CN104774921A - 一种检测三价砷的化学发光传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测三价砷的化学发光器，利用了砷与核酸适配体的特异性识别特征，采用滚环放大原理制备而成，同时本发明公开了其制备方法，本发明制备的化学发光器检测速度快、检测限低、特异性高，且操作简单，快速、灵敏、便于现场检测。
Description
技术领域
本发明涉及传感器技术领域，特别涉及一种检测砷（ ）的化学发光传感器，还涉及其制备方法。
背景技术
砷，俗称砒，是一种非金属元素，广泛的存在于自然界，共有数百种的砷矿物是已被发现。砷与其化合物被运用在农药、除草剂、杀虫剂，与许多种的合金中。单质砷无毒性，砷化合物均有毒性。美国疾病控制中心(CDC) 和国际癌症研究机构(LARC) 将砷确定为第一类致癌物质。我国的“ 生活饮用水水质标准” 明确规定饮用水中砷的浓度不得高于0.01mg/L。人的饮用水以及一些食物中所含有砷主要是无机砷,包括砷（III）和五价砷的化合物, 砷（III）比五价砷毒性大，约为60倍。砷（III）易被人体摄取,可以很快的被胃肠吸收，可以导致多种疾病的发生,例如皮肤癌,肺癌和膀肤癌,还可以造成心血管疾病,对于神经系统影响也不容忽视。研究发现砷对重要的酶系统有抑制作用,产生氧化压力,影响线粒体的呼吸作用,DNA修复,基因的诱导,基因的扩增,并可能产生遗传损伤等。因而对食品、药品及饮用水中砷（III）进行检测是十分必要的。
用于检测水中砷的方法有很多，如氢化物原子荧光光谱法，原子吸收光谱法，电感耦合等离子体质谱法。然而，这些方法需要昂贵的仪器和训练有素的技术人员进行测量等缺点,而且有的只能检测到总砷的含量,无法区分砷的价态。
发明内容
本发明针对现有检测方法中仪器操作复杂，需要专业操作人员的缺点，提供了一种特异性和灵敏度高、成本低的检测砷（）的化学发光传感器的制备方法。
本发明是通过以下步骤得到的：
本发明中一共用到了3条DNA链，其序列分别是：
Aptamer： 5’-TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCG-3’（ SEQ ID NO：1）；
Probe1：5’- AGAAGTACCCGG-3’ （ SEQ ID NO：2）；
挂锁探针：
5’-p-TAGCACGGACATTTTCCCAACCCGCCCTACCCTTTTCGGGTACTTCTTTT CCCAACCCGCCCTACCCTTTTGTAACTGTTTCCTTC-3’ （ SEQ ID NO：3）；
连接探针：5’- TGT CCG TGC TAG AAG GAA ACA GTT AC-3’ （ SEQ ID NO：4）。
其中Aptamer可与砷（III）特异性结合。设计的Probe1与Aptamer中下划线部分特异性结合，挂锁探针中，黑体部分为血红素的适配体的互补序列，下划双线与Probe1部分互补配对，斜体字部分与连接探针互补配对，挂锁探针在5’端修饰磷酸基团，目的是为了与3’端结合成环。
本发明中砷（III）的检测是在均相溶液中，由紫外分光光度计来检测的，通过滚环复制技术来实现信号的放大，从而实现砷（III）的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。
均相中发生的反应主要有：在无目标物的情况下，等量的Probe1会与Aptamer的部分序列杂交。然后向溶液中加入不同浓度的三价砷离子。此时三价砷离子与Aptamer特异性结合，而Probe1则游离于均相溶液中，向溶液中加入事先准备好的环状探针，以溶液中游离出来的Probe 1为引物。在phi29 DNA 聚合酶和 dNTP 的存在引发滚环复制反应，生成很长的串联重复序列。该重复序列由多个血红素适配体组成，可以在碱性条件下形成G-四联体结构。该G-四联体结构与血红素结合后行使DNA酶的功能，可催化2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)与双氧水发生氧化还原反应而产生化学发光。
所述的制备方法，适配体与砷（III）特异性结合通过以下步骤得到的：
（1）将砷（III）的适配体（10μL,10μM）和Probe1 （10μL,10μM），加入到预先准备好的灭菌的离心管1中，振荡30s；将混匀的混合液放入95℃的水浴锅中保持10min，后放置于37℃的恒温箱中孵育1h；
（2）取一定浓度的砷（III）溶液加入到已制备好的砷（III）适配体与DNA探针的杂交溶液中，振荡30s。然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育90min。
所述的制备方法：适配体：Probe1 物质量比为1:1。
所述的制备方法，优选合成环状探针的制备方法是通过以下步骤得到的：
（1）取45μL灭菌水，6μLT4DNA连接酶buffer，挂锁探针(3μL，10μM)和连接探针(6μL，10μM)于预先准备好的灭菌的离心管2中，振荡30s。
（2）将离心管2中混匀的混合液放入95℃下孵育10min。然后在37°C下孵育2小时后将混合物冷却至室温。
（3）向离心管2中混合液中加入2μLT4DNA连接酶,于16°C下孵育3h。
（4）将离心管2中混合物在65°C下加热20分钟灭活T4 DNA连接酶。再加入2μL核酸外切酶，在37℃下孵育40min，然后在80℃下保持20min灭活核酸外切酶，即得到环状探针。将最终得到的环状探针溶液保存在4°C直至使用。
（5）所述的制备方法，优选滚环复制反应制备大量血红素适配体通过以下步骤得到：
（6）取事先准备好的环状探针10μL加入到适配体与砷（III）特异性结合的混合液中；
（7）向溶液中加入6μL phi29 DNA 聚合酶buffer,2μL phi29 DNA 聚合酶和1μLdNTP混合液，于37℃的恒温箱中孵育40min；以溶液中置换下来的Probe1为引物，来引发滚环复制反应；
所述的制备方法，化学发光检测是通过以下步骤得到的：
(1）取检测缓冲液10μL（25mM HEPES-NH4OH,20mM KCl,200mM NaCl和l%DMSO(pH=7.5)），氯化高铁血红素（1.5μL ，2mM），灭菌水50μL加入到上述混合液中，在37°C下孵育30min。
(2)在向混合液中加入ABTS2-（10μL,3mM）和H2O2（10μL,3mM）在室温下孵育10min；
(3)于420nm处，用紫外分光光度计测量其吸光值。
本发明的工作原理：
本实验设计了一与砷（III）适配体的碱基序列部分互补配对的DNA探针Probe1,加入等量的砷（III）的适配体和Probe1，在其完全杂交的情况下，向溶液中砷（III）离子后，由于砷（III）与其适配体的特异性的亲和力，从而将Probe1和砷（III）适配体的杂交部分打开，使得Probe1游离于均相溶液中。向溶液中加入事先准备好的环状探针 ，以溶液中游离出来的Probe1为引物。在 phi29 DNA 聚合酶和 dNTP 的存在引发滚环复制反应，生成很长的串联重复序列。该重复序列由多个血红素适配体组成，可以在碱性条件下形成G-四联体结构。该G-四联体结构与血红素结合后行使DNA酶的功能，可催化ABTS与双氧水发生氧化还原反应而产生化学发光。于420nm处，用紫外分光光度计测量其吸光值，砷（III）浓度越高，溶液中被置换下来的Probe1的量就越多，则RCA产物越多，发光强度就越强。
本发明基于核酸适配体与目标物的特异性识别，滚环复制技术对信号的放大以及血红素的适配体在碱性条件下可以形成G-四联体的特殊结构，并能与氯化高铁血红素结合后具有DNA酶的作用，催化ABTS与双氧水发生氧化还原反应而产生化学发光的特性构建了化学发光传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补砷（III）现有检测方法的缺陷与不足，操作简单、快速、灵敏，便于现场检测。
本发明的有益效果：
1、利用了砷（III）与核酸适配体的特异型识别的特性进行检测；
2、利用了滚环复制技术，起到了信号放大的作用，提高了检测的灵敏度；
3、该传感器的反应条件温和，反应速度快；
4、检测原理的主要过程均是在均相溶液中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；
5、制备方法简单，性能稳定，适用于食品、药品及饮用水中砷（III）的检测；
6、制备过程的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
以上有益效果在以下是实施例中体现：
附图说明
图1为本发明化学发光传感器的制作流程图：
图2为实施例1检测结果图；
图3为实施例2检测结果图；
图4为实施例3检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
一种本发明所述化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：
所述的制备方法，适配体与砷（III）特异性结合通过以下步骤得到的：
a.将砷（III）的适配体（10μL,10μM）和Probe1 （10μL,10μM），加入到预先准备好的灭菌的离心管1中，振荡30s。将混匀的混合液放入95℃的水浴锅中保持10min，后放置于37℃的恒温箱中孵育1h；
b、取一定浓度的砷（III）溶液加入到已制备好的砷（III）适配体与DNA探针的杂交溶液中，振荡30s。然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中,孵育时间分别为孵育时间分别为30,60,90,120,150min；
c、取45μL灭菌水，6μLT4DNA连接酶buffer，挂锁探针(3μL，10μM)和连接探针(6μL，10μM)于预先准备好的灭菌的离心管2中，振荡30s；
d、将离心管2中混匀的混合液放入95℃下孵育10min。然后在37°C下孵育2小时后将混合物冷却至室温；
e、向离心管2中混合液中加入2μLT4DNA连接酶,于16°C下孵育3h；
f、将离心管2中混合物在65°C下加热20分钟灭活T4 DNA连接酶。再加入2μL核酸外切酶，在37℃下孵育40min，然后在80℃下保持20min灭活核酸外切酶，即得到环状探针。将最终得到的环状探针溶液保存在4°C直至使用；
g、取事先准备好的环状探针10μL加入到适配体与砷（III）特异性结合的混合液中；
h、向溶液中加入6μL phi29 DNA 聚合酶buffer,2μL phi29 DNA 聚合酶和1μLdNTP混合液，于37℃的恒温箱中孵育40min。以溶液中置换下来的Probe1为引物，来引发滚环复制反应；
化学发光检测方法如下
i 、取检测缓冲液10μL（25mM HEPES-NH4OH,20mM KCl,200mM NaCl和l%DMSO(pH=7.5)），氯化高铁血红素（1.5μL ，2mM），灭菌水50μL加入到上述混合液中，在37°C下孵育30min。
j、向混合液中加入ABTS2-（10μL,3mM）和H2O2（10μL,3mM）在室温下孵育10min；
k、于420nm处，用紫外分光光度计测量其吸光值。
具体制作流程图如图1所示，检测结果如图2所示，优化结果孵育时间为90min为最佳。
上述过程中用到的溶液的制备方法：
1、PBS缓冲液是由方法配制：Na2HPO4 (10mM)，NaH2PO4 (10mM), NaCl (140mM), KCl (1mM), MgCl2 (1mM), CaCl2 (1mM), 最终溶液的pH值为7.4。
2、10X的缓冲液（buffer）是随聚合酶一起买来的，可直接使用。
3、配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。
4、检测缓冲液的方法配制：25mM HEPES-NH4OH,20mM KCl,200mM NaCl和l%DMSO(pH=7.5),115℃灭菌20min,冷却后保存于4℃冰箱,备用。
实施例2
一种本发明所述化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：
A.取5支离心管，将砷（III）的适配体（10μL,10μM）和Probe1 （10μL,10μM），加入到预先准备好的灭菌的离心管1,2,3,4中，振荡30s。将混匀的混合液放入95℃的水浴锅中保持10min，后放置于37℃的恒温箱中孵育1h；
b、 取相等浓度的As3+溶液，Pb2+溶液，Hg2+溶液,Mg2+溶液分别加入到已制备好的砷（III）适配体与DNA探针的杂交溶液即离心管1,2,3,4中，振荡30s。然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育90min；
c、取45μL灭菌水，6μLT4DNA连接酶buffer，挂锁探针(3μL，10μM)和连接探针(6μL，10μM)于预先准备好的灭菌的离心管5中，振荡30s；
d、将离心管5中混匀的混合液放入95℃下孵育10min。然后在37°C下孵育2小时后将混合物冷却至室温；
e、向离心管5中混合液中加入2μLT4DNA连接酶,于16°C下孵育3h；
f、将离心管5中混合物在65°C下加热20分钟灭活T4 DNA连接酶。再加入2μL核酸外切酶，在37℃下孵育40min，然后在80℃下保持20min灭活核酸外切酶，即得到环状探针。将最终得到的环状探针溶液保存在4°C直至使用；
g、取事先准备好的环状探针10μL适配体与砷（III）特异性结合的混合液中；
h、向溶液中加入6μL phi29 DNA 聚合酶buffer,2μL phi29 DNA 聚合酶和1μLdNTP混合液，于37℃的恒温箱中孵育40min。以溶液中置换下来的Probe1为引物，来引发滚环复制反应。
化学发光检测方法如下
i 、取检测缓冲液10μL（ 25mM HEPES-NH4OH,20mM KCl,200mM NaCl和l%DMSO），氯化高铁血红素（1.5μL ，2mM），灭菌水50μL加入到上述混合液中，在37°C下孵育30min。
j、向混合液中加入ABTS2-（10μL,3mM）和H2O2（10μL,3mM）在室温下孵育10min；
k、于420nm处，用紫外分光光度计测量其吸光值。
检测结果如图3所示，优化结果表明只有砷（III）可与其适配体特异性结合，该传感器表现出高的特异性。
实施例3
一种本发明所述化学发光传感器的制备方法，包括以下步骤：
a.将砷（III）的适配体（10μL,10μM）和Probe1 （10μL,10μM），加入到预先准备好的灭菌的离心管1中，振荡30s。将混匀的混合液放入95℃的水浴锅中保持10min，后放置于37℃的恒温箱中孵育1h；
b、 取一定浓度的砷（III）溶液加入到已制备好的砷（III）适配体与DNA探针的杂交溶液中，振荡30s。然后将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育90min；
c、取45μL灭菌水，6μLT4DNA连接酶buffer，挂锁探针(3μL，10μM)和连接探针(6μL，10μM)于预先准备好的灭菌的离心管2中，振荡30s；
d、将离心管2中混匀的混合液放入95℃下孵育10min。然后在37°C下孵育2小时后将混合物冷却至室温；
e、向离心管2中混合液中加入2μLT4DNA连接酶,于16°C下孵育3h；
f、将离心管2中混合物在65°C下加热20分钟灭活T4 DNA连接酶。再加入2μL核酸外切酶，在37℃下孵育40min，然后在80℃下保持20min灭活核酸外切酶，即得到环状探针。将最终得到的环状探针溶液保存在4°C备用；
g、取事先准备好的环状探针10μL适配体与砷（III）特异性结合的混合液中；
h、向溶液中加入6μL phi29 DNA 聚合酶buffer,2μL phi29 DNA 聚合酶和1μLdNTP混合液，于37℃的恒温箱中孵育40min.以溶液中置换下来的Probe1为引物，来引发滚环复制反应；
化学发光检测方法如下:
i 、取检测缓冲液10μL（25mM HEPES-NH4OH,20mM KCl,200mM NaCl和l%DMSO），其pH分别为6.0，6.5，7.0,7.5,8.0,8.5.氯化高铁血红素（1.5μL ，20mM），灭菌水50μL加入到上述混合液中，在37°C下孵育30min。
j、向混合液中加入ABTS2-（10μL,3mM）和H2O2（10μL,3mM）在室温下孵育10min；
k、于420nm处，用紫外分光光度计测量其吸光值。
检测结果如图4所示，优化可得在佳检测pH为7.5。
实施例4
一种的化学发光传感器的制备方法的标准曲线的绘制及实际应用，步骤如下：
a.将砷（III）的适配体（10μL,10μM）和Probe1 （10μL,10μM），加入到预先准备好的灭菌的离心管中，振荡30s。将混匀的混合液放入95℃的水浴锅中保持10min，后放置于37℃的恒温箱中孵育1h；
b、取不同浓度的砷（III）溶液（0.1,0.5,1,5,10,50,100,500μg/L）加入到已制备好的砷（III）适配体与DNA探针的杂交溶液中，振荡30s。将混匀的混合液放入37℃的恒温箱中孵育90min；
c、取45μL灭菌水，6μLT4DNA连接酶buffer，挂锁探针(3μL，10μM)和连接探针(6μL，10μM)于预先准备好的灭菌的离心管2中，振荡30s；
d、将离心管2混匀的混合液放入95℃下孵育10min。然后在37°C下孵育2小时后将混合物冷却至室温；
e、向离心管2混合液中加入2μLT4DNA连接酶,于16°C下孵育3h；
f、将离心管2混合物在65°C下加热20分钟灭活T4 DNA连接酶。再加入2μL核酸外切酶，在37℃下孵育40min，然后在80℃下保持20min灭活核酸外切酶，即得到环状探针。将最终得到的环状探针溶液保存在4°C备用；
g、取事先准备好的环状探针10μL适配体与砷（III）特异性结合的混合液中；
h、向溶液中加入6μL phi29 DNA 聚合酶buffer,2μL phi29 DNA 聚合酶和1μLdNTP混合液，于37℃的恒温箱中孵育40min.以溶液中置换下来的Probe1为引物，来引发滚环复制反应；
化学发光检测方法如下:
i 、取检测缓冲液10μL（ 25mM HEPES-NH4OH,20mM KCl,200mM NaCl和l%DMSO），.氯化高铁血红素（1.5μL ，2mM），灭菌水50μL加入到上述混合液中，在37°C下孵育30min。
j、向混合液中加入ABTS2-（10μL,3mM）和H2O2（10μL,3mM）在室温下孵育10min；
k、于420nm处，用紫外分光光度计测量其吸光值。
实验结果如下表所示，且该发明的最低检出限（LOD）为0.03μg/L。检测范围为0.1-500μg/L。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种检测三价砷的化学传感器，其特征在于，由以下制备方法制备而成：
1） 适配体与三价砷的特异性结合：
（1）将10μL,浓度为10μM三价砷的适配体Aptamer和10μL,浓度为10μM的 Probe1 加入灭菌的离心管1中，振荡30s；将混匀的混合液放入95℃的水浴锅中保持10min，后放置于37℃的恒温箱中孵育1h；
（2）取三价砷溶液加入到已制备好上述杂交溶液中，振荡30s，然混匀，放入37℃的恒温箱中孵育90min；
2）合成环状探针：
（1）取45μL灭菌水，6μLT4DNA连接酶buffer，3μL，10μM的挂锁探针和6μL，10μM连接探针于灭菌的离心管2中，振荡30s；
（2）将离心管2中混匀的混合液放入95℃下孵育10min；然后在37°C下孵育2小时后将混合物冷却至室温；
（3）向离心管2中混合液中加入2μLT4DNA连接酶,于16°C下孵育3h；
（4）将离心管2中混合物在65°C下加热20分钟灭活T4 DNA连接酶；
（5）再加入2μL核酸外切酶 ，在37℃下孵育40min，然后在80℃下保持20min灭活核酸外切酶，即得到环状探针；将最终得到的环状探针溶液保存在4°C；
3）取步骤2）制备的的环状探针10μL加入到步骤1）的杂交溶液中；
4）向溶液中加入6μL phi29 DNA 聚合酶buffer,2μL phi29 DNA 聚合酶和1μLdNTP混合液，于37℃的恒温箱中孵育40min；
所述Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述Probe1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述挂锁探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述连接探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种 权利要求1所述的检测三价砷的化学传感器的制备方法，其特征在于，由以下方法制备而成：
1） 适配体与三价砷的特异性结合：
（1）将10μL,浓度为10μM三价砷的适配体Aptamer和10μL,浓度为10μM的 Probe1 加入灭菌的离心管1中，振荡30s；将混匀的混合液放入95℃的水浴锅中保持10min，后放置于37℃的恒温箱中孵育1h；
（2）取三价砷溶液加入到已制备好上述杂交溶液中，振荡30s，然混匀，放入37℃的恒温箱中孵育90min；
2）合成环状探针：
（1）取45μL灭菌水，6μLT4DNA连接酶buffer，3μL，10μM的挂锁探针和6μL，10μM连接探针于灭菌的离心管2中，振荡30s；
（2）将离心管2中混匀的混合液放入95℃下孵育10min；然后在37°C下孵育2小时后将混合物冷却至室温；
（3）向离心管2中混合液中加入2μLT4DNA连接酶,于16°C下孵育3h；
（4）将离心管2中混合物在65°C下加热20分钟灭活T4 DNA连接酶；
（5）再加入2μL核酸外切酶 ，在37℃下孵育40min，然后在80℃下保持20min灭活核酸外切酶，即得到环状探针；将最终得到的环状探针溶液保存在4°C；
3）取步骤2）制备的的环状探针10μL加入到步骤1）的杂交溶液中；
4）向溶液中加入6μL phi29 DNA 聚合酶buffer,2μL phi29 DNA 聚合酶和1μLdNTP混合液，于37℃的恒温箱中孵育40min；
所述Aptamer的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述Probe1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述挂锁探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
所述连接探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
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