JPH08505777A

JPH08505777A - 胎児の赤血球の単離

Info

Publication number: JPH08505777A
Application number: JP6517158A
Authority: JP
Inventors: ビーゴールドバード，サイモン
Original assignee: アプロジェネックスインク
Priority date: 1993-01-22
Filing date: 1994-01-18
Publication date: 1996-06-25
Also published as: EP0681614B1; DE69430365D1; ATE215992T1; AU6125094A; EP0681614A4; EP0681614A1; CA2154460A1; US5457024A; WO1994017209A1; DE69430365T2

Abstract

(57)【要約】母の血液試料の赤血球を他の全ての凝集した細胞から分離することにより母の血液試料から凝集した胎児の赤血球（ＮＦＥｓ）を単離すること及び非凝集の母の赤血球からＮＦＥｓを単離する方法。好ましい母の血液は末梢の母の血液である。単離したＮＦＥｓは、遺伝学の異常及びインサイチュハイブリッド形成法のようなもののために分析される。

Description

【発明の詳細な説明】胎児の赤血球の単離発明の背景本発明は、妊娠の初期段階中、特にインサイチュハイブリッド形成法（ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）のような出産前の診断で、母の血液から凝集した胎児の赤血球（ＮＥＦ）を単離及び濃縮する手順に関するものである。いくつかの装置及び方法が、血液成分、特に赤血球、血小板、白血球、プラズマを互いに分離するために開発されてきた。例えば、米国特許第４，８８０，５４８、同第４，９２３，６２０及び同第４，９２５，５７２に見いだすことができる。これらの方法及び装置は、フイブリノーゲン及び／又はフィブリルゲル、ミクロアグレゲート及び白血球を除去した容器詰め赤血球又は血小板からなる血液銀行業用の全血液組成の分離に関するものであり、輸血又は治療、特に緊急事態用で、通常比較的大容量すなわち１つ以上の単位（それぞれが４５０ｍｌ）で濃縮組成管理用のものである。母の血液に存在するＮＦＥの数は、非常に少ない（概算、一万中に一つから百万中に一つである）。現状の技術において、母の細胞の数が多いという主な理由でこれら細胞の単離は行われていない。発明の概要本発明は、妊娠の１−３ケ月又は４−６ケ月の女性の末梢の血液から凝集した胎児の赤血球（ＮＦＥ）を分離するために用いる方法を提供する。この方法は、母又は生産物どちらにも危険のない非侵入手順で構成しているので、年齢及び危険の要因にかかわりなくあらゆる妊娠女性に適用されうる。血液の収集は、病院、診療所又はその他どこででも行い、細胞の単離と分析は、類似の施設及び臨床の遣伝研究所で行うことができる。本発明のＮＦＥ単離方法は、遣伝学の異常出産前の診断のためのインサイチュハイブリッド形成法のような技術での分析のために単離した胎児の赤血球の試料を提供するのに用いる。従って、本発明の方法は、母の血液試料のＮＦＥｓを他の全ての凝集した細胞から分離することにより、母の血液から凝集した胎児の赤血球（ＮＦＥｓ）を単離すること及び非凝集の母の赤血球からＮＦＥｓを単離するものである。母の血液試料は末梢の母の血液からのものであることが好ましい。単離したＮＦＥｓは、遺伝学の異常及びインサイチュハイブリッド形成法のようなもののために分析される。好ましい具体例このように最も重要な特徴において、本発明は、母の血液試料から凝集した胎児の赤血球（ＮＦＥｓ）を単離する方法に関するものである。この方法は、母の血液試料のＮＦＥｓを他の全ての凝集した細胞から分離すること及び非凝集の母の赤血球からＮＦＥｓを単離することを特徴とする。試料は、末梢の母の血液であること及び約５−５０ｍｌの母の血液であることが好ましい。第１の特徴において、母の血液試料の赤血球は、全血液試料を白血球減少装置に通過させ、更に濾過器を通過して得られた赤血球を集めることにより他の凝集した細胞と分離される。驚くべきことに、凝集した胎児の赤血球は、凝集した白血球に保持されるよりもむしろ非凝集の母の赤血球とともに通過する。この白血球減少装置は、ニューヨーク州（ＮＹ）のグレン（Ｇｌｅｎ）コーベ（Ｃｏｖｅ）にあるポール株式会社（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、製造販売の特別小型のものが好ましく、米国特許第４９２５，５７２号に詳細に記載されている。液体が多孔質媒体でできている上流面に接触し、小さな差圧が生じると、多孔質媒体への流入が起こる場合と起こらない場合がある。流入が起こらない条件は、液体が多孔質構造の物質を湿潤しないということである。一続きの液体でそれぞれの液体が一つ前の液体より表面張力が３ｄｙｎｅｓ／ｃｍ高いものを用意する。それぞれの液体の一滴が多孔質表面に置かれ、それが速やかに吸収されるか表面に留まるかどうかを決めるために観察される。同様な挙動が他の合成樹脂製の多孔質媒体で観察され、第一に、その媒体は、多孔質媒体物質の表面特性に、第二には多孔質媒体の孔の形状特性に依存した湿潤、非湿潤値を持っている。例えば、表面張力が５０ｄｙｎｅｓ／ｃｍの液体は、約２０マイクロメーター未満の孔直径のポリエステル繊維（特にポリブチレンテレフタレート（以降”ＰＢＴ”）シート）を湿潤し、表面張力が５４ｄｙｎｅｓ／ｃｍの液体は、それを湿潤しない。この多孔質媒体の挙動を特徴づけるために、”臨界湿潤表面張力”（ＣＷＳＴ）なる術語を以下に定義した。多孔質媒体の表面に２−４ｄｙｎｅｓ／ｃｍの間で変化する表面張力を持つ一続きの液体を、好ましくは滴下方式で、個々に適用し、それぞれの液体の吸収、非吸収を観察し多孔質媒体のＣＷＳＴを決定する。多孔質媒体のｄｙｎｅｓ／ｃｍ単位のＣＷＳＴは、吸収した液体の表面張力値と吸収しないその隣の液体の表面張力値との平均とする。ＣＷＳＴの測定において、２−４ｄｙｎｅｓ／ｃｍの表面張力が次から次ぎに変わる一続きの標準液体をテストのために用意する。湿潤は、標準の液滴の１０分以内での少なくとも９０％の多孔質媒体への明白な湿潤又は吸収で決める。非湿潤は、標準の液滴の１０分以内での少なくとも９０％の非湿潤又は非吸収で決める。試験は、湿潤及び非湿潤が表面張力の最も接近した位置にある一対と決まるまで、連続したより高い又はより低い表面張力の液体を用いて行い続ける。ＣＷＳＴは、一対の表面張力の範囲内であり、便宜上、２つの表面張力の平均をＣＷＳＴの１つの特性値として用いる。米国特許第４，９２５，５７２号は、表面張力を変えた適切な溶液を報告している。全血液中で、赤血球細胞は、７３ｄｙｎｅｓ／ｃｍの表面張力を持つ血液プラズマ中に浮遊している。それ故、全血液が多孔質媒体と接触し、その多孔質媒体のＣＷＳＴが７３ｄｙｎｅｓ／ｃｍ以上であるならば自発的な湿潤が起こる。本発明の第１の具体例は、少なくとも第一、第二及び第三の多孔質要素からなり第二要素は第一及び第三要素間に挟まれている血液試料の白血球含有量減少装置を使用した。連続している要素は、前段の要素よりそれぞれ小さい孔径持っている。第一要素は、ゲル（ｇｅｌｓ）を除去するためのものであり、第二要素は、ミクロアグレゲート（ｍｉｃｒｏａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を除去するためのものであり、第三要素は、白血球を除去するためのものである。白血球減少装置のこの具体例は、約４−約８マイクロメーター、好ましくは約４−約５．５マイクロメーターの範囲にある孔径の第三要素を持つ。他の具体例において、この装置は、針状の繊維構造で厚さ調節に熱圧縮することのできる第一要素を持つ。この第一要素の平均孔径は、イソプロピルアルコールで前湿潤すると、水柱４−７ｃｍの差圧が、速度０．５ｃｍ／秒の空気流を引き起こすようにすることが出来る。更に、この装置は、約２５−約１０マイクロメーターの孔径の範囲を近似的幾何級数的に徐々に広がる少なくとも２つの挟みこみ又は張り合わせた多孔質媒体要素を含むことができる。例えば、約２５−約１０マイクロメーターの範囲に及び徐々に減少する孔径を持つ挟みこみ多孔質媒体要素を少なくとも２つ含むか又は約２５マイクロメーターから約１０−約１５マイクロメーターの範囲に孔径が徐々に変化している単独の要素を含むことができる。この装置の１つ以上の要素を界面活性剤で処理することが好ましい。界面活性剤は、血液試料の約７５−４５ｄｙｎｅｓ／ｃｍの表面張力を引き起こす。更にもう１つの方法として、少なくとも１つの水酸部分及びエネルギー源で活性化できる１つの部分を含むモノマー並びに少なくとも１つの疎水性部分及びエネルギー源で活性化できる１つの部分を含むモノマーに接触させながらエネルギー源で少なくとも１つの要素の表面を改質することができる。特に、この装置は、濾過手段を含む白血球除去手段のある要素を持つ。この要素は、５３−６３ｄｙｎｅｓ／ｃｍ超過の改質したＣＷＳＴを持つ表面の合成繊維で形成するのが好ましい。これらの繊維の表面は、前述のモノマーとに接触させながらエネルギー源に暴露して改質することもできる。本発明は、５３ｄｙｎｅｓ／ｃｍ超過の臨界湿潤表面張力を得るために照射グラフト重合し、その後熱圧縮して砕けにくい密着物とした繊維状媒体の要素を少なくとも１つを持つ装置を血液生産物から白血球滅少のために追加的に使用することもできる。この装置は、約５５−７５ｄｙｎｅｓ／ｃｍの範囲のＣＷＳＴを持ち、前述のモノマーに接触させながらエネルギー源に暴露して繊維の表面を改質することもできる。本発明は、約５５−７５ｄｙｎｅｓ／ｃｍの範囲のＣＷＳＴに改質した合成繊維及び前述のモノマーに接触させながらエネルギー源に暴露して改質した繊維表面を持つ合成繊維で形成した要素を含む白血球減少のため装置を使用することもできる。特に本発明は、流入口と流出口を含みその流入口と流出口間の流体流路を明示したハウジングで、ゲル除去用上流多孔質要素、少なくとも１つのミクロアグレゲート除去用中間多孔質要素及び白血球除去用下流多孔質要素と、これらの要素が、締め代方式のはめあいによりハウジング内に取り付けられていることを特徴とする血液試料の白血球減少のため装置を使用する。他の特徴において、非凝集の母の赤血球から細孔勾配物質を通して遠心分離により凝集した胎児の赤血球を単離する。少量の試料溶液が装置内に残るが、通常約９０％、即ち４．５−４５ｍｌの試料溶液が白血球減少装置を通過し、試料から白血球がなくなる。リン酸塩緩衝食塩水のような生理用溶液で遠心分離用の物質を３−７倍に希釈するのが好ましい。好ましい勾配物質は、多糖で、例えば、４−２０％の蔗糖勾配である。このような孔勾配物質の具体例として、エムオー（ＭＯ）のセントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）にあるシグマ化学株式会社（ＳＩＧＭＡＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）が提供するフイコール（Ｆｉｃｏｌｌ）及びパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配物質がある。非凝集の赤血球から凝集物を単離する他の有用な方法は、非凝集の母の赤血球を塩化アンモニウムのようなもので溶解することを特徴とする。赤血球を含んだ溶液を塩化アンモニウムの通常約１：４（Ｖ／Ｖ）比率の０．１−０．２Ｍ水溶液と混合する。非凝集の母の赤血球から凝集した赤血球を単離する本発明の方法は、赤血球と固相境界性の抗体、特に、凝集した赤血球とくっつくものとを反応させ、非境界性の非凝集の赤血球をそこから分雌する既知の方法により補足することができる。この方法は、本発明の胎児の赤血球単離に用いてもよい。好ましい抗体は、ポリクロナル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）、モノクロナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）、単鎖（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎ）、Ｆａｂ₂領域フラグメント（Ｆａｂ₂ ｒｅｇｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｓ）又は望ましい特殊性を持つその他の物であればどのようなタイプのものでもよい。抗体は、直接又は典型的な結合基を介在してスライド（ｓｌｉｄｅｓ）、ビーズ、微小粒子、マイクロカプセル、磁性を持ったビーズ等を含む既知固相と境界する。そのような抗体の１つの好ましい特殊性又はリガンド（ｌｉｇａｎｄ）は、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）知覚である。トランスフェリン知覚の抗体は、エヌジー（ＮＪ）のピスカタウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）にあるベクトン−ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で入手できる。本発明のその他の特徴は、凝集した胎児の赤血球の核酸の分析方法を提供することである。この方法は、母の血液試料のＮＦＥｓをそこにある他の全ての凝集した細胞から分離すること、そのＮＦＥｓを非凝集の母の赤血球から単離すること及び単離したＮＦＥｓと会合している核酸を分析することを含む。この特徴の好ましい具体例において、実質的に自然のままの膜を持つ凝集した胎児の赤血球の核酸を分析し、その核酸は、自然のままの胎児の染色体又はその染色体のフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）である。実施例１凝集した胎児の赤血球の単離プールしたヘソの緒の索状組織血液５０ｍｌを白血球除去フイルター（ニューヨーク州のグレンコーベにあるポール（Ｐａｌｌ）バイオメディカル（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）プロダクト（Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）株式会社（Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製、ＲＣ５０）で濾過した。６０ｍｌのシリンジバレルを短いチューブでフイルターにつなぎ、ＲＣ５０フイルターにその血液を通した。赤血球（２６ｍｌ）を含む収集部分は、ピービーエス（ＰＢＳ）で５倍に希釈し、ヒストパック（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）１．０７７勾配（エムオーのセントルイスにあるシグマ社製）の上に置いた。その勾配を３００ｇで４０分間遠心し、界面にある細胞を除去し、ピービーエスで一度洗浄し、遠心してペレットを作った。ペレットを一緒にしてピービーエスに再びけん濁し、細胞遠心分離器を用いて遠心し細胞をスライドに置いた。そのスライドをエタノール／メタノール（３：１）中に２分間固定し、ギムサ（Ｇｉｍｓａ）ステインで色づけし、顕微鏡下で観察した。視覚化のため凝集した赤血球に印をつけ数を数えた。視覚された凝集した細胞は、凝集した赤血球のみであった。数えた数からほぼ５０００の凝集した赤血球が回収されていることがわかった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年８月１９日【補正内容】明細書胎児の赤血球の単離発明の背景本発明は、妊娠の初期段階中、特にインサイチュハイブリッド形成法（ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）のような出産前の診断で、母の血液から凝集した胎児の赤血球（以降”ＮＥＦ”）を単離及び濃縮する手順に関するものである。いくつかの装置及び方法が、血液成分、特に赤血球、血小板、白血球、プラズマを互いに分離するために開発されてきた。例えば、米国特許第４，８８０，５４８、同第４，９２３，６２０及び同第４，９２５，５７２に見いだすことができる。これらの方法及び装置は、フイブリノーゲン及び／又はフィブリルゲル、ミクロアグレゲート及び白血球を除去した容器詰め赤血球又は血小板からなる血液銀行業用の全血液組成の分離に閏するものであり、輸血又は治療、特に緊急事態用で、通常比較的大容量すなわち１つ以上の単位（それぞれが４５０ｍｌ）で濃縮組成管理用のものである。母の血液に存在するＮＦＥの数は、非常に少ない（概算、一万中に一つから百万中に一つである）。現状の技術において、母の細胞の数が多いという主な理由でこれら細胞の単離は行われていない。発明の概要本発明は、妊娠の１−３ケ月又は４−６ケ月の女性の末梢の血液から凝集した胎児の赤血球（ＮＦＥ）を分離するために用いる方法を提供する。この方法は、母又は生産物どちらにも危険のない非侵入手順で構成しているので、年齢及び危険の要因にかかわりなくあらゆる妊娠女性に適用されうる。血液の収集は、病院、診療所又はその他どこででも行い、細胞の単離と分析は、類似の施設及び臨床の遣伝研究所で行うことができる。本発明のＮＦＥ単離方法は、遣伝学の異常出産前の診断のためのインサイチュハイブリッド形成法のような技術での分析のために単離した胎児の赤血球の試料を提供するのに用いる。従って、本発明の方法は、母の血液試料のＮＦＥｓを他の全ての凝集した細胞から分離することにより、母の血液から凝集した胎児の赤血球（ＮＦＥｓ）を単離すること及び非凝集の母の赤血球からＮＦＥｓを単離するものである。母の血液試料は末梢の母の血液からのものであることが好ましい。単離したＮＦＥｓは、遺伝学の異常及びインサイチュハイブリッド形成法のようなもののために分析される。好ましい具体例このように最も重要な特徴において、本発明は、母の血液試料から凝集した胎児の赤血球（ＮＦＥｓ）を単離する方法に閏するものである。この方法は、母の血液試料のＮＦＥｓを他の全ての凝集した細胞から分離すること及び非凝集の母の赤血球からＮＦＥｓを単離することを特徴とする。試料は、末梢の母の血液であること及び約５−５０ｍｌの母の血液であることが好ましい。第１の特徴において、母の血液試料の赤血球は、全血液試料を白血球減少装置に通過させ、更に濾過器を通過して得られた赤血球を集めることにより他の凝集した細胞と分離される。驚くべきことに、凝集した胎児の赤血球は、凝集した白血球に保持されるよりもむしろ非凝集の母の赤血球とともに通過する。この白血球滅少装置は、米国のニューヨーク州のグレン（Ｇｌｅｎ）コーべ（Ｃｏｖｅ）にあるポール株式会社（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、製造販売の特別小型のものが好ましく、米国特許第４，９２５，５７２号に詳細に記載されている。液体が多孔質媒体でできている上流面に接触し、小さな差圧が生じると、多孔質媒体への流入が起こる場合と起こらない場合がある。流入が起こらない条件は、液体が多孔質構造の物質を湿潤しないということである。一続きの液体でそれぞれの液体が一つ前の液体より表面張力が３ｄｙｎｅｓ／ｃｍ高いものを用意する。それぞれの液体の一滴が多孔質表面に置かれ、それが速やかに吸収されるか表面に留まるかどうかを決めるために観察される。同様な挙動が他の合成樹脂製の多孔質媒体で観察され、第一に、その媒体は、多孔質媒体物質の表面特性に、第二には多孔質媒体の孔の形状特性に依存した湿潤、非湿潤値を持っている。例えば、表面張力が５０ｄｙｎｅｓ／ｃｍの液体は、約２０マイクロメーター未満の孔直径のポリエステル繊維（特にポリブチレンテレフタレート（以降”ＰＢＴ”）シート）を湿潤し、表面張力が５４ｄｙｎｅｓ／ｃｍの液体は、それを湿潤しない。この多孔質媒体の挙動を特徴づけるために、”臨界湿潤表面張力”（以降”ＣＷＳＴ”）なる術語を以下に定義した。多孔質媒体の表面に２−４ｄｙｎｅｓ／ｃｍの間で変化する表面張力を持つ一続きの液体を、好ましくは滴下方式で、個々に適用し、それぞれの液体の吸収、非吸収を観察し多孔質媒体のＣＷＳＴを決定する。多孔質媒体のｄｙｎｅｓ／ｃｍ単位のＣＷＳＴは、吸収した液体の表面張力値と吸収しないその隣の液体の表面張力値との平均とする。ＣＷＳＴの測定において、２−４ｄｙｎｅｓ／ｃｍの表面張力が次から次ぎに変わる一続きの標準液体をテストのために用意する。湿潤は、標準の液滴の１０分以内での少なくとも９０％の多孔質媒体への明白な湿潤又は吸収で決める。非湿潤は、標準の液滴の１０分以内での少なくとも９０％の非湿潤又は非吸収で決める。試験は、湿潤及び非湿潤が表面張力の最も接近した位置にある一対と決まるまで、連続したより高い又はより低い表面張力の液体を用いて行い続ける。ＣＷＳＴは、一対の表面張力の範囲内であり、便宜上、２つの表面張力の平均をＣＷＳＴの１つの特性値として用いる。米国特許第４，９２５，５７２号は、表面張力を変えた適切な溶液を報告している。全血液中で、赤血球細胞は、７３ｄｙｎｅｓ／ｃｍの表面張力を持つ血液プラズマ中に浮遊している。それ故、全血液が多孔質媒体と接触し、その多孔質媒体のＣＷＳＴが７３ｄｙｎｅｓ／ｃｍ以上であるならば自発的な湿潤が起こる。本発明の第１の具体例は、少なくとも第一、第二及び第三の多孔質要素からなり第二要素は第一及び第三要素間に挟まれている血液試料の白血球含有量減少装置を使用した。連続している要素は、前段の要素よりそれぞれ小さい孔径持っている。第一要素は、ゲル（ｇｅｌｓ）を除去するためのものであり、第二要素は、ミクロアグレゲート（ｍｉｃｒｏａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）を除去するためのものであり、第三要素は、白血球を除去するためのものである。白血球減少装置のこの具体例は、約４−８マイクロメーター、好ましくは約４−約５．５マイクロメーターの範囲にある孔径の第三要素を持つ。他の具体例において、この装置は、針状の繊維構造で厚さ調節に熱圧縮することのできる第一要素を持つ。この第一要素の平均孔径は、イソプロピルアルコールで前湿潤すると、水柱４−７ｃｍの差圧が、速度０．５ｃｍ／秒の空気流を引き起こすようにすることが出来る。更に、この装置は、約２５−約１０マイクロメーターの孔径の範囲を近似的幾何級数的に徐々に広がる少なくとも２つの挟みこみ又は張り合わせた多孔質媒体要素を含むことができる。例えば、約２５−約１０マイクロメーターの範囲に及び徐々に減少する孔径を持つ挟みこみ多孔質媒体要素を少なくとも２つ含むか又は約２５マイクロメーターから約１０−約１５マイクロメーターの範囲に孔径が徐々に変化している単独の要素を含むことができる。この装置の１つ以上の要素を界面活性剤で処理することが好ましい。界面活性剤は、血液試料の約７５−４５ｄｙｎｅｓ／ｃｍの表面張力を引き起こす。更にもう１つの方法として、少なくとも１つの水酸部分及びエネルギー源で活性化できる１つの部分を含むモノマー並びに少なくとも１つの疎水性部分及びエネルギー源で活性化できる１つの部分を含むモノマーに接触させながらエネルギー源で少なくとも１つの要素の表面を改質することができる。特に、この装置は、濾過手段を含む白血球除去手段のある要素を持つ。この要素は、５３−６３ｄｙｎｅｓ／ｃｍ超過の改質したＣＷＳＴを持つ表面の合成繊維で形成するのが好ましい。これらの繊維の表面は、前述のモノマーとに接触させながらエネルギー源に暴露して改質することもできる。本発明は、５３ｄｙｎｅｓ／ｃｍ超過の臨界湿潤表面張力を得るために照射グラフト重合し、その後熱圧縮して砕けにくい密着物とした繊維状媒体の要素を少なくとも１つを持つ装置を血液生産物から白血球減少のために追加的に使用することもできる。この装置は、約５５−７５ｄｙｎｅｓ／ｃｍの範囲のＣＷＳＴを持ち、前述のモノマーに接触させながらエネルギー源に暴露して繊維の表面を改質することもできる。本発明は、約５５−７５ｄｙｎｅｓ／ｃｍの範囲のＣＷＳＴに改質した合成繊維及び前述のモノマーに接触させながらエネルギー源に暴露して改質した繊維表面を持つ合成繊維で形成した要素を含む白血球減少のため装置を使用することもできる。特に本発明は、流入口と流出口を含みその流入口と流出口間の流体流路を明示したハウジングで、ゲル除去用上流多孔質要素、少なくとも１つのミクロアグレゲート除去用中間多孔質要素及び白血球除去用下流多孔質要素と、これらの要素が、締め代方式のはめあいによりハウジング内に取り付けられていることを特徴とする血液試料の白血球減少のため装置を使用する。他の特徴において、非凝集の母の赤血球から細孔勾配物質を通して遠心分離により凝集した胎児の赤血球を単離する。少量の試料溶液が装置内に残るが、通常約９０％、即ち４．５−４５ｍｌの試料溶液が白血球滅少装置を通過し、試料から白血球がなくなる。リン酸塩緩衝食塩水（以降”ＰＢＳ”）のような生理用溶液で遠心分雌用の物質を３−７倍に希釈するのが好ましい。好ましい勾配物質は、多糖で、例えば、４−２０％の蔗糖勾配である。このような孔勾配物質の具体例として、米国のミズーリ州のセントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）にあるシグマ化学株式会社（ＳＩＧＭＡＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）が提供するフイコール（Ｆｉｃｏｌｌ）及びパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配物質がある。非凝集の赤血球から凝集物を単離する他の有用な方法は、非凝集の母の赤血球を塩化アンモニウムのようなもので溶解することを特徴とする。赤血球を含んだ溶液を塩化アンモニウムの通常約１：４（Ｖ／Ｖ）比率の０．１−０．２Ｍ水溶液と混合する。非凝集の母の赤血球から凝集した赤血球を単離する本発明の方法は、赤血球と固相境界性の抗体、特に、凝集した赤血球とくっつくものとを反応させ、非境界性の非凝集の赤血球をそこから分離する既知の方法により補足することができる。この方法は、本発明の胎児の赤血球単離に用いてもよい。好ましい抗体は、ポリクロナル（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）、モノクロナル（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）、単鎖（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎ）、Ｆａｂ₂領域フラグメント（Ｆａｂ₂ ｒｅｇｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｓ）又は望ましい特殊性を持つその他の物であればどのようなタイプのものでもよい。抗体は、直接又は典型的な結合基を介在してスライド（ｓｌｉｄｅｓ）、ビーズ、微小粒子、マイクロカプセル、磁性を持ったビーズ等を含む既知固相と境界する。そのような抗体の１つの好ましい特殊性又はリガンド（ｌｉｇａｎｄ）は、トランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）知覚である。トランスフェリン知覚の抗体は、米国のニュージャージー州のピスカタウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）にあるベクトン−ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で入手できる。本発明のその他の特徴は、凝集した胎児の赤血球の核酸の分析方法を提供することである。この方法は、母の血液試料のＮＦＥｓをそこにある他の全ての凝集した細胞から分離すること、そのＮＦＥｓを非凝集の母の赤血球から単離すること及び単離したＮＦＥｓと会合している核酸を分析することを含む。この特徴の好ましい具体例において、実質的に自然のままの膜を持つ凝集した胎児の赤血球の核酸を分析し、その核酸は、自然のままの胎児の染色体又はその染色体のフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）である。実施例１凝集した胎児の赤血球の単離プールしたヘソの緒の索状組織血液５０ｍｌを白血球除去フイルター（ニューヨーク州のグレンコーベにあるポール（Ｐａｌｌ）バイオメディカル（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）プロダクト（Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）株式会社（Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製、ＲＣ５０）で濾過した。６０ｍｌのシリンジバレルを短いチューブでフイルターにつなぎ、ＲＣ５０フイルターにその血液を通した。赤血球（２６ｍｌ）を含む収集部分は、ピービーエス（ＰＢＳ）で５倍に希釈し、ヒストパック（ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）１．０７７勾配（米国のミズーリ州のセントルイスにあるシグマ社製）の上に置いた。その勾配を３００ｇで４０分間遠心し、界面にある細胞を除去し、ピービーエスで一度洗浄し、遠心してペレットを作った。ペレットを一緒にしてピービーエスに再びけん濁し、細胞遠心分離器を用いて遠心し細胞をスライドに置いた。そのスライドをエタノール／メタノール（３：１）中に２分間固定し、ギムサ（Ｇｉｍｓａ）ステインで色づけし、顕微鏡下で観察した。視覚化のため凝集した赤血球に印をつけ数を数えた。視覚された凝集した細胞は、凝集した赤血球のみであった。数えた数からほぼ５０００の凝集した赤血球が回収されていることがわかった。

Claims

【特許請求の範囲】１．母の血液試料のＮＦＥｓを他の全ての凝集した細胞から分離すること及び非凝集の母の赤血球から該ＮＦＥｓを単離することを特徴とする母の血液から凝集した胎児の赤血球を単離する方法。２．前記血液試料は、末梢の母の血液である請求項１の方法。３．前記試料は、約５−５０ｍｌの母の血液であることを特徴とする請求項１の方法。４．前記ＮＦＥｓを除く全ての凝集した細胞を保持する装置に前記血液を通過させること及び該装置を通過した前記赤血球を収集することを特徴とする前記母の血液試料の前記赤血球を他の凝集した細胞から分離する請求項１の方法。５．前記装置は、白血球減少装置である請求項４の方法。６．細孔勾配物質を通した遠心分離を特徴とする非凝集の母の赤血球から前記ＮＦＥｓを単離する請求項１の方法。７．前記非凝集の赤血球を溶解することを特徴とする非凝集の母の赤血球から前記ＮＦＥｓを単離する請求項１の方法。８．前記非凝集の母の赤血球を、塩化アンモニウムで溶解する請求項７の方法。９．前記赤血球を固相境界性の抗体、特に、前記凝集した赤血球とくっつくものとを反応させること及び非境界性の前記非凝集の赤血球を前記凝集した赤血球と分離することを特徴とする非凝集の母の赤血球から前記ＮＦＥｓを単離する請求項７の方法。 10．母の血液試料の赤血球を他の全ての凝集した細胞から分離すること、非凝集の母の赤血球からＮＦＥｓを単離すること及び単離した該ＮＦＥｓと会合している核酸を分析することを特徴とする凝集した胎児の赤血球の生重合体を分析する方法。 11．自然のままの膜を持つＮＦＥｓの前記核酸を分析する請求項１０の方法。 12．前記試料は、末梢の母の血液試料である請求項１０の方法。 13．前記ＮＦＥｓを除く全ての細胞を保持する装置に前記全血液を通過させること及び該装置を通過した前記赤血球を収集することを特徴とする前記母の血液試料の前記赤血球を他の凝集した細胞から分離する請求項１０の方法。 14．前記装置は、白血球減少装置である請求項１２の方法。 15．細孔勾配物質を通した遠心分離を特徴とする非凝集の母の赤血球から前記ＮＦＥｓを単離する請求項１０の方法。 16．単離した前記ＮＦＥｓの濃度を濃くすることを特徴とする請求項１０の方法。