JP2020103299A5

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Publication number: JP2020103299A5
Application number: JP2020025062A
Authority: JP
Filing date: 2020-02-18
Publication date: 2021-07-26

Claims

胎児由来の核酸を取得するための方法であって、
ａ．母体血試料中の血球をその密度及び大きさのいずれか又は両方によって分画することで母体血試料中から取得された画分であって全血球を基準として有核赤血球の濃縮された画分Ａについて、含まれる赤血球及び細胞核のそれぞれに対して特異的に標識し、
ｂ．標識した前記画分Ａ中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで母体由来及び胎児由来の有核赤血球を、各血球が有核赤血球であるか否かを問わず一細胞レベルで分離された画分Ｂの群の中に取得するところ、前記赤血球に対して特異的な標識により標識され、さらに細胞核に対して特異的な標識により標識された血球を回収するように選別を行うとともに、並行して血球を含有する微量の流体を前記画分Ｂとして連続的に分取し、
ｃ．前記画分Ｂの含む血球のそれぞれに対して各血球が有核赤血球であるか否かを問わず核酸の抽出処理を行うことにより一細胞レベルで区別可能な核酸を各々含有する画分Ｃを取得し、
ｄ．前記画分Ｃのそれぞれに対して分子生物学的解析を行うことで、前記画分Ｃの群の中から、一細胞レベルで区別可能な胎児由来の核酸を含有する画分Ｄを選別する、
方法。
前記ａ．において、前記画分Ａを、追加的に白血球に対して特異的に標識し、
前記ｂ．において、さらに前記白血球に対して特異的な標識により標識された血球を除外するように前記選別を行う、
請求項１に記載の方法。
胎児由来の核酸を取得するための方法であって、
ａ．母体血試料中の血球をその密度及び大きさのいずれか又は両方によって分画することで母体血試料中から取得された画分であって全血球を基準として有核赤血球の濃縮された画分Ａについて、含まれる白血球及び細胞核のそれぞれに対して特異的に標識し、
ｂ．標識した前記画分Ａ中の血球を少なくともセルソーティングによって選別することで母体由来及び胎児由来の有核赤血球を、各血球が有核赤血球であるか否かを問わず一細胞レベルで分離された画分Ｂの群の中に取得するところ、前記白血球に対して特異的な標識により標識された血球を除外するとともに、細胞核に対して特異的な標識により標識された血球を回収するように選別を行うとともに、並行して血球を含有する微量の流体を前記画分Ｂとして連続的に分取し、
ｃ．前記画分Ｂの含む血球のそれぞれに対して各血球が有核赤血球であるか否かを問わず核酸の抽出処理を行うことにより一細胞レベルで区別可能な核酸を各々含有する画分Ｃを取得し、
ｄ．前記画分Ｃのそれぞれに対して分子生物学的解析を行うことで、前記画分Ｃの群の中から、一細胞レベルで区別可能な胎児由来の核酸を含有する画分Ｄを選別する、
方法。
前記ｃ．において、血球が有核赤血球に由来するか否かを問わない方法で前記画分Ｃが取得されたことから、前記画分Ｄに含有される核酸が一細胞レベルで分離された有核赤血球に由来することは、前記ｄ．において当該核酸が胎児由来であることを同定したことに基づき事後的に推定されることを特徴とする、
請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
前記母体血試料は、母体血それ自体、又は母体血に比べて全血球数を基準として有核赤血球が濃縮されていない未濃縮試料であり、
前記画分Ａは前記母体血試料中の血球をその大きさによって分画することで母体血試料中から取得された画分であるとともに、母体血試料中の血球から無核赤血球の少なくとも一部が取り除かれてなるものである、
請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
前記母体血試料を血球分離チップで処理することで前記母体血試料中の血球をその大きさによって分画し、
前記血球分離チップは、主流路と、前記主流路の側方に接続する副流路と、前記副流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する除去流路とを備えるマイクロ流路構造を有し、
前記主流路には前記母体血試料が流れ、
副流路から流れ出す液が前記主流路を流れる血球を、前記主流路の側方から前記除去流路に向かって押し込み、
前記除去流路において前記母体血試料から無核赤血球が除去されるとともに、前記主流路における前記除去流路の接続部の下流において前記母体血試料から有核赤血球が回収されることで、前記画分Ａが取得され、
前記除去流路の内接径が１２〜１９μｍである、
請求項５に記載の方法。
前記血球分離チップは、前記除去流路の下流において前記副流路とは反対側の前記主流路の側方に接続する回収流路をさらに備え、
副流路から流れ出す液が前記主流路を流れる血球を、前記主流路の側方からさらに前記回収流路に向かって押し込み、
前記回収流路において前記母体血試料から有核赤血球が回収されることで、前記回収流路から前記画分Ａが取得され、
前記回収流路の内接径が２０〜３０μｍである、
請求項６に記載の方法。
細胞を含む液滴の吐出装置により、血球ごとに流体を別個の容器に分注することで前記画分Ｂを得る、
請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
前記ａ．において、少なくとも細胞核に対する標識を核酸に対する蛍光標識によって行い、
前記ｂ．において、少なくとも細胞核に対して特異的に蛍光標識された前記画分Ａ中の血球を蛍光標示式細胞分取法に基づくセルソーティングによって選別する、
請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
前記ａ．において、母体血試料中の血球を密度又は大きさによって分画して得られた画分に対して、さらに免疫除去法により白血球を除去することで、前記画分Ａを取得し、これを標識する、
請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
前記ｃ．において前記画分Ｃに含有される前記核酸はＲＮＡであり、
前記ＲＮＡはｍＲＮＡ及びノンコーディングＲＮＡのいずれか又は両方であり、
前記ｄ．において分子生物学的解析を行うために、前記ＲＮＡに対して逆転写を行い、
前記胎児由来の核酸として逆転写産物であるｃＤＮＡを含有する前記画分Ｄを選別する、
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
さらに前記ｃ．において前記ＲＮＡの抽出と同時に、各血球に対して染色体ＤＮＡの抽出を行うことで各画分Ｃに紐付けられた画分Ｗを取得し、
前記画分Ｗの群の中から、前記画分Ｄに紐付けられた画分Ｚを一細胞レベルで区別可能な胎児由来の染色体ＤＮＡを含有する画分として得る、
請求項１１に記載の方法。
請求項１２に記載の方法により得た前記画分Ｚ中の前記核酸の配列をマイクロアレイ解析又は配列決定法により解析し、
前記解析の結果から非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する方法。
前記ｃ．において前記画分Ｃに含有される前記核酸は染色体ＤＮＡであり、
前記ｄ．において分子生物学的解析を行うために、前記染色体ＤＮＡに対して全ゲノム又はゲノム中の一部領域の増幅を行うとともに、前記胎児由来の核酸として増幅産物であるＤＮＡを含有する前記画分Ｄを選別し、
前記画分Ｄ中の前記胎児由来の前記核酸の配列情報の一部又は全部をマイクロアレイ解析又は配列決定法により解析するとともに、前記解析の結果から非侵襲的出生前遺伝学的検査における診断に供するデータを取得する、
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。