CN102936619B

CN102936619B - 定量检测大肠杆菌rna的方法及其专用标准品和应用

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Publication number: CN102936619B
Application number: CN201210202181.7A
Authority: CN
Inventors: 何苗; 林怡雯; 李丹; 吴舒旭
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: CN102936619A

Abstract

本发明公开了一种定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用。本发明提供的方法包括如下步骤：（1）按照如下方法制作标准曲线；将RNA标准品配制成各个浓度的标准品稀释液，然后将各个标准品稀释液反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，以实时荧光定量PCR体系中的cDNA对应的RNA拷贝数（也可对拷贝数进行数据处理，如拷贝数以10为底的对数）和Ct值制作标准曲线方程；（2）提取大肠杆菌的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，将Ct值代入所述标准曲线方程，得到大肠杆菌的RNA含量。本发明的方法可用于快速检测环境中少量的大肠杆菌，为快速检测活性大肠杆菌提供技术支持。

Description

定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用

技术领域

本发明涉及一种定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用。

背景技术

大肠杆菌（Escherichia coli)是一种食源性致病菌，会引起腹泻、恶心、出血性结肠炎等症状。近年来，由大肠杆菌引发的感染性疾病在许多国家都相继报道，已经成为世界性的环境安全性问题。

目前，大肠杆菌的传统检测方法是培养法。然而，近年的研究发现，细菌在环境压力（如高温）下可以进入“具有活性但不可培养（viable but nonculturable，VBNC）”的状态，无法用常规培养法检出，但仍然保持代谢活性和致病性，能够在环境压力解除的条件下恢复其可培养性，引发严重的微生物安全风险。已经有研究表明，大多数革兰氏阴性菌（包括大肠杆菌）也可以进入这样的状态。因此，传统培养法无法检测到处于VBNC状态的大肠杆菌而得到假阴性的结果。

PCR技术可以快速、灵敏的检测到目标菌。然而有研究表明，经过热处理后，尽管细菌已经丧失细胞活性，但作为PCR扩增模板的DNA仍可以存在数天，因此常规PCR技术无法区分活性菌与非活性菌。

与DNA相比，大多数mRNA较不稳定，其半衰期较短（仅几分钟），可以更好的作为活性菌存在的分子信标。已有大量研究证实，细菌体内mRNA的存在与其细胞活性之间存在显著关系。又有研究表明，处于VBNC状态的细菌仍具有转录活性，其体内仍可以检测到一定量的mRNA。

实时荧光定量PCR和反转录（又称逆转录）为定量检测样品中的RNA提供了技术手段。有研究者使用基因组DNA或者质粒DNA片段作为反转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测实际样品中RNA的标准品。可是，使用DNA作为标准品并没有考虑到反转录中的效率问题，从而导致检测到的RNA与实际相比减少了84%-98.6%。因此，以DNA作为检测RNA的标准品会大大低估样品中实际的RNA的含量。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用。

本发明提供了一种定量检测大肠杆菌RNA的方法，包括如下步骤：

（1）按照如下方法制作标准曲线；将RNA标准品配制成各个浓度的标准品稀释液，然后将各个标准品稀释液反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，以实时荧光定量PCR体系中的cDNA对应的RNA拷贝数（也可对拷贝数进行数据处理，如拷贝数以10为底的对数）和Ct值制作标准曲线方程；

（2）提取大肠杆菌的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，将Ct值代入所述标准曲线方程，得到大肠杆菌的RNA含量。

所述RNA标准品可为所述大肠杆菌的部分核酸片段。

所述步骤（1）的所述实时荧光PCR和所述步骤（2）中的所述实时荧光PCR的反应体系和反应条件均可相同。

所述RNA标准品具体可为序列表的序列6所示的单链RNA分子。

所述实时荧光PCR采用的引物对具体可为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。

所述标准曲线具体为一元线性回归曲线。

所述实时荧光定量PCR的退火温度具体可为55.5°C。

以上任意所述方法均可应用于检测大肠杆菌活菌数（一个拷贝数的RNA可以代表一个活菌）。

所述检测大肠杆菌活菌数具体可为检测水样中的大肠杆菌活菌数。

本发明还保护序列表的序列6所示的单链RNA分子。

本发明还保护序列表的序列1所示的双链DNA分子。

本发明还保护定量检测大肠杆菌RNA的特异引物对，由序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成。

本发明还保护一种定量检测大肠杆菌RNA（或检测大肠杆菌活菌数）的试剂盒，包括标准品和特异引物对；所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。

本发明还保护标准品和/或特异引物对在制备定量检测大肠杆菌RNA的试剂盒（或制备检测大肠杆菌活菌数的试剂盒）中的应用；所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。

本发明还保护序列表的序列6所示的单链RNA分子和/或特异引物对在检测大肠杆菌活菌数中的应用；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。

由于细菌的RNA较不稳定，半衰期短，因此可以作为活性菌的分子信标。本发明提供的方法中，将RNA用作定量RNA拷贝数的标准品（标准品和待测RNA一样进行了反转录，从而扣除了反转录效率的影响），可以更准确的定量大肠杆菌RNA，从而更准确的检测待测样本中的大肠杆菌数量。

本发明采用的标准品具有广谱识别和特异性相结合的特点，敏感性高，制备方法简便，可以长期保存，纯度好，线性检测范围宽，可以用于环境样品中大肠杆菌的快速定量检测。定量PCR具有快速、灵敏的优点。因此，本发明的方法可用于快速检测环境中少量的大肠杆菌，为快速检测活性大肠杆菌提供技术支持。

附图说明

图1为采用各个退火温度得到的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为采用引物对乙进行特异性验证中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为采用各个稀释液反转录的cDNA为模板的PCR扩增曲线图。

图4为标准曲线图。

图5为采用各个稀释液反转录的cDNA为模板的溶解曲线图。

图6为采用各个稀释液反转录的cDNA为模板的琼脂糖凝胶电泳图。

图7为实施例5中的溶解曲线图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli)，又称大肠杆菌：中国普通微生物菌种保存管理中心（网址为http://www.cgmcc.net/），CGMCC编号为1.2385。

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）：美国模式培养物集存库（ATCC，网址为www.atcc.org/），ATCC编号为14028。

耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）：中国普通微生物菌种保存管理中心（网址为http://www.cgmcc.net/），CGMCC编号为CGMCC 1.562。

实施例1、引物的合成与标准品的制备

一、引物的设计与合成

对大肠杆菌的基因组DNA进行分析，选取uidA基因的部分序列，根据该序列设计两对引物（引物对甲和引物对乙）。

引物对甲由uidA-T7-F和uidA-T7-R组成，靶序列为序列表的序列1所示的双链DNA分子，为921bp。

uidA-T7-F（序列2）：5'-taatacgactcactataggggcgttacaagaaagcc-3'；

uidA-T7-R（序列3）：5-gcatctcttcagcgtaagggtaatgcga-3'。

引物对乙由uidA-F和uidA-R组成，靶序列为序列表的序列1自5’末端第257至443位核苷酸所示的双链DNA分子，为187bp。

uidA-F（序列4）：5'-cgatgtcacgccgtatgttatt-3'；

uidA-R（序列5）：5'-ggtgtagagcattacgctgcg-3'。

分别合成以上各条引物。

二、标准品的制备

1、提取大肠杆菌的基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

3、将步骤2的PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，利用TaKaRa切胶回收试剂盒（TaKaRa Code：DV805A）回收约921bp的DNA片段。

4、采用promega体外转录试剂盒（promega Code：P1320）将步骤3回收的DNA片段进行体外转录，获得与所述DNA片段对应的RNA片段（标准品）。

三、标准品的测序

1、将步骤二获得的标准品进行反转录，获得与其对应的cDNA。

2、采用天根DNA纯化回收试剂盒（Code：DP214）回收纯化步骤1得到的cDNA。

3、将步骤2得到的cDNA进行测序，测序结果如序列表的序列1所示（序列1中，自5’末端第1至20位核苷酸为T7启动子）。测序结果表明，步骤二得到的标准品为序列表的序列6所示的单链RNA。

实施例2、标准品的梯度稀释

检测RNA拷贝数的方法：利用超微量核酸蛋白测定仪（NanoDrop ND-2000C，美国）测定RNA浓度，然后按照如下公式计算RNA拷贝数：

6.02×10²³为阿伏伽德罗常数；340（Da）为RNA的一个碱基的相对分子质量。

将实施例1制备得到的标准品用无菌水依次稀释，得到稀释液1至稀释液8，其中RNA的浓度依次为：9.6186×10⁸拷贝数/μL、9.6186×10⁷拷贝数/μL、9.6186×10⁶拷贝数/μL、9.6186×10⁵拷贝数/μL、9.6186×10⁴拷贝数/μL、9.6186×10³拷贝数/μL、9.6186×10²拷贝数/μL和9.6186×10¹拷贝数/μL。

实施例3、定量检测大肠杆菌活菌RNA的方法的建立

一、引物退火温度的优化

1、以实施例1得到的标准品反转录后的cDNA为模板，采用采用实施例1合成的引物对乙进行PCR扩增。

PCR反应体系为（20μL）：10×PCR Buffer 2μL，25mM MgCl₂1.6μL，10mM dNTP1.6μL，上游引物（20μM）1μL，下游引物（20μM）1μL，模板2μL（约100ng），Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.4μL，去离子水10.4μL。

PCR反应程序95°C 10min；95°C 30s、退火20s、72°C 20s，40个循环；72°C，5min；反应结束后4°C保存。分别采用51°C、52°C、53.7°C、54.4°C和55.5°C作为退火温度。

2、将步骤1的PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1（图1中，泳道1至5依次为采用51°C、52°C、53.7°C、54.4°C、55.5°C作为退火温度得到的PCR扩增产物）。退火温度为55.5°C时，扩增效果最好。

二、引物的特异性验证

分别将大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和耻垢分枝杆菌进行如下步骤：

1、提取菌株的基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用实施例1合成的引物对乙进行PCR扩增。

PCR反应体系同步骤一。

PCR反应程序：采用55.5°C的退火温度，其它同步骤一。

3、将步骤2的PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。

图2中，M为DNA Marker（DL 2000），1为阴性对照（以水为模板），2为阳性对照（以实施例1得到的标准品反转录后的cDNA为模板），3为大肠杆菌，4为鼠伤寒沙门氏菌，5为耻垢分枝杆菌。5个泳道中，只有阳性对照和大肠杆菌具有187bp的目标条带。结果表明，引物对乙特异性针对大肠杆菌，与鼠伤寒沙门氏菌和耻垢分枝杆菌无交叉反应。

三、qPCR检测限、定量区间及标准曲线的制定

将实施例2制备的稀释液1至稀释液8（各2μL）分别进行反转录实时荧光定量PCR，具体步骤如下：将稀释液作为模板进行反转录，得到cDNA；采用天根DNA纯化回收试剂盒（Code：DP214）回收各个cDNA并作模板，进行实时荧光定量PCR（qPCR）。

qPCR反应体系为20μL，溶剂为水，其中含有模板（将2μL稀释液反转录得到的cDNA）、10μL 2×Premix Ex Taq^TM、0.5μmol/L uidA-F、0.5μmol/L uidA-R。采用将2μL稀释液（依次为稀释液1至稀释液8）反转录得到的cDNA作为模板，qPCR反应体系中的cDNA反转录前的RNA量分别为：1.92×10⁹、1.92×10⁸、1.92×10⁷、1.92×10⁶、1.92×10⁵、1.92×10⁴、1.92×10³、1.92×10²拷贝。

qPCR反应程序：1个循环：95°C 10min；

40个循环：95°C 30s、55.5°C 20s、72°C 20s，在退火过程中收集荧光；

熔解曲线过程：95°C 1min，从60°C开始每30s温度升高0.5°C，结束温度为95°C。

PCR扩增曲线见图3。图3中，自左至右的8条扩增曲线分别为采用2μL稀释液（依次为稀释液1至稀释液8）反转录得到的cDNA作为模板。从图中可以看出，扩增曲线平滑，扩增效果较好。

标准曲线见图4。标准曲线方程为：y=-3.1502x+32.757，R²＝0.99933，y代表临界循环数，x代表qPCR反应体系中的cDNA对应的RNA量（log₁₀拷贝数）。最低检测限为1.92×10²copies/反应，定量检测区间为1.92×10²-1.92×10⁹copies/ul，扩增效率E=10^1/3.1502-1=1.077，即107.7%。

溶解曲线见图5。可以看出，8条曲线一致，均曲线平稳，峰尖且窄，熔解温度为83.5±0.5°C，证明该PCR扩增产物极为特异。

将qPCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图6。图5中，M为DNA Marker（DL2000），2-9依次为采用稀释液8至稀释液1反转录得到的cDNA作为模板的qPCR体系，10为阳性对照（以实施例1得到的标准品反转录后的cDNA为模板），N为阴性对照（以水为模板）。

四、qPCR检测方法的重复性

分别进行6次实施例1，得到6个批次的标准品。将每个批次的标准品分别反转录为cDNA并反复冻融6次，然后进行qPCR（qPCR反应体系和反应程序同步骤三），根据循环数的变异系数（CV）对重复性进行评价。

结果见表1，循环数变异系数分别为0.58%-7.48%，结果表明，标准品甲的标准曲线重复性良好。

表1标准品不同批次间重复性分析

实施例4、检测大肠杆菌活菌数量

一、待测样本的制备

1、将大肠杆菌菌液（大肠杆菌浓度为10⁹CFU/mL）作为菌液甲；将菌液甲95℃处理10min（热灭活），得到菌液乙。

2、将菌液甲和菌液乙分别以不同的体积比混合，得到待检样本；菌液甲和菌液乙分别采用以下体积比：1:999、10:990、100:900、500:500；将菌液甲作为待检样本的阳性对照。

二、定量检测待测样本中的大肠杆菌RNA

将步骤一得到的各个待测样本分别进行如下操作：

1、提取1ml待检样本的总RNA。

2、将步骤1得到的全部总RNA反转录为cDNA。

3、将步骤2得到的全部cDNA作为模板，进行qPCR（qPCR反应体系和反应程序同实施例3的步骤三）；将荧光信号7设为阈值，得到临界循环数（Ct值）；将临界循环数代入实施例3的步骤三得到的标准曲线方程，得到待测样本中的大肠杆菌RNA浓度（一个拷贝数的RNA可以代表一个细胞响应值，也就是代表一个活菌；细胞相应值的单位为CE，即copies equivalence）。

三、采用培养法定量检测待测样本中的大肠杆菌活菌数量

将步骤一得到的各个待测样本分别进行如下操作：取1ml待测样本，采用培养法定量检测待测样本中的大肠杆菌活菌浓度（以CFU计）。

培养法中采用营养肉汤培养基（BG11培养基）进行大肠杆菌培养。每升LB培养基由去离子水和如下溶质组成：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g和琼脂15g；121℃，20分钟灭菌。

步骤二和步骤三的结果见表2（四次重复试验的结果）。

表2步骤二和步骤三检测到的大肠杆菌RNA浓度

当活性菌比例为100%时，步骤二的方法与步骤三的方法检测到的大肠杆菌活菌浓度相近（平均值分别为1.25×10⁸CFU/100μL和1.22×10⁸CE/100μL）。当活性菌比例下降到0.1%时，步骤三的方法检测到的大肠杆菌活菌浓度平均值为6.18×10⁶CFU/100μL，步骤二的方法检测到的大肠杆菌活菌浓度平均值为3.18×10⁷CE/100μL，这是由于当细菌处于不利温度条件时部分进入VBNC状态，无法用培养法检测而其RNA仍然存在造成的，所以步骤二的方法检测到的大肠杆菌活菌浓度比培养法高。综上所述，步骤二的方法能够较为有效地区分活菌与非活菌。

实施例5、检测实际水环境样品中的大肠杆菌活菌数

实际水样取自再生水厂二沉池、混凝池、砂滤池三处。样品放入冰盒运回实验室，4°C保存。

一、水样浓缩（无菌操作）

1、将水样用0.45μm滤膜，然后将滤膜剪成条状置于4mL离心管中，向离心管中加入4mL PBS缓冲液。

2、将离心管置于漩涡震荡仪上剧烈震荡，然后将离心管内的液体转移至10mL离心管中，再加入4mL PBS缓冲液，然后转移至一个新的10mL离心管内。

3、将离心管4℃、12000rpm离心5min，弃去上清夜，将余下的近2mL包括沉淀在内的混合液转移至2mL离心管，4℃、12000rpm离心2min，收集沉淀（菌体）。

二、提取步骤一得到的菌体的总RNA并反转录为cDNA。

三、将步骤二得到的cDNA作为模板，进行qPCR（qPCR反应体系和反应程序同实施例3的步骤三）；将荧光信号7设为阈值，得到临界循环数（Ct值）；将临界循环数代入实施例3的步骤三得到的标准曲线方程，得到待测样本中的大肠杆菌RNA浓度（一个拷贝数的RNA可以代表一个活菌）。

熔解曲线见图7。曲线平稳，熔点曲线的熔点峰窄且尖，熔解温度为83.5±0.5°C。

检测结果见表3。

表3水环境样品中的大肠杆菌活菌数

Claims

1.一种定量检测大肠杆菌RNA的方法，所述方法不应用于临床疾病的诊断，包括如下步骤：

(1)按照如下方法制作标准曲线；将RNA标准品配制成各个浓度的标准品稀释液，然后将各个标准品稀释液反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，以实时荧光定量PCR体系中的cDNA对应的RNA拷贝数和Ct值制作标准曲线方程；所述RNA标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子；

(2)提取大肠杆菌的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，除模板以外，所述步骤(1)的所述实时荧光PCR和所述步骤(2)中的所述实时荧光PCR的反应体系和反应条件相同，将Ct值代入所述标准曲线方程，得到大肠杆菌的RNA含量；

所述实时荧光PCR采用的引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。

2.权利要求1所述方法在检测大肠杆菌活菌数中的应用，所述应用不包括应用于临床疾病的诊断。

3.一种试剂盒，包括标准品和特异引物对；所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对；所述试剂盒的功能为定量检测大肠杆菌RNA或检测大肠杆菌活菌数。

4.标准品和特异引物对在制备试剂盒中的应用；所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对；所述试剂盒的功能为定量检测大肠杆菌RNA或检测大肠杆菌活菌数。

5.序列表的序列6所示的单链RNA分子和特异引物对在检测大肠杆菌活菌数中的应用，所述应用不包括应用于临床疾病的诊断；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。