JP2017521091A - 診断試験用の胎児有核赤血球(nrbc)の調製 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年5月15日出願の米国仮特許出願第61/993659号明細書の優先権の利益を主張し、この出願の内容は、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。
胎児に起こり得る染色体異常および遺伝的異常を検出する出生前診断の実践により、両親および保育者は、素因のモニタリングおよび疾患または症状の早期の処置を開始することが可能となる。出生前診断の実践は、胎児の起こり得る染色体異常および遺伝的異常を検出するように確立されているので、両親および保護者による、情報に基づいた決定が可能となる。生命に係わる種々の染色体異常(異数性21、18、13、X、Y)のうち、第21染色体の全てまたは一部の余分なコピーの存在によって引き起こされるダウン症候群は、精神遅滞の最も一般的な遺伝的原因であり、女性が出生前診断を求める主たる理由となっている(Pierce B. Genetics: A conceptual approach (W.H. Freeman and company, 2008), 3d edition; Driscoll and Gross, 2009, N Engl J Med. 360:2556-62)。報告によると、細胞遺伝学的障害は、生存出生の約1%、35歳を超える女性の妊娠では2%、そして第1三半期の自然流産ではおおよそ50%で生じる(Thompson and Thompson Genetics in Medicine, sixth edition, chapter 9)。報告によると、100万人の生存出生集団中の単一遺伝子欠損の発生率は、約0.36%である(Thompson and Thompson Genetics in Medicine, sixth edition, chapter 9)。
本開示は、胎児有核赤血球(fNRBC)がかなり少数派である混合細胞集団からのfNRBCの濃縮および単離を可能にする単離技術の開発に基づく。したがって、本開示は、fNRBCが高度に濃縮された細胞調製物、およびそのような濃縮細胞集団を生成する方法を提供する。
5.1.定義
抗体とは、免疫グロブリン分子であって、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置決めされる少なくとも1つの抗原認識部位によって、標的、例えば炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドその他に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書中で用いられる用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その任意の抗原結合断片(すなわち、「抗原結合部分」)、またはその単一鎖、抗体を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のあらゆる改変された構成をも包含し、例えば、限定されないが、単鎖(scFv)およびドメイン抗体(例えば、ヒト、ラクダ科動物、またはサメのドメイン抗体)、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、vNARおよびビスscFvが挙げられる(例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotech 23:1126-1136参照)。抗体は、任意のクラス、例えばIgG、IgA、またはIgM(またはそのサブクラス)の抗体が挙げられ、抗体は、任意の特定のクラスである必要もない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは様々なクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのいくつかはさらに、例えば、IgG1、lgG2、lgG3、lgG4、IgA1、およびlgA2といったサブクラス(アイソタイプ)に分割され得る。「抗体」はまた、ソーティングおよび検出を容易にするように修飾された前述の各抗体/免疫グロブリンタイプのいずれをも包含し、例えば5.3.5.節に記載されている。
fNRBCの濃縮を向上させるために、以下に記載される、ポジティブ選択ステップ、および場合による選択ステップに先立つ前濃縮ステップが実行されてもよい。例示的な前濃縮プロセスが、以下に記載される。
本開示の方法は、fNRBCの濃縮および/または単離のための1つまたは複数のポジティブ選択プロセスを伴い、典型的には、fNRBCに結合する抗体を用いる、少なくとも1つのポジティブ免疫選択ステップを伴う。ポジティブ免疫選択は、生物学的サンプルから、fNRBC以外の1つまたは複数の細胞型、例えば母体リンパ球を枯渇させるためにネガティブ選択(例えばネガティブ免疫選択)と一緒に用いられてよい。
本開示のポジティブ選択試薬は、生物学的サンプル中のfNRBCを、当該サンプル中の他の少なくとも1つの細胞型から区別するのに用いられ得るあらゆる試薬であってよい。
fNRBC用のポジティブ選択マーカーとして、グリコホリンA(CD235aとしても知られている)、「i」抗原、CD36、CD71、および核マーカーが挙げられる。下流の分析が細胞固定を容認する場合(例えばFISH)、胎児ヘモグロビンがポジティブ選択マーカーであってよい。
典型的に、本開示のネガティブ選択法は、fNRBCを認識しない1つまたは複数の試薬を利用する。ある態様において、試薬は、ネガティブ免疫選択抗体である。
ネガティブ選択試薬は、生物学的サンプル中のfNRBC以外の細胞をfNRBCから分離するのに用いられ得るあらゆる試薬であってよい。
好都合にも、本開示のポジティブ選択プロセスおよびネガティブ選択プロセスに用いられる抗体および核染色剤は、他の細胞型からのfNRBCの選択および分離を可能にするように修飾されてよい。修飾された抗体は、ソーティングおよび検出を可能にするあらゆる分子または物質、例えば、磁気ビーズまたは蛍光色素を備えてよい。特定の実施形態において、抗体は、比色分子、蛍光部分、化学発光部分、抗原、酵素、検出可能なビーズ(磁気ビーズまたは高電子密度(例えば金)ビーズ等)、または別の分子に結合する分子(例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン)に結合する。
免疫選択ステップは、例えば抗体がコーティングされた磁気ビーズを用いる、磁気分離、またはフローサイトメトリーを利用してよい。フローサイトメトリー技術は、例えば蛍光活性化細胞ソーターの使用を介して、正確な分離を実現することができ、これは、精巧さ、例えば多色チャンネル、低角度オブチューズ光散乱検出チャネル、インピーダンスチャンネルその他の程度を変えることができるものである。
ポジティブ選択(そして、場合によってはネガティブ選択)の後、fNRBCが、固体表面(例えば、ポジティブ免疫選択抗体結合細胞を捕捉するために4B9または二次抗体等のポジティブ免疫選択抗体を有する)上での捕捉、または物理的技術、例えば顕微操作によって単離され得る。
本開示はさらに、本明細書中に記載される方法によって調製される、または得ることができるfNRBCの調製物を提供する。例示的な調製物として、fNRBCを含む細胞の集団が挙げられる。
例えば、ショートタンデムリピート(STR)分析、制限酵素断片長多型(RFLP)分析、または単一ヌクレオチド多型(SNP)分析を用いて遺伝的プロファイルを得ることを含む遺伝的フィンガープリント法が、本明細書中に記載される方法によって単離されるfNRBCを胎児細胞と確認するために用いられ得る。単離細胞から得たプロファイルを、母親細胞、および場合により父親細胞から得たプロファイルと比較することによって、単離細胞が胎児細胞であることが確認され得る。遺伝的プロファイルを得る適切なキットが市販されている。例えば、fNRBCが何であるかを確認するために用いられ得るPromegaのPowerPlex(登録商標)Fusion STRキットおよびAffymetrixのGenome−Wide Human SNP Array 6.0がそれぞれ、STRプロファイルおよびSNPプロファイルを得るのに用いられてよい。一部の実施形態において、全ゲノム増幅(WGA)が、分析に利用可能な遺伝物質の量を増大させるのに用いられる。
調製物は、例えば多胎妊娠または胎児異常の存在を判定する、胎児診断試験に用いられてよい。試験され得る異常の例として、トリソミー13、トリソミー18、トリソミー21、ダウン症候群、圧迫性麻痺の傾向がある神経障害、神経線維腫症、アラジール症候群、軟骨形成不全、ハンチントン舞踏病、アルファ−マンノース症、ベータ−マンノース症、異染性ロイコジストロフィー、フォンレックリングハウゼン病、結節性硬化症、筋強直性ジストロフィー、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ−サックス病、ベータ−サラセミア、ムコ多糖症、フェニルケトン尿症、シトルリン尿症、ガラクトース血症、ガラクトキナーゼおよびガラクトース4−エピメラーゼ欠乏症、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠乏症、メチルマロン酸尿症、プロピオン酸血症、ファーバー病、フコシドーシス、ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、I細胞病、ムコリピドーシスIII、ニーマン−ピック病、シアリドーシス、ウォールマン病、ツェルヴェーガー症候群、シスチン症、第X因子欠乏症、毛細血管拡張性運動失調、ブルーム症候群、ローベルト症候群、色素性乾皮症、脆弱(X)症候群、性染色体異数性、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、XXX症候群、ステロイドスルファターゼ欠乏症、線形の皮膚欠損を伴う小眼球症、ペリツェーウス−メルツパッヒャー病、Y染色体上の精巣決定因子、オルニチンカルバモイル転移酵素欠乏症、ブドウ糖6−リン酸脱水素酵素欠乏症、レッシュ−ナイハン症候群、アンダーソン−ファブリ疾患、血友病A、血友病B、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、dup(17)(p11.2p11.2)症候群、16p11.2欠失、16p11.2重複、ミトコンドリア欠損、dup(22)(q11.2q11.2)症候群、ネコ眼症候群、ネコ鳴き症候群、ウォルフ−ヒルシュホーン症候群、ウィリアムス−ボイレン症候群、シャルコー−マリー−ツース病、染色体再配列、染色体欠失、スミス−マゲニス症候群、口蓋心臓顔貌症候群、ディジョージ症候群、1p36欠失、プラーダー−ヴィリ症候群、無精子症(因子a)、無精子症(因子b)、無精子症(因子c)、脊椎披裂、無脳症、神経管欠損、小頭症、水頭症、腎欠損、カルマン症候群、副腎発育不全、アンゲルマン症候群、嚢胞腎、嚢胞性ヒグローマ、胎児水症、臍ヘルニアおよび胃壁裂、横隔膜ヘルニア、十二指腸閉鎖症、骨格形成異常、口唇裂、口蓋裂、アルギニノコハク酸尿、クラッベ病、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、3−メチルクロトニル補酵素Aカルボキシラーゼ欠乏症、糖原病、副腎過形成、低フォスファターゼ症、胎盤ステロイドスルファターゼ欠乏症、重症合併型免疫不全症候群、T細胞免疫不全、エーラース−ダンロー症候群、骨形成不全症、成人多嚢胞性腎疾患、ファンコーニ貧血、表皮水泡症症候群、発汗減少症性外胚葉性形成異常、先天性ネフローゼ(フィンランド型)、ならびに多発性内分泌腫瘍が挙げられる。
本開示はさらに、本開示のポジティブ免疫選択法に有用な1つまたは複数の抗体であって、先の5.3.2節に記載されるような抗体を含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは抗体4B9を含む。抗体は、検出可能な部分、例えば、ビオチンまたは蛍光部分に付着し得る。抗体がビオチン化されるならば、キットはアビジンコンジュゲートされた検出試薬(すなわち、抗体)を含んでいてもよい。
図1および図2は、fNRBCの濃縮および/または単離のための一部の例示的なワークフローを示す。本開示の方法は、図1もしくは図2に表される完全な一ワークフロー、またはfNRBCを濃縮または単離するのに適したワークフローからのステップの組合せを伴ってもよい。
7.1節の密度分離プロトコル、7.2節のネガティブ選択プロトコル、および/または7.3節のポジティブ選択プロトコルの種々の組合せが、fNRBCおよび母親細胞、例えば母体血液を含むサンプルからNRBCを濃縮するのに用いられる。例えば、以下のプロトコルの組合せが、本開示の範囲内である。濃縮の後、濃縮されたNRBCは、更なる分析のために、例えば7.4節に記載される蛍光染色にかけられてよい。分析の前に、NRBCはさらに、FACSによって、例えば図1および図2に示されるワークフローを利用することによって、濃縮されてよい。
7.1.1.密度分離プロトコル#1
以下の例示的な密度分離プロトコル#1は、本開示の方法に用いるのに適している:
1.ある量の密度分離媒体を、多孔質バリアが管内に配置された遠心管、例えばLeucosep(登録商標)管に加える。多孔質バリアの下方において管を媒体で満たすために、管を、例えば230×gにて1分間、遠心分離する。管に加える媒体の量は、遠心分離後の多孔質バリアの下方における管の部分を満たすのに十分な量であるべきである。遠心分離後、もし残っていれば、多孔質バリアよりも上方にある媒体は全て捨てる。多孔質バリアの無い遠心管が、本開示の方法において密度分離に用いられてもよいが、多孔質バリアを有する遠心管を用いれば、サンプルが媒体と混合するのが妨げられ、不連続勾配が維持され、かつ分離が向上する。
2.ある量の血液を遠心管に加える。血液を処理して、例えば血液を、2mM EDTAを含有するリン酸緩衝生理食塩水、pH 7.2等のバッファで希釈して、分離の向上を補助してよい。ゆえに、遠心管に加える血液を処理してよく、例えばバッファで希釈する。
3.管を遠心分離して、例えば管を1000×gにて20分間遠心分離することによって、多孔質バリアの上方に、プラズマ層および濃縮された細胞画分を形成させる。
4.多孔質バリアの上方にある全て(血漿、PBMCその他)を第2の遠心管に移す。
5.洗浄バッファ、例えば、PBS+2mM EDTA、pH 7.2を第2の遠心管に加えて混合する。その後、第2の遠心管を、例えば450×gにて10分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
6.ペレットを乱すことなく、上澄みを完全に吸引除去する。
7.ペレットを洗浄バッファで再懸濁させる。
8.再懸濁したペレットを遠心分離して細胞を再びペレット化させる。
9.ペレットを乱すことなく、上澄みを完全に吸引除去する。
ステップ2の後にリンスステップ2.1を加えることによって改変された密度分離プロトコル#1が、密度分離プロトコル#2である:
2.1 ステップ2において遠心管に加えられた血液を含有したコンテナに洗浄バッファを加えてから、洗浄バッファを遠心管に加える。
ステップ4を以下のステップ4と入れ替えることによって改変された密度分離プロトコル#2が、密度分離プロトコル#3である:
4.血漿層を遠心管から取り除いて、捨てる。多孔質バリアの上方に残留する液体を第2の遠心管に移す。
本開示の一部の実施形態において、fNRBCおよび母親細胞を含むサンプルが、母親細胞のサンプルを枯渇させるネガティブ選択にかけられる。一部の実施形態において、ネガティブ選択は、抗CD45抗体に結合したマイクロビーズによる磁気活性化細胞ソーティング(MACS)を利用する。
以下の例示的なネガティブ選択プロトコル#1が、本開示の方法に用いるのに適している:
1.密度分離プロトコル#1〜#3のいずれか1つに由来する最終ペレットを、MACSランニングバッファ、例えばautoMACS(登録商標)Running Buffer(Miltenyi Biotec)で再懸濁させる。
2.サンプルを、例えば450×gにて10分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
3.上澄みを完全に吸引除去する。
4.細胞ペレットをMACSランニングバッファ中に再懸濁させる。
5.CD45マイクロビーズ(すなわち、抗CD45抗体に付着したマイクロビーズ)をサンプルに加え、混合してインキュベートすることでCD45マイクロビーズを母親細胞に結合させる。
6.MACSランニングバッファをサンプルに加えて混合する。その後、サンプルを、例えば450×gにて10分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。上澄みを完全に吸引除去する。
7.ペレットをMACSランニングバッファ中に再懸濁させる。
8.MACSカラムをメーカーの説明書に従って用いて、細胞を磁気的にソートして、CD45ネガティブ画分およびCD45ポジティブ細胞画分を得る。
本開示の一部の実施形態において、fNRBCおよび母親細胞を含むサンプルが、抗体4B9を用いたポジティブ選択にかけられる。
以下の例示的なポジティブ選択プロトコル#1が、本開示の方法に用いるのに適している:
1.ネガティブ選択プロトコル#1によって得られたfNRBCを含む懸濁液から始めるならば、懸濁液を、例えば450×gにて10分間、遠心分離して細胞をペレット化させて、上澄みを完全に吸引除去する。密度分離プロトコル#1〜#3のいずれかに由来する細胞ペレットから始めるならば、ステップ2から始める。
2.ペレットをMACSランニングバッファ中に再懸濁させる。
3.FcRブロッキング試薬、例えばFcR Blocking Reagent(Miltenyi Biotec)を加えて、よく混合する。FcRブロッキング試薬は、非特異的なFcレセプタ介在性の抗体結合を遮断する。
4.ビオチン化された4B9を加える;インキュベートすることで、ビオチン化された4B9をfNRBCに結合させる。
5.MACSランニングバッファをサンプルに加える;例えば300×gにて10分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
6.上澄みを完全に吸引除去する。
7.MACSランニングバッファをサンプルに加えて、サンプルを、例えば450×gにて10分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
8.上澄みを完全に吸引除去する。
9.ペレットをMACSランニングバッファ中に再懸濁させる。
10.FcRブロッキング試薬をサンプルに加えて、ステップ11における非特異的なFcレセプタ介在性の抗体結合を遮断する。
11.抗ビオチンマイクロビーズをサンプルに加える;インキュベートすることで、マイクロビーズは、ビオチン化された4B9に結合することができる。
12.MACSランニングバッファをサンプルに加えて、混合する。その後、サンプルを、例えば450×gにて10分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。上澄みを完全に吸引除去する。
13.MACSランニングバッファをサンプルに加える。
14.MACSカラムをメーカーの説明書に従って用いて、細胞を磁気的にソートして、4B9ポジティブ画分および4B9ネガティブ画分を得る。
ビオチン化4B9を、非コンジュゲート型4B9と入れ替え、かつ抗ビオチンマイクロビーズを抗IgMマイクロビーズと入れ替えることによって改変されたポジティブ選択プロトコル#1が、ポジティブ選択プロトコル#2である。
非コンジュゲート型4B9(IgMモノクローナル抗体)とインキュベートし、洗浄して非結合型4B9抗体を取り除き、4B9でコーティングされた細胞をヤギ抗マウスIgMマイクロビーズと結合させてから洗浄し、結果として生じた細胞を再懸濁させて遠心分離することによって、4B9+細胞が選択される。遠心分離の後、上澄みを破棄して、ペレットをPBS等のバッファ中に再懸濁させる。
本開示の一部の実施形態において、本開示に従って調製されたfNRBCを含むサンプルが蛍光染色されて、例えばFACSによる、視覚化、ソーティング、および/または単離されたfNRBCの選出が可能となる。
以下の例示的な染色プロトコル#1が、fNRBCを含むサンプルを蛍光染色するのに用いられ得る:
1.先の組合せ#1〜#18のいずれか1つに従って調製された4B9ポジティブ画分を、例えば400×gにて10分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
2.上澄みを吸引除去する。
3.蛍光マスター混合物をサンプルに加えてインキュベートする。マスター混合物は、先に記載されるプロトコルのいずれかに従って濃縮されたfNRBCを検出するのに適した標識マーカー、例えばストレプトアビジンAlexa 488および/またはヤギ抗マウスIgM Alexa 488、ならびに核マーカー、例えばHoechstを含有する。
4.バッファ、例えば0.5%BSAを含有する1×PBSをサンプルに加えて、細胞を洗浄する。
5.サンプルを、例えば400×gにて10分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
6.上澄みを吸引除去する。
7.ペレットを適切なバッファ、例えば1×PBS中に再懸濁させる。
以下の例示的な染色プロトコル#2もまた、fNRBCを含むサンプルを蛍光染色するのに用いられ得る:
1.先の組合せ#1〜#18のいずれか1つに従って調製された4B9ポジティブ画分を、例えば400×gにて10分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
2.ペレットをバッファ、例えば1×PBS中に再懸濁させる。
3.FcRブロッキング試薬を加えて、ステップ4における非特異的なFcレセプタ介在性の抗体結合を遮断する。
4.非コンジュゲート型4B9をサンプルに加える;サンプルをインキュベートすることで、4B9はfNRBCに結合することができる。
5.蛍光マスター混合物をサンプルに加えてインキュベートする。マスター混合物は、fNRBCを検出するのに適した標識マーカー、例えばCD235a−PEおよび/またはヤギ抗マウスIgM Alexa 488、ならびに核マーカー、例えばDCルビーを含有する。
6.バッファ、例えば1×PBSをサンプルに加えて、細胞を洗浄する。
7.サンプルを、例えば300×gにて5分間、遠心分離して、細胞をペレット化させる。
8.上澄みを吸引除去する。
9.ペレットを適切なバッファ、例えば1×PBS中に再懸濁させる。
fNRBCを含有する元の生物学的サンプル、または先に記載される方法ステップのいずれかによってfNRBCが濃縮されたサンプルは、fNRBCを濃縮または単離するための更なる処理にかけられてよい。
細胞の単離のために、市販のマイクロマニピュレータが、逆位相コントラスト顕微鏡に取り付けられる。顕微鏡は、種々の対物レンズ、蛍光フィルター、カメラ、モニタ、およびジョイスティックで操作されるマイクロマニピュレータプラットホームが装備される。顕微操作は、3本の直線軸(X、YおよびZ方向)で構成される。
8.密度分離+MACSによって母体血液から単離したfNRBCのFISH分析
男性胎児を妊娠した5から16週目の40人の女性から得た母体末梢血サンプルを、密度分離プロトコル#3およびポジティブ選択プロトコル#2に従って処理して、fNRBCを含有する磁気細胞分離「スープ」(MCSS)を得た。細胞をスライドに固定して、FISHを用いて分析し、X染色体およびY染色体を同定した。
9.胎児肝臓中のfNRBCの特徴付け
フレッシュな、または凍結した単核胎児肝細胞を、妊娠期間の範囲が様々なドナーから得、液体窒素中に保存した。細胞は、対応する分析証明書のある承認IRBドナープログラム下で、外部ソースにより処理された。
10.密度分離+MACS+FACSによって混合細胞集団から単離した胎児肝臓fNRBCのSTR分析
本実施例は、スパイク実験を介して、本開示の方法がfNRBCの濃縮を可能にすることを実証する。
女性の4000個の胎児肝細胞を、密度勾配遠心分離を介した単核細胞単離の前に、無関係な男性対象由来の正常な男性血液25mL中に加えた。
23個のSTR遺伝子座および性特異的アメロゲニン多型遺伝子座の蛍光検出用のPowerPlex(登録商標)Fusion(Promega,WI)5色キットを用いて、4B9+画分のSTR(ショートタンデムリピート)分析を実行した。
11.種々のプロトコルによって母体血液から単離したfNRBCのSTR分析
11.1.密度分離+MACSによって母体血液から単離したfNRBCのSTR分析
男性胎児または女性胎児のいずれかを妊娠した4から14週目の40人の女性から得た母体末梢血サンプルを、密度分離プロトコル#1、ネガティブ選択プロトコル#1、およびポジティブ選択プロトコル#1に従って処理して、各サンプルについてMCSSをもたらした。サンプルを、染色プロトコル#1に従って染色した。その後、4B9タグ付き細胞は、各MCSSから選出してプールし、23個のSTR遺伝子座および性特異的アメロゲニン多型遺伝子座の蛍光検出用のPowerPlex(登録商標)Fusion(Promega,WI)STRキットを用いて分析し、胎児性であることを確かめた。胎児の対立遺伝子を、サンプルの100%で同定した。
11.2.1.密度分離プロトコル#2、ポジティブ選択プロトコル#2、およびFACSによって単離したfNRBC
STR分析を、密度分離プロトコル#2、ポジティブ選択プロトコル#2、およびFACSによって、ネガティブ選択なしで処理した、妊娠女性由来の母体血液サンプルに実行した。図19〜図22は、妊娠期間が9週目の、男性胎児を妊娠した女性から得た母体末梢血から処理したサンプルのSTR分析を示す。細胞を、ヤギ抗マウスIgM、CD235a、およびDC−Rubyによるポジティブ選択後に蛍光染色し、FACSでソートし、手動で選出し、STR分析用に一緒にプールした。合計8個の細胞を選出した。図19〜図22の全部にわたって、3つのプロファイルが示される:母体ゲノムDNA、単離4B9ポジティブ画分、および父系ゲノムDNA。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成した円は、母親プロファイルと父親プロファイル間で共有される単離4B9ポジティブ画分において見出された対立遺伝子を示す。均一長の短いダッシュによって形成した円は、単離4B9ポジティブ画分において見出された、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を示す。
STR分析を、密度分離プロトコル#3、ポジティブ選択プロトコル#2、およびFACSによって、ネガティブ選択なしで処理した、妊娠女性由来の母体血液サンプルに実行した。図23〜図26は、妊娠期間が12週目の、男性胎児を妊娠した女性から得た母体末梢血から処理したサンプルのSTR分析を示す。細胞を、ヤギ抗マウスIgM、CD235a、およびDC−Rubyによるポジティブ選択後に蛍光染色し、FACSでソートし、STR分析用の0.2ml PCRチューブ中に直接ソートした。合計35事象をソートした。チューブA〜Cは10事象を含有し、チューブDは5事象を含有した。図23〜図26の全部にわたって、4つのプロファイルが示される:母系ゲノムDNA、4B9ポジティブ画分から単離した2つの別々の反応物(それぞれチューブCおよびD)、および父系ゲノムDNA。ダッシュおよびドットを交互に並べることによって形成した円は、母親プロファイルと父親プロファイル間で共有される単離4B9ポジティブ画分において見出された対立遺伝子を示す。均一長の短いダッシュによって形成した円は、単離4B9ポジティブ画分において見出された、父親プロファイルでしか見出されない対立遺伝子を示す。
12.単離したNRBCのフィンガープリンティング分析
母体末梢血の100サンプルを、密度選択プロトコル#3およびポジティブ選択プロトコル#2に従って処理して、MCSSをもたらした。MCSSの細胞を、染色プロトコル#2に従って染色した。その後、4B9タグ付き細胞を、FACSによって他の細胞および残渣から単離した。DC−Ruby、CD235a、および4B9のトリプルポジティブな細胞を、スライド上にソートした。単細胞を顕微操作によって選出し、形態および蛍光に基づいてグレード分けした。
本開示は、以下の具体的な実施形態によって例示される。
1.胎児有核赤血球(NRBC)を調製する方法であって、fNRBCを含む生物学的サンプルをポジティブ免疫選択にかけることを含み、前記ポジティブ免疫選択は、
(a)液体培地中で生物学的サンプルを第1の抗体と接触させるステップであって、第1の抗体は、生物学的サンプル中の他の細胞(例えば、1つまたは複数の他の細胞型)と比較して選択的にfNRBCに結合する、ステップと;
(b)前記第1の抗体に結合した細胞を選択するステップと
を含む、方法。
2.生物学的サンプルをネガティブ免疫選択にかけることをさらに含み、前記ネガティブ免疫選択は、
(a)液体培地中で生物学的サンプルを第2の抗体と接触させるステップであって、第2の抗体は、fNRBCと比較して選択的に生物学的サンプル中の他の細胞と結合する、ステップと;
(b)前記第2の抗体に結合しなかった細胞を選択するステップと
を含む、実施形態1の方法。
3.ポジティブ免疫選択は、ネガティブ免疫選択の前に実行される、実施形態2の方法。
4.ネガティブ免疫選択は、ポジティブ免疫選択の前に実行される、実施形態2の方法。
5.ポジティブ免疫選択およびネガティブ免疫選択は、同時に実行される、実施形態2の方法。
6.第1の抗体は、fNRBC有核前駆細胞の表面上に存在する抗原と結合するが、成体の赤血球上に存在するCD71または他の表面抗原と結合しない、実施形態1から5のいずれか1つの方法。
7.第1の抗体は4B9であるか、またはfNRBC有核前駆細胞の表面への結合に関して4B9と競合する抗体である、実施形態6の方法。
8.複数の第1の抗体が用いられる、実施形態1から7のいずれか1つの方法。
9.ポジティブ免疫選択は、オートメーション化された方法を用いて実行される、実施形態1から8のいずれか1つの方法。
10.オートメーション化された方法は、細胞ソーティング、限外濾過、またはマイクロ流体分離である、実施形態9の方法。
11.第2の抗体は:
(a)Tリンパ球細胞表面マーカー、場合によりCD3、CD4またはCD8;
(b)Bリンパ球細胞表面マーカー、場合によりCD19、CD20、またはCD32;
(c)panリンパ球マーカー、場合によりCD45;
(d)NK細胞表面マーカー、場合によりCD56;
(e)樹状細胞表面マーカー、場合によりCD11cまたはCD23;および
(f)マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、場合によりCD14またはCD33
から選択される細胞表面マーカーに対するものである、実施形態2から10のいずれか1つの方法。
12.複数の第2の抗体が用いられる、実施形態2から11のいずれか1つの方法。
13.複数の第2の抗体は、以下の細胞表面マーカーの少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、または5つに対する抗体を含む、実施形態12の方法:CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD45、CD56、CD11c、CD23、CD14、CD32、およびCD33。
14.ネガティブ免疫選択は、オートメーション化された方法を用いて実行される、実施形態2から13のいずれか1つの方法。
15.オートメーション化された方法は、細胞ソーティング、限外濾過、またはマイクロ流体分離である、実施形態11の方法。
16.密度分離法を用いてfNRBCを濃縮することをさらに含む、実施形態1から15のいずれか1つの方法。
17.密度分離法は、前記ポジティブ免疫選択の前に実行される、実施形態16の方法。
18.顕微操作によってfNRBCを単離することをさらに含む、実施形態1から17のいずれか1つの方法。
19.顕微操作は、ポジティブ免疫選択の後に実行される、実施形態18の方法。
20.生物学的流体は、血液、血漿、尿、または柔毛膜柔毛サンプリング(CVS)生検もしくは経皮的臍帯血サンプリング由来の細胞の懸濁液を含む、実施形態1から19のいずれか1つの方法。
21.生物学的サンプルは、母体血液を含む、実施形態20の方法。
22.母体血液は、妊娠約5週目から約38週目の妊娠中の対象から採取された母体血液サンプル由来である、実施形態21の方法。
23.実施形態1から22のいずれか1つの方法によって調製される、または得ることができるfNRBCの調製物。
24.fNRBCに診断アッセイを実行することをさらに含む、実施形態1から22のいずれか1つの方法。
25.fNRBCを診断する方法であって、実施形態23のfNRBCの調製物に診断アッセイを実行することを含む方法。
26.診断アッセイは、多胎妊娠の存在を判定するためのものである、実施形態24または25の方法。
27.診断アッセイは、胎児異常の存在を判定するためのものである、実施形態24または25の方法。
28.胎児異常は、トリソミー13、トリソミー18、トリソミー21、ダウン症候群、圧迫性麻痺の傾向がある神経障害、神経線維腫症、アラジール症候群、軟骨形成不全、ハンチントン舞踏病、アルファ−マンノース症、ベータ−マンノース症、異染性ロイコジストロフィー、フォンレックリングハウゼン病、結節性硬化症、筋強直性ジストロフィー、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ−サックス病、ベータ−サラセミア、ムコ多糖症、フェニルケトン尿症、シトルリン尿症、ガラクトース血症、ガラクトキナーゼおよびガラクトース4−エピメラーゼ欠乏症、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠乏症、メチルマロン酸尿症、プロピオン酸血症、ファーバー病、フコシドーシス、ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、I細胞病、ムコリピドーシスIII、ニーマン−ピック病、シアリドーシス、ウォールマン病、ツェルヴェーガー症候群、シスチン症、第X因子欠乏症、毛細血管拡張性運動失調、ブルーム症候群、ローベルト症候群、色素性乾皮症、脆弱(X)症候群、性染色体異数性、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、XXX症候群、ステロイドスルファターゼ欠乏症、線形の皮膚欠損を伴う小眼球症、ペリツェーウス−メルツパッヒャー病、Y染色体上の精巣決定因子、オルニチンカルバモイル転移酵素欠乏症、ブドウ糖6−リン酸脱水素酵素欠乏症、レッシュ−ナイハン症候群、アンダーソン−ファブリ疾患、血友病A、血友病B、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、dup(17)(p11.2p11.2)症候群、16p11.2欠失、16p11.2重複、ミトコンドリア欠損、dup(22)(q11.2q11.2)症候群、ネコ眼症候群、ネコ鳴き症候群、ウォルフ−ヒルシュホーン症候群、ウィリアムス−ボイレン症候群、シャルコー−マリー−ツース病、染色体再配列、染色体欠失、スミス−マゲニス症候群、口蓋心臓顔貌症候群、ディジョージ症候群、1p36欠失、プラーダー−ヴィリ症候群、無精子症(因子a)、無精子症(因子b)、無精子症(因子c)、脊椎披裂、無脳症、神経管欠損、小頭症、水頭症、腎欠損、カルマン症候群、副腎発育不全、アンゲルマン症候群、嚢胞腎、嚢胞性ヒグローマ、胎児水症、臍ヘルニアおよび胃壁裂、横隔膜ヘルニア、十二指腸閉鎖症、骨格形成異常、口唇裂、口蓋裂、アルギニノコハク酸尿、クラッベ病、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、3−メチルクロトニル補酵素Aカルボキシラーゼ欠乏症、糖原病、副腎過形成、低フォスファターゼ症、胎盤ステロイドスルファターゼ欠乏症、重症合併型免疫不全症候群、T細胞免疫不全、エーラース−ダンロー症候群、骨形成不全症、成人多嚢胞性腎疾患、ファンコーニ貧血、表皮水泡症症候群、発汗減少症性外胚葉性形成異常、先天性ネフローゼ(フィンランド型)、ならびに多発性内分泌腫瘍である、実施形態27の方法。
29.診断アッセイは核酸アッセイである、実施形態24から28のいずれか1つの方法。
30.核酸アッセイはDNAアッセイであり、場合により、DNAアッセイはマイクロアレイ上で実行される、実施形態29の方法。
31.核酸アッセイは、FISH、PCR、またはDNA配列決定アッセイである、実施形態29または30の方法。
32.核酸アッセイはRNAアッセイであり、場合により、RNAアッセイは、マイクロアレイ上で実行される、実施形態29の方法。
33.RNAアッセイは、RT−PCRアッセイまたはFISHアッセイである、実施形態32の方法。
34.診断試験を実行する前に、fNRBCを溶解させ、または透過性にさせることをさらに含む、実施形態29から33のいずれか1つの方法。
35.診断アッセイはタンパク質検出アッセイであり、場合により、タンパク質検出アッセイはマイクロアレイ上で実行される、実施形態24から28のいずれか1つの方法。
36.タンパク質は抗体を用いて検出される、実施形態35の方法。
37.診断アッセイは組織学的アッセイである、実施形態24から28のいずれか1つの方法。
38.診断試験用の胎児有核赤血球(NRBC)の調製方法であって、
(a)場合により、それぞれが胎児細胞表面を有する1個または複数個のfNRBC、およびそれぞれが母親細胞表面を有する複数の母親細胞を含む生物学的流体を提供するステップと;
(b)密度分離法によって複数の母親細胞の第1の部分から1個または複数個のfNRBCを濃縮することによって、1個または複数個のfNRBCおよび残存する第1の数の母親細胞を含む第1の懸濁液を生成するステップと;
(c)第1の懸濁液を、第1の分離可能な粒子に結合した第1の抗体とインキュベートするステップであって、第1の抗体は、母親細胞の母親細胞表面上に存在するが、fNRBCの胎児細胞表面上に存在しない第1の抗原と、第1の抗体が第1の抗原と結合する条件下で結合して、第1の粒子−細胞複合体を生成する、ステップ、ならびに第1の粒子−細胞複合体を第1の懸濁液から分離して取り除くことによって、1個または複数個のfNRBCおよび残存する第2の数の母親細胞を含む第2の懸濁液を生成するステップと;
(d)第2の抗体を第2の懸濁液に加えるステップであって、第2の抗体は、fNRBCの胎児細胞表面上に存在する第2の抗原と結合し、第2の抗原は、母親細胞表面上に存在しない、ステップ、第2の懸濁液を、第2の抗体が第2の抗原と結合する条件下でインキュベートして、第2の抗体−細胞複合体を生成するステップ、ならびに第2の懸濁液から第2の抗体−細胞複合体を分離することによって、診断試験用の1個または複数個のfNRBCを含む第3の懸濁液を生成するステップと
を含む調製方法。
39.第1の抗体は抗CD45抗体を含む、実施形態38に従う、fNRBCの調製方法。
40.第2の抗体は、fNRBC有核前駆細胞の細胞表面上に存在する表面抗原と結合するが、成体の赤血球上に存在するCD71または他の表面抗原と結合しない、実施形態38に従う、fNRBCの調製方法。
41.第2の抗体は4B9である、実施形態40に従う、fNRBCの調製方法。
42.fNRBCの細胞成分を染色することをさらに含む、実施形態38に従う、fNRBCの調製方法。
43.fNRBCの細胞成分は、直接的に、または間接的に染色される、実施形態42に従う、fNRBCの調製方法。
44.顕微操作によって1個または複数個のfNRBCを単離することをさらに含む、実施形態38に従う、fNRBCの調製方法。
45.オートメーション化された分離技術によってfNRBCを単離し、またはさらに濃縮することをさらに含む、実施形態38に従う、fNRBCの調製方法。
46.オートメーション化された分離は、細胞ソーティング、限外濾過、およびマイクロ流体分離技術からなる群から選択される方法によって実行される、実施形態45に従う、fNRBCの調製方法。
47.fNRBCは、1個または複数個の原始赤芽球を含む、実施形態38に従う、fNRBCの調製方法。
48.fNRBCは、1個または複数個の完全赤芽球を含む、実施形態38に従う、fNRBCの調製方法。
49.生物学的流体は、血液、血漿、尿、または柔毛膜柔毛サンプリング(CVS)生検もしくは経皮的臍帯血サンプリング由来の細胞の懸濁液を含む、実施形態38に従う、fNRBCの調製方法。
50.生物学的流体は母体血液を含む、実施形態44に従う、fNRBCの調製方法。
51.母体血液は、妊娠約5週目から約38週目の妊娠中の対象から採取された血液サンプル由来である、実施形態50に従う、fNRBCの調製方法。
52.第2の抗体は、検出可能な標識が標識されている、実施形態38に従う、fNRBCの調製方法。
53.検出可能な標識は、蛍光標識、酵素標識、放射性同位元素標識、または化学反応性の連結剤を含む、実施形態52に従う、fNRBCの調製方法。
54.濃縮したfNRBCを溶解させて、1つまたは複数の核酸を含む溶解fNRBCを生成することと、1つまたは複数の核酸配列を分析することと、それらによって胎児異常または対立遺伝子変異を示す核酸配列の有無を判定することとをさらに含む、実施形態40に従う、fNRBCの調製方法。
55.多胎妊娠の存在を判定することをさらに含む、実施形態40に従う、fNRBCの調製方法。
56.1つまたは複数の核酸配列の分析は、染色体異常を検出することを含む、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
57.胎児異常は単一遺伝子の異常を含む、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
58.胎児異常は単一ヌクレオチド多型(SNP)を含む、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
59.1つまたは複数の核酸配列の分析は、FISH、PCR、またはDNA配列決定法によって実行される、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
60.1つまたは複数の核酸配列の分析は、定量PCR、リアルタイムPCR、または逆転写酵素PCRによって実行される、実施形態59に従う、fNRBCの調製方法。
61.1つまたは複数の抽出された核酸の分析は、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)によって実行される、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
62.1つまたは複数の抽出された核酸の分析は、多重アニーリングおよびループ化による増幅サイクル(MALBAC)によって実行される、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
63.胎児異常は、トリソミー13、トリソミー18、トリソミー21、ダウン症候群、圧迫性麻痺の傾向がある神経障害、神経線維腫症、アラジール症候群、軟骨形成不全、ハンチントン舞踏病、アルファ−マンノース症、ベータ−マンノース症、異染性ロイコジストロフィー、フォンレックリングハウゼン病、結節性硬化症、筋強直性ジストロフィー、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ−サックス病、ベータ−サラセミア、ムコ多糖症、フェニルケトン尿症、シトルリン尿症、ガラクトース血症、ガラクトキナーゼおよびガラクトース4−エピメラーゼ欠乏症、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠乏症、メチルマロン酸尿症、プロピオン酸血症、ファーバー病、フコシドーシス、ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、I細胞病、ムコリピドーシスIII、ニーマン−ピック病、シアリドーシス、ウォールマン病、ツェルヴェーガー症候群、シスチン症、第X因子欠乏症、毛細血管拡張性運動失調、ブルーム症候群、ローベルト症候群、色素性乾皮症、脆弱(X)症候群、性染色体異数性、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、XXX症候群、ステロイドスルファターゼ欠乏症、線形の皮膚欠損を伴う小眼球症、ペリツェーウス−メルツパッヒャー病、Y染色体上の精巣決定因子、オルニチンカルバモイル転移酵素欠乏症、ブドウ糖6−リン酸脱水素酵素欠乏症、レッシュ−ナイハン症候群、アンダーソン−ファブリ疾患、血友病A、血友病B、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、dup(17)(p11.2p11.2)症候群、16p11.2欠失、16p11.2重複、ミトコンドリア欠損、dup(22)(q11.2q11.2)症候群、ネコ眼症候群、ネコ鳴き症候群、ウォルフ−ヒルシュホーン症候群、ウィリアムス−ボイレン症候群、シャルコー−マリー−ツース病、染色体再配列、染色体欠失、スミス−マゲニス症候群、口蓋心臓顔貌症候群、ディジョージ症候群、1p36欠失、プラーダー−ヴィリ症候群、無精子症(因子a)、無精子症(因子b)、無精子症(因子c)、脊椎披裂、無脳症、神経管欠損、小頭症、水頭症、腎欠損、カルマン症候群、副腎発育不全、アンゲルマン症候群、嚢胞腎、嚢胞性ヒグローマ、胎児水症、臍ヘルニアおよび胃壁裂、横隔膜ヘルニア、十二指腸閉鎖症、骨格形成異常、口唇裂、口蓋裂、アルギニノコハク酸尿、クラッベ病、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、3−メチルクロトニル補酵素Aカルボキシラーゼ欠乏症、糖原病、副腎過形成、低フォスファターゼ症、胎盤ステロイドスルファターゼ欠乏症、重症合併型免疫不全症候群、T細胞免疫不全、エーラース−ダンロー症候群、骨形成不全症、成人多嚢胞性腎疾患、ファンコーニ貧血、表皮水泡症症候群、発汗減少症性外胚葉性形成異常、先天性ネフローゼ(フィンランド型)、ならびに多発性内分泌腫瘍からなる群から選択される、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
64.単離したfNRBC中のタンパク質または代謝産物の有無を検出することをさらに含む、実施形態38に従う、fNRBCの調製方法。
65.単離したfNRBC中のタンパク質または代謝産物のレベルを検出することをさらに含む、実施形態38に従う、fNRBCの調製方法。
66.1つまたは複数の核酸の分析は、次世代シーケンシング技術またはウルトラディープシーケンシングを含む、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
67.1つまたは複数の核酸はDNAマイクロアレイで分析される、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
68.1つまたは複数の核酸は出生前染色体マイクロアレイで分析される、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
69.胎児異常は制限酵素断片長多型(RFLP)によって検出される、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
70.胎児異常は微小欠失または微小重複を含む、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
71.fNRBCは、正常なテロメア長範囲と比較して長さが増加または減少したテロメアを含む、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
72.1つまたは複数の核酸の分析は、fNRBCの核酸のストレッチを配列決定することを含む、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
73.fNRBCの核酸のストレッチは、次世代シーケンシング技術または大規模並列シーケンシングによって配列決定される、実施形態72に従う、fNRBCの調製方法。
74.胎児異常は発癌の素因である、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
75.癌は、乳癌、脳癌、肝癌、急性リンパ芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、腺癌、腺腫、副腎癌、基底細胞癌、骨癌、気管支癌、急性または慢性のリンパ球性腫瘍または顆粒球性腫瘍、急性脊髄性白血病、子宮頸部形成異常、慢性骨髄性白血病、結腸癌、類表皮癌、島細胞腫瘍、カポージ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋腫、悪性高カルシウム血症、悪性黒色腫、マルファン症候群の腫瘍、ユーイング肉腫、胆嚢癌、胆石腫瘍、巨細胞腫瘍、多形性膠芽腫、毛様細胞腫瘍、頭部癌、過形成、奇形腫、過形成性角膜神経腫瘍、上皮内癌、腸神経節細胞腫、髄様癌、転移性皮膚癌、肺癌、リンパ腫、悪性カルチノイド、粘膜神経腫、菌状息肉腫、脊髄異形成症候群、骨髄腫、頚部癌、神経芽細胞腫、骨原性肉種、骨肉腫、卵巣腫瘍、膵臓癌、神経組織癌、甲状腺癌、局所的な皮膚病変、副甲状腺癌、クロム親和性細胞腫、真性赤血球増加症、原発性脳腫瘍、前立腺癌、直腸癌、腎細胞腫瘍、網膜芽腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、皮膚癌、小細胞肺腫瘍、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、細網細胞肉腫、およびウィルム腫瘍からなる群から選択される、実施形態54に従う、fNRBCの調製方法。
76.胎児有核赤血球(NRBC)を単離する方法であって、
(a)場合により、それぞれ胎児細胞表面を有する1個または複数個のfNRBC、およびそれぞれ母親細胞表面を有する複数の母親細胞を含む生物学的流体を提供するステップと;
(b)密度分離法によって複数の母親細胞の第1の部分から1個または複数個のfNRBCを濃縮することによって、1個または複数個のfNRBCおよび残存する第1の数の母親細胞を含む第1の懸濁液を生成するステップと;
(c)第1の懸濁液を、第1の回収可能な粒子に結合した第1の抗体とインキュベートするステップであって、第1の抗体は、母親細胞の細胞表面上に存在するが、fNRBCの細胞表面上に存在しない第1の抗原と、第1の抗体が第1の抗原と結合する条件下で結合して、第1の粒子−細胞複合体を生成する、ステップ、ならびに第1の粒子−細胞複合体を第1の懸濁液から分離して取り除くことによって、1個または複数個のfNRBCおよび残存する第2の数の母親細胞を含む第2の懸濁液を生成するステップと;
(d)第2の回収可能な粒子に結合した第2の抗体を第2の懸濁液に加えるステップであって、第2の抗体は、fNRBCの細胞表面上に存在する第2の抗原と結合し、抗原は、母親細胞の細胞表面上に存在しない、ステップ、第2の懸濁液を、第2の抗体が第2の抗原と結合する条件下でインキュベートして、第2の粒子−細胞複合体を生成するステップ、第2の懸濁液から第2の粒子−細胞複合体を分離するステップ、ならびに第2の粒子−細胞複合体から細胞を放出させて再懸濁させることによって、1個または複数個のfNRBCを生成するステップと;
(e)物理的技術によってfNRBCの1個または複数個を単離するステップと
を含む方法。
77.第2の抗体は、fNRBC有核前駆細胞の細胞表面上に存在する表面抗原と結合するが、成体の赤血球上に存在するCD71または他の表面抗原と結合しない、実施形態76に従う、胎児有核赤血球(NRBC)を単離する方法。
78.第2の抗体は4B9である、実施形態76に従う、胎児有核赤血球(NRBC)を単離する方法。
79.第1の抗体は抗CD45抗体を含む、実施形態76に従う、胎児有核赤血球(NRBC)を単離する方法。
80.fNRBCの細胞成分を染色することをさらに含む、実施形態76に従う、胎児有核赤血球(NRBC)を単離する方法。
81.物理的技術は顕微操作である、実施形態76に従う、胎児有核赤血球(NRBC)を単離する方法。
82.胎児異常を検出する方法であって、
(a)場合により、それぞれが胎児細胞表面を有する1個または複数のfNRBC、およびそれぞれが母親細胞表面を有する複数の母親細胞を含む生物学的流体を提供するステップと;
(b)密度分離法によって複数の母親細胞の第1の部分から1個または複数のfNRBCを濃縮することによって、1個または複数のfNRBCおよび残存する第1の数の母親細胞を含む第1の懸濁液を生成するステップと;
(c)第1の懸濁液を、第1の回収可能な粒子に結合した第1の抗体とインキュベートするステップであって、第1の抗体は、母親細胞の細胞表面上に存在するが、fNRBCの細胞表面上に存在しない第1の抗原と、第1の抗体が第1の抗原と結合する条件下で結合して、第1の粒子−細胞複合体を生成する、ステップ、ならびに第1の粒子−細胞複合体を第1の懸濁液から分離して取り除くことによって、1個または複数個のfNRBCおよび残存する第2の数の母親細胞を含む第2の懸濁液を生成するステップと;
(d)第2の回収可能な粒子に結合した第2の抗体を第2の懸濁液に加えるステップであって、第2の抗体は、fNRBCの細胞表面上に存在する第2の抗原と結合し、第2の抗原は、母親細胞の細胞表面上に存在しない、ステップ、第2の懸濁液を、第2の抗体が第2の抗原と結合する条件下でインキュベートして、第2の粒子−細胞複合体を生成するステップ、第2の懸濁液から第2の粒子−細胞複合体を分離するステップ、ならびに第2の粒子−細胞複合体から細胞を放出させて再懸濁させることによって、1個または複数個のfNRBCを含む第3の懸濁液を生成するステップと;
(e)1個または複数個のfNRBCを分析することによって、胎児異常の有無を判定するステップと
を含む方法。
83.第2の抗体は、fNRBC有核前駆細胞の細胞表面上に存在する表面抗原と結合するが、成体の赤血球細胞上に存在するCD71または他の表面抗原と結合しない、実施形態82に従う、胎児異常を検出する方法。
84.第2の抗体は4B9である、実施形態82に従う、胎児異常を検出する方法。
85.第1の抗体は抗CD45抗体を含む、実施形態82に従う、胎児異常を検出する方法。
86.fNRBCの細胞成分を染色することをさらに含む、実施形態82に従う、胎児異常を検出する方法。
87.胎児異常は、トリソミー13、トリソミー18、トリソミー21、ダウン症候群、圧迫性麻痺の傾向がある神経障害、神経線維腫症、アラジール症候群、軟骨形成不全、ハンチントン舞踏病、アルファ−マンノース症、ベータ−マンノース症、異染性ロイコジストロフィー、フォンレックリングハウゼン病、結節性硬化症、筋強直性ジストロフィー、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、テイ−サックス病、ベータ−サラセミア、ムコ多糖症、フェニルケトン尿症、シトルリン尿症、ガラクトース血症、ガラクトキナーゼおよびガラクトース4−エピメラーゼ欠乏症、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠乏症、メチルマロン酸尿症、プロピオン酸血症、ファーバー病、フコシドーシス、ガングリオシドーシス、ゴーシェ病、I細胞病、ムコリピドーシスIII、ニーマン−ピック病、シアリドーシス、ウォールマン病、ツェルヴェーガー症候群、シスチン症、第X因子欠乏症、毛細血管拡張性運動失調、ブルーム症候群、ローベルト症候群、色素性乾皮症、脆弱(X)症候群、性染色体異数性、クラインフェルター症候群、ターナー症候群、XXX症候群、ステロイドスルファターゼ欠乏症、線形の皮膚欠損を伴う小眼球症、ペリツェーウス−メルツパッヒャー病、Y染色体上の精巣決定因子、オルニチンカルバモイル転移酵素欠乏症、ブドウ糖6−リン酸脱水素酵素欠乏症、レッシュ−ナイハン症候群、アンダーソン−ファブリ疾患、血友病A、血友病B、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、dup(17)(p11.2p11.2)症候群、16p11.2欠失、16p11.2重複、ミトコンドリア欠損、dup(22)(q11.2q11.2)症候群、ネコ眼症候群、ネコ鳴き症候群、ウォルフ−ヒルシュホーン症候群、ウィリアムス−ボイレン症候群、シャルコー−マリー−ツース病、染色体再配列、染色体欠失、スミス−マゲニス症候群、口蓋心臓顔貌症候群、ディジョージ症候群、1p36欠失、プラーダー−ヴィリ症候群、無精子症(因子a)、無精子症(因子b)、無精子症(因子c)、脊椎披裂、無脳症、神経管欠損、小頭症、水頭症、腎欠損、カルマン症候群、副腎発育不全、アンゲルマン症候群、嚢胞腎、嚢胞性ヒグローマ、胎児水症、臍ヘルニアおよび胃壁裂、横隔膜ヘルニア、十二指腸閉鎖症、骨格形成異常、口唇裂、口蓋裂、アルギニノコハク酸尿、クラッベ病、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、3−メチルクロトニル補酵素Aカルボキシラーゼ欠乏症、糖原病、副腎過形成、低フォスファターゼ症、胎盤ステロイドスルファターゼ欠乏症、重症合併型免疫不全症候群、T細胞免疫不全、エーラース−ダンロー症候群、骨形成不全症、成人多嚢胞性腎疾患、ファンコーニ貧血、表皮水泡症症候群、発汗減少症性外胚葉性形成異常、先天性ネフローゼ(フィンランド型)、ならびに多発性内分泌腫瘍からなる群から選択される、実施形態82に従う、胎児異常を検出する方法。
88.生物学的サンプルから胎児有核赤血球(fNRBC)を濃縮する方法であって、
(a)生物学的サンプルを密度分離にかけて、fNRBC含有細胞画分を得るステップと;
(b)ステップ(a)において得たfNRBC含有細胞画分を、少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬を用いる磁気活性化細胞ソーティング(MACS)にかけて、MACSでソートした細胞集団を得るステップと;
(c)ステップ(b)において得た、MACSでソートした細胞集団中の細胞を、少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬で蛍光標識して、蛍光標識細胞集団を得るステップと;
(d)ステップ(c)において得た蛍光標識細胞集団を、フローサイトメトリーによってソートして、fNRBCを選択することによって、fNRBCが濃縮された細胞集団を得るステップと
を含み、
実施形態88の方法は、場合によりさらに、
(e)場合により、物理的方法、例えば顕微操作によって、個々のfNRBCまたはfNRBCの群を単離するステップと;
(f)場合により、例えば遺伝的フィンガープリンティングによって、fNRBCが胎児であることを確認するステップと
である、ステップ(e)および/または(f)を含む、方法。
89.ステップ(b)は、少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択剤を利用し、ステップ(c)は、少なくとも2つのfNRBCポジティブ選択試薬を利用し、場合により、ステップ(b)における少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、ステップ(c)における少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬と同じ標的を選択する(例えば、両方が同じ標的に対する抗体である)、実施形態88の方法。
90.ステップ(b)は、少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬を利用し、ステップ(c)は、少なくとも3つのfNRBCポジティブ選択試薬を利用し、場合により、ステップ(b)における少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、ステップ(c)における少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬と同じ標的を選択する(例えば、両方が同じ標的に対する抗体である)、実施形態88の方法。
91.ステップ(b)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体4B9を含む、実施形態88から90のいずれか1つの方法。
92.ステップ(b)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、抗CD235a抗体を含む、実施形態88から91のいずれか1つの方法。
93.ステップ(c)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体4B9を含む、実施形態88から92のいずれか1つの方法。
94.ステップ(b)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、抗CD235a抗体を含む、実施形態88から93のいずれか1つの方法。
95.ステップ(b)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、核染色剤を含む、実施形態88から94のいずれか1つの方法。
96.個々のfNRBCまたはfNRBCの群を単離するための顕微操作をさらに含む、実施形態88から95のいずれか1つの方法。
97.ネガティブ選択ステップを含まない、実施形態88から96のいずれか1つの方法。
98.ステップ(a)において得たfNRBC含有細胞画分を、ステップ(b)の前にネガティブ選択にかける、実施形態88から96のいずれか1つの方法。
99.ステップ(b)において得た、MACSでソートした細胞集団を、ステップ(c)の前にネガティブ選択にかける、実施形態88から96のいずれか1つの方法。
100.ネガティブ選択は、ネガティブ免疫選択である、実施形態98または99の方法。
101.ネガティブ免疫選択は、
(a)Tリンパ球細胞表面マーカー、場合によりCD3、CD4またはCD8;
(b)Bリンパ球細胞表面マーカー、場合によりCD19、CD20、またはCD32;
(c)panリンパ球マーカー、場合によりCD45;
(d)NK細胞表面マーカー、場合によりCD56;
(e)樹状細胞表面マーカー、場合によりCD11cまたはCD23;および
(f)マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、場合によりCD14またはCD33
から選択される1つまたは複数の細胞表面マーカーに対する1つまたは複数の抗体を利用する、実施形態100の方法。
102.生物学的サンプルからfNRBCを濃縮する方法であって、
(a)生物学的サンプルを密度分離にかけて、fNRBC含有細胞画分を得るステップと;
(b)ステップ(a)において得たfNRBC含有細胞画分を、少なくとも2つのfNRBCポジティブ選択試薬を用いるMACSにかけて、MACSでソートした細胞集団を得るステップと;
(c)ステップ(b)において得た、MACSでソートした細胞集団に顕微操作を実行して、個々のfNRBCまたはfNRBCの群を単離するステップと
を含む方法。
103.ステップ(b)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体4B9を含む、実施形態102の方法。
104.ステップ(b)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、抗CD235a抗体を含む、実施形態102または103の方法。
105.ネガティブ選択ステップを含まない、実施形態102から104のいずれか1つの方法。
106.ステップ(a)において得たfNRBC含有細胞画分を、ステップ(b)の前にネガティブ選択にかける、実施形態102から104のいずれか1つの方法。
107.ステップ(b)において得た、MACSでソートした細胞集団を、ステップ(c)の前にネガティブ選択にかける、実施形態102から104のいずれか1つの方法。
108.ネガティブ選択は、ネガティブ免疫選択である、実施形態106または107の方法。
109.ネガティブ免疫選択は、
(a)Tリンパ球細胞表面マーカー、場合によりCD3、CD4またはCD8;
(b)Bリンパ球細胞表面マーカー、場合によりCD19、CD20、またはCD32;
(c)panリンパ球マーカー、場合によりCD45;
(d)NK細胞表面マーカー、場合によりCD56;
(e)樹状細胞表面マーカー、場合によりCD11cまたはCD23;および
(f)マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、場合によりCD14またはCD33
から選択される1つまたは複数の細胞表面マーカーに対する1つまたは複数の抗体を利用する、実施形態108の方法。
110.生物学的サンプルは母体血液である、実施形態88から109のいずれか1つの方法。
111.母体血液は、妊娠約4週から約38週の間に採取される、実施形態110の方法。
112.母体血液は、妊娠約6週から約20週の間に採取される、実施形態111の方法。
113.実施形態88から112のいずれか1つの方法によって得られる、または得ることができる、fNRBCが濃縮された細胞集団。
114.母体血液から濃縮された、(a)少なくとも2、少なくとも5、もしくは少なくとも10個の、かつ/または(b)最大15、最大25、もしくは最大35個のfNRBCを含有する、FACSでソートした細胞集団。
115.(a)少なくとも20、少なくとも50、または少なくとも100の、かつ/または(b)最大150、最大250、または最大350のFACS事象を含有する、実施形態114の、FACSでソートした細胞集団。
116.固定されていない、実施形態113から115のいずれか1つの細胞集団。
117.胎児異常について、実施形態113から116のいずれか1つの細胞集団由来の少なくとも1個のfNRBCを分析することを含む、胎児異常を検出する方法。
118.実施形態1から112のいずれか1つの方法に従って、fNRBCを、前記分析の前に濃縮することをさらに含む、実施形態117の方法。
119.胎児異常について単一のfNRBCを分析することを含む、実施形態117または118の方法。
120.胎児異常について一群のfNRBCを分析することを含む、実施形態117または118の方法。
121.前記分析の前に全ゲノム増幅を実行することを含む、実施形態119または120の方法。
122.前記分析の前にゲノムのサブセットを増幅することを含む、実施形態119または120の方法。
123.分析は定量PCRを含む、実施形態117から122のいずれか1つの方法。
124.分析はマイクロアレイ上で実行される、実施形態117から122のいずれか1つの方法。
125.fNRBCを胎児細胞として確認することをさらに含む、実施形態117から124のいずれか1つの方法。
126.確認が、ショートタンデムリピート(STR)分析、遺伝的フィンガープリンティング、または単一ヌクレオチド多型(SNP)分析を実行することを含む、実施形態125の方法。
127.確認が、fNRBC DNAを母系DNAと比較することを含む、実施形態125または126の方法。
128.確認が、fNRBC DNAを、母系DNAおよび父系DNAの両方と比較することを含む、実施形態125または126の方法。
本出願において引用される全ての刊行物、特許、特許出願、および他の文献は、個々の刊行物、特許、特許出願、または他の文献が、全ての目的について、参照によって組み込まれることが個々に示されている場合と同じ範囲まで、全ての目的について、それらの全体が参照によって本明細書中に組み込まれる。本明細書中に組み込まれる参考文献の1つまたは複数の教示と本開示との間に矛盾がある場合には、本明細書の教示が意図される。
Claims (42)
- 生物学的サンプルから胎児有核赤血球(fNRBC)を濃縮する方法であって、
(a)前記生物学的サンプルを密度分離にかけて、fNRBC含有細胞画分を得るステップ;
(b)ステップ(a)において得た前記fNRBC含有細胞画分を、少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬を用いる磁気活性化細胞ソーティング(MACS)にかけて、MACSでソートした細胞集団を得るステップ;
(c)ステップ(b)において得た、前記MACSでソートした細胞集団中の細胞を、少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬で蛍光標識して、蛍光標識細胞集団を得るステップ;および
(d)ステップ(c)において得た前記蛍光標識細胞集団を、フローサイトメトリーによってソートして、fNRBCを選択することによって、fNRBCが濃縮された細胞集団を得るステップ
を含む方法。 - ステップ(b)は、少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬を利用し、ステップ(c)は、少なくとも2つのfNRBCポジティブ選択試薬を利用する、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)は、少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬を利用し、ステップ(c)は、少なくとも3つのfNRBCポジティブ選択試薬を利用する、請求項1に記載の方法。
- ステップ(b)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体4B9を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)の前記少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、抗CD235a抗体を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体4B9を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、抗CD235a抗体を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、核染色剤を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 個々のfNRBCまたはfNRBCの群を単離するための顕微操作をさらに含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- ネガティブ選択ステップを含まない、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)において得た前記fNRBC含有細胞画分を、ステップ(b)の前にネガティブ選択にかける、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)において得た、前記MACSでソートした細胞集団を、ステップ(c)の前にネガティブ選択にかける、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ネガティブ選択はネガティブ免疫選択である、請求項11または12に記載の方法。
- 前記ネガティブ免疫選択は、
(a)Tリンパ球細胞表面マーカー、場合によりCD3、CD4またはCD8;
(b)Bリンパ球細胞表面マーカー、場合によりCD19、CD20またはCD32;
(c)panリンパ球マーカー、場合によりCD45;
(d)NK細胞表面マーカー、場合によりCD56;
(e)樹状細胞表面マーカー、場合によりCD11cまたはCD23;および
(f)マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、場合によりCD14またはCD33
から選択される1つまたは複数の細胞表面マーカーに対する1つまたは複数の抗体を利用する、請求項13に記載の方法。 - 生物学的サンプルからfNRBCを濃縮する方法であって、
(a)前記生物学的サンプルを密度分離にかけて、fNRBC含有細胞画分を得るステップ;
(b)ステップ(a)において得た前記fNRBC含有細胞画分を、少なくとも2つのfNRBCポジティブ選択試薬を用いるMACSにかけて、MACSでソートした細胞集団を得るステップ;および
(c)ステップ(b)において得た、前記MACSでソートした細胞集団に顕微操作を実行して、個々のfNRBCまたはfNRBCの群を単離するステップ
を含む方法。 - ステップ(b)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、モノクローナル抗体4B9を含む、請求項15に記載の方法。
- ステップ(b)の少なくとも1つのfNRBCポジティブ選択試薬は、抗CD235a抗体を含む、請求項15または16に記載の方法。
- ネガティブ選択ステップを含まない、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)において得た前記fNRBC含有細胞画分を、ステップ(b)の前にネガティブ選択にかける、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)において得た、前記MACSでソートした細胞集団を、ステップ(c)の前にネガティブ選択にかける、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ネガティブ選択はネガティブ免疫選択である、請求項19または20に記載の方法。
- 前記ネガティブ免疫選択は、
(a)Tリンパ球細胞表面マーカー、場合によりCD3、CD4またはCD8;
(b)Bリンパ球細胞表面マーカー、場合によりCD19、CD20またはCD32;
(c)panリンパ球マーカー、場合によりCD45;
(d)NK細胞表面マーカー、場合によりCD56;
(e)樹状細胞表面マーカー、場合によりCD11cまたはCD23;および
(f)マクロファージまたは単球細胞表面マーカー、場合によりCD14またはCD33
から選択される1つまたは複数の細胞表面マーカーに対する1つまたは複数の抗体を利用する、請求項21に記載の方法。 - 前記生物学的サンプルは母体血液である、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記母体血液は、妊娠約4週から約38週の間に採取される、請求項23に記載の方法。
- 前記母体血液は、妊娠約6週から約20週の間に採取される、請求項24に記載の方法。
- 少なくとも1個のfNRBCの正体を胎児細胞として確認することをさらに含む、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から25のいずれか一項に記載の方法によって得られる、または得ることができる、fNRBCが濃縮された細胞集団。
- 母体血液から濃縮された、(a)少なくとも2、少なくとも5、もしくは少なくとも10個の、かつ/または(b)最大15、最大25、もしくは最大35個のfNRBCを含有する、FACSでソートした細胞集団。
- (a)少なくとも20、少なくとも50、または少なくとも100の、かつ/または(b)最大150、最大250、または最大350のFACS事象を含有する、請求項28に記載の、FACSでソートした細胞集団。
- 固定されていない、請求項27から29のいずれか一項に記載の、細胞集団。
- 胎児異常について、請求項27から30のいずれか一項に記載の細胞集団由来の少なくとも1個のfNRBCを分析することを含む、胎児異常を検出する方法。
- 請求項1から25のいずれか一項に記載の方法に従って、fNRBCを、前記分析の前に濃縮することをさらに含む、請求項31に記載の方法。
- 前記胎児異常について単一のfNRBCを分析することを含む、請求項31または32に記載の方法。
- 前記胎児異常について一群のfNRBCを分析することを含む、請求項31または32に記載の方法。
- 前記分析の前に全ゲノム増幅を実行することを含む、請求項33または34に記載の方法。
- 前記分析の前にゲノムのサブセットを増幅することを含む、請求項33または34に記載の方法。
- 前記分析は定量PCRを含む、請求項31から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分析はマイクロアレイ上で実行される、請求項31から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記fNRBCを胎児細胞として確認することをさらに含む、請求項31から38のいずれか一項に記載の方法。
- 確認が、ショートタンデムリピート(STR)分析、遺伝的フィンガープリンティング、または単一ヌクレオチド多型(SNP)分析を実行することを含む、請求項39に記載の方法。
- 確認が、fNRBC DNAを母系DNAと比較することを含む、請求項39または40に記載の方法。
- 確認が、fNRBC DNAを、母系DNAおよび父系DNAの両方と比較することを含む、請求項39または40に記載の方法。
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