材料。本发明提及的所有出版物均通过引用并入本发明，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
必须注意的是，如本发明和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，单数形式“一”、“和”与“所述”包括复数的所指事物。因此，例如，提及“一种抗体”包括多种这样的抗体，提及“一种框架区”包括提及一种或多种框架区及本领域技术人员已知的它的等同物，等等。
本发明讨论的出版物仅仅是为了提供在本申请的提交日之前的公开内容。本发明中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于这些出版物公开。此外，提供的出版物的日期可能与实际公开日期不同而需要单独确认。
术语“样品”是指来自生物来源的核酸样品。样品可以来自动物，包括人类、流体、固体(例如，粪便)或组织，以及液体、固体食物以及饲料产品和成分，例如乳制品、蔬菜、肉类和肉类副产品，以及废物。生物样品可包括取自患者的材料，包括但不限于培养物、血液、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴液、痰液、精液、针吸物等。生物样品可以从所有各科家畜，以及各科野生动物或野兽中获得，包括但不限于诸如有蹄类动物、熊、鱼、啮齿动物等动物。环境样品包括环境材料，例如地表物质、土壤、水和工业样品，以及从食品和乳制品加工仪器、装置、设备、器具、一次性和非一次性物品获得的样品。这些实例不应被解释为限制适用于本发明的样品类型。
涉及基因组或靶多核苷酸的“基因座位”、“基因座”、“基因”或“目标基因座”是指基因组或靶多核苷酸的连续亚区或区段。如本发明所用，基因座位、基因、基因座或目标基因座可以指核苷酸、基因或基因的一部分在基因组中的位置，包括线粒体DNA或其他非染色体DNA(例如，细菌质粒)，或者它可以指基因组序列的任何毗连部分，无论其是否在基因内或与基因相关。基因座位、基因座或目标基因座可以从单个核苷酸至数百或数千个核苷酸长度或更长的区段不等。通常，目标基因座将具有与其相关的参考序列。
术语“多个”、“群体”和“集合”可互换使用，以指代包含至少2个成员的事物。在某些情况下，多个、群体或集合可具有至少10个、至少100个、至少1,000个、至少10,000个、至少100,000个、至少106个、至少107个、至少108个或至少109个或更多个成员。
术语“接头”是指添加(例如通过连接)至核酸的序列。接头的长度可以是5至100个，或更多个碱基，并且其可以提供例如扩增引物结合位点，测序引物结合位点和/或分子条形码如样品标识符序列或分子标识符序列。可以将接头添加到核酸分子的5'末端、3'末端或两个末端。双链接头含有与核酸连接的双链末端。接头可以是黏性末端或平端。如以下将更加详细描述的，通过仅将所述接头的一条链连接到片段上，可以将双链接头添加到片段中。双链接头的类型有Y型接头和环路接头。
术语“样品标识符序列”、“样品索引”、“多重标识符”或“MID”是附加到靶多核苷酸的核苷酸序列，其序列能够鉴定靶多核苷酸的来源(即，该样品来自衍生出靶多核苷酸的样品)。在使用时，每个样品可以用不同的样品标识符序列标记(例如，每个样本附加一个序列，不同的样品附加不同的序列)，并且可以合并标记的样品。在对合并的样品进行测序后，样品标识符序列可用于鉴定序列的来源。可以将样品标识符序列添加到多核苷酸的5'末端或多核苷酸的3'末端。在某些情况下，一些样品标识符序列可以位于多核苷酸的5'末端，而样品标识符序列的其余部分可以位于多核苷酸的3'末端。当多核苷酸在两端都具有样品标识符序列时，3'和5'末端的样品标识符序列可以一起识别样品。在许多实例中，所述样品标识符序列仅是附加到靶寡核苷酸的碱基的子集。
术语“分子标识符序列”(在一些情况下也可以称为“反向序列”或“索引”)是可以附加到样品的核酸片段上的核苷酸序列，使得附加的核苷酸序列单独的或与片段的其他特征(例如它们的片段断裂点)组合后，可用于区分样品中的不同片段分子或其部分。在任何一种实施方式中使用的分子标识符序列群的复杂性可以根据各种参数而变化，所述参数例如样品中的片段数和/或后续步骤中使用的样品量。例如，在某些情况下，分子标识符序列可以具有低的复杂性(例如，可以由8至1024个序列的混合物组成)。在其他情况下，分子标识符序列可以具有高复杂性(例如，可以由1025至1M或更多序列组成)。在某些实施方案中，分子标识符序列群可包含简并碱基区(DBR)，其包含1个或多个(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、或5至30个或更多个)选自R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N(由IUPAC代码定义)或其变体的核苷酸。在一些实施方案中，可以通过将限定序列的寡核苷酸混合在一起来制备分子标识符序列群。在这些实施方案中，每个寡核苷酸中的分子标识符序列可以是可纠错的。在本发明所述的方法中，所述分子标识符序列可用于区分部分初始样品的中的不同片段，其中该部分已从初始样品中除去。分子标识符序列可以与片段的其他特征(例如，定义断裂点的片段的末端序列)结合使用以区分该片段。分子标识符序列在CasbonNuc.AcidsRes.2011,22e81中有所描述，并且已被证明可增加在HIV(Jabara等人，2011)、巴氏涂片(Kinde等人，2013)和RNA-Seq(Shiroguchi等人，2012)中检测少数变体的灵敏度。术语“少数变体”定义为相对于样品中的其他分子以小于20％的频率存在的变体。在一些情况下，少数变体可以是多态性靶序列的第一等位基因，其中，在样品中，含有多态性靶序列的第一等位基因的分子与含有多态性靶序列的其他等位基因的分子的比率为1:10或更低、1:100或更低、1:1,000或更低、1:10,000或更低、1:100,000或更低或1:1M或更低。Gianella等人(JInfect Dis.(2010)202:657-666)描述了抗药性HIV的少数变体。
如果体积包含已知浓度的核酸，则术语“确定量”可以是以摩尔、重量或体积来测量。可以使用任何合适的方法测定样品中核酸的浓度。
术语“扩增”旨在表示等温扩增方法和需要热循环(例如PCR)的方法。相对于样品的未扩增组分而言，扩增需要将样品中一个或多个序列的相对浓度增加至少10倍。
术语“核酸模板”意指在扩增过程中被复制的初始核酸分子。
如本发明所用，术语“测序”是指一种方法，通过这种方法可获得多核苷酸的被鉴定出的至少10个连续核苷酸的同一性(例如，鉴定出至少20个、至少50个，至少100个或至少200个或更多个连续核苷酸的同一性)。
术语“下一代测序”是指Illumina、Life Technologies和Roche等目前采用的所谓的并行化合成测序或连接测序平台。下一代测序方法还可包括纳米孔测序例如由OxfordNanopore商业化的方法或基于电子检测的方法例如Life Technologies商业化的IonTorrent技术或诸如Pacific Biosciences商业化的基于荧光的切割方法。
术语“反应”和“处理”旨在表示在适合于试剂在产物中引起变化(例如，片段或切割)的条件下使产物(例如，DNA)与试剂(例如，酶)接触。
术语“未知量”是指未测定的或未量化的量。例如，在一些实施方案中，样品可含有未知量的核酸。在其他实施方案中，尽管一系列的值是已知的(例如，在10轮线性延伸后，样品具有原始浓度的1倍至11倍)，但样品可含有未知量的核酸。在这些实施方案中，并未测量样品中核酸的浓度。
术语“核酸”是指双链DNA、单链DNA、RNA或其任何组合。含有核酸的样品类型包括含有非扩增核酸的样品和含有扩增核酸的样品，所述扩增核酸例如PCR扩增产物(包括RT-PCR和多重PCR产物)以及等温扩增产物。
术语“片段化的同时添加标签”是指在使用转座酶催化片段化的同时标记双链DNA样品，例如Picelliet al,Genome Res.2014 24:2033-40；Adey et al,Genome Biol.201011:R119 and Caruccioet al,Methods Mol.Biol.2011 733:241-55,US20100120098andUS20130203605)中所述。用于进行片段化的同时添加标签的试剂盒由Illumina(SanDiego，CA)以商品名NEXTERATM进行商业销售。
术语“单周转核酸内切酶”是指切割不超过单个分子底物的核酸内切酶。具体地，单周转核酸内切酶的单个分子(其可以是包含单个蛋白质分子和向导核酸的复合物)与单个分子的底物反应并进行切割以产生例如两个分子的产物。在切割一个分子的底物后，这些酶不会移动并切割另一个底物分子。当所有单周转酶已经使用一次时，含有单周转酶的反应将停止。
术语“序列特异性核酸内切酶”是指在特定序列(例如，在其内或与其接近)切割的核酸内切酶，所述特定序列在本发明中被称为“靶序列”。
术语“切割”是指核酸中一个或多个磷酸二酯键发生断裂的反应。在切割反应中一条链中的磷酸二酯键或两条链中的磷酸二酯键发生断裂。例如，这类反应可能导致缺刻或两个片段。
术语“限定量”是指限定可以形成的产物的量。在含有限定量的单周转酶的反应中，在足够的温育时间后，所产生产物的量应该与反应中单周转酶的量成正比。例如，如果反应含有1,000个限定量的单周转核酸内切酶分子，那么该反应将产生1,000分子的切割产物(假设反应是100％有效的)。含有限定量核酸内切酶的切割反应可以非常快速地达到平衡，例如在10分钟内或在5分钟内达到平衡。在此类反应中，核酸内切酶的靶位点相对于核酸内切酶过量。例如，在某些情况下，相对于核酸内切酶分子的数目而言，核酸内切酶的靶位点至少有2个、至少有5个、至少有10个、至少有100个、至少有1,000个或至少有10,000个。在任何实施方案中，含有限定量的单周转核酸内切酶的反应混合物可含有少于1pmol的单周转核酸内切酶(即，少于6×1011个核酸内切酶分子)，尽管在许多情况下使用不在该范围的量(例如，小于1fmol的酶，即6×108个酶分子)。在任何实施方案中，此类反应混合物可以含有1amol至100fmol、1amol至10fmol、1amol至1fmol或1amol至100amol的核酸内切酶(即6×105至6×1010、6×105至6×109个、6×105至6×108个、6×105至6×107个酶分子)。在任何实施方案中，单周转核酸内切酶的浓度可以在1amol/μl至100fmol/μl的范围内，例如1amol/μl至100fmol/μl。在一些情况下，反应混合物可含有限定量的多个单周转核酸内切酶。
术语“部分”表示一些而非全部。例如，一部分可小于50％、小于20％、小于10％或小于5％。
术语“标准化样品”是指具有所需含量的核酸分子的样品。标准化的样品中核酸分子的数量和浓度是近似已知的(例如，在定义的数量或浓度的例如+/-50％，+/-30％，+/-20％或+/-10％的范围内)。标准化的两个样品具有大致相同的数量或浓度(例如，在定义的数量或浓度的例如+/-50％，+/-30％，+/-20％或+/-10％的范围内)的核酸分子。含有两种或更多种标准化的核酸种类的样品具有两种或更多种预先确定了摩尔比的核酸种类。例如，这样的样品可含有大约相同数量的两种或更多种核酸种类的分子。
术语“分离”是指将混合物中的某些物质与该混合物中的其他物质分离的过程。例如，要将容器中溶液里的核酸与附着于容器中的固体支持物的核酸分离，可以通过移出该溶液(其含有溶液里的核酸)并将其置于另一个容器里。
术语“选择性扩增”是指使用一种或多种序列特异性引物，或与已连接到产物的接头杂交的引物进行扩增。
术语“比率”是指摩尔比或相对浓度。
术语“可连接末端”是指平端或含有3'或5'突出的末端，所述末端含有可与另一核酸分子连接的5'磷酸和/或3'羟基。可选的连接反应可以通过点击化学(参见例如El-Sagheeret al J Am Chem Soc.2009 131:3958-64)和GB1604559.3进行。在一些情况下，末端转移酶可用于将三磷酸5'碱基连接至可与另一分子连接的单链DNA。
术语“亲和标签”是指可以将核酸拴系到底物上的基团。亲和标签的示例有生物素基团(该术语包括生物素和生物素类似物，如脱硫生物素、氧化生物素、2'-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等，其与链霉亲和素结合)和化学选择性官能团(如叠氮基或炔基，其参与点击反应)。
术语“支持物”是指固体或半固体的实体，其含有可以与核酸连接的表面，例如珠子(例如磁珠)或玻璃表面。
术语“拴系”是指直接或间接地、共价或非共价地固定到支持物的表面。
在已经分离的切割产物的背景下，术语“分离的”是指已经从未切割的分子中分离出的切割产物。
术语“Argonaute”是指由来自格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute蛋白质代表的DNA定向的核酸内切酶家族。参见例如Gao et al NatBiotechnol.2016 34:768-73.；Swarts et al Nature.2014 507:258-61；and Swarts etal.Nucleic Acids Res.2015 43:5120-9)。
术语“CRISPR蛋白”是指RNA向导的2类CRISPR-Cas核酸内切酶。这个家族包括Cas9、Cpf1等。参见例如Zetsche et al Cell 2015 163:759-71andMakarovaNat.Rev.Microbiol.2015 13:722-36。
具体实施方式
本方法可包括使包含核酸的第一样品与限定量的能够识别样品中靶序列的第一单周转序列特异性核酸内切酶反应(即消化)。根据所使用的核酸内切酶(例如，核酸内切酶是归巢核酸内切酶、核酶、DNA酶或核酸向导的核酸内切酶如Argonaute或CRISPR蛋白(例如Cpf1、Cas9或其变体或其直系同源物)，样品中的核酸可以是双链DNA(例如，基因组DNA或cDNA)、单链DNA或RNA。在一些实施方案中，样品中的产物可以含有PCR产物或预先片段化的基因组DNA或其双链DNA，其上可已经添加或未添加接头序列。在一些实施方案中，所述的样品可以是接头标记的测序文库。每个核酸内切酶分子在靶序列上切割一条链或两条链。如果所述样品含有双链DNA，那么核酸内切酶可以在靶序列上切割两条链。在一些实施方案中，核酸内切酶可以在靶序列上切割一条链以产生带缺刻的核酸。因为使用限定量的核酸内切酶时，仅一部分(即，一些但不是全部)包含靶序列的核酸分子被切割。基于样品中核酸的量，含有小于50％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％或小于1％靶序列的分子被切割。在这些实施方案中，所切割产物的量通过第一单周转序列特异性核酸内切酶所用的限定量(即应该与其成正比)来确定。因此，产生的第一切割产物的量应该是已知的，而不需要进行定量分析。
在产生切割产物后，可以将其从未被切割的核酸中分离、转录或选择性扩增。这些反应的实施例如下所述。
该方法可用于标准化两个不同样品之间(即，至少第一样品和第二样品之间)的特定分子的量，使得这些样品产生的切割产物的量大致相同。在这些实施方案中，该方法可以包括：(a)使样品与限定量的识别靶序列的单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含靶序列的核酸分子，并产生标准化量的第一切割产物；(b)分离、转录或选择性扩增标准化量的第一切割产物；(c)使包含核酸的第二样品与限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶(即，与上述步骤(a)中使用的相同量的相同核酸内切酶)反应，以切割一部分包含靶序列的核酸分子。在该反应中切割的核酸分子部分可以与上述步骤(a)中切割的核酸分子的部分相同或不同。然而，因为在该第二反应中产生的切割产物的量由所使用的限定量的核酸内切酶确定(即，应该与其成正比)，所产生的切割产物的量应该与另一个(即，第一个)反应大致相同。在这些实施方案中，第二切割产物的量通过步骤(c)中使用的限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶来确定，并且从第一样品(上述步骤(a))获得的第一切割产物的量应与从步骤(c)的第二反应得到的第二切割产物的标准化量大致相同。同样，在产生切割产物后，它可以从未被切割的核酸中分离、转录或选择性扩增。这些反应的实例如下所述。该方法的这种实施方式通常可以用于标准化多个样本，使得应用到该方法的下一步骤的材料量对于每个样本而言应该是相同的，并且是不需要测量的。
另外，该方法可用于标准化同一样品中的两种或更多种核酸序列(例如，两种或多种不同基因座或PCR产物)的量。在这些实施方案中，相同的样品可以与限定量的两种或多种单周转序列特异性核酸内切酶反应，其中每种核酸内切酶靶向不同的序列(例如，不同的基因座或PCR产物)。因为产物的摩尔比通过所用核酸内切酶的量决定，所以该方法可用于制备含有预设了相对浓度的两种或更多种产物的混合物。所述的产物可以是任何所需的比例，例如，比例约为1:1。在这些实施方案中，步骤(c)可以包括使第一样品与限定量的识别第二靶序列(除了识别第一靶序列的第一单周转序列特异性核酸内切酶之外，即在相同的反应中)的第二单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含第二靶序列的核酸分子，并在与第一切割产物相同的反应中产生标准化量的第二切割产物。在该实施方案中，反应中第一切割产物和第二切割产物的标准化量通过所使用的限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶和第二单周转序列特异性核酸内切酶来确定。显而易见的是，从第一样品获得的第一切割产物的标准化量与从第一样品获得的第二切割产物的标准化量的比率通过所使用的第一核酸内切酶和第二核酸内切酶的量来确定。显而易见的是，该方法可包括分离、转录或选择性扩增标准化量的第二切割产物。
可以通过任何合适的方法分离、转录或选择性扩增标准化量的切割产物。例如，在一些实施方案中，(a)的样品中的核酸分子可能不具有可连接的末端。例如，核酸可以是使用不具有5'末端磷酸的引物制备的扩增产物，或者可以进行处理以除去5'末端磷酸和/或3'末端羟基。在这些实施方案中，使样品与单周转序列特异性核酸内切酶反应，以产生确定量的切割产物，其包含可连接末端，即包含5'磷酸和/或3'羟基的末端，其可以连接至接头。在这些实施方案中，所述方法可包括在切割后但在分离、转录或选择性扩增之前将接头连接到切割产物上。在这些实施方案中，仅切割的分子可与接头连接。接头可用于分离、转录或选择性扩增切割的分子。例如，在一些实施例中，接头可包括亲和标签。在这些实施方案中，所述方法包括通过将连接产物结合到与亲和标签结合的支持物上，而将切割产物与样品的其余部分分离。在分离连接产物后，分离的连接产物本身可以连接到另一个接头上(例如，通过将分离的产物片段化并将其连接到接头上，或通过片段化的同时添加标签)。可选地，接头可以包含启动子序列(例如，用于噬菌体聚合酶的启动子，例如T7聚合酶)，并且该方法可以包括转录切割产物。在另一个实施方案中，接头可以包含引物的结合位点，并且该方法包括通过使引物与结合位点杂交并使用模板依赖性聚合酶延伸引物来复制切割产物。该反应可以使用可与接头中的序列杂交或具有与接头中的序列相同的3'末端的第一引物和与基因特异性的第二引物来完成。在该实施方案中，与接头连接的分子可以通过例如PCR进行扩增。
在以下将更详细解释的替代实施方案中，样品中的核酸分子可以通过一个末端附着到支持物上。例如，所述样品可含有使用一对引物扩增的PCR产物，其中一条引物具有亲和标签。所述亲和标签可用于将PCR产物拴系至支持物。可选地，所述样品可含有扩增产物(例如使用桥式PCR等)，所述扩增产物使用与固体支持物拴系的引物合成。在这些实施方案中，核酸内切酶从支持物中释放(即，进入溶液)标准量的切割产物。可以容易地将所述切割产物从未被切割的分子中分离，只需将反应的溶液相转移到单独的容器中即可。在切割的分子被释放和分离后，该方法可以包括将接头连接到上述切割产物上。如上所述，这可以通过将接头连接到分离的切割产物(或其片段)的末端或通过在片段化切割产物的同时添加标签来完成。
在另一个实施方案中，可以通过阴性选择将切割的产物与未切割的产物分离。在该实施方案中，核酸内切酶可以切割一部分核酸分子的末端。在该实施方案中，步骤(b)可以通过与末端杂交的探针(例如，与支持物拴系的探针或含有可以与支持物结合的亲和标签的探针)进行杂交，以去除仍然含有该末端的分子。进行该步骤时将标准化量的第一切割产物留在溶液中。
显而易见的是，可以将标准化量的切割产物引入各种不同的下游方法中。在一些实施方案中，可以对标准化量的切割产物或其扩增产物进行测序。在这些实施方案中，该方法可以包括制备测序文库，然后对文库进行测序。
以下更详细地描述以上概述的方法的实施方案。该实施方案可包括：(a)获得包含核酸的样品和(b)将样品中的至少一些核酸分子拴系至支持物。可以共价地(例如使用点击化学)或使用生物素-链霉亲和素相互作用来非共价地进行拴系。在该实施方案中，样品可包含一种或多种双链扩增产物，例如PCR产物。在该实施方案中，核酸可以通过亲和标签与支持物拴系，所述亲和标签位于用于扩增样品的引物之一中。可选地，可以在相对少量的生物素化核苷酸(例如，生物素-dCTP)存在时合成样品中的核酸，从而使分子与含有链霉亲和素的支持物拴系。与上述方法相同，接下来，该方法包括(c)使步骤(b)产生的拴系核酸分子与识别样品中的第一靶序列的、限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第一切割产物释放到溶液中。接下来，该方法包括(d)分离步骤(c)中释放的第一切割产物。显而易见的是，因为切割的分子不再与支持物连接，所以可以通过将液相(“上清液”)转移到另一个容器中来方便地完成分离的步骤。如上所述，通过步骤(c)中使用的限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶来确定步骤(d)中分离的第一切割产物的量。
与以上一般描述的方法相同，该方法的该实施方案可用于标准化样品中不同核酸种类的量。因此，在一些实施方案中，该方法的步骤(c)可以包括：(c)使(b)中拴系的核酸分子与：(i)识别样品中第一靶序列的、限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第一切割产物释放到溶液中；(ii)识别样品中的第二靶序列的、限定量的第二单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含第二靶序列的拴系的核酸分子，并释放标准化量的第二靶序列切割产物进入溶液；(d)分离步骤(c)中释放的第一切割产物和第二切割产物；其中步骤(d)中分离的第一和第二切割产物的量通过步骤(c)中使用的限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶和第二单周转序列特异性核酸内切酶来确定。显而易见的是，两种不同的核酸可以在同一样品中相互进行标准化。
在该实施方案中，第一核酸内切酶可切割第一扩增产物，第二核酸内切酶可切割第二扩增产物中的序列。靶序列可以在引物中(例如，用于将核酸拴系到支持物上的引物)，或者其可以与引物相邻，例如，在扩增产物的末端，其靠近将产物拴系至支持物的引物。
在这些实施方案中，样品(其含有第一扩增产物和第二扩增产物)可以通过在不同的反应(例如，两个不同的PCR反应)中产生第一扩增产物和第二扩增产物，然后将产物合并在一起来制备。可选地，第一扩增产物和第二扩增产物可以在相同的反应中制备，例如通过多重PCR。这种反应可以含有至少2种，至少5种，至少10种扩增产物，所有这些产物都可以在单独的反应中标准化。
与以上一般描述的方法相同，该方法的该实施方案可用于标准化不同的样本(例如，至少10个、至少100个或至少1000个样本)。在这些实施方案中，所述方法可以进一步包括：(e)获得包含核酸的第二样品；(f)将第二样品中的至少一些核酸分子拴系到支持物上；(g)使(f)中的拴系核酸分子与相同量的步骤(c)中所用第一单周转序列特异性核酸内切酶(即相同量的相同核酸内切酶)反应，从而切割一部分包含靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第二切割产物释放到溶液中。然后可以通过将溶液相转移到另一个容器中来分离步骤(g)中释放的第二切割产物。显而易见的是，步骤(g)中释放的第二切割产物的量由步骤(g)中使用的第一单周转序列特异性核酸内切酶的量来确定。在一些实施方案中，步骤(c)和(g)中分离的第一切割产物和第二切割产物的量大致相同。
在分离产物后，所述方法可包括从释放的切割产物制备测序文库。在一些实施方案中，所述方法可以包括将接头与释放的切割产物或其片段连接。所述方法可以通过将接头连接到释放的切割产物的末端或通过在片段化切割产物的同时添加标签来完成。然后可以任选地扩增和测序接头连接的切割产物。
显而易见的是，与片段连接的接头和/或用于扩增的引物可以与下一代测序平台的用途相容，例如，Illumina的可逆终止子方法、Roche的焦磷酸测序方法(454)、LifeTechnologies的连接测序(SOLiD平台)、Life Technologies的Ion Torrent平台或OxfordNanopore的MinIon系统。这些方法的实例在以下参考文献中有所描述：Margulies et al(Nature 2005 437:376–80)；Ronaghi et al(Analytical Biochemistry 1996 242:84–9)；Shendure(Science 2005 309:1728)；Imelfort et al(Brief Bioinform.2009 10:609-18)；Fox et al(Methods Mol Biol.2009；553:79-108)；Appleby et al(Methods MolBiol.2009；513:19-39)and Morozova(Genomics.2008 92:255-64)，对于用于方法的一般描述和方法的特定步骤，通过引用并入本发明，包括每个步骤的所有起始产品、试剂和最终产品。本方法可用于任何测序平台，包括基于合成测序的那些平台(即，通过延伸与模板杂交的引物)。
试剂盒
如上所述，本公开还提供了用于实行主题方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒可以含有至少：一对用于PCR扩增产物的引物，其中一个引物包含亲和部分；和一种重编程的RNA向导的核酸内切酶，其靶向引物中的序列(以双链形式)。在一些实施方案中，所述试剂盒可以进一步包含与亲和部分结合或反应的支持物。
另外，所述试剂盒还可以包含用于进行扩增的试剂(例如，聚合酶、核苷酸和缓冲液等)，以及用于实施所述方法的其他酶和/或试剂，例如连接酶、引物，支持物等。所述试剂盒的各种组分可以存在于不同的容器中，或者某些相容的组分可以根据需要预先组合到单个容器中。
除了上述组分之外，主题试剂盒还可以包括使用所述试剂盒组分来实施主题方法的说明书，即提供样品分析的说明书。用于实行主题方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基材上，例如纸或塑料等。因此，说明书可以作为包装说明书存在于试剂盒中、在试剂盒的容器或其组件的标签中(即，与包装或者子包装相关联)等。在其他实施例中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、磁盘等)上的电子存储数据文件存在。在其他实施例中，实际上的说明书不存在于试剂盒中，但提供了用于从远程来源(例如，通过互联网)获得说明书的装置。该实施例的示例是包括网址的试剂盒，其中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，这种用于获得说明书的装置记录在合适的基质上。
实施方案
实施方案1.一种处理样品的方法，其包括：
(a)使包含核酸的第一样品与识别靶序列的、限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含靶序列的核酸分子并产生标准化量的第一切割产物；和
(b)分离、转录或选择性扩增标准化量的所述第一切割产物；
其中标准化量的第一切割产物通过步骤(a)中使用的限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶来确定。
实施方案2.如权利要求1所述的方法，其还包括：
(c)使包含核酸的第二样品与限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含靶序列的核酸分子，并产生标准化量的第二切割产物，
(d)分离、转录或选择性扩增标准化量的所述第二切割产物；
其中所述标准化量的第二切割产物由步骤(c)中使用的限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶来确定；和
其中从第一样品中获得的所述标准化量的第一切割产物与从第二个样品中获得的所述标准化量的第二切割产物大致相同。
实施方案3.如前述任一项实施方案所述的方法，其中
步骤(c)还包括：使第一样品与识别第二靶序列的、限定量的第二单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含第二靶序列的核酸分子并产生标准化量的第二切割产物；和
步骤(b)进一步包括分离、转录或选择性扩增标准化量的第一切割产物；
其中标准化量的第二切割产物由步骤(c)中使用的限定量的第二单周转序列特异性核酸内切酶来确定；和
其中从第一样品中获得的所述标准化量的第一切割产物与从第一样品中获得的所述标准化量的第二切割产物之比通过所用第一核酸内切酶和第二核酸内切酶的量决定。
实施方案4.如前述任一项实施方案所述的方法，其中：
(a)所述样品中的核酸分子不具有可连接的末端；
使样品与单周转序列特异性核酸内切酶反应产生
确定量的切割产物，其包含可连接的末端；和
所述方法包括在步骤(a)和(b)之间将接头与所述切割产物连接。
实施方案5.如实施方案4所述的方法，其中所述接头包含亲和标签，并且所述方法包括通过结合与所述亲和标签结合的支持物将所述切割产物与所述样品的其余部分分离。
实施方案6.如实施方案5所述的方法，其还包括将所述接头与分离的切割产物连接。
实施方案7.如实施方案6所述的方法，其中所述连接通过将所述接头连接到所述分离的切割产物的末端或通过在片段化切割产物的同时添加标签来进行。
实施方案8.如实施方案4所述的方法，其中所述接头包含RNA启动子序列，并且所述方法包括转录所述切割产物。
实施方案9.如实施方案4所述的方法，其中所述接头包含引物的结合位点，并且所述方法包括通过使引物与所述结合位点杂交并使用模板依赖性聚合酶延伸所述引物来复制所述切割产物。
实施方案10.如前述任一项实施方案所述的方法，其中：i.所述样品中的所述核酸分子仅通过一端连接到所述支持物上，ii.所述核酸内切酶将标准化量的所述切割产物释放到溶液中，和iii.所述方法包括分离释放的切割产物。
实施方案11.如实施方案10所述的方法，其还包括将所述接头与所述释放的切割产物连接。
实施方案12.如实施方案11所述的方法，其中通过将所述接头连接到所述分离的切割产物的末端或通过在片段化切割产物的同时添加标签来进行连接。
实施方案13.如前述任一项实施方案所述的方法，其中所述核酸内切酶从一部分核酸分子的末端进行切割，并且通过与该末端杂交的表面拴系探针杂交去除仍含有该末端的分子来完成步骤(b)，从而将标准化量的所述第一切割产物留在溶液中。
实施方案14.如前述任一项实施方案所述的方法，其还包括对所述标准化量的第一切割产物或其扩增产物进行测序。
实施方案15.如前述任一项实施方案所述的方法，其中所述单周转序列特异性核酸内切酶是归巢核酸内切酶、核酶、DNA酶或核酸向导的核酸内切酶。
实施方案16.如实施方案所述15的方法，其中所述单周转序列特异性核酸内切酶是Argonaute或CRISPR蛋白。
实施方案17.如实施方案16所述的方法，其中所述CRISPR蛋白是Cpf1、Cas9或其变体或直系同源物。
实施方案18.如前述任一项实施方案所述的方法，其中所述样品中的所述核酸是双链扩增产物。
实施方案19.如实施方案18所述的方法，其中所述样品中的所述核酸是聚合酶链式反应(PCR)的产物。
实施方案20.如前述任一项实施方案所述的方法，其中所述样品中的所述核酸已用初始样品进行富集。
实施方案21.一种处理样品的方法，包括：
(a)获得包含核酸的样品；
(b)将所述样品中的至少一些核酸分子拴系到支持物上(例如，通过一个末端而不通过另一个末端)；
(c)使(b)中拴系的核酸分子与识别样品中的第一靶序列的、限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶反应，所述核酸内切酶，从而切割一部分包含靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的上述第一切割产物释放到溶液中，和
(d)分离步骤(c)中释放的所述第一切割产物；
其中，步骤(d)中分离的所述第一切割产物的量通过步骤(c)中使用的限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶来确定。
22.如实施方案21所述的方法，所述样品中的所述核酸是扩增产物。
23.如实施方案21所述的方法，所述扩增产物包含PCR产物。
24.如实施方案21-23任一项所述的方法，所述方法的步骤(c)包括：
(c)使(b)中拴系的核酸分子与：
(i)识别样品中的第一靶序列的、限定量的第一单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第一切割产物释放到溶液中；和
(ii)识别样品中的第二靶序列的、限定量的第二单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含第二靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第二切割产物释放到溶液中；和
(d)分离步骤(c)中释放的所述第一切割产物和所述第二切割产物；
其中，步骤(d)中分离的所述第一和第二切割产物的量通过步骤(c)中使用的限定量的所述第一核酸向导的核酸内切酶和所述第二单周转序列特异性核酸内切酶来确定。
25.如实施方案21-24任一项所述的方法，所述第一核酸内切酶切割第一扩增产物，且所述第二核酸内切酶切割第二扩增产物中的序列。
26.如实施方案25所述的方法，所述第一扩增产物和所述第二扩增产物在不同的反应中制备，然后合并在一起。
27.如实施方案25所述的方法，所述第一扩增产物和所述第二扩增产物在相同的反应中制备。
28.如实施方案21-27任一项所述的方法，所述方法还包括：
(e)获得包含核酸的第二样品；
(f)将所述第二样品中的至少一些核酸分子拴系到支持物上；
(g)使(f)中拴系的核酸分子与相同量的步骤(c)中使用的所述第一单周转序列特异性核酸内切酶反应，从而切割一部分包含靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第二切割产物释放到溶液中；和
(h)分离步骤(g)中释放的所述第二切割产物；
其中步骤(g)中释放的所述第二切割产物的量通过步骤(g)中使用的所述第一单周转序列特异性核酸内切酶的量来确定，并且其中步骤(d)和(h)中分离的所述第一切割产物和所述第二切割产物的量大致相同。
29.如实施方案21-28任一项所述的方法，其进一步包括用释放的切割产物来制备测序文库。
30.如实施方案21-29任一项所述的方法，其进一步包括将所述接头与所述释放的切割产物连接。
31.如实施方案30所述的方法，所述连接通过将接头连接到所述释放的切割产物的末端，或通过在片段化所述切割产物的同时添加标签来进行。
32.如实施方案21-31任一项所述的方法，其进一步包括对所述释放的切割产物进行测序。
33.如实施方案21-32任一项所述的方法，其进一步包括扩增所述释放的切割产物。
34.如实施方案21-33任一项所述的方法，所述样品中的所述核酸已用初始样品进行富集。
35.如实施方案21-34任一项所述的方法，所述核酸分子通过共价键与所述支持物拴系。
36.如实施方案35所述的方法，所述拴系使用点击化学进行。
37.如实施方案21-36任一项所述的方法，所述核酸分子通过非共价键与所述支持物拴系。
38.如实施方案17所述的方法，所述拴系使用生物素/链霉亲和素相互作用进行。
39.一种试剂盒，其包括：
一对用于PCR扩增产物的引物，其中一条引物包含亲和部分；和
一种重编程的RNA向导的核酸内切酶，其以双链形式靶向所述引物中的序列。
40.如实施方案39所述的试剂盒，其还包含与所述亲和部分结合或与所述亲和部分反应的支持物。
实施例
提供以下实施例是为了论证和进一步说明本发明的某些实施方案和方面，而不应解释为限制其范围。
在许多实验方案中，通过珠子或柱(例如，AMPure XP珠子)清除反应，对样品中的核酸量进行定量(例如，使用Qubit测定法)以及在下游步骤中用于给定体积的反应。这些实验方案虽然相对便宜且易于执行并且仅需要相对便宜的资本设备(例如，荧光计)，但确实需要大量的步骤和计算。因此，用户错误是一个真正的问题。这些步骤可能是自动化的，但这取决于进行测定的实验室的复杂程度。
这里描述的是标准化靶标DNA，甚至样品中的单个扩增子的另一种方法(例如在多重PCR反应中)。以下描述的方法是使用Cas9核酸酶。然而，可以潜在地使用任何的序列特异性单周转核酸内切酶(例如归巢核酸内切酶、核酶、DNA酶或其他CRISPR核酸内切酶如Cpf1和Argonaute)。通过RNA和靶序列之间的序列互补性靶向Cas9-RNA复合物形成双链核酸内切酶。虽然主要描述的是体内编辑，但Cas9也可用于体外。
就本方法而言，Cas9核酸酶的最重要特性为它是单周转酶(Sternberg et al2014Nature 507:62-67)。这意味着一个Cas9-RNA复合物恰好切割了一个DNA分子(而非更多)。如果靶DNA过量，并且允许反应无限延续，则切割的DNA分子的数量等于Cas9-RNA复合物的数量。在许多反应条件下，约1分钟后可达到平衡；随着孵育时间的延长，切割的DNA不会增加(Sternberg等，同上)。
Cas9-RNA的这种性质(即单周转特性)可用于样品标准化。这种方法的一个实施例如图1所示。在该实施例中，将PCR扩增子固定在固体表面上，然后进行洗涤以除去未结合的物质。然后加入确定量的Cas9-RNA，确保模板DNA过量。Cas9-RNA的切割取决于向导RNA的序列。可以设计向导RNA以通过共同序列切割所有所需的扩增产物。在一些情况下，可以设计向导RNA以期望的比例切割特定的扩增子(例如，当人们想要回收一个扩增子的更多分子时，因为它难以在下游步骤中被加工)。第二种方法可以使用已知浓度的向导RNA库。然而，进行消化后，结果是特定数量的扩增子分子被切割。然后可以从上清液中分离消化的扩增子。然后可以在进一步的步骤中单独处理扩增子或者合并后再处理。
由于靶序列的存在，Cas9-RNA复合物应该从切割的靶标的末端解离(即向导RNA靶向的靶序列在靶位点被切割)。如果Cas9-RNA不能与靶标解离(并且该方法的下一步需要Cas9-RNA复合物结合位点)，则可以水解向导RNA(例如，通过碱水解或RNA酶)，所述复合物可以通过加热进行解离，或Cas9蛋白可被蛋白酶消化。可替代的方法是已知的，并且如果需要可以使用。例如，可以使用洗涤剂如十二烷基硫酸钠或还原剂如二硫苏糖醇或2-巯基乙醇来使蛋白质变性。
在一些情况下，该方法可以通过以下方式实施：(1)合并所有反应，(2)使用Cas9-RNA库来标准化不同的样品(基于例如可以包括用于后续序列分析的样品标识符条形码之外的样品特异性序列)。
Cas9-RNA也可用于靶向富集。例如，可以固定DNA分子库如基因组DNA样品，然后通过Cas9-RNA库消化特异性靶标并释放到上清液中。消化的产物也具有已知序列的平末端。这些可用于下游步骤。
实施例1
扩增模板和标准化方法
标准的30μL实验方案中组分的最终浓度是3nM dsDNA模板，30nM Cas9和30nM向导RNA。为了驱动标准反应，Cas9-RNA以10倍过量存在。将代替Cas9:RNA:dsDNA的比率10:10:1，修改为例如1:1:≥10，以根据Cas9-RNA分子的总数限制消化。
在该实施例中，在该方法的下一步骤(或“更进一步”)中使用1.5ng的总PCR扩增子，其设定可从固体表面释放的最小dsDNA。鉴于平均的扩增子的尺寸为约800bp，1.5ngdsDNA为约0.003pmol。如果消化1.5ng dsDNA，则可能需要除去100％的上清液。这不是最佳的，因为大家可能希望减少反应(例如，为帮助缓冲剂与工作流程中的后续步骤兼容)并允许一些废留体积。如果进一步取出10％的上清液，则需要释放总共15ng或0.03pmol的dsDNA。
以下计算假定最终反应体积为10μL(并且去除1μL用于后续反应)。如果想要释放总共0.03pmol dsDNA，则可以使用总共0.03pmol的Cas9和0.03pmol的RNA。若假设dsDNA模板是10倍过量的，则可以使用0.3pmol的dsDNA模板。因此，10μL最终反应体积中的最终反应浓度为dsDNA 0.03pmol/μL(30nM)、Cas9 0.003pmol(3nM)和RNA 0.003pmol(3nM)。
与支持物(例如珠子)一起孵育的PCR反应的体积可以超过Cas9-RNA的反应体积。在珠子结合后有洗涤的步骤，之后珠子可以以较低的体积重新悬浮。如果用50μL的PCR产物孵育珠子并假设结合效率为100％，那么800bp扩增子(例如)的浓度可能超过3ng/μL。结合PCR反应的较小体积假定来自PCR的产物浓度较高。例如，在该实施例中，孵育10μL的PCR产物假定产物具有大于15ng/μL的浓度。如果从上清液中除去更大比例的消化产物，则可以进一步限制所需的总产量。例如，如果将20％，而非10％的上清液用于下一步骤中，那么产量要求减半。
NEB和其他供应商目前可以供应浓度为1μM(1pmol/μL)的Cas9。如果在10μL最终反应中加入1μL的Cas9，则可能需要将Cas9稀释至0.03pmol/μL(30nM)的浓度。类似地，向10μL最终反应中添加1μL的RNA可能需要0.03pmol/μL(30nM)的RNA原液浓度。1mg的BangsLaboratories无核酸酶珠子将结合25pmol的1kb 5'末端生物素化的dsDNA。上述计算假设需要结合至少0.3pmol dsDNA模板。因此，每个反应可以使用0.012mg珠子。珠子的浓度为1mg/mL，因此每次反应可使用12μL的珠子。
以下工作流程假设有48×样本，并提供大约10％额外体积的试剂。下面描述的结合方案改编自Bangs Laboratories的530链霉亲和素，无核酸酶的产品数据表：
1.将640μL珠子加入到不含核酸酶的1.5mL微量离心管中。使用磁力分离装置，将磁性颗粒拉到微量离心管的侧面30秒。取出上清液并丢弃。将珠子重悬于320μL结合缓冲液(20mM Tris，0.5M NaCl，pH8.0)中。
2.将6μL珠子等分加入到96孔板的每个孔中。
3.将10μL生物素化的PCR扩增子直接添加到96孔板的每个孔中。在室温下孵育15分钟。
4.当生物素化的PCR扩增子在室温下结合时，补充以下混合物并在37℃下预孵育至少10分钟。
成分 μL 终浓度
水 7
10×反应液 1 1×
30nM gRNA 1 3nM
30nM Cas9核酸酶 1 3nM
5.将珠子磁性分离30秒并弃去上清液。用50μL结合缓冲液洗涤结合的颗粒2次，留下磁性颗粒作为湿滤饼。
6.将步骤4中的10μL反应组分加入到珠子中。使用以下热循环程序：37℃60分钟，65℃20分钟，4℃储存。65℃热灭活旨在从DNA中释放出Cas9-RNA。
7.将1μL上清液移入新的96孔板中。该板即包含标准化库。
所描述的实施例和从属权利要求的所有可选的和优选的特征和修改都可用于本发明所教导的本发明的所有方面。此外，从属权利要求的各个特征以及所描述的实施例的所有可选的和优选的特征和修改是可组合的并且可彼此互换。

Claims (20)

1.一种样品标准化的方法，其包括：
(a)获得包含核酸的样品；
(b)将所述样品中的至少一些核酸分子拴系到支持物上；
(c)使(b)中拴系的核酸分子与识别样品中的第一靶序列的、限定量的第一核酸向导的核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第一切割产物释放到溶液中，和
(d)分离步骤(c)中释放的所述第一切割产物；
其中，步骤(d)中分离的所述第一切割产物的量通过步骤(c)中使用的限定量的第一核酸向导的核酸内切酶来确定。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品中的所述核酸是扩增产物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述扩增产物包含PCR产物。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤(c)包括：
(c)使(b)中拴系的核酸分子与：
(i)识别样品中的第一靶序列的、限定量的第一核酸向导的核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第一切割产物释放到溶液中；以及
(ii)识别样品中的第二靶序列的、限定量的第二核酸向导的核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述第二靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第二切割产物释放到溶液中；和
步骤(d)包括：
(d)分离步骤(c)中释放的所述第一切割产物和所述第二切割产物；
其中，步骤(d)中分离的所述第一和切割产物的量通过步骤(c)中使用的限定量的所述第一核酸向导的核酸内切酶和所述第二核酸向导的核酸内切酶来确定。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一核酸内切酶切割第一扩增产物，且所述第二核酸内切酶切割第二扩增产物中的序列。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述第一扩增产物和所述第二扩增产物在不同的反应中制备，然后合并在一起。
7.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述第一扩增产物和所述第二扩增产物在相同的反应中制备。
8.如权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
(e)获得包含核酸的第二样品；
(f)将所述第二样品中的至少一些核酸分子拴系到支持物上；
(g)使(f)中拴系的核酸分子与相同量的步骤(c)中所述第一核酸向导的核酸内切酶反应，从而切割一部分包含所述靶序列的拴系核酸分子，并将标准化量的第二切割产物释放到溶液中；和
(h)分离步骤(g)中释放的所述第二切割产物；
其中步骤(g)中释放的所述第二切割产物的量由步骤(g)中使用的所述第一核酸向导的核酸内切酶的量来确定，并且其中步骤(d)和(h)中分离的所述第一切割产物和所述第二切割产物的量大致相同。
9.如前述任一项权利要求所述的方法，其还包括用释放的切割产物来制备测序文库。
10.如前述任一项权利要求所述的方法，其还包括将接头与所述释放的切割产物连接。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述连接通过将接头连接到所述释放的切割产物的末端，或通过在片段化所述切割产物的同时添加标签来进行。
12.如前述任一项权利要求所述的方法，其还包括对所述释放的切割产物进行测序。
13.如前述任一项权利要求所述的方法，其还包括扩增所述释放的切割产物。
14.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述样品中的所述核酸已用初始样品进行富集。
15.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述核酸分子通过共价键与所述支持物拴系。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述拴系使用点击化学进行。
17.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述核酸分子通过非共价键与所述支持物拴系。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述拴系使用生物素/链霉亲和素相互作用进行。
19.一种试剂盒，其包括：
一对用于PCR扩增产物的引物，其中一条引物包含亲和部分；和
一种重编程的RNA向导的核酸内切酶，其以双链形式靶向所述引物中的序列。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其特征在于，其还包含与所述亲和部分结合或与所述亲和部分反应的支持物。
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