CN113755622A - 等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂、试剂盒及其应用，本申请提供的一种等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂，包括如下用于检测诺氏疟原虫的环介导等温核酸扩增引物组：第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6.所述试剂盒包括所述试剂。所述试剂和试剂盒用于检测诺氏疟原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高，还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断。

Description

等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂、试剂盒及其应用
技术领域
本申请属于分子生物学检测技术领域，尤其涉及一种等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂、试剂盒及其应用。
背景技术
疟疾(malaria)是由疟原虫经按蚊叮咬进入血液而引起的虫媒传染病。寄生于人体的疟原虫主要有四种，即恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodiumovale)。另外一种人兽共患的诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)则是相对较为少见的引起人类疟疾。诺氏疟原虫是引起人类和其他灵长类动物疟疾的寄生虫。它在整个东南亚都有发现，是马来西亚人类疟疾的最常见原因。据2020年疟疾报告统计，马来西亚在2018年和2019年没有4种常见的人体疟疾病例，但在2019年报告了3212例诺氏疟原虫病例。
被诺氏疟原虫感染的人类可能出现与恶性疟原虫相似的单纯或严重疟疾。因此对诺氏疟原虫感染的诊断具有挑战性。诺氏疟疾是一种新兴疾病，以前被认为在人类中很少见，但在东南亚日益被认为是主要的健康负担。
传统上，通过在显微镜下检查吉姆萨染色的血膜来诊断疟疾。然而，由于其外观相似，以这种方式将诺氏疟原虫与其他疟原虫物种区分开来具有挑战性。经常将诺氏疟原虫误诊为恶性疟原虫或间日疟原虫等。虽然某些快速诊断测试可以检测到诺氏疟原虫，它们倾向于具有较差的敏感性和特异性，因此并不总是可靠的。
多种不同的聚合酶链反应(PCR)测试可用于检测诺氏疟原虫DNA。借助该测定，最终可能实现特异性且灵敏的诊断程序。使用这种特定方法，即使寄生虫的量非常低，仍然可以检测诺氏疟原虫。当需要诊断特定的疟原虫物种时，与检测有无相比，分子生物学方法更为出色。但目前PCR是荧光染料，其检测的通病就是需要专业人员操作和专业昂贵仪器。
另外，现有待测样品核酸的需要移液器、枪头、离心机、恒温金属浴和PCR仪等昂贵且不便于携带的仪器，且提取需要专业人士进行专业操作，这直接导致现有样本核酸提取和PCR检测不方便，且需要专业人员操作，且成本高。
发明内容
本申请的目的在于提供一种检测等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂、试剂盒以及其应用，旨在解决现有技术荧光PCR检测方法操作需要专业操作，而且成本高，检测不方便的技术问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂，试剂包括如下用于检测诺氏疟原虫的环介导等温核酸扩增引物组：第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6。
第二方面，本申请提供一种等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂盒，试剂盒包括试剂。
第三方面，本申请提供一种检测诺氏疟原虫的方法，该方法包括如下步骤：
获取待检测样品的核酸；
将待检测样品的核酸与试剂或试剂盒提供的等温扩增试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理；
根据环介导等温核酸扩增处理的混合液所含的pH染料显示颜色，进行比对，对待检测样品进行分析判断。
本申请第一方面提供的等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂含有诺氏疟原虫的环介导等温核酸扩增引物组，其中，各个引物组是根据其特异性基因设定的，SEQ ID No.1～SEQID No.6的引物能够特异性扩增得到诺氏疟原虫属靶序列SSuRNA基因，引物组特异性强，不会产生非特异性扩增，从而使得本申请试剂用于检测诺氏疟原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。同时，本申请中提供的环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，其可以直接向试剂中添加pH染料的可视化恒温扩增试剂构成环介导等温核酸扩增体系，从而使得试剂能够通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断以简易快速检测诺氏疟原虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。
本申请第二方面提供的等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂盒，由于采用本申请等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂，因此，试剂盒用于检测诺氏疟原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。同时，环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，从而使得试剂能够简易快速检测诺氏疟原虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。当试剂盒含有本申请可视化恒温扩增试剂时，试剂盒还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得使用试剂盒检测诺氏疟原虫时不用依赖专业人员、专业仪器，进一步使得试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。
本申请第三方面提供的检测诺氏疟原虫的方法，由于是利用本申请提供的试剂盒进行检测，因此，检测诺氏疟原虫的方法灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。当本申请试剂盒含有本申请可视化恒温扩增试剂时，检测诺氏疟原虫的方法不需要依赖专业人员、专业仪器，直接用裸眼观察PCR扩增反应体系的颜色变化而直接进行结果判断，使得本申请检测诺氏疟原虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的可视化LAMP扩增体系中的诺氏疟原虫阳性质控品和无核酸酶水阴性质控品以诺氏疟原虫的检测引物组的LAMP扩增结果显色照片；图1中的1-4号孔为诺氏疟原虫阳性质控品扩增体系最终显色照片；5号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终显色照片。
图2为本申请实施例提供的可视化LAMP扩增体系中的诺氏疟原虫阳性质控品设置1000拷贝/μL、100拷贝/μL、10拷贝/μL时浓度梯度和无核酸酶水阴性质控品以诺氏疟原虫的检测引物组的LAMP扩增结果显色照片；图2中的1号孔为1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；2号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；3号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终显色照片；4号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终显色照片。
图3为本申请实施例提供的可视化LAMP扩增体系中的诺氏疟原虫的LAMP引物LAMP扩增“诺氏疟原虫的阳性质控品(10000拷贝/μL)”的结果显色照片，图3中的1号孔为诺氏疟原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终显色照片。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请涉及的专业名称说明：
环介导等温核酸扩增技术：(loop-mediated isotherm amplification，LAMP)是等温核酸扩增方法，其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)和多对特异性引物，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下完成核酸扩增反应。
本申请实施例第一方面提供一种等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂，试剂包括如下用于检测诺氏疟原虫的环介导等温核酸扩增引物组：第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ IDNo.5、第二环引物SEQ ID No.6。
本申请第一方面提供的等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂含有诺氏疟原虫的环介导等温核酸扩增引物组，其中，各个引物组是根据其特异性基因设定的，SEQ ID No.1～SEQID No.6的引物能够特异性扩增得到诺氏疟原虫属靶序列SSuRNA基因，引物组特异性强，不会产生非特异性扩增，从而使得本申请试剂用于检测诺氏疟原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。同时，本申请中提供的环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，其可以直接向试剂中添加pH染料的可视化恒温扩增试剂构成环介导等温核酸扩增体系，从而使得试剂能够通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断以简易快速检测诺氏疟原虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。
在一些实施例中，用于检测诺氏疟原虫的环介导等温核酸扩增引物组是根据诺氏疟原虫靶基因设计的，诺氏疟原虫靶基因为SSuRNA基因，SSuRNA基因全长在2000bp左右。
在一些实施例中，诺氏疟原虫引物设计区域在该基因的1447-1664bp之间，根据该基因片段设计诺氏疟原虫引物能够特异性地对诺氏疟原虫进行检测。在一实施例中，诺氏疟原虫靶序列SSuRNA基因的引物设计区域序列为SEQ ID No.7所示。
在一些实施例中，SEQ ID No.1至SEQ ID No.7的具体序列如下表1所示：
表1
Figure BDA0003245904410000061
Figure BDA0003245904410000071
在一些实施例中，试剂还包括：可视化恒温试剂，且，可视化恒温试剂包括如下组分：
聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。
由于本申请实施例试剂含有上述环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID No.1至SEQID No.6。因此，当本申请实施例试剂采用LAMP进行扩增时，其LAMP扩增反应过程中会释放出大量的H+，致使LAMP扩增反应体系的pH值发生变化。本申请实施例试剂所含的pH染料会根据LAMP扩增反应体系的pH值发生颜色变化。因此，可视化恒温扩增试剂与环介导等温核酸扩增引物组构成扩增反应体系，在实现检测诺氏疟原虫在具有灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高的基础上，可以实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得检测诺氏疟原虫不依赖专业人员、专业仪器，进一步使得检测诺氏疟原虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。从而避免传统的采用荧光PCR检测需要专业的人员和专业仪器从而导致检测受条件限制而不便利和成本高的问题。
在一些实施例中，聚合酶为Bst聚合酶。该Bst聚合酶能够有效促进上文环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的LAMP扩增，并使得pH染料快速灵活发生显色反应，以便于可以用裸眼直接判断结果。
在一些实施例中，pH染料为间甲酚紫。这样，间甲酚紫作为结果显示剂能够根据PCR扩增反应体系的pH值的变化灵活发生颜色变化，提高检测的准确性和灵敏度，而且提高结果判断的便捷性和快速性。
在一些实施例中，等温扩增缓冲液包括LAMP扩增所需的组分。其中，一些具体实施例中，等温扩增缓冲液包括KCl、MgSO4、吐温20、dNTPs和无核酸酶水(如无菌水)等组分。该等温扩增缓冲液与聚合酶、pH染料等组分构成可视化恒温扩增试剂，有效提高了本申请实施例试剂所含环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID No.1至SEQ ID No.6的LAMP扩增的稳定性。
本申请实施例试剂含有诺氏疟原虫的环介导等温核酸扩增引物组，引物组之间不会产生非特异的扩增，特异性强。当进一步含有可视化恒温扩增试剂时，实现检测诺氏疟原虫在具有灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高的基础上，可以实现通过观察颜色变化而直接进行结果判断，使得检测诺氏疟原虫不依赖专业人员、专业仪器，进一步使得检测诺氏疟原虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。有效避免传统PCR检测需要荧光探针与荧光染料，而且还需专业人员、专业仪器进行而导致检测临场检测性差，而且成本高的不足。
本申请实施例第二方面提供一种等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂盒，试剂盒包括试剂。
本申请第二方面提供的等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂盒，由于采用本申请等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂，因此，试剂盒用于检测诺氏疟原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。同时，环介导等温核酸扩增引物组具有等温核酸扩增特性，从而使得试剂能够简易快速检测诺氏疟原虫，并使得该检测拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。当试剂盒含有本申请可视化恒温扩增试剂时，试剂盒还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得使用试剂盒检测诺氏疟原虫时不用依赖专业人员、专业仪器，进一步使得试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。
在一些实施例中，试剂盒包括试剂，其中，试剂包括：可视化恒温扩增试剂；且，可视化恒温扩增试剂包括如下组分：聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。
在一些实施例中，聚合酶选自Bst聚合酶，使得pH染料快速灵活发生显色反应，以便于可以用裸眼直接判断结果。
在一些实施例中，pH染料选自间甲酚紫；以间甲酚紫作为pH染料，得到的结果显示剂能够根据PCR扩增反应体系的pH值的变化灵活发生颜色变化，提高检测的准确性和灵敏度，而且提高结果判断的便捷性和快速性。
在一些实施例中，等温扩增缓冲液包括但不限于如下组分：KCl、MgSO4、吐温20、dNTPs和无核酸酶水。
在一些实施例中，试剂盒还包括：核酸提取耗材、阳性质控品，阴性质控品。
其中，增设核酸提取耗材以配合本申请实施例试剂盒所含的环介导等温核酸扩增引物组或进一步所包含的可视化恒温扩增试剂，以提高本申请实施例试剂盒的操作的便捷性。
在一些实施例中，核酸提取耗材包括核酸提取液和用于核酸提取的器件，其中，核酸提取液选自处理液、裂解液、清洗液、洗脱液中的至少一种，器件选自取液器、核酸裂解容器、核酸富集器中的至少一种。
在一些具体实施例中，处理液选自红细胞裂解液；裂解液选自TES裂解液、清洗液选自乙醇、洗脱液选自无核酸酶水。
在一些具体实施例中，取液器选自螺旋口活塞注射器。
在一些具体实施例中，核酸裂解容器选自裂解管。
在一些具体实施例中，用于核酸提取的器件选自核酸富集器，其中，核酸富集器包括硅胶膜和富集器壳体，富集器壳体设有液体进入口，在富集器壳体内且在液体进入通道上开设有一凹槽，硅胶膜填设于凹槽内。核酸富集器在使用时，将富集器壳体设有液体进入口连接取液器的液体出口。
通过在本申请实施例试剂盒中设置核酸提取耗材，从而降低核酸提取的专业要求，使得本申请实施例试剂盒操作的便利性，可在实现在无专业人员和无专业设备的情况下，实现现场完成对样本的核酸提取。
在一些实施例中，阳性质控品选自诺氏疟原虫的核酸模板。
在一些实施例中，阴性质控品选自无核酸酶水，当然也可以是无菌水，如DEPC水。
在一些具体实施例中，提供的试剂盒中可以按照表2所示的内容提供核酸提取耗材。
表2
Figure BDA0003245904410000101
在一些实施例中，提供的试剂盒进行使用中，第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2的使用终浓度均为1.8～2.0μM；第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQID No.4的使用终浓度均为57.6～58.0μM；第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ IDNo.6的使用终浓度均为20～22μM。
在一些具体实施例中，提供的试剂盒进行使用中，第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ ID No.2的使用终浓度均为1.8μM；第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ IDNo.4的使用终浓度均为57.6μM；第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6的使用终浓度均为20μM。
通过控制每个基因的外引物、内引物和环引物的浓度，确保用于检测疟原虫属及能区分四种疟原虫种灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。优选当试剂盒含有本申请可视化恒温扩增试剂时，试剂盒还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，使得使用试剂盒检测疟原虫属及能区分四种疟原虫种时不用依赖专业人员、专业仪器，进一步使得试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。
在一些具体实施例中，试剂盒可以按照如下表3中的规格进行配备个试剂：
表3
Figure BDA0003245904410000111
Figure BDA0003245904410000121
因此，本申请实施例试剂盒由于采用本申请实施例试剂或进一步配设可视化恒温扩增试剂，使得试剂盒用于检测诺氏疟原虫灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。当试剂盒含有可视化恒温扩增试剂时，试剂盒还能够实现通过裸眼观察颜色变化而直接进行结果判断，有效避免传统PCR检测需要荧光探针与荧光染料，使得使用试剂盒检测诺氏疟原虫时不用依赖专业人员、专业仪器，进一步使得试剂盒的使用拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测能力。
本申请实施例第三方面提供一种检测诺氏疟原虫的方法，该方法包括如下步骤：
S01.获取待检测样品的核酸；
S02.将待检测样品的核酸与试剂或试剂盒提供的等温扩增试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理；
S03.根据环介导等温核酸扩增处理的混合液所含的pH染料显示颜色，进行比对，对待检测样品进行分析判断。
本申请第三方面提供的检测诺氏疟原虫的方法，由于是利用本申请提供的试剂盒进行检测，因此，检测诺氏疟原虫的方法灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。当本申请试剂盒含有本申请可视化恒温扩增试剂时，检测诺氏疟原虫的方法不需要依赖专业人员、专业仪器，直接用裸眼观察PCR扩增反应体系的颜色变化而直接进行结果判断，使得本申请检测诺氏疟原虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测性。
其中，上述步骤S01中用于提取待测样本核酸的待测样本可以是脱离人体物，如全血等，还可以是传播媒介大劣按蚊等。也即是说，该步骤S01中待测样本还可以是为卫生安全为目的样品为来源，即非仅仅以疾病判断为目标的来源。提取方式可以按照本领域核酸常规提取方式即可。
在一些实施例中，可以直接用实施例试剂盒附带的核酸提取耗材进行提取。具体的采用本实施例试剂盒附带的核酸提取耗材进行提取核酸的方法可以按照如下步骤进行实施例中的核酸提取方法进行自行提取。这样可以实现在非专业人员和非专业设备的条件下实现快速提取待测样本核酸。
在一些实施例中，取待检测样品的核酸的方法包括如下步骤：
S011.对待检测样品进行裂解处理，获得含待检测样品核酸的裂解液；
S012.将裂解液经过核酸富集器吸附处理，并对被吸附的待检测样品核酸进行清洗处理后，进行核酸洗脱处理。
步骤S02中，将待检测样品的核酸与试剂或试剂盒提供的试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理，得到环介导等温核酸扩增处理的混合液。
在一些实施例中，将待测样本核酸与提供的实施例试剂混合处理后，形成LAMP扩增体系。具体可以按照上文表3中的LAMP扩增试剂来配制LAMP扩增体系。
在一些实施例中，LAMP处理的温度优选设定为60℃-70℃，具体处理的问题选自65℃，时间应该是充分的，可为50～70min。由于LAMP处理是等温扩增，因此LAMP处理的温度可以采用保温杯或水浴锅等可在一定温度范围内维持一段时间的设备来提供，从而显著的降低了检测诺氏疟原虫的方法的非专业检测人员和非专业设备的要求。
步骤S03中，根据混合液的所含pH染料的显示颜色，进行比对，对待检测样品进行分析判断。
由于在步骤S02中LAMP扩增体系含有可视化的pH染料，因此，待LAMP处理结束后，LAMP扩增体系的颜色会显示一定的颜色。从而根据取待测样本核酸最终LAMP扩增体系显示的颜色，与含质控品核酸最终LAMP扩增体系显示的颜色比较，从而直接用裸眼判断待测样本中是否含有诺氏疟原虫。
因此，检测诺氏疟原虫的方法利用本申请试剂盒进行检测，使得检测诺氏疟原虫的方法灵敏度高，重复性好，假阴性及假阳性低，检测准确率高。且检测诺氏疟原虫的方法不需要依赖专业人员、专业仪器，直接用裸眼观察LAMP扩增反应体系的颜色变化而直接进行结果判断，使得检测诺氏疟原虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测性。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂
试剂包括用于检测诺氏疟原虫的环介导等温核酸扩增引物组以及可视化恒温扩增试剂，其中环介导等温核酸扩增引物组和可视化恒温扩增试剂的规格如表4中所示。
表4
Figure BDA0003245904410000141
Figure BDA0003245904410000151
实施例2
一种等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂盒
试剂盒包括实施例1提供的试剂、核酸提取耗材、阳性质控品和阴性质控品；
其中，核酸提取耗材包括核酸提取液和用于核酸提取的器件，核酸提取液选自处理液、裂解液、清洗液、洗脱液，具体添加量及选择如表2所示，器件选自取液器、核酸裂解容器、核酸富集器；且，取液器5ml、1ml的螺口活塞注射器中，核酸裂解容器选自裂解管，核酸富集器为自组装耗材，是用打孔器将硅胶膜进行剪裁成规则的圆形结构，装入富集器壳体内，该富集器壳体内中间位置为凹槽，将裁剪好的硅胶膜装入凹槽内，组成核酸富集器；
其中，阳性质控品选自诺氏疟原虫的核酸模板；阴性质控品选自无核酸酶水。
实施例3
一种等温扩增检测诺氏疟原虫的方法
采用实施例2提供的等温扩增检测诺氏疟原虫试剂盒检测诺氏疟原虫，检测方法包括如下步骤：
S11.样品核酸的提取方法
待检测样品：诺氏疟原虫病人全血8份；健康人全血10份；
样本前处理：分别用1ml吸管吸取待检测样品200μL-1000μL到处理管中(含有处理液)，充分混匀室温放置5min，进行第一次的裂解；
样本裂解：将处理后的全血样本转入装有裂解液的裂解管中混匀(裂解液体积为0.6ml)，56℃孵育10-15min充分裂解；
核酸吸附及清洗：分别待经裂解处理后的待检测样品冷却至室温，分别加入1.4ml95％乙醇混匀，用一次性核酸提取装置缓慢吸取裂解后的全血样本，全部吸入5ml注射器，然后缓慢推弃(不反复推吸)；注意：使用前不可将核酸富集器从5ml注射器前端取下；取2ml清洗液至2ml离心管中，用一次性核酸提取装置缓慢吸取全部液体，再缓慢推弃(不反复推吸)；注意：操作前请确认清晰液已加入响应体己的95％乙醇；缓慢推戏注射器活塞5次，充分去除残留的液体；
核酸洗脱：取下与核酸富集器连接的5ml注射器，更换为1ml注射器。用1ml注射器缓慢吸取洗脱液；缓慢推吸1次，将1ml注射器静置1分钟，再推出洗脱的核酸到检测管中，或推出洗脱的核酸到0.6ml离心管中保存，-20℃保存，分别得到全血、血浆、血清核酸，用于后续的检测。
S12.可视化检测体系的建立
(1)可视化LAMP扩增试剂的配制：
1μl的8U/μl的Bst聚合酶；0.2μl的1M KCL；0.4μl的0.4M MgSO4；0.2μl的10％吐温20；1.12μl的25mM dNTPs；5.52μl的无菌水；0.16μl的50mM可视化pH染料，用无核酸酶水至20μL体系。其中，pH染料为间甲酚紫。
(2)环介导等温核酸扩增引物组的建立
根据GenBank上收录的诺氏疟原虫的SSuRNA基因序列，分别进行收集。筛选保守区域(能有效鉴定诺氏疟原虫)，确定序列状态，并进行比较和筛选确定最终如上文表1中的SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6。具体的根据上文表1中SEQ ID NO.7设计上文用于检测诺氏疟原虫的环介导等温核酸扩增引物组SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6。
(3)可视化LAMP扩增体系的具体配制为：
0.3mM的外引物F3和外引物B3各0.12μL；2.4mM的内引物FIP和内引物BIP各0.48μL；1mM的环引物LF和环引物LB各0.4μL；步骤(1)中配制的可视化LAMP扩增试剂的配制10μL(含染料与Bst酶)；加灭菌纯化水至20μL体系。
(4)LAMP扩增
等温扩增检测反应条件为：65℃恒温50min。
待检测样品、诺氏疟原虫核酸DNA的阳性质控品、无核酸酶水阴性质控品，分别与(1)可视化LAMP扩增试剂按照(3)可视化LAMP扩增体系构建方法分别构件可视化LAMP扩增体系并进行LAMP扩增。
采用保温杯或水浴锅等可在一定温度范围内维持1-2h的设备进行LAMP扩增，反应时间为50min，结束后观察颜色变化。
(5)判定环介导等温扩增反应结果的原则：
a.若LAMP扩增体系最终出现黄绿色，判定测试结果为阳性；
b.若出现紫色(颜色不变)，判定测试结果为阴性。
c.对其他种类的疟原虫或其他物种，在反应的50分钟(min)时间内未检测出(颜色不变)，显示为阴性反应。
结果分析
对实施例3的检测结果进行分析：
质控品的检测结果：
诺氏疟原虫核酸DNA的阳性质控品、无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如下表5所示。
表5
Figure BDA0003245904410000171
其中，诺氏疟原虫阳性质控品(浓度为1000copies/μl)和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增(所用的LAMP引物为诺氏疟原虫的检测引物组)结果如图1所示，图1中的1-4号孔为诺氏疟原虫阳性质控品扩增体系最终颜色为黄绿色；5号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色。
诺氏疟原虫阳性质控品设置1000拷贝/μL(copies/μL)、100拷贝/μL(copies/μL)、10拷贝/μL(copies/μL)时浓度梯度的LAMP扩增(所用的LAMP引物为诺氏疟原虫的检测引物组)结果和无核酸酶水阴性质控品的LAMP扩增结果如图2所示。图2中的1号孔为1000拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为黄绿色；2号孔为100拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为淡洋紫色；3号孔为10拷贝/μL浓度的扩增体系最终颜色为淡洋紫色；4号孔为无核酸酶水阴性质控品扩增体系最终颜色为洋紫色。
诺氏疟原虫的LAMP引物扩增“无核酸酶水”的结果如图3所示，图3中的1号孔为诺氏疟原虫的LAMP引物LAMP扩增体系最终颜色为洋紫色。
对于诺氏疟原虫的LAMP引物分别LAMP扩增“全血核酸待测样品”的结果如表6所示：
表6
Figure BDA0003245904410000181
综上，本申请实施例提供的检测诺氏疟原虫的方法，由于是利用本申请提供的试剂盒进行检测，因此，检测诺氏疟原虫的方法灵敏度高，重复性好、假阴性及假阳性低，检测准确率高。当本申请试剂盒含有本申请可视化恒温扩增试剂时，检测诺氏疟原虫的方法不需要依赖专业人员、专业仪器，直接用裸眼观察PCR扩增反应体系的颜色变化而直接进行结果判断，使得本申请检测诺氏疟原虫的方法拥有更宽的发挥场景，更好的临场检测性。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所（国家热带病研究中心）
<120> 等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂、试剂盒及其应用
<130> 2021-09-01
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ggcaaataca acatatttct at 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tgtaaaagca aatacatttc tac 23
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aaggtagcaa aatgcatttt ttccgctgaa tttgtatttg gat 43
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gtacctaata atacttgtgc gcctatgaaa gtgaaatggc atcataatc 49
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gtactcatta tatgcacggc aaaa 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tatttccaac cctctattcc ctg 23
<210> 7
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
aatatgattt gtctggttaa ttccgataac gaacgagatc ttaacctgct aattagcggc 60
aaatacaaca tatttctatg ctgaatttgt atttggataa tttaaaaggt ttttttgccg 120
tgcatataat gagtacggaa aaaatgcatt ttgctacctt gtacctaata atacttgtgc 180
gcctatgcat atttccaacc ctctattccc tgtaccgcat aaaactggat tatgatgcca 240
tttcactttt atgtagaaat gtatttgctt ttacataaag cttcttagag gaacgatgtg 300
tgtctaacac aaggaagttt aaggcaacaa caggtctgtg atgtccttag atgaactagg 360
ctgcacgcgt gctac 375

Claims (10)

1.一种等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂，其特征在于，所述试剂包括如下用于检测诺氏疟原虫的环介导等温核酸扩增引物组：第一外引物SEQ ID No.1、第二外引物SEQ IDNo.2、第一内引物SEQ ID No.3、第二内引物SEQ ID No.4、第一环引物SEQ ID No.5、第二环引物SEQ ID No.6。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括：可视化恒温试剂，且，所述可视化恒温试剂包括如下组分：
聚合酶、pH染料、等温扩增缓冲液。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述聚合酶选自Bst聚合酶；和/或，
所述pH染料选自间甲酚紫；和/或，
所述等温扩增缓冲液包括如下组分：KCl、MgSO4、吐温20、dNTPs和无核酸酶水。
4.一种等温扩增检测诺氏疟原虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一所述的试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸提取耗材、阳性质控品，阴性质控品。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取耗材包括核酸提取液和用于核酸提取的器件，其中，所述核酸提取液选自处理液、裂解液、清洗液、洗脱液中的至少一种，所述器件选自取液器、核酸裂解容器、核酸富集器中的至少一种；和/或，
所述阳性质控品选自诺氏疟原虫的核酸模板；和/或，
所述阴性质控品选自无核酸酶水。
7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一外引物SEQ ID No.1、所述第二外引物SEQ ID No.2的使用终浓度均为1.8～2.0μM；
所述第一内引物SEQ ID No.3、所述第二内引物SEQ ID No.4的使用终浓度均为57.6～58.0μM；
所述第一环引物SEQ ID No.5、所述第二环引物SEQ ID No.6的使用终浓度均为20～22μM。
8.一种检测诺氏疟原虫的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
获取待检测样品的核酸；
将所述待检测样品的核酸与权利要求1-3任一所述的试剂或权利要求4-7任一项所述的试剂盒提供的等温扩增试剂进行混合并进行环介导等温核酸扩增处理；
根据所述环介导等温核酸扩增处理的混合液所含的pH染料显示颜色，进行比对，对所述待检测样品进行分析判断。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，获取待检测样品的核酸的方法包括如下步骤：
对待检测样品进行裂解处理，获得含待检测样品核酸的裂解液；
将所述裂解液经过核酸富集器吸附处理，并对被吸附的待检测样品核酸进行清洗处理后，进行核酸洗脱处理。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述环介导等温核酸扩增处理的温度为60-70℃，时间为50～70分钟。
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WO2012021054A2 (en) * 2010-08-13 2012-02-16 University Of Malaya A diagnostic system for malaria
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