CN113817806A - 等温扩增检测克氏锥虫的试剂、试剂盒及其应用 - Google Patents

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邓少玉
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Abstract

本申请涉及分子生物学检测技术领域，提供了一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂、试剂盒及其应用。本申请提供的等温扩增检测克氏锥虫的试剂包括用于检测克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组：第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5以及第二环引物SEQ ID No.6，该环介导等温核酸扩增引物组特异性强，能够有效区分疟原虫属中的其它疟原虫种，使得本申请试剂用于检测克氏锥虫具有灵敏度高、重复性好、假阴性以及假阳性低，检测准确率高，还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断。

Description

等温扩增检测克氏锥虫的试剂、试剂盒及其应用
技术领域
本申请属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂、试剂盒及其应用。
背景技术
美洲锥虫病又称为恰加斯病(Chagas disease)，由克氏锥虫(Trypanosomacruzi)引起，传播媒介是锥蝽。该病主要发生在21个拉丁美洲国家，多见于儿童，急性期表现为发热、全身性淋巴结肿大和心脏扩大。慢性期则以心肌炎、心脏扩大、食道或结肠扩张为主要特征。2017年，全世界估计有620万人患有恰加斯病，每年约有162,000例新感染和7900例死亡。这导致全球每年的经济负担估计为72亿美元。
我国虽然不是美洲锥虫病流行区，但部分地区有锥蝽分布，一旦美洲锥虫病输入我国，有可能造成局部传播。随着我国国际交往、劳务输出和跨境旅游人数的增长，锥虫病的输入性风险也随之不断增加，迫切需要我国政府对该病引起高度重视，加强对美洲锥虫病的检测和监测研究。
目前，多种不同的聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)测试可用于检测克氏锥虫DNA，这种特定方法虽然可以在寄生虫含量很低的情况下检测出克氏锥虫，然而PCR需要荧光染料，其检测需要专业人员操作和专业的昂贵仪器。另外，现有提取待测样品核酸需要移液器、枪头、离心机、恒温金属浴和PCR仪等昂贵且不便于携带的仪器，并且提取需要专业人士进行专业操作。
因此，现有的待测样品核酸提取和PCR存在需要专业人员操作、成本高以及检测不方便的问题。
发明内容
本申请的目的在于提供一种检测等温扩增检测克氏锥虫的试剂、试剂盒以及其应用，旨在解决现有技术中的待测样品核酸提取和荧光PCR检测存在需要专业人员操作、成本高以及检测不方便的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂，所述试剂包括如下用于检测克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组：
第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6。
第二方面，本申请提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒，所述等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒包括本申请的等温扩增检测克氏锥虫的试剂。
第三方面，本申请提供一种检测克氏锥虫的方法，所述检测克氏锥虫的方法包括如下步骤：
获取待检测样品核酸；
将所述待测样本核酸与本申请的所述试剂或本申请的所述试剂盒提供的等温扩增试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理；
根据所述环介导等温核酸扩增处理的混合液所含的pH染料显示颜色，直接裸眼判断结果。
本申请第一方面提供的等温扩增检测克氏锥虫的试剂所含的环介导等温核酸扩增引物组特异性强，能够有效区分疟原虫属中的其它疟原虫种，使得本申请试剂用于检测克氏锥虫具有灵敏度高、重复性好、假阴性以及假阳性低，检测准确率高。同时，本申请提供的环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，其可以直接向所述试剂中添加pH染料的可视化恒温扩增试剂构成环介导等温核酸扩增体系，使得所述试剂能够通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，从而可以简易快速检测克氏锥虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。
本申请第二方面提供的等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒，由于所述试剂盒包括本申请的等温扩增检测克氏锥虫的试剂，因此，所述试剂盒用于检测克氏锥虫具有灵敏度高、重复性好、假阴性以及假阳性低，检测准确率高；同时，该环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，使得所述试剂能够简易快速检测克氏锥虫；并且当所述试剂盒含有本申请可视化恒温扩增试剂时，所述试剂盒还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得使用所述试剂盒检测克氏锥虫时不用依赖专业人员及专业仪器，使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。
本申请第三方面提供的检测克氏锥虫的方法，其通过获取待检测样品核酸，并将所述待测样本核酸与本申请的所述试剂或所述试剂盒提供的等温扩增试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理，再根据所述环介导等温核酸扩增处理的混合液所含的pH染料显示颜色，直接裸眼判断结果。本申请检测克氏锥虫的方法由于是利用本申请试剂盒进行检测，因此，所述检测克氏锥虫的方法灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高，并且可以直接通过裸眼观察PCR扩增反应体系的颜色变化而直接进行结果判断，因此，所述检测克氏锥虫的方法不需要依赖专业人员及专业仪器，使得本申请检测克氏锥虫的方法拥有更宽的发挥场景及更好的临场检测能力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的克氏锥虫阳性质控品(浓度为1000copies/μL)扩增结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果显色照片，1-4号孔为克氏锥虫阳性质控品扩增体系最终颜色为黄绿色；5号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色；
图2是本申请实施例提供的克氏锥虫阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时浓度梯度的LAMP扩增结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果显色照片。1号孔为1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；2号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为淡洋紫色；3号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为淡洋紫色；4号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色；
图3是本申请实施例提供的克氏锥虫的LAMP引物扩增“克氏锥虫核酸DNA”的结果显色照片，1号孔为克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为黄绿色；
图4是本申请实施例提供的克氏锥虫的LAMP引物扩增“无核酸酶水”的结果显色照片；1号为克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色；
图5是本申请实施例提供的克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增“含布氏冈比亚锥虫锥虫基因的质粒DNA(10000拷贝/μL)和含布氏罗德西亚锥虫锥虫基因的质粒DNA”的结果显色照片，1和2号孔为克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请涉及的专业名称说明：
环介导等温核酸扩增技术：(loop-mediated isotherm amplification，LAMP)是等温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和多对特异性引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下完成核酸扩增反应。
本申请实施例第一方面提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂(下文均简称试剂)。该试剂包括根据克氏锥虫靶基因设计的引物序列，因此，该试剂包括用于检测克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组。
其中，用于检测克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组包括如下引物：
第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6。其中，第一外引物的序列为SEQ ID No.1，为cgcatggctcattacatc；第二外引物的序列为SEQ ID No.2，为gcacggaatgaattgaatc；第一内引物的序列为SEQ ID No.3，为tgccgccggaacagagaacgacgtaatctgccgcaa；第二内引物的序列为SEQ ID No.4，为cagggcaacacctgctgccacttctgagtgttactgcc；第一环引物的序列为SEQ ID No.5，为cgtttcgccaagttatcca；第二环引物的序列为SEQ ID No.6，为cagcgaatgaatgaaagtaaaacc。
因此，本申请实施例所述试剂含有克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组，引物组不会产生非特异的扩增，特异性强，从而使得本申请实施例所述试剂用于检测克氏锥虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。同时，环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，其可以直接向所述试剂中添加pH染料的可视化恒温扩增试剂构成环介导等温核酸扩增体系，从而使得所述试剂能够通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断以简易快速检测克氏锥虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景和更好的临场检测能力。
在一些的实施例中，第一外引物的序列SEQ ID No.1至第二环引物的序列SEQ IDNo.6具体的序列如下表1中所示。上述用于检测克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组是根据克氏锥虫靶基因设计，克氏锥虫靶基因可以根据基因资源获得。克氏锥虫靶基因为18s基因，18s基因全长在2000bp左右，具体可以从GenBank上直接获取。其中，克氏锥虫引物设计区域在B1基因的1-445bp之间。具体的，克氏锥虫靶序列18s基因的引物设计区域序列为SEQ ID No.7。
具体的，上文所述SEQ ID No.1至SEQ ID No.7的具体序列如下表1所示：
表1
Figure BDA0003283990830000071
在一些实施例中，第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2的使用浓度范围均为1.0-2.5μM；第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4的使用浓度范围均为45-70μM；第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6的使用浓度范围均为10-30μM。在具体的实施例中，第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2的使用浓度均为1.8μM；第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4的使用浓度均为57.6μM；第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6的使用浓度均为20μM。本实施例通过设置引物合适的浓度范围，能够实现快速将克氏锥虫基因序列进行扩增反应，增强反应效率，进而提高鉴别效率。
在进一步实施例中，本申请实施例试剂还包括可视化恒温扩增试剂，该可视化恒温扩增试剂包括如下组分：
聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。
具体的，聚合酶为Bst聚合酶。Bst聚合酶的浓度范围为0.3-0.4U/μL，在一实施例中，Bst聚合酶的浓度可以为0.4U/μL该Bst聚合酶能够有效促进环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的LAMP扩增，并使得pH染料快速灵活发生显色反应，以便于可以用裸眼直接判断结果。
具体的，pH染料为间甲酚紫。间甲酚紫的浓度范围为0.1-0.5mmol/L，在一实施例中，间甲酚紫的浓度可以为0.4mmol/L。该间甲酚紫作为结果显示剂能够根据PCR扩增反应体系的pH值的变化灵活的发生颜色变化，提高了检测的准确性和灵敏度，并且提高了结果判断的便捷性和快速性。
具体的，等温扩增缓冲液包括LAMP扩增所需的组分，其中，该等温扩增缓冲液包括KCL、MgSO4、吐温20、dNTPs以及无核酸酶水(如无菌水)等组分。其中，KCL的浓度范围为50-80mmol/L，MgSO4的浓度范围为0.4-0.8mmol/L，dNTPs的浓度范围为0.4-1.6mmol/L，吐温20的浓度范围为0.1％-0.6％，在一实施例中，KCL的浓度可以为65mmol/L，MgSO4的浓度可以为0.6mmol/L，dNTPs的浓度可以为1mmol/L，吐温20的浓度可以为0.35％。该等温扩增缓冲液与聚合酶、pH染料等组分构成可视化恒温扩增试剂，其有效提高了本申请实施例试剂所含环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的LAMP扩增的稳定性。
本申请实施例试剂含有克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组，引物组之间不会产生非特异的扩增，特异性强。当进一步含有可视化恒温扩增试剂时，检测克氏锥虫具有灵敏度高，重复性好、假阴性以及假阳性低，并且在检测准确率高的基础上，还可以实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得检测克氏锥虫不依赖专业人员及专业仪器，进一步使得检测克氏锥虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。有效避免了传统PCR检测需要荧光探针与荧光染料，而且还需专业人员及专业仪器进行而导致的临场检测性差和成本高的问题。
本申请实施例第二方面提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒(下文统称试剂盒)，该试剂盒包括上文的本申请实施例试剂。具体的，该试剂盒包括上文所述的用于检测克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组。
在一些的实施例中，该试剂盒还包括聚合酶、pH染料以及等温扩增缓冲液构成的可视化恒温扩增试剂。这样，该试剂盒由于采用本申请等温扩增检测克氏锥虫的试剂，因此，试剂盒用于检测克氏锥虫具有灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。具体的，当该试剂盒含有本申请可视化恒温扩增试剂时，该试剂盒还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得使用该试剂盒检测克氏锥虫时不用依赖专业人员及专业仪器，进一步使得该试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景和更好的临场检测能力。
在一些实施例中，本申请实施例试剂盒还包括核酸提取耗材、阳性质控品以及阴性质控品中的至少一种。
具体的，所述核酸提取耗材用于配合本申请实施例试剂盒所含的环介导等温核酸扩增引物组或进一步包含的可视化恒温扩增试剂，提高了本申请实施例试剂盒的操作的便捷性。在一实施例中，该核酸提取耗材包括核酸提取液和/或用于核酸提取的器件；其中，该核酸提取液包括处理液、裂解液、清洗液以及洗脱液中的至少一种；该核酸提取的器件包括取液器、核酸裂解容器以及核酸富集器中的至少一种。
在一些的实施例中，所述核酸富集器包括硅胶膜和富集器壳体，该富集器壳体设有液体进入口，在该富集器壳体内且在液体进入通道上开设有一凹槽，该硅胶膜填设于所述凹槽内。该核酸富集器在使用时，将该富集器壳体设有液体进入口连接所述取液器的液体出口。
具体的，洗脱液可以是无核酸酶水，核酸裂解容器可以是裂解管，取液器可以是螺旋口活塞注射器。
通过在本申请实施例试剂盒中设置核酸提取耗材，降低了核酸提取的专业要求，实现了本申请实施例试剂盒操作的便利性，在无专业人员和无专业设备的情况下，可实现现场完成对样本的核酸提取。
在一些实施例中，所述阳性质控品可以是克氏锥虫核酸样本，其环介导等温扩增(LAMP)的模板。所述阴性质控品可以是无核酸酶水，当然也可以是无菌水，如DEPC水。所述清洗液可以是常用的核酸清洗液。
因此，在一实施例中，所述本申请实施例试剂盒可以按照表2-7中的规格进行配备个试剂。
因此，上文本申请实施例试剂盒由于采用本申请实施例试剂或进一步配设可视化恒温扩增试剂，使得该试剂盒用于检测克氏锥虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。当该试剂盒进一步含有可视化恒温扩增试剂时，该试剂盒还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，有效避免传统PCR检测需要荧光探针与荧光染料，使得使用该试剂盒检测克氏锥虫时不用依赖专业人员及专业仪器，从而使得该试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景和更好的临场检测能力。
基于上文所述本申请实施例试剂和本申请实施例试剂盒，本申请实施例第三方面提供一种检测克氏锥虫的方法。所述检测克氏锥虫的方法包括如下步骤：
S01：提取待测样本核酸；
S02：将所述待测样本核酸与上文本申请实施例试剂盒提供的本申请实施例试剂进行混合并进行LAMP处理；
S03：根据所述LAMP处理的混合液所含的pH染料显示颜色，直接裸眼判断结果。
在上述步骤S01中，可以直接用本申请实施例试剂盒附带的核酸提取耗材进行提取。具体的，采用本申请实施例试剂盒附带的核酸提取耗材进行核酸提取的方法自行提取。这样可以实现在非专业人员和非专业设备的条件下实现快速提取待测样本核酸。
上述步骤S02中，将所述待测样本核酸与上文本申请实施例试剂盒提供的本申请实施例试剂混合处理后，形成LAMP扩增体系。具体可以按照上文表2中的LAMP扩增试剂来配制LAMP扩增体系。
在一些实施例中，所述LAMP处理的温度优选设定为60℃-70℃，具体如65℃，时间应该是充分的，如为50min。由于所述LAMP处理是等温扩增，因此，该LAMP处理的温度可以采用保温杯或水浴锅等可在一定温度范围内维持一段时间的设备来提供，从而显著的降低了检测克氏锥虫的方法的专业检测人员和专业设备的要求。
上述步骤S03中，由于在步骤S02中LAMP扩增体系含有可视化的pH染料，因此，待所述LAMP处理结束后，所述LAMP扩增体系的颜色会显示一定的颜色。从而可以根据待测样本核酸最终LAMP扩增体系显示的颜色，与含质控品核酸最终LAMP扩增体系显示的颜色比较，从而直接用裸眼判断待测样本中是否含有克氏锥虫核酸。
因此，所述检测克氏锥虫的方法利用本申请试剂盒进行检测，使得所述检测克氏锥虫的方法具有灵敏度高，重复性好，假阴性及假阳性低，检测准确率高。并且所述检测克氏锥虫的方法不需要依赖专业人员和专业仪器，直接用裸眼观察LAMP扩增反应体系的颜色变化而直接进行结果判断，使得所述检测克氏锥虫的方法拥有更广阔的应用前景，能够更好地适用于临床样本的检测。
下面结合具体实施例进行说明。
1.等温扩增检测克氏锥虫的试剂实施例
实施例A1
本实施例提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂，其包括：第一外引物SEQ IDNo.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6、Bst聚合酶、间甲酚紫、KCL、MgSO4、吐温20、dNTPs以及无核酸酶水，各成分的浓度如下表2：
表2
Figure BDA0003283990830000111
Figure BDA0003283990830000121
实施例A2
实施例提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂，其包括：第一外引物SEQ IDNo.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6、Bst聚合酶、间甲酚紫、KCL、MgSO4、吐温20、dNTPs以及无核酸酶水，各成分的浓度如下表3：
表3
组分 起始浓度 使用浓度 规格(μL)
第一外引物 0.3mM 1μM 0.12μL
第二外引物 0.3mM 1μM 0.12μL
第一内引物 2.4mM 45μM 0.48μL
第二内引物 2.4mM 45μM 0.48μL
第一环引物 1mM 10μM 0.4μL
第二环引物 0.3mM 10μM 0.12μL
Bst聚合酶 8U/μl 0.3U/μl 1μL
间甲酚紫 50mM 0.1mM 0.16μL
KCL 1M 50mM 0.2μL
MgSO<sub>4</sub> 0.4M 0.4mM 0.4μL
吐温20 10％ 0.1％ 0.2μL
dNTPs 25mM 0.4mM 1.12μL
无核酸酶水 / / 5.52μL
实施例A3
实施例提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂，其包括：第一外引物SEQ IDNo.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6、Bst聚合酶、间甲酚紫、KCL、MgSO4、吐温20、dNTPs以及无核酸酶水，各成分的浓度如下表4：
表4
组分 起始浓度 使用浓度 规格(μL)
第一外引物 0.3mM 1.8μM 0.12μL
第二外引物 0.3mM 1.8μM 0.12μL
第一内引物 2.4mM 57.6μM 0.48μL
第二内引物 2.4mM 57.6μM 0.48μL
第一环引物 1mM 20μM 0.4μL
第二环引物 0.3mM 20μM 0.12μL
Bst聚合酶 8U/μl 0.4U/μl 1μL
间甲酚紫 50mM 0.4mM 0.16μL
KCL 1M 0.4mM 0.2μL
MgSO<sub>4</sub> 0.4M 10mM 0.4μL
吐温20 10％ 8mM 0.2μL
dNTPs 25mM 0.1％ 1.12μL
无核酸酶水 / / 5.52μL
2.等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒实施例
实施例B1
本实施例提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒。本实施例试剂盒包括如下试剂：
(1)可视化LAMP扩增试剂和环介导等温核酸扩增引物组。该可视化LAMP扩增试剂和环介导等温核酸扩增引物组包括上述实施例A1中的等温扩增检测克氏锥虫的试剂。
(2)核酸提取耗材。该核酸提取耗材包括：样品处理液、核酸裂解液以及清洗液，螺旋口活塞注射器、核酸富集器。
(3)阳性质控品。该阳性质控品为克氏锥虫核酸样本。
(4)阴性质控品。该阴性质控品为无核酸酶水。
本实施例试剂盒中的可视化LAMP扩增试剂和环介导等温核酸扩增引物组的浓度为上述实施例A1中的各成分的浓度，其余试剂的各组分的浓度如下表5：。
表5
Figure BDA0003283990830000141
实施例B2
本实施例提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒。本实施例试剂盒包括如下试剂：
(1)可视化LAMP扩增试剂和环介导等温核酸扩增引物组。该可视化LAMP扩增试剂和环介导等温核酸扩增引物组包括上述实施例A2中的等温扩增检测克氏锥虫的试剂。
(2)核酸提取耗材。该核酸提取耗材包括：样品处理液、核酸裂解液以及清洗液，螺旋口活塞注射器、核酸富集器。
(3)阳性质控品。该阳性质控品为克氏锥虫核酸样本。
(4)阴性质控品。该阴性质控品为无核酸酶水。
本实施例试剂盒中的可视化LAMP扩增试剂和环介导等温核酸扩增引物组的浓度为上述实施例A2中的各成分的浓度，其余试剂的各组分的浓度如下表5：。
表6
Figure BDA0003283990830000151
实施例B3
本实施例提供一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒。本实施例试剂盒包括如下试剂：
(1)可视化LAMP扩增试剂和环介导等温核酸扩增引物组。该可视化LAMP扩增试剂和环介导等温核酸扩增引物组包括上述实施例A3中的等温扩增检测克氏锥虫的试剂。
(2)核酸提取耗材。该核酸提取耗材包括：样品处理液、核酸裂解液以及清洗液，螺旋口活塞注射器、核酸富集器。
(3)阳性质控品。该阳性质控品为克氏锥虫核酸样本。
(4)阴性质控品。该阴性质控品为无核酸酶水。
本实施例试剂盒中的可视化LAMP扩增试剂和环介导等温核酸扩增引物组的浓度为上述实施例A3中的各成分的浓度，其余试剂的各组分的浓度如下表5：。
表7
Figure BDA0003283990830000152
3.检测克氏锥虫的方法实施例
本实施例提供一种等温扩增检测克氏锥虫的检测方法。本实施例检测方法包括如下步骤：
实施例C1
S1.样品核酸的提取
取待检测样品：锥蝽3份；全血3份；克氏锥虫DNA 2份。
样本前处理：取锥蝽不同部位样本，或用棉签沾取锥蝽粪便适量，或用1ml吸管吸取液态待检测样品(如全血、心包积液等)200μL到处理管中(含有处理液)，充分混匀室温放置5min，进行第一次的裂解。
样本裂解：将处理后的全血样本转入装有裂解液的裂解管中混匀(裂解液体积为0.6mL)，56℃孵育10min至15min充分裂解。
核酸吸附及清洗：分别待经裂解处理后的待检测样品冷却至室温，分别加入1.4mL95％乙醇混匀，用一次性核酸提取装置缓慢吸取裂解后的全血样品，全部吸入5ml注射器，然后缓慢推弃(不反复推吸)；需要注意的是，使用前不可将核酸富集器从5ml注射器前端取下；取2ml清洗液至2ml离心管中，用一次性核酸提取装置缓慢吸取全部液体，再缓慢推弃(不反复推吸)；需要注意的是，操作前请确认清洗液已加入相应体积的95％乙醇；缓慢推戏注射器活塞5次，充分去除残留的液体；
核酸洗脱：取下与核酸富集器连接的5mL注射器，更换为1mL注射器。用1ml注射器缓慢吸取洗脱液；缓慢推吸1次，将1mL注射器静置1分钟，再推出洗脱的核酸到检测管中，或推出洗脱的核酸到0.6mL离心管中-20℃保存，分别得到待测样品核酸，用于后续的检测。
S2.可视化检测体系的建立。
(1)按照上述实施例A1的各成分的浓度配制为可视化LAMP扩增试剂，具体如表2所示，并加无核酸酶水至10μL体系；
(2)按照上述实施例A1中的引物组的各成分的浓度配制各引物浓度，具体如表2所示，并与可视化LAMP扩增试剂进行混合后加灭菌纯化水至20μL体系构成可视化LAMP扩增体系；
(3)将待检测样品核酸、克氏锥虫核酸DNA的阳性质控品、无核酸酶水阴性质控品分别与可视化LAMP扩增体系进行混合，并于水浴锅中在65℃的温度下反应50min，结束后观察颜色变化。
(4)环介导等温扩增反应结果的判定原则：
a.若LAMP扩增体系最终出现黄绿色，判定测试结果为阳性；
b.若出现紫色(颜色不变)，判定测试结果为阴性。
c.对其他种类物种，在反应的50min内未检测出(颜色不变)，显示为阴性反应。
(5)LAMP扩增结果：
克氏锥虫核酸DNA的阳性质控品、无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如下表8所示。
表8
Figure BDA0003283990830000171
其中，克氏锥虫阳性质控品(浓度为1000copies/μL)和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增(所用的LAMP引物为克氏锥虫的检测引物组)结果如图1所示，图1中的1-4号孔为克氏锥虫阳性质控品扩增体系最终颜色为黄绿色；5号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色。
克氏锥虫阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时浓度梯度的LAMP扩增(所用的LAMP引物为克氏锥虫的检测引物组)结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如图2所示。图2中的1号孔为1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；2号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为淡洋紫色；3号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为淡洋紫色；4号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色。
克氏锥虫的LAMP引物扩增“克氏锥虫核酸DNA”的结果如图3所示，图3中的1号孔为克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为黄绿色。
克氏锥虫的LAMP引物扩增“无核酸酶水”的结果如图4所示，图4中的1号孔为克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色。
克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增“含布氏冈比亚锥虫锥虫基因的质粒DNA(10000拷贝/μL)和含布氏罗德西亚锥虫锥虫基因的质粒DNA”的结果如图5所示，图5中的1和2号孔为克氏锥虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色。
对于克氏锥虫的LAMP引物分别LAMP扩增“全血、血浆、血清核酸待测样品”的结果如下表9所示。检测结果表明，3份待测样品中锥蝽均能100％呈现为阴性；3份待测样品中全血均能100％呈现为阴性，2份待测样品中DNA均能100％呈现为阳性。
表9
Figure BDA0003283990830000181
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
<110> 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所）、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）
<120> 等温扩增检测克氏锥虫的试剂、试剂盒及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> T.cruzi1-F3-3
cgcatggctc attacatc 18
<400> 1
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> T.cruzi1-B3-4
gcacggaatg aattgaatc 19
<400> 2
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> T.cruzi1-FIP-3
tgccgccgga acagagaacg acgtaatctg ccgcaa 36
<400> 3
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> T.cruzi1-BIP-4
cagggcaaca cctgctgcca cttctgagtg ttactgcc 38
<400> 4
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> T.cruzi1-LF-3
cgtttcgcca agttatcca 19
<400> 5
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> T.cruzi1-LB-3
cagcgaatga atgaaagtaa aacc 24
<400> 6
<210> 7
<211> 445
<212> DNA
<213> 克氏锥虫靶序列B1基因的引物设计区域序列
gtcgtatgct tgtttcaagg acttagccat gcatgcctca gaatcactgc attgcaggaatctgcgcatg gctcattaca tcagacgtaa tctgccgcaa gaaatcttgc ggtctccgca acactggataacttggcgaa acgccaagct aatacatgaa ccaaccggat gttctctgtt ccggcggcag ggcaacacctgctgccatgg gacgtccagc gaatgaatga aagtaaaacc aatgccttca ccgggcagta acactcagaagtgttgattc aattcattcc gtgcgaaagc cgggtttttt tayccggcta ggtcttttga cgaacaactgccctatcagc cagcgatggc cgtgtagtgg actgccatgg cgttgacggg agcgggggga ttagggttcgattccggaga gggagcctga gaaatagcta ccact 445
<400> 7

Claims (9)

1.一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂，其特征在于，所述试剂包括如下用于检测克氏锥虫的环介导等温核酸扩增引物组：
第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6。
2.如权利要求1所述的等温扩增检测克氏锥虫的试剂，其特征在于，所述第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2的使用浓度相同或不相同的为1.0-2.5μM；和/或
所述第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4的使用浓度相同或不相同为45-70μM；和/或
所述第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6的使用浓度相同或不相同为10-30μM。
3.如权利要求1或2所述的等温扩增检测克氏锥虫的试剂，其特征在于，所述试剂还包括可视化恒温扩增试剂，所述可视化恒温扩增试剂包括如下组分：
聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。
4.如权利要求3所述的等温扩增检测克氏锥虫的试剂，其特征在于，所述聚合酶为Bst聚合酶；和/或
所述pH染料为间甲酚紫；和/或
所述等温扩增缓冲液包括KCL、MgSO4、吐温20、dNTPs和无核酸酶水。
5.一种等温扩增检测克氏锥虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～4任一所述的试剂。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括核酸提取耗材、阳性质控品，阴性质控品中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸提取耗材包括核酸提取液和/或用于核酸提取的器件；其中，
所述核酸提取液包括处理液、裂解液、清洗液、洗脱液中的至少一种；
所述器件包括取液器、核酸裂解容器、核酸富集器中的至少一种；
所述阳性质控品为克氏锥虫的核酸模板；
所述阴性质控品为无核酸酶水。
8.一种检测克氏锥虫的方法，该方法包括如下步骤：
获取待检测样品核酸；
将所述待测样本核酸与权利要求1-4任一所述的试剂或权利要求5-7任一项所述的试剂盒提供的等温扩增试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理；
根据所述环介导等温核酸扩增处理的混合液所含的pH染料显示颜色，直接裸眼判断结果。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，获取所述待检测样品核酸的方法包括如下步骤：
对待检测样品进行裂解处理，获得含待检测样品核酸的裂解液；
将所述裂解液经过核酸富集器吸附处理，并对被吸附的待检测样品核酸进行清洗处理后进行核酸洗脱处理。
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