CN112877329A - 一种基于脱氧核酶的细胞外atp快速传感方法及应用试剂盒 - Google Patents

一种基于脱氧核酶的细胞外atp快速传感方法及应用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒，属于分析检测领域。一种脱氧核酶，所述脱氧核酶包括核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链，在SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链的5'端连有羟基，3'端连有胆固醇分子。一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法的步骤简单、响应快速，可实现对细胞外分泌ATP分子的快速传感与测定，可有效区分其他细胞外核苷酸包括ADP、AMP和腺苷等物质，实现准确测定，可广泛应用于细胞生长、组织损伤、炎症和移植免疫等各种生理和病理研究过程中，可更好地理解ATP的信号机制以及其在基本病理、生理过程中的功能。

Description

一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
自1994年首次通过体外筛选技术获得具有催化活性的DNA(又称脱氧核酶或DNAzyme)以来，到目前为止，已经发现了许多可催化裂解RNA的DNAzymes(简称RCDz)。这些RCDz广泛应用于临床诊断、药物研发、环境监测和生物传感等领域。例如，RCDz可作为传感器和显像剂用于细胞内金属离子以及其他目标分子成像。但时间分辨率较低，这些RCDz传感器通常需要数分钟甚至数小时才能读出信号，这极大的限制了其传感性能。因此，亟需开发具有高时间分辨率或快速响应的DNAzyme传感器。
三磷酸腺苷(ATP)是一种重要的细胞外信号指示剂，在细胞生长、组织损伤、炎症和移植免疫等各种生理和病理过程中，细胞都会向外释放ATP。因此，监控ATP的释放过程，可以更好地理解其信号机制以及研究相关的病理、生理过程。尽管已经研发出基于核酸适配体的传感器，用于分析细胞内ATP，但是针对细胞间复杂的信号传递的情况下，该方法无法保证对ATP的检测特异性，甚至无法区分细胞外的ADP和AMP，因此，对细胞外ATP的监测仍然是一个重大挑战和技术难点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法。利用具有自磷酸化催化功能的特定结构的脱氧核苷酸链为传感分子(已修饰荧光基团，简称FDK1)，并将其固定至细胞膜表面，当细胞释放ATP分子时，FDK1可催化底物ATP分子的γ-磷酸基团移到其自身序列的5'-羟基端，实现磷酸化，再与具有荧光猝灭基团(QDO)的DNA链进行碱基互补配对，完成荧光猝灭，形成较低的荧光检测背景，利用λ噬菌体核酸外切酶(λ-exo)将5'-磷酸化的脱氧核苷酸链分子切割至短链，进而产生强烈的荧光信号，可在数秒内完成细胞外ATP分子的快速传感。
本发明的技术方案为：
一种脱氧核酶，所述脱氧核酶包括如SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链，在SEQ IDNO.2所示的脱氧核苷酸链的5'端连有羟基，3'端连有胆固醇分子。
进一步地，上述技术方案中，所述脱氧核酶具有自磷酸化催化功能，可以固定在细胞膜表面。
一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，脱氧核酶催化底物ATP分子的γ-磷酸基团移到脱氧核酶自身序列的5'-羟基端，磷酸化的脱氧核酶再与SEQ ID NO.3所示的具有荧光猝灭基团(QDO)的DNA链进行碱基互补配对，利用λ噬菌体核酸外切酶(λ-exo)将5'-磷酸化的脱氧核苷酸核酶切割至短链，产生荧光信号，完成细胞外ATP分子传感。
进一步地，上述技术方案中，一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，包括以下步骤：
a)对SEQ ID NO.1所示的ATP识别分子进行荧光标记，形成SEQ ID NO.2所示的所示的脱氧核酶；
b)在脱氧核酶的3'端修饰胆固醇分子，使脱氧核酶可与细胞膜反应，将脱氧核酶固定在细胞膜表面；
c)将细胞在玻璃基培养皿中孵育；
d)向细胞玻璃基培养皿中加入脱氧核酶，进行孵育，使脱氧核酶被固定在细胞膜表面，固定后采用洗涤液洗涤细胞；
e)向步骤d)中的细胞加入带有金属离子辅助因子的缓冲溶液，用于辅助脱氧核酶自磷酸化催化过程；
f)对步骤e)中的细胞进行刺激，使细胞释放出ATP分子；
g)向步骤f)中的细胞中加入SEQ ID NO.3所示的荧光猝灭试剂(QDO)和λ噬菌体核酸外切酶(λ-exo)，在37℃下孵育；
h)采用激光扫描共焦显微镜对细胞进行成像，激发和发射波长与所用荧光标记的分子的激发和发射波长相匹配，使用Image J软件计算定量数据。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤a)中荧光标记的分子为FAM或者Cy5。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤d)中向细胞玻璃基培养皿中加入脱氧核酶的浓度为100～300nmol/L，洗涤液成分为20～30mmol/L HEPES，120～140mmol/L NaCl，5～10mmol/L KCl，1～3mmol/L CaCl2，2～4mmol/L MgCl2，3～6mmol/L葡萄糖。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤e)中带有金属离子辅助因子的缓冲溶液中的金属离子包括Mn2+、Cd2+或Zn2+，在Cd2+或Zn2+的作用下，脱氧核酶的活性略有降低，优化的Mn2+的最佳浓度为10mmol/L；所述带有金属离子辅助因子的缓冲溶液还包括100～120mmol/L HEPES，600～900mmol/L NaCl，100～300mmol/L KCl。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤f)中的刺激包括化学刺激或者物理刺激，所述化学刺激包括谷氨酸刺激、凝血酶刺激或钙离子刺激，所述物理刺激包括采用微电极进行电刺激、机械刺激或流体剪切应力刺激。
进一步地，上述技术方案中，所述步骤g)中的λ噬菌体核酸外切酶(λ-exo)的最终浓度为20～30μmol/L，荧光猝灭试剂(QDO)的最终浓度为1～3μmol/L。
一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速检测试剂盒，包括SEQ ID NO.2所示的脱氧核酶、带有Mn2+、Cd2+或Zn2+辅助因子的缓冲溶液、SEQ ID NO.3所示的荧光猝灭试剂和λ噬菌体核酸外切酶。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明方法具有快速响应的优势(反应时间在亚秒数量级)。
2、本发明方法的特异性好，可在细胞外部环境中有效区分其他核苷酸(ADP、AMP、UTP、UDP和腺苷)，对ATP分子的传感结果更准确。
3、本发明方法可实时监测ATP的释放过程，可广泛应用于细胞生长、组织损伤、炎症和免疫移植等各种生理和病理研究过程中，可更好地理解其信号机制以及研究相关的病理、生理过程。
附图说明
图1为本发明中涉及的FDK1分子的检测原理图(a)及检测流程示意图(b)。
图2为本发明实施例1中利用FDK1分子对MCF-7细胞在添加ATP条件下的荧光传感照片。
图3为本发明实施例2中利用FDK1分子对鼠脑星形胶质细胞在谷氨酸刺激条件下的荧光传感照片，其中形式如图3(a)、3(b)分别为在谷氨酸刺激下，细胞的荧光成像照片；图3(c)为以无自磷酸化催化功能的MFDK1分子标记细胞后，在谷氨酸的刺激下，细胞的荧光照片；图3(d)为图3(a)所示细胞在不同浓度的谷氨酸刺激下，细胞的荧光/背景信号比值。
图4为本发明实施例3中对鼠脑星形胶质细胞进行机械刺激实物照片(a)及ATP分子成像荧光照片(b)。
图5为本发明实施例3中对鼠脑星形胶质细胞进行电流刺激的实验原理图(a)和在不同电流强度刺激下，ATP分子的成像荧光照片：(b)为10pA电流强度，(c)为40pA电流强度，(d)为100pA电流强度。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，通过实施例对本发明进行说明。本发明所列的这些具体实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。
表1：本发明中使用的核酸序列
Figure BDA0002924682930000051
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的SPB缓冲液(2×)：100mmol/L HEPES(pH 7.0，23℃)，800mmol/LNaCl，200mmol/L KCl，20mmol/L MnCl2。
下述实施例中的λ-exo的LEB缓冲液(1×)：67mmol/L Glycine-KOH(pH 9.4，25℃)，2.5mmol/L MgCl2，50μg/ml BSA。
下述实施例中的HB缓冲溶液(1×)：25mmol/L HEPES(pH 7.4，23℃)，137mmol/LNaCl，5mmol/L KCl，1mmol/L CaCl2，2mmol/L MgCl2，5.5mmol/L葡萄糖。
实施例1利用FDK1分子对MCF-7细胞进行成像
利用FDK1分子对MCF-7细胞进行成像，原理如图1所示，具体操作如下：
a)MCF-7细胞培养。在改良的DMEM培养基中加入10％的(v/v)的胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，置于37℃、5％CO2和95％空气的湿润气氛中培养。在收获细胞前，采用1mL的PBS洗涤细胞，然后加入1mL的0.25％(v/v)胰蛋白酶-EDTA溶液(购于Invitrogen)，在37℃下孵育5分钟，使细胞与培养皿分离，获得细胞悬浮液，将细胞悬浮液离心3000g(5分钟)后，将细胞重悬于1mL的DMEM中，将大约1×105个细胞转移至直径为35mm的玻璃基培养皿内，在37℃下孵育24h。
b)将FDK1分子固定在MCF-7细胞膜表面。取200μL的1×HB缓冲溶液加入细胞玻璃基培养皿中，其中包含100nmol/L的FDK1分子，在4℃下孵育15分钟完成FDK1分子固定，然后采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞3次。
c)MCF-7细胞的共聚焦荧光成像。在步骤b)中的玻璃基培养皿中加入200μL的1×HB缓冲溶液，其中包含10mmol/L的MnCl2和1mmol/L的ATP，在室温下孵育5分钟。再加入200μL的1×LEB缓冲溶液，其中包含20μmol/L的λ-exo(λ噬菌体核酸外切酶)和1μmol/L的QDO，于37℃下孵育10分钟，然后采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞三次。加入500μL的4％(w/v)的多聚甲醛，于室温下孵育20分钟，再采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。再加入500ng/mL的DAPI进行细胞核染色，室温下孵育10分钟，采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。最后采用激光扫描共焦显微镜测定细胞的荧光强度，激发波长为488nm，中心收集波长为520(带宽＝20nm)的检测通道用于采集FAM的荧光信号；激发波长为405nm，中心收集波长为460(带宽＝20nm)的检测通道用于采集DAPI的荧光信号，并使用Image J软件进行数据分析。在对照实验中，培养基中不加入ATP分子，或者不加入切割分子λ-exo，细胞成像照片见图2。如图2所示，在细胞培养基中加入ATP刺激后，细胞膜表面会产生荧光，而不加入ATP进行刺激，细胞膜表面则不会产生荧光；在λ-exo存在下，细胞膜表面产生明显的荧光强度，而不加入λ-exo的细胞表面仅有微弱的荧光背景值，说明λ-exo可以有效切割FDK1分子，使荧光基团与猝灭基团分离，进而产生强烈荧光。
实施例2利用FDK1分子对鼠脑星形胶质细胞在谷氨酸刺激情况下进行共聚焦荧光成像分析
利用FDK1分子对鼠脑星形胶质细胞在谷氨酸刺激情况下进行共聚焦荧光成像分析，步骤如下：
a)利用P1～P4期的小鼠幼仔来获取鼠脑星形胶质细胞。取小鼠的头部，在显微镜下用平头钳将小鼠的皮质从大脑中剥离，使用精细的钳子从皮质中仔细分离出大脑半球皮层，将获得的大脑半球皮层切碎，置于含有0.25％(v/v)trypsin-EDTA的培养基中孵育10分钟(37℃)获得鼠脑星形胶质细胞。将获得的细胞接种在25cm2的多聚L-赖氨酸包覆的培养瓶中，使用DMEM培养基进行培养，其中包含10％的(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，在37℃、5％CO2和95％空气的湿润气氛中培养，新鲜培养基每两天补充一次。约2周后，收获星形胶质细胞用于后续实验。所有动物实验均按照大连医科大学动物实验机构指导，经大连理工大学动物实验委员会批准。
b)将FDK1分子固定在鼠脑星形胶质细胞膜表面。取200μL的1×HB缓冲溶液加入细胞玻璃基培养皿中，其中包含100nmol/L的FDK1分子，在4℃下孵育15分钟完成FDK1分子固定。然后采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞3次。
c)鼠脑星形胶质细胞的共聚焦荧光成像。在步骤b)中的玻璃基培养皿中加入200μL的1×HB缓冲溶液，其中包含10mmol/L的MnCl2和2mmol/L的谷氨酸，在室温下孵育3分钟。再加入200μL的1×LEB缓冲溶液，其中包含20μmol/L的λ-exo和1μmol/L的QDO，于37℃下孵育10分钟，然后采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞三次。加入500μL的4％(w/v)的多聚甲醛，于室温下孵育20分钟。再采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。再加入500ng/mL的DAPI进行细胞核染色，室温下孵育10分钟，采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。最后采用激光扫描共焦显微镜测定细胞的荧光强度，激发波长为488nm，中心收集波长为520(带宽＝20nm)的检测通道用于采集FAM的荧光信号；激发波长为405nm，中心收集波长为460(带宽＝20nm)的检测通道用于采集DAPI的荧光信号，并使用Image J软件进行分析。在对照实验中，培养基中不加入谷氨酸进行刺激，细胞不外排ATP分子，或者不加入切割分子λ-exo，细胞的成像图见图3，图3(a)为加入谷氨酸进行刺激的细胞成像，图3(b)为不加入谷氨酸进行刺激的细胞成像，如图所示，在加入谷氨酸后，小鼠细胞膜表面产生强烈的荧光；而不加入谷氨酸刺激的细胞膜表面仅有微弱的荧光，为荧光背景信号。
d)采用不同浓度的谷氨酸刺激鼠脑星形胶质细胞，谷氨酸的浓度范围是0.1mmol/L～5mmol/L，室温下孵育3分钟，再加入200μL的1×LEB缓冲溶液，其中包含20μmol/L的λ-exo和1μmol/L的QDO试剂，于37℃下孵育10分钟，然后采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞三次。加入500μL的4％(w/v)的多聚甲醛，于室温下孵育20分钟，再采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。再加入500ng/mL的DAPI进行细胞核染色，室温下孵育10分钟，用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。最后采用激光扫描共焦显微镜测定细胞的荧光强度，激发波长为488nm，中心收集波长为520(带宽＝20nm)的检测通道用于采集FAM的荧光信号；激发波长为405nm，中心收集波长为460(带宽＝20nm)的检测通道用于采集DAPI的荧光信号，并使用Image J软件进行数据分析，细胞成像后的荧光强度-刺激物浓度关系图见图3(d)，如图所示，在谷氨酸浓度为0.1～5mmol/L的范围内，细胞膜表面的荧光强度/背景信号比值不断增加，说明在此范围内，ATP的外排释放量与谷氨酸的刺激浓度呈现正相关。
e)采用MFDK1分子固定鼠脑星形胶质细胞，并进行共聚焦荧光成像。取200μL的1×HB缓冲溶液加入细胞玻璃基培养皿中，其中包含100nmol/L MFDK1分子，在4℃下孵育15分钟完成MFDK1分子固定。然后采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞3次。其中，MFDK1分子中与自磷酸化催化功能相关的碱基序列被改变，导致MFDK1分子失去自磷酸化催化功能，用于阴性对照。
f)在步骤e中的培养皿中加入200μL的1×HB缓冲溶液，其中包含10mmol/L的MnCl2和2mmol/L的谷氨酸，在室温下孵育3分钟。再加入200μL的1×LEB缓冲溶液，其中包含20μmol/L的λ-exo和1μmol/L的QDO试剂，于37℃下孵育10分钟，然后采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞三次。加入500μL的4％(w/v)的多聚甲醛，于室温下孵育20分钟，再采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。加入500ng/mL的DAPI进行细胞核染色，室温下孵育10分钟，采用200μL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。最后采用激光扫描共焦显微镜测定细胞的荧光强度，激发波长为488nm，中心收集波长为520(带宽＝20nm)的检测通道用于采集FAM的荧光信号；激发波长为405nm，中心收集波长为460(带宽＝20nm)的检测通道用于采集DAPI的荧光信号，并使用Image J软件进行数据分析。在对照实验中，培养基中不加入谷氨酸进行刺激，细胞不外排ATP分子，或者不加入切割分子λ-exo，细胞的成像图见图3(c)为加入谷氨酸进行刺激的细胞成像。
实施例3利用FDK1分子对鼠脑星形胶质细胞在机械和电流刺激情况下进行共聚焦荧光成像分析
利用FDK1分子对鼠脑星形胶质细胞在机械和电流刺激情况下进行共聚焦荧光成像分析，步骤如下：
a)利用P1～P4期的小鼠幼仔来获取鼠脑星形胶质细胞。取小鼠的头部，在显微镜下用平头钳将小鼠的皮质从大脑中剥离，使用精细的钳子从皮质中仔细分离出大脑半球皮层。将获得的大脑半球皮层切碎，置于含有0.25％(v/v)trypsin-EDTA的培养基中孵育10分钟(37℃)获得鼠脑星形胶质细胞。将获得的细胞接种在25cm2的多聚赖氨酸包覆的培养瓶中，使用DMEM培养基进行培养，其中包含10％的(v/v)的胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，在37℃、5％CO2和95％空气的湿润气氛中培养，新鲜培养基每两天补充一次。约2周后，收获星形胶质细胞用于后续实验。所有动物实验均按照大连医科大学动物实验机构指导，经大连理工大学动物实验委员会批准。
b)将FDK1分子固定在鼠脑星形胶质细胞膜表面。将步骤a)中的细胞接种于尺寸为25.4mm×76.2mm×1mm的表面涂有聚L-赖氨酸的培养玻片，取1mL的1×HB缓冲溶液冲洗细胞培养玻片，其中包含100nmol/L的FDK1分子，在4℃下孵育15分钟完成FDK1分子固定，采用1mL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞3次。
c)在步骤b)所得细胞中加入200μL的1×HB，其中含10mmol/L的MnCl2。利用玻璃微电极轻触星形胶质细胞，对其进行机械刺激，实物照片见图4(a)。使用EPC-10双膜片钳(HEKA，德国)进行电刺激(2.9kHz低通滤波器，采样率为1kHz，微电极尖端电阻为5MΩ)。随后加入200μL的1×LEB缓冲溶液，其中包含20μmol/L的λ-exo和1μmol/L的QDO，于37℃下孵育10分钟，用1mL的1×HB洗涤细胞3次。加入500μL的4％(w/v)的多聚甲醛，于室温下孵育20分钟。，采用1mL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。再加入500ng/mL的DAPI进行细胞核染色，室温下孵育10分钟，采用1mL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。最后采用激光扫描共焦显微镜测定细胞的荧光强度，激发波长为488nm，中心收集波长为520(带宽＝20nm)的检测通道用于采集FAM的荧光信号；激发波长为405nm，中心收集波长为460(带宽＝20nm)的检测通道用于采集DAPI的荧光信号，使用Image J软件进行分析，图4(b)为对鼠脑星形胶质细胞进行机械刺激的ATP分子成像荧光照片。
d)在步骤b)所得细胞中加入200μL的1×HB，其中含10mmol/L的MnCl2。鼠星形胶质细胞接受一系列时长为500ms的去极化电流脉冲(电流强度分别为10、40和100pA)处理，原理图见图5(a)。随后加入200μL含的1×LEB缓冲溶液，其中包含20μmol/L的λ-exo和1μmol/L的QDO。细胞于37℃下孵育10分钟，用1mL的1×HB洗涤细胞3次。然后加入500μL的4％(w/v)的多聚甲醛，于室温下孵育20分钟，采用1mL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。再加入500ng/mL的DAPI进行细胞核染色，室温下孵育10分钟，采用1mL的1×HB缓冲溶液洗涤细胞两次。最后采用激光扫描共焦显微镜测定细胞的荧光强度，激发波长为488nm，中心收集波长为520(带宽＝20nm)的检测通道用于采集FAM的荧光信号；激发波长为405nm，中心收集波长为460(带宽＝20nm)的检测通道用于采集DAPI的荧光信号，细胞的成像图见图5(b)～(d)，并使用Image J软件进行分析，如图所示，细胞在不同的电流刺激下，细胞膜表面的荧光强度不同，说明在不同的电流刺激下，细胞释放的ATP含量不同，ATP的释放量与电流强度呈正相关。
SEQUENCE LISTING
<110> 大连理工大学
<120> 一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法及应用试剂盒
<130> 2021
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaagagtgg tgacgttggt gataaagacc gcgctagggt ctgcaaggga ggag 54
<210> 2
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggaagagtgg tgacgttggt gataaagacc gcgctagggt ctgcaaggga ggagtttttt 60
tttt 64
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgcggtcttt atcaccaacg tcaccactct tcc 33
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggaagagtga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcgctagggt ctgcaaggga ggagtttttt 60
tttt 64
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgcttttttt tttttttttt ttttcactct tcc 33

Claims (10)

1.一种脱氧核酶，其特征在于：所述脱氧核酶包括如SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链，在SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸链的5'端连有羟基，3'端连有胆固醇分子。
2.根据权利要求1所述的一种脱氧核酶，其特征在于：所述脱氧核酶具有自磷酸化催化功能，可以固定在细胞膜表面。
3.一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：权利要求1或2所述的脱氧核酶催化底物ATP分子的γ-磷酸基团移到脱氧核酶自身序列的5'-羟基端，磷酸化的脱氧核酶再与SEQ ID NO.3所示的具有荧光猝灭基团的DNA链进行碱基互补配对，利用λ噬菌体核酸外切酶将5'-磷酸化的脱氧核酶切割至短链，产生荧光信号，完成细胞外ATP分子传感。
4.根据权利要求3所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：包括以下步骤：
a)对SEQ ID NO.1所示的ATP识别分子进行荧光标记，形成SEQ ID NO.2所示的所示的脱氧核酶；
b)在脱氧核酶的3'端修饰胆固醇分子，使脱氧核酶可与细胞膜反应，将脱氧核酶固定在细胞膜表面；
c)将细胞在玻璃基培养皿中孵育；
d)向细胞玻璃基培养皿中加入脱氧核酶，进行孵育，使脱氧核酶被固定在细胞膜表面，固定后采用洗涤液洗涤细胞；
e)向步骤d)中的细胞加入带有金属离子辅助因子的缓冲溶液，用于辅助脱氧核酶自磷酸化催化过程；
f)对步骤e)中的细胞进行刺激，使细胞释放出ATP分子；
g)向步骤f)中的细胞中加入SEQ ID NO.3所示的荧光猝灭试剂和λ噬菌体核酸外切酶，孵育；
h)采用激光扫描共焦显微镜对细胞进行成像，激发和发射波长与所用荧光标记的分子的激发和发射波长相匹配，使用Image J软件计算荧光定量数据。
5.根据权利要求4所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：所述步骤a)中荧光标记的分子为FAM或者Cy5。
6.根据权利要求4所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：所述步骤d)中向细胞玻璃基培养皿中加入脱氧核酶的浓度为100～300nmol/L，洗涤液为20～30mmol/L HEPES，120～140mmol/L NaCl，5～10mmol/L KCl，1～3mmol/L CaCl2，2～4mmol/L MgCl2，3～6mmol/L葡萄糖。
7.根据权利要求4所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：所述步骤e)中带有金属离子辅助因子的缓冲溶液中的金属离子包括Mn2+、Cd2+或Zn2+；所述带有金属离子辅助因子的缓冲溶液还包括100～120mmol/L HEPES，600～900mmol/L NaCl，100～300mmol/L KCl。
8.根据权利要求4所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：所述步骤f)中的刺激包括化学刺激或者物理刺激；所述化学刺激包括谷氨酸刺激、凝血酶刺激或钙离子刺激，所述物理刺激包括采用微电极进行电刺激、机械刺激或流体剪切应力刺激。
9.根据权利要求4所述的一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速传感方法，其特征在于：所述步骤g)中的λ噬菌体核酸外切酶的最终浓度为20～30μmol/L，荧光猝灭试剂的最终浓度为1～3μmol/L。
10.一种基于脱氧核酶的细胞外ATP快速检测试剂盒，其特征在于：包括SEQ ID NO.2所示的脱氧核酶、带有Mn2+、Cd2+或Zn2+辅助因子的缓冲溶液、SEQ ID NO.3所示的荧光猝灭试剂和λ噬菌体核酸外切酶。
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