CN116716420A - 一种用于多重pcr-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探针、引物、试剂及应用 - Google Patents

一种用于多重pcr-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探针、引物、试剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于多重PCR‑反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探针，包括十三种氨基标记特异性杂交探针，碱基序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：13所示，且各探针的5’端均标记有氨基。本发明提供了一种用于多重PCR‑反向斑点杂交技术检测肠道病原体的引物，序列分别如SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23所示，5’端均标记有生物素。本发明还提供了一种用于多重PCR‑反向斑点杂交技术检测肠道病原体的试剂以及基于多重PCR‑反向斑点杂交技术检测肠道病原体的方法。本发明的优点在于：具备快速、便捷、成本低以及适应性强等特点，可不依赖细菌培养即可同时鉴定十三种腹泻病原体。

Description

一种用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探 针、引物、试剂及应用
技术领域
本发明涉及医疗检测技术领域，尤其涉及一种用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探针、引物、试剂及应用。
背景技术
肠道病原体常常污染食物或水进入人体消化道，并最终定植在肠道，从而引起感染性腹泻等疾病。然而，各种肠道病原体引起的腹泻症状大多相同，难以区分，很大程度上依赖于临床实验室进行鉴定。
目前，临床微生物实验室中传统的细菌鉴定是使用表型测试进行的，包括革兰染色涂片和生化测试，并考虑培养要求和生长特征，细菌培养仍然是鉴定病原体的金标准，通常需要2～3天甚至更长时间才能获得最终结果。腹泻病毒大都采用QPCR检测或者抗原检测，QPCR和抗原都是特异性的，仅仅针对一种病毒。这些方法都很难用于快速同时检测多种肠道病原体，这不仅延误患者的最佳治疗时机，疾病预防控制中心也无法迅速采取有效措施。
新世纪以来，许多分子生物学技术应用到腹泻病原体的检测中，如聚合酶链式反应(PCR)、高通量测序扩增的16S rDNA基因等，但这些方法通常仅能鉴别一种或几种病原体，并且依赖大型仪器设备，费用昂贵，不适合大规模筛查。
因此，目前迫切需要一种能够实现多种肠道病原体快速同时检测的方法，这对感染性腹泻的临床诊断与用药具有重要的指导意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探针、引物、试剂及应用，其可实现多种肠道病原体的快速同时检测，适用于感染性腹泻患者的快速早期便捷式诊断。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探针，包括沙门氏菌探针、志贺氏菌探针、副溶血弧菌探针、空肠弯曲菌探针、类志贺邻单胞菌探针、艰难梭菌探针、产气荚膜梭菌探针、金黄色葡萄球菌探针、产单核李斯特菌探针、蜡样芽孢杆菌探针、小肠结肠炎耶尔森菌探针、GⅡ型诺如病毒探针、轮状病毒探针，这十三种氨基标记特异性杂交探针；所述十三种氨基标记特异性杂交探针的碱基序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：13所示，且各探针的5’端均标记有氨基。
所述沙门氏菌探针、志贺氏菌探针、副溶血弧菌探针、空肠弯曲菌探针、类志贺邻单胞菌探针、艰难梭菌探针、产气荚膜梭菌探针、金黄色葡萄球菌探针、产单核李斯特菌探针、蜡样芽孢杆菌探针、小肠结肠炎耶尔森菌探针、GⅡ型诺如病毒探针、轮状病毒探针，分别用于针对沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌、类志贺邻单胞菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、产单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、GⅡ型诺如病毒、轮状病毒检测。
作为本发明的优选方式之一，还包括内参探针和氨基酸阳性对照探针；所述内参探针的碱基序列如SEQ ID NO：14所示，探针的5’端标记有氨基；所述氨基酸阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO：15所示，探针的5’端标记有氨基，3’端标记有生物素。
一种上述基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探针在制备肠道病原体检测产品中的应用。
一种用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的PCR扩增引物，包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4；
所述引物对1用于针对沙门氏菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌、类志贺邻单胞菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、产单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌16S rDNA，包括如SEQ ID NO.16所示的16SrRNA-F以及如SEQ ID NO.17所示的16SrRNA-R，各引物的5’端标记有生物素；
所述引物对2用于针对志贺氏菌ipaH基因，包括如SEQ ID NO.18所示的IpaH-F以及如SEQ ID NO.19所示的IpaH-R，且各引物的5’端标记有生物素；
所述引物对3用于针对GⅡ型诺如病毒RdRp区，包括如SEQ ID NO.20所示的RdRp-F以及如SEQ ID NO.21所示的RdRp-R，各引物的5’端标记有生物素；
所述引物对4用于针对轮状病毒NSP基因，包括如SEQ ID NO.22所示的NSP-F以及如SEQ ID NO.23所示的NSP-R，各引物的5’端标记有生物素。
一种上述用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的PCR扩增引物在制备肠道病原体检测产品中的应用。
一种用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的试剂，包括多重核苷酸探针阵列、多重PCR体系、反向斑点杂交体系；
所述多重核苷酸探针阵列用于与肠道病原体基因进行杂交，构成方法为：将序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：13所示的十三种氨基标记特异性杂交探针用TE缓冲液稀释溶解后，分别点于活化后的尼龙膜上，晾干；接着，用NaOH浸没尼龙膜；再用45℃预热的杂交缓冲液浸没尼龙膜；所述杂交缓冲液为2×SSPE/0.1％SDS溶液；
所述多重PCR体系用于扩增肠道病原体基因，组成为：序列分别如SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23所示、且5’端均标记有生物素的引物，PCR预混液，DNA模板，ddH2O；
所述反向斑点杂交体系用于PCR扩增产物与多重核苷酸探针阵列进行杂交显色，组成为：PCR扩增产物，多重核苷酸探针阵列，杂交结合液，显色液；其中，所述杂交结合液通过将HRP标记的链霉亲和素以1：1000稀释到2×SSPE/0.1％SDS溶液中制得；所述显色液为ELSIA显色液，由TMB+H2O2制得。
作为本发明的优选方式之一，所述试剂用于手工点膜或者微流控生物芯片操作；
当用于手工点膜时：
多重PCR体系的组成为：序列分别如SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23所示、且5’端均标记有生物素的引物各1μL，PCR预混液25μL，DNA模板2μL，ddH2O 15μL；
反向斑点杂交体系的组成为：PCR扩增产物50μL，多重核苷酸探针阵列，杂交结合液2mL，显色液2mL；
当用于微流控生物芯片操作时：
每份多重PCR体系的组成为：序列分别如SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23所示、且5’端均标记有生物素的引物各0.4125μL，PCR预混液10.425μL，DNA模板2μL，ddH2O 3.775μL；共使用24样本份；
每份反向斑点杂交体系的组成为：PCR扩增产物30μL，多重核苷酸探针阵列，杂交结合液1/6mL，显色液0.125mL，共使用24样本份。
一种基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的方法，利用上述试剂对待测样品进行检测。
作为本发明的优选方式之一，包括如下具体步骤：
S1、核酸提取及RNA逆转录：
提取核酸，并进行RNA逆转录；
S2、PCR引物、探针设计：
(1)针对10种细菌16S rRNA基因、志贺氏菌ipaH基因、GⅡ型诺如病毒RdRp区、轮状病毒NSP基因设计四对PCR引物以及十三种氨基标记特异性杂交探针；所述十三种氨基标记特异性杂交探针的碱基序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：13所示，四对PCR引物的碱基序列如SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23所示；
S3、PCR扩增：
利用设计的四对PCR引物进行多重PCR反应扩增；
S4、杂交缓冲液、杂交结合液及显色液的配制：
杂交缓冲液：配制2×SSPE/0.1％SDS溶液；
杂交结合液：将HRP标记的链霉亲和素1：1000稀释到2×SSPE/0.1％SDS溶液中；
显色液：ELSIA显色液，TMB+H2O2；
S5、杂交膜的制作：
(1)尼龙膜的活化：配制16％EDAC溶液浸没尼龙膜，摇床室温摇10分钟，弃去溶液，去离子水冲洗两次；
(2)点膜：将上述尼龙膜晾干，再将设计的十三种氨基标记特异性杂交探针用TE缓冲液溶解配制浓度为100μM，将十三种探针点于相应位置，晾干；
(3)膜的活化：用0.1mol/L的NaOH浸没尼龙膜，摇动10分钟；再用45℃预热的杂交缓冲液浸没尼龙膜，摇动5分钟；
S6、扩增产物与杂交膜上探针杂交、显色：
PCR扩增产物在100℃条件下解开为单链，在42℃条件下与氨基标记特异性杂交探针杂交30分钟，之后加入杂交结合液孵育20分钟，再加入显色液孵育10分钟，即可判断结果。
作为本发明的优选方式之一，当采用微流控生物芯片时，芯片上固定有点好探针的矩阵尼龙膜，并在所述芯片上实现核酸提取、PCR扩增、解链、反向斑点杂交、显色。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明运用多重PCR-反向斑点杂交技术对腹泻病原体核酸进行扩增，且可应用于微流控芯片中；该技术不仅可以同时检测十三种腹泻病原体，具有较高的灵敏度和特异性，且整个过程仅需要4～5个小时，相对于传统培养方法节省了36～48小时；
(2)本发明所设计的引物与探针可制备多重PCR-反向斑点杂交检测腹泻病原体试剂盒；
(3)本发明通过该技术可建立快速检测平台，适用于感染性腹泻患者的快速早期便捷式诊断，且可检测革兰阳性菌低至103CFU/mL，革兰阴性菌低至102CFU/mL；
(4)本发明方法价格相对低廉，检测一份样本仅需人民币200元，相较于市场上检测多种腹泻病原体的QPCR试剂(检测一份样本1000元)具有价格优势，具有市场价值的创新性；将基础研究转向临床研究，具有转化的创新性。
附图说明
图1是验证例中多重PCR-反向斑点杂交过程示意图；
图2是验证例中微流控点膜矩阵图(图2中，空白对照用的是“水”；阴性对照用的是“溶解特异性探针的缓冲液”，里面没有任何探针；阳性对照是使用“氨基酸阳性对照探针”)；
图3是验证例中的微流控芯片杂交结果展示图(图3中的a～m图依次表示蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、类志贺邻单胞菌、金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌、志贺氏菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、GⅡ型诺如病毒和轮状病毒阳性结果)；
图4是验证例中沙门氏菌的检测限测试结果图；
图5是验证例中金黄色葡萄球菌限测试结果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的所使用的试剂产品及实验方法，未经特别说明的，均为本领域常规试剂或方法，不再赘述。
实施例1
本实施例的一种基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探针，包括沙门氏菌探针、志贺氏菌探针、副溶血弧菌探针、空肠弯曲菌探针、类志贺邻单胞菌探针、艰难梭菌探针、产气荚膜梭菌探针、金黄色葡萄球菌探针、产单核李斯特菌探针、蜡样芽孢杆菌探针、小肠结肠炎耶尔森菌探针、GⅡ型诺如病毒探针、轮状病毒探针，十三种氨基标记特异性杂交探针。这十三种氨基标记特异性杂交探针的碱基序列分别如分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：13所示，且各探针的5’端均标记有氨基。
本实施例中，沙门氏菌探针、志贺氏菌探针、副溶血弧菌探针、空肠弯曲菌探针、类志贺邻单胞菌探针、艰难梭菌探针、产气荚膜梭菌探针、金黄色葡萄球菌探针、产单核李斯特菌探针、蜡样芽孢杆菌探针、小肠结肠炎耶尔森菌探针、GⅡ型诺如病毒探针、轮状病毒探针，分别针对沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌、类志贺邻单胞菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、产单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、GⅡ型诺如病毒、轮状病毒检测所设计，用于与相应的PCR产物解开的单链互补杂交。
同时，为了便于后续多重PCR-反向斑点杂交技术的应用，本实施例还设计了一种内参探针和氨基酸阳性对照探针；内参探针的碱基序列如SEQ ID NO：14所示，探针的5’端标记有氨基；氨基酸阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO：15所示，探针的5’端标记有氨基，3’端标记有生物素。
实施例2
本实施例的一种基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的PCR扩增引物，包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4。
引物对1为通用引物，用于针对沙门氏菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌、类志贺邻单胞菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、产单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌16S rDNA所设计，包括如SEQ ID NO.16所示的16S rRNA-F以及如SEQ IDNO.17所示的16S rRNA-R，各引物的5’端标记有生物素。
引物对2用于针对志贺氏菌ipaH基因，包括如SEQ ID NO.18所示的IpaH-F以及如SEQ ID NO.19所示的IpaH-R，且各引物的5’端标记有生物素。
引物对3用于针对GⅡ型诺如病毒RdRp区，包括如SEQ ID NO.20所示的RdRp-F以及如SEQ ID NO.21所示的RdRp-R，各引物的5’端标记有生物素。
引物对4用于针对轮状病毒NSP基因，包括如SEQ ID NO.22所示的NSP-F以及如SEQID NO.23所示的NSP-R，各引物的5’端标记有生物素。
实施例3
本实施例的一种用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的试剂盒，包括多重核苷酸探针阵列、多重PCR体系、反向斑点杂交体系。
多重核苷酸探针阵列用于与肠道病原体基因进行杂交，构成方法为：将实施例中序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：13所示的十三种氨基标记特异性杂交探针用TE缓冲液稀释溶解后，分别点于活化后的尼龙膜上，晾干；接着，用NaOH浸没尼龙膜；再用45℃预热的杂交缓冲液浸没尼龙膜；所述杂交缓冲液为2×SSPE/0.1％SDS溶液。
多重PCR体系用于扩增肠道病原体基因，组成为：实施例2中的序列如SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23所示、且5’端均标记有生物素的引物，PCR预混液，DNA模板，ddH2O。
反向斑点杂交体系用于PCR扩增产物与多重核苷酸探针阵列进行杂交显色，组成为：PCR扩增产物，多重核苷酸探针阵列，杂交结合液，显色液；其中，所述杂交结合液通过将HRP标记的链霉亲和素以1：1000稀释到2×SSPE/0.1％SDS溶液中制得；所述显色液为ELSIA显色液，由TMB+H2O2制得。
本实施例试剂盒可用于手工点膜或者微流控生物芯片操作。
且当用于手工点膜时：
上述多重PCR体系具体采用：序列分别如SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23所示、且5’端均标记有生物素的引物各1μL(10μM)，PCR预混液25μL，DNA模板2μL，ddH2O 15μL；
反向斑点杂交体系具体采用：PCR扩增产物50μL，多重核苷酸探针阵列，杂交结合液2mL，显色液2mL。
当用于微流控生物芯片操作时：
每份多重PCR体系具体采用：序列分别如SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23所示、且5’端均标记有生物素的引物各0.4125μL(10μM)，PCR预混液10.425μL，DNA模板2μL，ddH2O3.775μL；共使用24样本份；
每份反向斑点杂交体系具体采用：PCR扩增产物30μL，多重核苷酸探针阵列，杂交结合液1/6mL，显色液0.125Ml，共使用24样本份。
实施例4
本实施例的一种基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的方法，采用实施例3试剂盒，包括如下具体步骤：
S1、核酸提取及RNA逆转录：
提取待测粪便标本核酸，并进行RNA逆转录。
S2、PCR引物、探针设计：
(1)将针对10种细菌16S rRNA基因、志贺氏菌ipaH基因、GⅡ型诺如病毒RdRp区、轮状病毒NSP基因设计四对PCR引物(使用primer explorerV5设计)以及十三种氨基标记特异性杂交探针，并送往公司合成。
S3、PCR扩增：
(1)利用设计的四对PCR引物进行多重PCR反应扩增。
(2)多重PCR反应体系如下：16S rRNA-F(10μM)：1μL；16S rRNA-R(10μM)：1μL；IpaH-F(10μM)：1μL；IpaH-R(10μM)：1μL；RdRp-F(10μM)：1μL；RdRp-R(10μM)：1μL；NSP-F(10μM)：1μL；NSP-R(10μM)：1μL；PCR预混液：25μL；DNA模板：2μL；ddH2O：15μL。最终体积50μL。
PCR的全部加样过程均在冰上操作完成。
(3)PCR扩增条件为：94℃30秒；55℃30秒；72℃1分钟；一共35个循环。
S4、杂交缓冲液、杂交结合液及显色液的配制：
杂交缓冲液：配制2×SSPE/0.1％SDS溶液。
杂交结合液：将HRP标记的链霉亲和素1：1000稀释到2×SSPE/0.1％SDS溶液中。
显色液：ELSIA显色液(TMB+H2O2)。
S5、杂交膜的制作：
(1)尼龙膜的活化：配制16％EDAC溶液浸没尼龙膜，摇床室温缓慢摇10分钟，弃去溶液，去离子水冲洗两次；
(2)点膜：将上述尼龙膜晾干，再将设计的十三种氨基标记特异性杂交探针用TE缓冲液溶解配制浓度为100μM，将十三种探针点于相应位置，晾干；
(3)膜的活化：用0.1mol/L的NaOH浸没尼龙膜，摇动10分钟；再用45℃预热的杂交缓冲液浸没尼龙膜，缓慢摇动5分钟。
S6、扩增产物与杂交膜上探针杂交、显色：
反向斑点杂交体系如下：PCR扩增产物50μL，预热后的杂交缓冲液浸尼龙膜，杂交结合液2mL，显色液2mL。
PCR扩增产物在100℃条件下解开为单链，在42℃条件下与氨基标记特异性杂交探针杂交30分钟，之后加入杂交结合液孵育20分钟，再加入显色液孵育10分钟，即可判断结果。
由于PCR引物5’端标记有生物素，若存在目的基因，则成功扩增的PCR产物双链和解开的单链被生物素标记，结合液体中的HRP标记的链霉亲和素将单链DNA捕获，加入显色液即可显色，在矩阵上相对位置即可判断结果。
实施例5
本实施例的一种基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的方法，与实施例4基本相同，主要不同之处在于：结合微流控生物芯片使用。委托公司生产微流控生物芯片，芯片上固定有点好探针的矩阵尼龙膜，可在芯片上实现核酸提取、PCR扩增、解链、反向斑点杂交、显色。
且当用于微流控生物芯片操作时：
PCR扩增体系(单样本份)为：16S rRNA-F(10μM)：0.4125μL；16S rRNA-R(10μM)：0.4125μL；IpaH-F(10μM)：0.4125μL；IpaH-R(10μM)：0.4125μL；RdRp-F(10μM)：0.4125μL；RdRp-R(10μM)：0.4125μL；NSP-F(10μM)：0.4125μL；NSP-R(10μM)：0.4125μL；PCR预混液：10.425μL；DNA模板：2μL；ddH2O：3.775μL。共使用24样本份。
内参PCR扩增体系(单样本份)为：16S rRNA-F(10μM)：0.4125μL，16SrRNA-R(10μM)：0.4125μL；PCR预混液：10.425μL；ddH2O：6.25μL。共使用24样本份。
反向斑点杂交体系(单样本份)为：PCR扩增产物30μL，多重核苷酸探针阵列，杂交结合液1/6mL，显色液0.125mL，共使用24样本份。
验证例
本验证例用于验证上述实施例中基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体方法的可行性，参照图1，结合“北京博晖创新生物技术股份有限公司”生产的“微流控生物芯片”使用，芯片上固定有点好探针的矩阵尼龙膜，在芯片上实现核酸提取、PCR扩增、解链、反向斑点杂交、显色，包括如下具体步骤：
S1、核酸提取及RNA逆转录：
提取若干感染性腹泻粪便标本核酸，并进行RNA逆转录(根据现有常规试剂盒说明书操作即可)。
S2、PCR引物、探针设计：
(1)将针对10种细菌16S rRNA基因、志贺氏菌ipaH基因、GⅡ型诺如病毒RdRp区、轮状病毒NSP基因设计四对PCR引物以及十三种氨基标记特异性杂交探针，并送往公司合成。
S3、PCR扩增：
(1)利用设计的四对PCR引物进行多重PCR反应扩增。
(2)微流控生物芯片的PCR扩增体系(单样本份)为：16S rRNA-F(10μM)：0.4125μL；16S rRNA-R(10μM)：0.4125μL；IpaH-F(10μM)：0.4125μL；IpaH-R(10μM)：0.4125μL；RdRp-F(10μM)：0.4125μL；RdRp-R(10μM)：0.4125μL；NSP-F(10μM)：0.4125μL；NSP-R(10μM)：0.4125μL；PCR预混液：10.425μL；DNA模板：2μL；ddH2O：3.775μL。共使用24样本份。
内参PCR扩增体系(单样本份)为：16S rRNA-F(10μM)：0.4125μL，16SrRNA-R(10μM)：0.4125μL；PCR预混液：10.425μL；ddH2O：6.25μL。共使用24样本份。
(3)PCR扩增条件为：94℃30秒；55℃30秒；72℃1分钟；一共35个循环。
S4、杂交缓冲液、杂交结合液及显色液的配制：
杂交缓冲液：配制2×SSPE/0.1％SDS溶液。
杂交结合液：将HRP标记的链霉亲和素1：1000稀释到2×SSPE/0.1％SDS溶液中。
显色液：ELSIA显色液，TMB+H2O2。
S5、杂交膜的制作：
(1)尼龙膜的活化：配制16％EDAC溶液浸没尼龙膜，摇床室温缓慢摇10分钟，弃去溶液，去离子水冲洗两次；
(2)点膜：将上述尼龙膜晾干，再将设计的十三种氨基标记特异性杂交探针用TE缓冲液溶解配制浓度为100μM，将十三种探针点于相应位置(位置参考图2示意图；图2中，空白对照用的是“水”；阴性对照用的是“溶解特异性探针的缓冲液”，里面没有任何探针；阳性对照是使用“氨基酸阳性对照探针”)，晾干；
(3)膜的活化：用0.1mol/L的NaOH浸没尼龙膜，摇动10分钟；再用45℃预热的杂交缓冲液浸没尼龙膜，缓慢摇动5分钟。
S6、扩增产物与杂交膜上探针杂交、显色：
反向斑点杂交体系(单样本份)为：PCR扩增产物30μL，多重核苷酸探针阵列，杂交结合液1/6mL，显色液0.125Ml，共使用24样本份。
PCR扩增产物在100℃条件下解开为单链，在42℃条件下与氨基标记特异性杂交探针杂交30分钟，之后加入杂交结合液孵育20分钟，再加入显色液孵育10分钟，即可判断结果。
由于PCR引物5’端标记有生物素，若存在目的基因，则成功扩增的PCR产物双链和解开的单链被生物素标记，结合液体中的HRP标记的链霉亲和素将单链DNA捕获，加入显色液即可显色，在矩阵上相对位置即可判断结果。
最终的微流控芯片杂交结果如图3所示。结合图2和图3对比可明确判断患者是否感染腹泻肠道病原体以及具体感染的哪儿一种。具体地，图3中的a～m图依次表示蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、类志贺邻单胞菌、金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌、志贺氏菌、沙门氏菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、GⅡ型诺如病毒和轮状病毒阳性结果。
此外，分别以沙门氏菌和金黄色葡萄球菌为例，测试本发明方法对细菌的检测限，结果如图4、图5所示。
由图4可知：沙门氏菌的检测限下限为102CFU/m。
由图5可知：金黄色葡萄球菌的检测限下限为103CFU/m。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探针，其特征在于，包括沙门氏菌探针、志贺氏菌探针、副溶血弧菌探针、空肠弯曲菌探针、类志贺邻单胞菌探针、艰难梭菌探针、产气荚膜梭菌探针、金黄色葡萄球菌探针、产单核李斯特菌探针、蜡样芽孢杆菌探针、小肠结肠炎耶尔森菌探针、GⅡ型诺如病毒探针、轮状病毒探针，这十三种氨基标记特异性杂交探针；所述十三种氨基标记特异性杂交探针的碱基序列分别如SEQ ID NO：1～SEQID NO：13所示，且各探针的5’端均标记有氨基。
2.根据权利要求1所述的基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探针，其特征在于，还包括内参探针和氨基酸阳性对照探针；所述内参探针的碱基序列如SEQ IDNO：14所示，探针的5’端标记有氨基；所述氨基酸阳性对照探针的碱基序列如SEQ ID NO：15所示，探针的5’端标记有氨基，3’端标记有生物素。
3.一种如权利要求1～2任一所述的基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的探针在制备肠道病原体检测产品中的应用。
4.一种用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的PCR扩增引物，其特征在于，包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4；
所述引物对1用于针对沙门氏菌、副溶血弧菌、空肠弯曲菌、类志贺邻单胞菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌、产单核增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌16S rDNA，包括如SEQ ID NO.16所示的16SrRNA-F以及如SEQ ID NO.17所示的16SrRNA-R，各引物的5’端标记有生物素；
所述引物对2用于针对志贺氏菌ipaH基因，包括如SEQ ID NO.18所示的IpaH-F以及如SEQ ID NO.19所示的IpaH-R，且各引物的5’端标记有生物素；
所述引物对3用于针对GⅡ型诺如病毒RdRp区，包括如SEQ ID NO.20所示的RdRp-F以及如SEQ ID NO.21所示的RdRp-R，各引物的5’端标记有生物素；
所述引物对4用于针对轮状病毒NSP基因，包括如SEQ ID NO.22所示的NSP-F以及如SEQID NO.23所示的NSP-R，各引物的5’端标记有生物素。
5.一种如权利要求4所述的用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的PCR扩增引物在制备肠道病原体检测产品中的应用。
6.一种用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的试剂，其特征在于，包括多重核苷酸探针阵列、多重PCR体系、反向斑点杂交体系；
所述多重核苷酸探针阵列用于与肠道病原体基因进行杂交，构成方法为：将序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：13所示的十三种氨基标记特异性杂交探针用TE缓冲液稀释溶解后，分别点于活化后的尼龙膜上，晾干；接着，用NaOH浸没尼龙膜；再用45℃预热的杂交缓冲液浸没尼龙膜；所述杂交缓冲液为2×SSPE/0.1％SDS溶液；
所述多重PCR体系用于扩增肠道病原体基因，组成为：序列分别如SEQ ID NO：16～SEQID NO：23所示、且5’端均标记有生物素的引物，PCR预混液，DNA模板，ddH2O；
所述反向斑点杂交体系用于PCR扩增产物与多重核苷酸探针阵列进行杂交显色，组成为：PCR扩增产物，多重核苷酸探针阵列，杂交结合液，显色液；其中，所述杂交结合液通过将HRP标记的链霉亲和素以1：1000稀释到2×SSPE/0.1％SDS溶液中制得；所述显色液为ELSIA显色液，由TMB+H2O2制得。
7.根据权利要求6所述的用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的试剂，其特征在于，所述试剂用于手工点膜或者微流控生物芯片操作；
当用于手工点膜时：
多重PCR体系的组成为：序列分别如SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23所示、且5’端均标记有生物素的引物各1μL，PCR预混液25μL，DNA模板2μL，ddH2O 15μL；
反向斑点杂交体系的组成为：PCR扩增产物50μL，多重核苷酸探针阵列，杂交结合液2mL，显色液2mL；
当用于微流控生物芯片操作时：
每份多重PCR体系的组成为：序列分别如SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23所示、且5’端均标记有生物素的引物各0.4125μL，PCR预混液10.425μL，DNA模板2μL，ddH2O 3.775μL；共使用24样本份；
每份反向斑点杂交体系的组成为：PCR扩增产物30μL，多重核苷酸探针阵列，杂交结合液1/6mL，显色液0.125mL，共使用24样本份。
8.一种基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的方法，其特征在于，利用如权利要求6～7任一所述的用于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的试剂对待测样品进行检测。
9.根据权利要求8所述的基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
S1、核酸提取及RNA逆转录：
提取核酸，并进行RNA逆转录；
S2、PCR引物、探针设计：
(1)针对10种细菌16S rRNA基因、志贺氏菌ipaH基因、GⅡ型诺如病毒RdRp区、轮状病毒NSP基因设计四对PCR引物以及十三种氨基标记特异性杂交探针；所述十三种氨基标记特异性杂交探针的碱基序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：13所示，四对PCR引物的碱基序列如SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：23所示；
S3、PCR扩增：
利用设计的四对PCR引物进行多重PCR反应扩增；
S4、杂交缓冲液、杂交结合液及显色液的配制：
杂交缓冲液：配制2×SSPE/0.1％SDS溶液；
杂交结合液：将HRP标记的链霉亲和素1：1000稀释到2×SSPE/0.1％SDS溶液中；
显色液：ELSIA显色液，TMB+H2O2；
S5、杂交膜的制作：
(1)尼龙膜的活化：配制16％EDAC溶液浸没尼龙膜，摇床室温摇10分钟，弃去溶液，去离子水冲洗两次；
(2)点膜：将上述尼龙膜晾干，再将设计的十三种氨基标记特异性杂交探针用TE缓冲液溶解配制浓度为100μM，将十三种探针点于相应位置，晾干；
(3)膜的活化：用0.1mol/L的NaOH浸没尼龙膜，摇动10分钟；再用45℃预热的杂交缓冲液浸没尼龙膜，摇动5分钟；
S6、扩增产物与杂交膜上探针杂交、显色：
PCR扩增产物在100℃条件下解开为单链，在42℃条件下与氨基标记特异性杂交探针杂交30分钟，之后加入杂交结合液孵育20分钟，再加入显色液孵育10分钟，即可判断结果。
10.根据权利要求9所述的基于多重PCR-反向斑点杂交技术检测肠道病原体的方法，其特征在于，当采用微流控生物芯片时，芯片上固定有点好探针的矩阵尼龙膜，并在所述芯片上实现核酸提取、PCR扩增、解链、反向斑点杂交、显色。
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