CN110964843A - 用于锥虫基因检测的特异性引物、探针、试剂盒和芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测克氏锥虫的特异性引物，其序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；还提供了一种用于检测布氏锥虫的特异性引物，其序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；还提供了用于检测布氏罗得西亚锥虫的特异性引物，其序列如SEQ ID No.5和如SEQ ID No.6所示；还提供了用于检测布氏冈比亚锥虫的特异性引物，其序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；还提供了用于检测锥虫的探针，序列如SEQ ID No.9～26所示。还提供了用于检测锥虫的试剂盒和芯片。本发明可特异性地针对锥虫感染情况进行鉴别诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及检测锥虫基因，具体来说是一种用于锥虫基因检测的特异性引物、探针、试剂盒和芯片。
背景技术
锥虫病(trypanosomiasis)是由非洲锥虫和美洲锥虫引起的血液原虫病。非洲锥虫病由布氏冈比亚锥虫(Trypanosoma brucei gambiense)和布氏罗得西亚锥虫(Trypanosoma brucei rhodesiense)引起，前者分布于非洲西部和中部，传播媒介是须舌蝇；后者分布于非洲东部，传播媒介是刺舌蝇。
非洲锥虫病也称为睡眠病，布氏冈比亚锥虫引起的昏睡病占所有报告病例的95％以上，且常为慢性感染。患者可感染数月或甚至数年而没有明显的症状。出现症状时，患者常常已到疾病晚期，中枢神经系统受到影响。布氏罗得西亚锥虫通常引起急性感染，在感染之后数月或数周可观察到最初的症状，患者的中枢神经系统受到损害。
美洲锥虫病又称为恰加斯病(Chagas disease)，由克氏锥虫(Trypanosomacruzi)引起，传播媒介是锥蝽。该病主要发生在21个拉丁美洲国家，多见于儿童，急性期表现为发热、全身性淋巴结肿大和心脏扩大。慢性期则以心肌炎、心脏扩大、食道或结肠扩张为主要特征。
锥虫病一般发生在卫生条件较差边远乡村地区，疾病的严重程度在村庄之间有所不同。我国不是锥虫病流行区，也无采采蝇分布，但部分地区有锥蝽分布，一旦美洲锥虫病输入我国，有可能造成局部传播。随着我国国际交往、劳务输出和跨境旅游人数的增长，锥虫病的输入性风险也随之增加，迫切需要我国政府对该病引起高度重视。
病原学检查是锥虫检测的金标准，但很多时候病原学检出率较低，这就需要通过免疫学检测方法、分子生物学等其他辅助检测。目前，用于锥虫的免疫学检测方法主要有：胶体金免疫层析法(GICA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接荧光抗体试验(IFAT)；分子生物学有聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR等。但其检测的通量有限，无法一次同时检测多种血液原虫感染。
基因芯片(Gene chip)又称DNA芯片(DNA Chip)、DNA阵列(DNA arrays)或寡核苷酸芯片(oligonucleotide micro-chip)。该技术是将一些特定的基因片段或寡核苷酸片段有序地固定在固相载体上，然后与标记后的待测样品按碱基互补配对原则进行DNA杂交，再通过芯片扫描仪扫描杂交结果信号，利用芯片分析软件对信号进行比对，获得杂交结果信息，该技术可用于基因的高通量、规模化、集约化、平行化的信息分析和相关功能研究。九十年代初，由美国Affymetrix公司提出并开展基因芯片技术研究开始，如今，该技术已在生物医学、生命科学、人类遗传学、医学检验等各个领域中获得应用并取得突出成果。该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。用基因芯片检测锥虫18S等基因，发挥基因芯片高通量、操作简单、快速、结果准确的特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于锥虫基因检测的特异性引物、探针、试剂盒和芯片，所述的这种用于锥虫基因检测的特异性引物、探针、试剂盒和芯片要解决现有技术中检测锥虫的过程复杂、通量地、耗费人力和时间的技术问题。
本发明提供了一种用于检测克氏锥虫的引物，其引物序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；
本发明提供了一种用于检测布氏锥虫的引物，其引物序列如SEQ ID No.3所示；下游引物的序列如SEQ ID No.4所示；
本发明提供了一种用于检测布氏罗得西亚锥虫的引物，其引物序列如SEQ IDNo.5所示；下游引物的序列如SEQ ID No.6所示；
本发明提供了一种用于检测布氏冈比亚锥虫的引物，其引物序列如SEQ ID No.7所示；下游引物的序列如SEQ ID No.8所示；
进一步的，所述的SEQ ID No.1～8的核苷酸序列5’端用生物素、地高辛、荧光素、荧光素衍生物、荧光分子、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶进行修饰。
本发明还提供了一批用于检测锥虫的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.9～17所示。
进一步的，所述的锥虫基因为18S。
本发明还提供了一批用于检测克氏锥虫的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.18～20所示。
进一步的，所述的克氏锥虫基因为18S。
本发明还提供了一批用于检测布氏罗得西亚锥虫的探针，所述探针的序列如SEQID No.21～23所示。
进一步的，所述的布氏罗得西亚锥虫基因为p67。
本发明还提供了一批用于检测布氏冈比亚锥虫的探针，所述探针的序列如SEQ IDNo.24～26所示。
进一步的，所述的布氏冈比亚锥虫基因为hp。
本发明还提供了一种用于检测锥虫的试剂盒，所述的试剂盒中含有用于检测锥虫的引物，其引物的序列如SEQ ID No.1～8所示；还含有用于检测锥虫的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.9～26所示。
本发明还提供了一种用于检测锥虫的芯片，其特征在于：含有用于检测锥虫的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.9～26所示。
利用上述引物对及特异性寡核苷酸探针检测锥虫的方法，步骤包括：
(1)制备待测样本的基因组DNA；
(2)采用聚合酶链反应方法扩增锥虫基因；用上述的引物对进行扩增；
(3)将所得扩增产物与杂交缓冲液混合；
(4)将上述混合液与锥虫基因检测芯片杂交；所述的基因检测芯片包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的特异寡核苷酸探针；
(5)检测芯片的杂交信号
步骤(5)中检测杂交信号的方法选自碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应，辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺显色反应，或荧光检测。
上述特异性寡核苷酸探针用于制备锥虫基因检测芯片或试剂盒。
上述的引物对用于制备锥虫基因检测芯片或试剂盒。
本发明还提供一种用于锥虫基因检测的试剂盒，该试剂盒包含上述的检测芯片和使用说明书。
上述基因芯片的制备可按照生物芯片的常规制造方法进行。
本发明和已有技术相比，其技术进步是积极和明显的。本发明采用基因芯片技术，利用特异性的引物和探针可以高效准确的从样本中扩增出目的片段，检测锥虫的感染情况，为锥虫病的诊断和疾病监测提供便利。而且操作简便、快速高效、结果准确、成本可控。
附图说明
图1为实施例1本发明基因芯片上的一种点样列阵。
图2为实施例5中，用实施例1的芯片和探针检测锥虫基因时所得结果的照片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)
实施例1基因芯片的制备
人工合成以下特异性探针，用水溶解为100pmol/μL浓度的溶液，然后用2×点样buffer(产品编号：BST02010，上海百傲科技有限公司)等比混合。接着，用点样仪按说明书所述方法，在醛基修饰的载玻片(产品编号：BST03011，上海百傲科技有限公司)上点制如图1的阵列。室温放置过夜。
如图1所示，载玻片上点上质控探针、阴性对照探针、阳性对照探针和锥虫探针。其中，QC为质控探针，NC为阴性探针，PC为阳性探针，Trypanosoma 1～12为锥虫探针；T.cruzi1～3为克氏锥虫探针；T.b.rhodesiense 1～3为布氏罗得西亚锥虫探针；T.b.gambiense 1～3为布氏冈比亚锥虫探针。
用于检测锥虫的探针序列如SEQ ID No.9～17所示。
用于检测克氏锥虫的探针序列如SEQ ID No.18～20所示。
用于检测布氏罗得西亚锥虫的探针序列如SEQ ID No.21～23所示。
用于检测布氏冈比亚锥虫的探针序列如SEQ ID No.24～26所示。
SEQ ID No.9:tgcatgggttgataccccgcttttggtcaaggtggagtga
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SEQ ID No.24:gcgagtgccttcgcaattctgttccgttacttagcgctgc
SEQ ID No.25:acacgagacctccgagcatctttcttgtaaacccacgggc
SEQ ID No.26:gcaggtggcatggaagttctgaagggcctaaagcgtacag
实施例2染色体DNA的制备
使用QIAmp DNA Mini kit250血样DNA提取试剂盒(Qiagen)按说明书操作如下：
(1)取待检血样100μL，加入100μL PBS后，再加入20μL蛋白酶K；
(2)加入200μL AL缓冲液，混合均匀后置于56℃水浴反应10min；
(3)加入200μL无水乙醇，混匀；
(4)将上述反应体系移至过滤管，8000rpm离心1min后，将吸附柱转移至新的2ml空管中；
(5)加AW1溶液500μL，8000rpm，离心1min，丢弃滤液；
(6)加AW2溶液500μL，14000rpm，离心3min，丢弃滤液；
(7)不加法洗涤液，14000rpm，1min离心，空转去除柱上多余的溶液；将吸附柱转移至1.5mL空管中，加入150μL Buffer AE，室温放置1min后，8000rpm离心1min将柱上DNA洗脱下来，置于-20℃，保存备用。
实施例3用本发明提供的引物通过PCR方法扩增锥虫基因
委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物，引物信息如下。
用于扩增克氏锥虫18S基因的引物序列为：
SEQ ID NO.1：上游5’-CGAACAACTGCCCTATCA-3’，
SEQ ID NO.2：下游5’-ACGACTTTTGCTTCCTCT-3’。
用于扩增布氏锥虫18S基因的引物序列为：
SEQ ID NO.3：上游5’-TTCTACGGAGGGCAGCAGGC-3’，
SEQ ID NO.4：下游5’-CTGTAACCTCAAAGCTTTCGCGT-3’。
用于扩增布氏罗得西亚锥虫P67基因的引物序列为：
SEQ ID NO.5：上游5’-CTCTGCGCTTTTGTCTGA-3’，
SEQ ID NO.6：下游5’-TACGCCCCACTGCTTTCC-3’。
用于扩增布氏冈比亚锥虫HP基因的引物序列为：
SEQ ID NO.7：上游5’-TTTATCGGAAAACCCAACG-3’，
SEQ ID NO.8：下游5’-CTACGCAGCCCAGAAACC-3’。
并且，引物5’端用生物素进行修饰。
然后用水溶解并稀释至50pmol/μL。将购置的Taq酶(TaKaRa)、10×PCR buffer(TaKaRa)、MgCl2(TaKaRa)、dNTPs(TaKaRa)、ddH2O以及实施例2获得的PCR模板按以下表1配方配置PCR扩增体系：
表1 PCR扩增体系
用PCR仪(TC-96/G/H PCR扩增仪，杭州博日)按如下程序扩增：
94℃5min，然后94℃30sec、50℃30sec、72℃1min 30sec做35个循环，最后72℃延伸10min。
实施例4用实施例1制成的基因芯片与实施例3的PCR产物杂交
采用上海百傲科技有限公司出品的杂交显色试剂盒(BST03021)，在
全自动杂交仪(上海百傲科技有限公司：BST03011)，按以下方法进行杂交：杂交显色试剂盒为碱性磷酸酶显色反应。
(1)杂交反应液配置：吸取150μL杂交液，加入实施例3中扩增产物各10μL，混匀。
(2)按表2设置反应程序，按表要求用量分装各试剂。并将各试剂放入指定位置内，运行程序，杂交显色反应自动进行。
表2杂交体系和反应程序
实施例5基因芯片杂交信号的检测
将杂交并洗涤完毕的基因芯片至于晶芯
10K-A微阵列芯片扫描仪(北京博奥生物有限公司)上扫描后得到如图2所示的检测结果。检测结果经测序结果验证完全符合。
效果检测，采用上述引物和探针对3份样本进行检测，并采用测序方法进行验证。结果显示，3例测序结果与检测结果全部一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所
<120> 用于锥虫基因检测的特异性引物、探针、试剂盒和芯片
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgaacaactg ccctatca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgacttttg cttcctct 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttctacggag ggcagcaggc 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgtaacctc aaagctttcg cgt 23
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctctgcgctt ttgtctga 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tacgccccac tgctttcc 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttatcggaa aacccaacg 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctacgcagcc cagaaacc 18
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcatgggtt gataccccgc ttttggtcaa ggtggagtga 40
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacaagcggc tgggtggtta ttccacacac acacacacac 40
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtgtggcact cgtcgccttt gtgggaaatc cgtgtggcac 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcctttgtgg gaaatccgtg tggcacgtgt tttgtgtgtt 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaatccgtgt ggcacgtgtt ttgtgtgttg ttggcagaga 40
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcacgtgttt tgtgtgttgt tggcagagac ttcggtcttt 40
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgtgttgttg gcagagactt cggtcttttg cccttcgcat 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaccaaagtg tggggatcga agactgatta gagaccattg 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tccctggctt gttgttcctc gtctcgccaa ttgaatatat 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tctttcccac atgtgtcatg ccttccctca actcagtatg 40
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggcgcaatgg tttagtccca tccacttcgg acttggtaga 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcatcccgtt cctcgtctcg ccaatgaata tattaaattt 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcccctgctg acgaacggtt ggatcggatg aagctgttaa 40
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
actcgtgccc ctgctgacga acggttggat cggatgaagc 40
<210> 23
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgcccctgct gacgaacggt tggatcggat gaagctgtta 40
<210> 24
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcgagtgcct tcgcaattct gttccgttac ttagcgctgc 40
<210> 25
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
acacgagacc tccgagcatc tttcttgtaa acccacgggc 40
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcaggtggca tggaagttct gaagggccta aagcgtacag 40
Claims (10)
1.一种用于检测克氏锥虫的引物，其特征在于：其上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种用于检测布氏锥虫的引物，其特征在于：其上游引物的序列如SEQ ID No.3所示；下游引物的序列如SEQ ID No.4所示。
3.一种用于检测布氏罗得西亚锥虫的引物，其特征在于：其上游引物的序列如SEQ IDNo.5所示；下游引物的序列如SEQ ID No.6所示。
4.一种用于检测布氏冈比亚锥虫的引物，其特征在于：其上游引物的序列如SEQ IDNo.7所示；下游引物的序列如SEQ ID No.8所示。
5.一种用于检测锥虫的探针，其特征在于：所述探针的序列如SEQ ID No.9～17所示。
6.一种用于检测克氏锥虫的探针，其特征在于：所述探针的序列如SEQ ID No.18～20所示。
7.一种用于检测布氏罗得西亚锥虫的探针，其特征在于：所述探针的序列如SEQ IDNo.21～23所示。
8.一种用于检测布氏冈比亚锥虫的探针，其特征在于：所述探针的序列如SEQ IDNo.24～26所示。
9.一种用于检测锥虫的试剂盒，其特征在于：有用于检测锥虫的引物，其引物的序列如SEQ ID No.1～8所示；还含有用于检测锥虫的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.9～26所示。
10.一种用于检测锥虫的芯片，其特征在于：含有用于检测锥虫的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.9～26所示。
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2020
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