CN109603704B - 一种寡核苷酸合成芯片系统及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种寡核苷酸合成芯片系统，所述寡核苷酸合成芯片系统包括寡核苷酸合成芯片和合成载体粒径筛选芯片，所述高通量寡核苷酸合成芯片包括微漏斗结构，所述微漏斗结构两端开口，上端开口位于所述高通量寡核苷酸合成芯片的上表面，下端开口位于所述高通量寡核苷酸合成芯片的下表面，上端开口的口径大于下端开口的口径；所述合成载体粒径筛选芯片包括筛孔，筛孔的上表面开口孔径小于所述寡核苷酸合成芯片的上端开口孔径，筛孔的下表面开口孔径明显大于所述寡核苷酸合成芯片的下端开口孔径，所述筛孔的下表面开口孔径略小于筛孔的上表面开口孔径。

Description

一种寡核苷酸合成芯片系统及其使用方法

技术领域

本发明涉及微流控技术领域，也涉及固相DNA化学合成领域。更具体来说，本发明涉及利用微流控芯片进行高通量寡核苷酸的固相化学合成芯片系统及其使用方法。

背景技术

DNA是最关键的生物大分子，根据需要制备DNA在科研和应用领域具有重要意义。尽管利用微生物培养繁殖等生物学方法可以大量获得DNA，利用聚合酶链式反应(PCR扩增)也可以扩增DNA，但都需要模板从头无模板制备DNA仍然必须使用化学合成方法。固相化学合成是化学合成DNA的主要手段，目前业界通用的DNA固相合成策略是固相亚磷酰胺法。固相DNA合成的基本方法是将核苷酸的末端连接到带有活性基团的固相载体上，引入DNA合成单元，逐一与固相载体上的活性基团发生化学合成反应，杂质和副产物则留在流动相中经清洗而去除，最后将目标DNA产物裂解下来。由于固相合成的产物被固定在固相上，而杂质和副产物保留在液相中，容易进行分离，固相DNA合成法能够获得较高的产率和纯度。

近年来，随着分子生物学等研究手段的逐渐深入，特别是随着高通量测序技术和合成生物学研究的出现和发展，对DNA合成的需求也日趋增加。利用高通量方法合成的大量寡核苷酸，可以构建高容量的DNA探针库，用于对核酸适配体和核酸药物的筛选，也可以结合聚合酶链式装配等方法逐步构建基因甚至基因组。然而，尽管固相DNA合成已经发展多年，工业界也早已出现了以Dr.Oligo 192、MerMade 192为代表的商品化DNA合成仪器，但这些合成设备的合成通量只有上百至数百条，通常只能满足DNA引物合成等较传统的分子生物学研究需求。而构建高容量DNA文库、从头合成基因甚至基因组等新兴研究，往往需要一次制备数千甚至数十万条寡核苷酸序列，上述商品化合成设备的通量仍然远远不能满足需求。

上世纪90年代出现的微流控芯片技术(Sens.Actutors,B,1990,1,244-248.)近年来发展迅速，而构建化学微反应器是微流控芯片的重要应用方向之一(Tetrahedron,2005,61:2733-2742；Chem.Rev.,2007,107,2300-2318)。利用微流控芯片技术构建的微反应器，可以在微小尺度下集成大量芯片元件，从而可以同时进行成千上万个合成反应，使得高通量制备寡核苷酸成为可能。而如何高通量控制这么多芯片元件，目前也已经发展出不同策略。

Affymetrix研发了光化学合成芯片(Science,1991,251:767-773)并在该类微芯片上高通量合成寡核苷酸探针(PNAS,1994,91:5022-5026)。芯片上光化学合成DNA可以达到很高的合成密度，但这种方法也存在很多问题：在合成时需要使用特殊的光敏试剂，其合成效率稍逊色于已经充分优化的亚磷酰胺法，所以不适合长链DNA的合成；更关键的是每连接一个核苷酸残基，都需要制备一种光掩模，合成长度为N的寡核苷酸就需要制备4N种光掩模，因此掩模制备成本很高，通常只适用于合成固定的寡核苷酸探针阵列，而不适合高通量寡核苷酸的定制合成。

电化学芯片(US20030050437A1、US20060102471A1)是另一种高通量合成寡核苷酸的策略。电化学方法合成寡核苷酸也会用到专用试剂，用于在微电极的作用下产酸以脱去核苷酸的保护基团，因此也需要对工艺条件进行专门优化，以确保合成效率。电化学合成芯片可以用软件灵活控制芯片上的序列合成，可以用于高通量寡核苷酸的定制合成，但无法对芯片的不同位置输送不同的反应试剂，通常不适合直接应用于基因合成等领域。

基于喷墨打印的高通量寡核苷酸合成芯片是一种较为灵活的策略(US20160310927A1、US20150038373A1)。微芯片上设计了大量合成单元，通过喷墨打印头对每个合成单元选择性地输送不同的反应原料，从而灵活实现高通量寡核苷酸的定制合成。由于可以对芯片不同位置输送不同试剂，寡核苷酸合成、短序列拼接(PCA)、PCR扩增等操作均可以在芯片上原位实现，因此也可用于基因合成等合成生物学领域的应用。但该芯片方案需要在硅基芯片的不同位置进行精细的修饰以获得DNA合成所需的活性表面和亲水/疏水区域，芯片的微加工工艺比较复杂，芯片的加工成本和使用成本很高，实际上限制了高通量DNA合成的应用范围。

综上可见，工业中应用的DNA合成设备不适合于高通量DNA合成，现有的基于微流控芯片的高通量DNA合成方法在适用领域、制造成本等方面存在不同程度的缺点。因此，本领域长期想开发一种微流控芯片及方法，以期能够实现高通量、可定制、低成本的DNA固相合成，但均未得到有效解决。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种寡核苷酸合成芯片系统及其使用方法。本发明的寡核苷酸合成芯片系统的加工工艺简单，不需要复杂的表面修饰，芯片制造成本较低，同时可以根据需要多次装载寡核苷酸的合成载体，从而显著降低合成成本，可以解决本领域长期想解决但未能解决的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种寡核苷酸合成芯片系统，所述寡核苷酸合成芯片系统包括寡核苷酸合成芯片，所述高通量寡核苷酸合成芯片包括微漏斗结构，所述微漏斗结构两端开口，上端开口位于所述高通量寡核苷酸合成芯片的上表面，下端开口位于所述高通量寡核苷酸合成芯片的下表面，上端开口的口径大于下端开口的口径，多个矩形排布的微漏斗结构形成一组，把每组微漏斗结构为一个重复单元，多个重复单元按照矩形排布形成二维阵列。

在一个实施方案中，所述寡核苷酸合成芯片系统还包括合成载体粒径筛选芯片，所述合成载体粒径筛选芯片包括筛孔，筛孔的上表面开口孔径小于所述寡核苷酸合成芯片的上端开口孔径，筛孔的下表面开口孔径明显大于所述寡核苷酸合成芯片的下端开口孔径，所述筛孔的下表面开口孔径略小于筛孔的上表面开口孔径；多个筛孔矩形排布在所述高通量合成载体粒径筛选芯片上；所述筛孔的上表面位于所述高通量合成载体粒径筛选芯片的上表面，所述筛孔的下表面位于所述高通量合成载体粒径筛选芯片的下表面。

在一个实施方案中，所述寡核苷酸合成芯片的基础材质为硅材质，例如运用两次干法刻蚀的方式获得漏斗状结构。例如，先采用干法刻蚀处理硅片的上表面，获得微漏斗结构孔径较大的上端开口，然后使用干法刻蚀硅片的下表面，获得孔径较小的下端开口，所述下表面开口的中心点与所述上表面开口的中心点重合，并且贯通得到漏斗状的微结构。

在一个实施方案中，所述寡核苷酸合成芯片的漏斗状结构，其上端开口的形状为圆柱形，直径为150-200微米，深度为150-200微米，其下端开口的形状为圆柱形，直径为10-40微米，深度为150-400微米，上端开口与下端开口的中心点在同一垂直轴上并且相互贯通，所述高通量寡核苷酸合成芯片的厚度即为300-600微米。

在一个实施方案中，若干个所述寡核苷酸合成芯片的漏斗状结构按照矩形排列成为一组，每组中漏斗状结构为5-15行和5-15列，每个漏斗状结构的间距相等，为250-500微米，把每组微漏斗结构划分为一个重复单元，若干个重复单元又按照矩形排布，每组之间的间距相等，都为2-8毫米。

在一个实施方案中，所述寡核苷酸合成芯片的总尺寸为长75-127毫米，宽25-85毫米。

在一个实施方案中，所述的合成载体粒径筛选芯片为硅材质，运用两次干法刻蚀的方式获得筛孔结构，其上端开口的形状为圆柱形，直径为130-180微米，深度为150-200微米；其下端开口的形状为圆柱形，直径为120-160微米，深度为150-400微米，上端开口与下端开口的中心点在同一垂直轴上并且相互贯通，所述寡核苷酸合成芯片的厚度即为400-600微米。

在一个实施方案中，所述合成载体粒径筛选芯片下端开口的直径需要控制在上端开口直径的80％-95％，合成载体粒径筛选芯片下端开口的直径需要控制在合成芯片漏斗状结构上端开口直径的80％-90％之间，以确保的合成载体粒径分布在一个较小的区间内，控制DNA合成产量的均一性。

本发明还提供了本发明的寡核苷酸合成芯片系统进行寡核苷酸合成的方法，所述方法包括：

先把大小不一干燥的固态载体平铺在合成载体粒径筛选芯片的上表面，用刮板轻轻刮过合成载体粒径筛选芯片的上表面，符合粒径要求的DNA合成载体将被截留在合成载体粒径筛选芯片中，粒径太小的DNA合成载体会从合成载体粒径筛选芯片中流出，而粒径太大的DNA合成载体则无法进入合成载体粒径筛选芯片，滞留在高通量合成载体粒径筛选芯片上表面的太大粒径的DNA合成载体会被刮片轻轻刮走。

倒扣合成载体粒径筛选芯片将符合粒径要求的DNA合成载体取出，然后可以用同样的步骤将DNA合成载体装载入寡核苷酸合成芯片，

DNA的合成载体及反应试剂经所述寡核苷酸合成芯片的漏斗状结构的上端装载，DNA的合成载体的粒径大于下端开口，被截留在漏斗状结构中，通过在结构上表面施加正压或者在下表面施加负压，反应试剂连续流动反应并排出废液，实现高效地DNA合成。

在一个实施方案中，所述的DNA的合成载体可以采用商用或自制的DNA固相合成载体。

在一个实施方案中，装载了DNA合成载体的合成芯片可以进行高通量的寡核苷酸合成。

本发明的有益效果为：所设计的合成反应微芯片上整合了高通量的微漏斗结构，可以装载DNA合成载体实现寡核苷酸合成。本发明的寡核苷酸合成芯片的加工工艺简单，不需要复杂的表面修饰，芯片制造成本较低。由于DNA合成载体可以在芯片使用前通过装载的方式加入，而不需要在制做微芯片时通过表面修饰的方式在芯片上直接连接所需的化学基团，因此微流控芯片的加工工艺可以大大简化，从而显著降低微流控芯片的制造成本。同时，可以根据需要多次装载寡核苷酸的合成载体，从而显著降低合成成本，解决了本领域长期想解决但未能解决的技术问题。

附图说明

通过以下附图对本发明进行说明：

图1为本发明所述寡核苷酸合成芯片外观示意图。

图2为本发明所述寡核苷酸合成芯片中的一组微漏斗结构的示意图。

图3为本发明所述合成载体粒径筛选芯片的筛孔结构示意图。

图4为本发明所述寡核苷酸合成芯片的微加工流程示意图。

图5为本发明所述DNA载体筛选粒径方法示意图。

图6为本发明所述DNA载体装配方法示意图。

图7为本发明合成过程示意图。

图8为本发明实施例5合成结果图。

图9为本发明实施例6的部分合成结果图。

图中的标号具有如有意义：

101：成寡核苷酸合成芯片；102：成寡核苷酸合成芯片的一组微漏斗结构；103：成寡核苷酸合成芯片上的微漏斗结构；201：微漏斗结构的上开口；202：微漏斗结构的下开口；301：合成载体粒径筛选芯片；302：合成载体粒径筛选芯片上的筛孔结构；303：筛孔结构的上开口；304：筛孔结构的下开口；401：微加工使用的硅片；402：光刻胶；403：光刻暴露出待刻蚀的芯片上表面开口图形；404：芯片上表面干法刻蚀；405：去除芯片上表面光刻胶；406：芯片对准并光刻暴露出待刻蚀的芯片下表面开口图形；407：芯片下表面干法刻蚀；408：去除芯片下表面光刻胶，得到微芯片；501：粒径适合的DNA合成载体；502：粒径过小的DNA合成载体；503：粒径过大的DNA合成载体；504：用于去除芯片上表面无效合成载体的刮板；505：将合成载体铺满合成载体粒径筛选芯片上表面；506：粒径太小的载体不能保留；507：粒径太大的载体会被刮板去除；508：只有粒径适合的载体被保留；509：从合成载体粒径筛选芯片中可以取出载体供合成使用；601：粒径经筛选的载体铺满合成芯片上表面；602：过量的合成载体会被刮板去除；603：仅在漏斗状结构103中保留需要的合成载体；701：需要通过喷墨打印或微针阵列输送的个性化合成试剂(包括核苷酸单体溶液和活化试剂)；702：其余通用的合成试剂；703：通过喷墨打印或微针阵列输送个性化合成试剂；704：通过输液泵输送通用合成试剂；705：个性化合成试剂分别没过每个漏斗状结构103而不产生交叉污染；706：合成试剂在气压作用下从漏斗状结构103中排出。

具体实施方式

在本发明中，为解决现有技术中的问题，本发明提供了一种寡核苷酸合成芯片及其应用方法。由于所设计的合成反应微芯片装载的DNA合成载体通常具有多孔结构，比表面积大从而寡核苷酸的载量也大，容易获得较高的寡核苷酸产量，而US20160310927A1等所描述的微流控芯片只能通过在芯片表面制作复杂的微图形来达到相似的比表面积，因此其芯片制作成本及良品率均不如本发明方案有优势。所设计的合成反应微芯片易于通过DNA合成载体多次装填来实现芯片的再生与再利用，而常规的在微芯片表面修饰得到合成载体的方式则需要借助微加工手段才有可能实现芯片的再生与再利用，因此本发明的寡核苷酸的合成成本也有显著降低。此外，由于微加工工艺只能对整个微芯片做整体的表面修饰，对于通过表面修饰得到合成载体的微芯片方案而言，每次必须使用整张芯片，而本发明方案易于通过限定装载DNA合成载体的区域来实现对芯片的按需分配，可以灵活选择合成通量，因而也会带来合成成本的下降。

在本发明中，为确保各反应单元中DNA的产量，需要对合成载体的投量进行准确控制，因此需要使用本发明所提供的合成载体粒径筛选芯片。

在本发明中，所述合成载体粒径筛选芯片下端开口的直径需要控制在上端开口直径的80％-95％，合成载体粒径筛选芯片上端开口的直径需要控制在合成芯片漏斗状结构上端开口直径的80％-90％之间，以确保的合成载体粒径分布在一个较小的区间内，控制DNA合成产量的均一性。

在本发明中，实际制备时，所述的DNA合成载体先通过合成载体粒径筛选芯片筛选出粒径均一性好的合成载体，再装载入合成芯片进行DNA合成。在筛选DNA合成载体的粒径时，先把干燥的固态载体平铺在合成载体粒径筛选芯片的上表面，用刮板轻轻刮过合成载体粒径筛选芯片的上表面，符合粒径要求的DNA合成载体将被截留在合成载体粒径筛选芯片中，粒径太小的DNA合成载体会从合成载体粒径筛选芯片中流出，而粒径太大的DNA合成载体则无法进入合成载体粒径筛选芯片，可以被刮板刮走；倒扣合成载体粒径筛选芯片将符合粒径要求的DNA合成载体取出，然后可以用同样的步骤将DNA合成载体装载入寡核苷酸合成芯片。

在本发明中，DNA的合成载体及反应试剂经所述寡核苷酸合成芯片的漏斗状结构的上端装载，DNA的合成载体的粒径大于下端开口，被截留在漏斗状结构中，通过在结构上表面施加正压或者在下表面施加负压，反应试剂则可以实现连续流动反应和排出废液，实现对DNA的高效合成。

在本发明中，所述的DNA的合成载体可以采用商用或自制的DNA固相合成载体。

在本发明中，装载了DNA合成载体的合成芯片可以进行高通量的寡核苷酸合成。

在本发明中，合成的基本流程与经典的亚磷酰胺法相同，为包括脱保护、偶联、加帽封闭、氧化等步骤的多次循环反应。

在本发明中，反应过程中所需要的通用试剂，如乙腈、CapA、CapB、氧化液、TCA等可以通过以注射泵方式直接往合成芯片的上表面加样。

在本发明中，保护核苷酸的单体及单体的活化试剂，由于每个合成位点的寡核苷酸序列各不相同，需要使用喷墨打印头或微针加样阵列，分别往各个合成单元中加样，防止试剂交叉污染。

在本发明中，在加入每步反应所需的试剂后，需要从合成芯片的上表面施加正气压，或者从合成表面的下表面施加负气压，使得覆盖在每个微漏斗结构中的反应废液逐渐从下端开口中排出。

在本发明中，为保证寡核苷酸的合成效率，整个反应体系需要严格控制无水无氧。合成芯片及附属的控制器件都位于手套箱环境之中，手套箱环境配备压力传感器及高精度的湿度传感器和氧含量传感器，传感器实时监控反应环境参数，并不断补充惰性的高纯氩气。

下面描述通过筛选芯片进行载体筛选、载体装载进合成芯片、合成芯片上的试剂操控的方式。

先把干燥的固态载体平铺在合成载体粒径筛选芯片的上表面，用刮板轻轻刮过合成载体粒径筛选芯片的上表面，符合粒径要求的DNA合成载体将被截留在合成载体粒径筛选芯片中，粒径太小的DNA合成载体会从合成载体粒径筛选芯片中流出，而粒径太大的DNA合成载体则无法进入合成载体粒径筛选芯片；

倒扣合成载体粒径筛选芯片将符合粒径要求的DNA合成载体取出，然后可以用同样的步骤将DNA合成载体装载入寡核苷酸合成芯片；

DNA的合成载体及反应试剂经所述寡核苷酸合成芯片的漏斗状结构的上端装载，DNA的合成载体的粒径大于下端开口，被截留在漏斗状结构中，反应试剂则可以在结构上表面施加正压或者在下表面施加负压，实现连续流动反应并排出废液，实现高效地DNA合成。

在本发明中，所述的寡核苷酸合成芯片和合成载体粒径筛选芯片在进行寡核苷酸合成时，不需要物理上结合为一个整体，而应该按照逻辑顺序分别使用，并配合必要的附属结构实现寡核苷酸合成。在使用时首先需要通过所述合成载体粒径筛选芯片实现合成载体筛选，然后把经过筛选粒径的合成载体装载入所述寡核苷酸合成芯片，接下来把所述寡核苷酸合成芯片的整个下表面密封置于一个负压环境，而所述寡核苷酸合成芯片的整个上表面保持在常压环境中，从而可以通过压力差实现反应试剂操控。用于密封所述寡核苷酸合成芯片的结构即属于所述的必要附属结构。

下面通过具体实施方式对本发明的合成反应微芯片、合成载体筛选粒径微芯片及其在高通量寡核苷酸合成中的应用进行详细描述。如无特殊说明，实施例中均为常规方法；所用的实验材料及部件，如无特殊说明，均为自常规试剂厂商或仪器商购买得到的。

实施例1成寡核苷酸合成芯片制备

请参见附图1和附图2，于本实施例中，所制备的成寡核苷酸合成芯片101的外观尺寸为长127毫米，宽85毫米，与通用的96孔板的外观尺寸相同。所制备的成寡核苷酸合成芯片101中的微漏斗结构103的上端开口201的直径为0.15毫米，深度为0.20毫米，下端开口202的直径为0.02毫米，深度为0.30毫米，微漏斗结构103间距为0.3毫米，每组微漏斗结构102中包括微漏斗结构103的个数为10X10，即100个。每组微漏斗结构102的间距为3毫米。

请参见附图4，于本实施例中，所制备的成寡核苷酸合成芯片101的材质为硅材质，通过两次干法刻蚀来制备。首先在硅片401的正面旋涂光刻胶402，经紫外光刻得到成寡核苷酸合成芯片101上表面需要刻蚀的微图形，此即为步骤403。利用深硅干法刻蚀工艺刻蚀得到成寡核苷酸合成芯片101上表面的开口(即201)的阵列，此即为步骤404。然后使用去胶液去除硅片401正面的残余光刻胶402，此即为步骤405。接下来翻转硅片401为背面朝上，利用辅助定位标记将硅片401精准对齐，在硅片401的背面选旋涂光刻胶402，经紫外光刻得到成寡核苷酸合成芯片101下表面需要刻蚀的微图形，此即为步骤406。利用深硅干法刻蚀工艺刻蚀得到成寡核苷酸合成芯片101下表面的开口(即202)的阵列，此即为步骤407。然后使用去胶液去除硅片401背面的残余光刻胶402，此即为步骤408。

将经过完整处理的硅片401按照所需的尺寸进行切割后，可以得到成寡核苷酸合成芯片101。

实施例2合成载体粒径筛选芯片制造

请参见附图3，于本实施例中，所制备的合成载体粒径筛选芯片301的外观尺寸为长127毫米，宽85毫米，与通用的96孔板的外观尺寸相同。所制备的合成载体粒径筛选芯片301中的筛孔结构302的上端开口303的直径为0.14毫米，深度为0.20毫米，下端开口304的直径为0.13毫米，深度为0.30毫米，筛孔结构302间距为0.3毫米。

请参见附图4，于本实施例中，所制备的合成载体粒径筛选芯片301的材质为硅材质，通过两次干法刻蚀来制备。如步骤403所示，首先在硅片401的正面旋涂光刻胶402，经紫外光刻得到合成载体粒径筛选芯片301上表面需要刻蚀的微图形。如步骤404所示，利用深硅干法刻蚀工艺刻蚀得到合成载体粒径筛选芯片301上表面的开口(即303)的阵列。然后如步骤405所示，使用去胶液去除硅片401正面的残余光刻胶402。接下来如步骤406所示，翻转硅片401为背面朝上，利用辅助定位标记将硅片401精准对齐，在硅片401的背面选旋涂光刻胶402，经紫外光刻得到合成载体粒径筛选芯片301下表面需要刻蚀的微图形。如步骤407所示，利用深硅干法刻蚀工艺刻蚀得到合成载体粒径筛选芯片301下表面的开口(即304)的阵列。然后如步骤403所示，使用去胶液去除硅片401背面的残余光刻胶402。

将经过完整处理的硅片401按照所需的尺寸进行切割后，可以得到合成载体粒径筛选芯片301。

实施例3合成载体分选方法

市售的DNA合成载体的基础材质为多孔玻璃，通常用于填充商用合成仪使用的合成柱，其粒径分布范围较宽，通常可以达到0.12-0.18毫米左右，因此粒径较小的合成载体与粒径较大的合成载体上DNA的合成载量差距可以达到3倍以上。对于高通量寡核苷酸合成而言，初始合成载量差异太大，会导致目标产物的产量有显著差异。而高通量寡核苷酸合成通常用于构建高通量DNA文库、进行长序列DNA或基因拼接等，目标产物的产量差异太大会导致DNA文库均一性差、长序列DNA拼接失败等后果。因此在应用本发明所述的寡核苷酸合成反应微芯片之前，必须对所使用的DNA合成载体进行粒径分选，确保参与合成的各反应单元中DNA初始载量相当，以保证高通量合成的效果。本实施例中所使用的DNA合成载体为市售的DNA合成载体。

请参见附图5，于本实施例中，DNA合成载体通过实施例2所制备的合成载体粒径筛选芯片301进行分选。首先取过量的DNA合成载体尽量均匀的覆盖在通过实施例2所制备的合成载体粒径筛选芯片301的上表面，然后轻轻晃动芯片使得合成载体均匀分布并下落，即步骤505所示。由于合成载体粒径筛选芯片301的筛孔的上下直径通过微加工方法准确制备，从而使得不同粒径的合成载体呈现差异表现。粒径小于筛孔302的下端开口直径的的合成载体502会从筛孔302中流出，粒径大于筛孔302的上端开口直径的的合成载体503无法进入筛孔，即步骤506所示。使用刮板504并控制与合成载体粒径筛选芯片301的间距，从而将粒径大于筛孔302的上端开口直径的的合成载体503从芯片301上表面去除，即步骤507所示。这样，只有粒径介于筛孔302的下端开口直径和上端开口直径之间的的的合成载体501才会被筛孔302截留，即步骤508所示。由于筛孔302的上下开口直径差距只有不到10％，因此筛选出的合成载体粒径基本一致，不会造成合成载量的显著差异。翻转并轻叩合成载体粒径筛选芯片301，可收集被截留的合成载体，即步骤509。经过数次反复，即可收集足够合成使用的粒径均一的合成载体。

实施例4合成载体装载方法

合成载体经过筛选后，可装载入成寡核苷酸合成芯片101用以进行高通量寡核苷酸合成。本实施例将描述这一过程，请参见附图6。首先如步骤601所示，先将过量的粒径适合的合成载体501平铺在成寡核苷酸合成芯片101的上表面。然后控制刮板504与芯片101上表面的距离，小心的将合成载体501推入微漏斗结构103中，并回收多余的合成载体501，即如步骤602所示。在显微镜下扫描成寡核苷酸合成芯片101，确保各个合成单元即各微漏斗结构103中都有合成载体，即完成载体装配，可随时用于高通量寡核苷酸合成。

实施例5单一寡核苷酸序列合成

本实施例主要用以测试成寡核苷酸合成芯片101的使用效果，在芯片上的寡核苷酸合成过程如图7所示。寡核苷酸的合成策略为通用的DNA亚磷酰胺合成法，每个合成循环包括脱保护、偶联、加帽封闭、氧化四个步骤，经多轮循环得到寡核苷酸产物。本实施例合成的寡核苷酸序列为TCCTTACTGCGTTCA，其中在5’保留了一个DMT保护基团，便于收集产物进行验证。

高通量寡核苷酸合成的一个关键因素是实现合成反应的时空隔离，即在一个时间点上反应区域内的活性位点只能与一种核苷酸单体接触，因此本发明所使用的核苷酸单体试剂和DCI活化试剂均需要对每个反应区域分别输送，在本发明中采用喷墨打印头对成寡核苷酸合成芯片101的每一个反应单元分别输送，如步骤701所示。控制反应试剂的输送量，从而使得合成载体可以充分与足量的反应试剂接触，而避免相互污染，如步骤705所示。尽管本实施例为便于验证芯片效果进行合成单一序列，但每一个反应单元所需要的核苷酸单体试剂和DCI活化试剂仍为分别输送。其余的合成原料，由于均不在反应活性位点开放时输送，因此可以采用常规的注射泵来进行输送，如步骤704所示。试剂加样并反应之后，通过在芯片的下表面施加负压，可以促使反应试剂排空，实现清洗和试剂交换。

主要的操作步骤如下：

a.将装配了合成载体的合成反应微芯片置于自行研发的自动化合成装置的芯片承载台上，承载台的上方设置有喷墨打印头，承载台上放置芯片的位置之下有空腔，可以产生负压，用以排空反应试剂。承载台位于一个可严格密闭的环境中，便于控制合成反应所需的无水无氧环境。

b.往密闭环境中充入高纯氩气20分钟，利用高精度氧传感器和湿度传感器监测密闭环境的氧和水蒸汽含量，用气压传感器监测密闭环境的气压，直至体系稳定。

c.利用注射泵往合成芯片表面输送脱保护试剂，使用微小负压使得试剂可以充满反应单元，孵育反应40秒。增大负压，使得反应单元中的试剂完全排空。

d.利用注射泵往合成芯片表面输送清洗液，利用负压，使得反应单元中的试剂完全排空，重复此清洗步骤三次。

e.利用喷墨打印头往合成芯片表面各个反应单元分别输送所需的核苷酸试剂(在本实施例中核苷酸均为A)，然后接着利用喷墨打印头往合成芯片表面各个反应单元分别输送活化试剂，孵育反应30秒。利用负压，使得反应单元中的试剂完全排空。

f.利用注射泵往合成芯片表面输送清洗试剂，利用负压，使得反应单元中的试剂完全排空，重复此清洗步骤三次。

g.利用注射泵往合成芯片表面输送体积比1:1的CapA试剂和CapB试剂，使用微小负压使得试剂可以充满反应单元，孵育反应20秒。增大负压，使得反应单元中的试剂完全排空。

h.利用注射泵往合成芯片表面输送清洗液，利用负压，使得反应单元中的试剂完全排空，重复此清洗步骤三次。

i.利用注射泵往合成芯片表面输送碘液氧化剂，使用微小负压使得试剂可以充满反应单元，孵育反应20秒。增大负压，使得反应单元中的试剂完全排空。

j.利用注射泵往合成芯片表面输送清洗液，利用负压，使得反应单元中的试剂完全排空，重复此清洗步骤三次。

k.上述c-j为一个合成循环，根据合成序列重复进行c-j的循环完成序列的合成，每轮循环中加入的核苷酸试剂分别为C、T、T、G、C、G、T、C、A、T、T、C、C、T。

l.合成完毕后，取出合成芯片，置于气相氨解仪中裂解2小时，将寡核苷酸从合成载体上剪切下来。加少量水溶解，获得寡核苷酸溶液。

本实施例得到的最终产物，经质谱鉴定产物分子量为4796，与目标序列分子量相同。

实施例6高通量寡核苷酸合成

本实施例进一步验证本发明所设计的成寡核苷酸合成芯片进行高通量寡核苷酸合成时的效果，合成策略同实施例5，为亚磷酰胺合成法。为衡量高通量合成的实际效果，本实施例在一次合成中测试并鉴定了不同长度的寡核苷酸的合成效果，考虑到脱保护试剂中三氯乙酸对寡核苷酸有脱嘌呤效应，本实施例中脱保护试剂也通过喷墨打印头对所需要的合成单元进行加样，减少了合成序列较短的合成单元与三氯乙酸的不必要接触。

为便于产物验证，本实施例选取了三个长度不同的寡核苷酸序列，序列分别为：

由于高通量合成得到的产物组成非常复杂，虽然使用高通量测序可以获得各个目标序列在终产物中是否存在，但难以获得最直接的质量评估数据，本实施例采用更直接的方法来获得原始的质量数据。为本实施例制作的成寡核苷酸合成芯片包含多组微漏斗结构102，可以为上述三个序列各指定一组微漏斗结构102做为其合成单元，从而便于将对应组的微漏斗结构102从成寡核苷酸合成芯片上切割下来做质量评估。显而易见，实际合成时可以将每组微漏斗结构102中的每一个微漏斗结构103做为一个单独的合成单元。同时，将微漏斗结构102进行分组除便于切割做质量评估外，也便于进行定制的中小通量的寡核苷酸合成。

主要的操作步骤如下：

a.将装配了合成载体的合成反应微芯片置于自行研发的自动化合成装置的芯片承载台上，承载台的上方设置有喷墨打印头，承载台上放置芯片的位置之下有空腔，可以产生负压，用以排空反应试剂。承载台位于一个可严格密闭的环境中，便于控制合成反应所需的无水无氧环境。

b.往密闭环境中充入高纯氩气20分钟，利用高精度氧传感器和湿度传感器监测密闭环境的氧和水蒸汽含量，用气压传感器监测密闭环境的气压，直至体系稳定。

c.利用喷墨打印头往合成芯片表面各个反应单元分别输送脱保护试剂，孵育反应40秒。利用负压，使得反应单元中的试剂完全排空。

d.利用注射泵往合成芯片表面输送清洗液，利用负压，使得反应单元中的试剂完全排空，重复此清洗步骤三次。

e.利用喷墨打印头往合成芯片表面各个反应单元分别输送所需的核苷酸试剂，然后接着利用喷墨打印头往合成芯片表面各个反应单元分别输送活化试剂，孵育反应30秒。利用负压，使得反应单元中的试剂完全排空。

f.利用注射泵往合成芯片表面输送清洗试剂，利用负压，使得反应单元中的试剂完全排空，重复此清洗步骤三次。

g.利用注射泵往合成芯片表面输送体积比1:1的CapA试剂和CapB试剂，使用微小负压使得试剂可以充满反应单元，孵育反应20秒。增大负压，使得反应单元中的试剂完全排空。

h.利用注射泵往合成芯片表面输送清洗液，利用负压，使得反应单元中的试剂完全排空，重复此清洗步骤三次。

i.利用注射泵往合成芯片表面输送碘液氧化剂，使用微小负压使得试剂可以充满反应单元，孵育反应20秒。增大负压，使得反应单元中的试剂完全排空。

j.利用注射泵往合成芯片表面输送清洗液，利用负压，使得反应单元中的试剂完全排空，重复此清洗步骤三次。

k.上述c-j为一个合成循环，根据合成序列重复进行c-j的循环进行序列的合成。如果反应单元上所需合成的序列已经合成完毕，则不再往对应的合成单元输送核苷酸试剂、活化试剂和脱保护试剂。根据软件设定的参数，如果合成单元所对应序列选择了带末端DMT保护，则在连接最后一个核苷酸的循环之后，还要继续加入一次脱保护试剂。重复合成循环，直至序列最长的合成单元完成合成。

l.合成完毕后，取出合成芯片，置于气相氨解仪中裂解2小时，将寡核苷酸从合成载体上剪切下来。在显微镜辅助下，找到待验证的合成序列所在的区域，分别进行切割，并加少量水溶解，获得三份寡核苷酸溶液。

本实施例得到的最终产物经质谱鉴定，产物分子量为4885、17329、40040，分别与目标序列分子量相同。

本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所提出的反应器结构进行等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种寡核苷酸合成芯片系统，所述寡核苷酸合成芯片系统包括寡核苷酸合成芯片和合成载体粒径筛选芯片，所述寡核苷酸合成芯片包括微漏斗结构，所述微漏斗结构两端开口，上端开口位于所述寡核苷酸合成芯片的上表面，下端开口位于所述寡核苷酸合成芯片的下表面，上端开口的口径大于下端开口的口径，多个矩形排布的微漏斗结构形成一组，把每组微漏斗结构为一个重复单元，多个重复单元按照矩形排布形成二维阵列；所述合成载体粒径筛选芯片包括筛孔，筛孔的上表面开口孔径小于所述寡核苷酸合成芯片的上端开口孔径，筛孔的下表面开口孔径明显大于所述寡核苷酸合成芯片的下端开口孔径，所述筛孔的下表面开口孔径略小于筛孔的上表面开口孔径，多个筛孔矩形排布在所述合成载体粒径筛选芯片上，所述筛孔的上表面位于所述合成载体粒径筛选芯片的上表面，所述筛孔的下表面位于所述合成载体粒径筛选芯片的下表面。

2.权利要求1所述的寡核苷酸合成芯片系统，所述寡核苷酸合成芯片的基础材质为硅材质。

3.权利要求2所述的寡核苷酸合成芯片系统，先采用干法刻蚀处理硅片的上表面，获得微漏斗结构孔径较大的上端开口，然后使用干法刻蚀硅片的下表面，获得孔径较小的下端开口，所述下表面开口的中心点与所述上表面开口的中心点重合，并且贯通得到漏斗状的微结构。

4.权利要求1所述的寡核苷酸合成芯片系统，所述寡核苷酸合成芯片的漏斗状结构，其上端开口的形状为圆柱形，直径为150-200微米，深度为150-200微米，其下端开口的形状为圆柱形，直径为10-40微米，深度为150-400微米，上端开口与下端开口的中心点同轴并且贯通，所述寡核苷酸合成芯片的厚度即为300-600微米。

5.权利要求1所述的寡核苷酸合成芯片系统，若干个所述寡核苷酸合成芯片的漏斗状结构按照矩形排列成为一组，每组中漏斗状结构为5-15行和5-15列，每个漏斗状结构的间距相等，为250-500微米，把每组微漏斗结构划分为一个重复单元，若干个重复单元又按照矩形排布，每组之间的间距相等，为2-8毫米。

6.权利要求1所述的寡核苷酸合成芯片系统，所述的合成载体粒径筛选芯片为硅材质，运用两次干法刻蚀的方式获得筛孔结构，其上端开口的形状为圆柱形，直径为130-180微米，深度为150-200微米；其下端开口的形状为圆柱形，直径为120-160微米，深度为150-400微米，上端开口与下端开口的中心点同轴并且贯通，所述合成载体粒径筛选芯片的厚度为400-600微米。

7.权利要求1或6所述的寡核苷酸合成芯片系统，所述合成载体粒径筛选芯片下端开口的直径需要控制在上端开口直径的80%-95%，合成载体粒径筛选芯片上端开口的直径需要控制在合成芯片漏斗状结构上端开口直径的80%-90%之间，以确保合成载体粒径分布在一个较小的区间内，控制DNA合成产量的均一性。

8.利用权利要求1、6或7所述的寡核苷酸合成芯片系统进行寡核苷酸合成的方法，所述方法包括：

先把干燥的固态载体平铺在合成载体粒径筛选芯片的上表面，用刮板轻轻刮过合成载体粒径筛选芯片的上表面，符合粒径要求的DNA合成载体将被截留在合成载体粒径筛选芯片中，粒径太小的DNA合成载体会从合成载体粒径筛选芯片中流出，而粒径太大的DNA合成载体则无法进入合成载体粒径筛选芯片；

倒扣合成载体粒径筛选芯片将符合粒径要求的DNA合成载体取出，然后用同样的步骤将DNA合成载体装载入寡核苷酸合成芯片，

DNA的合成载体及反应试剂经所述寡核苷酸合成芯片的漏斗状结构的上端装载，DNA的合成载体的粒径大于下端开口，被截留在漏斗状结构中，反应试剂则在结构上表面施加正压或者在下表面施加负压，实现连续流动反应并排出废液，实现高效地DNA合成。

9.权利要求8的方法，所述的DNA的合成载体采用商用或自制的DNA固相合成载体。

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