CN104641228B - 色谱柱中或与其相关的改进 - Google Patents

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Abstract

一种含有填充颗粒的床的色谱柱(2)，其中这些填充颗粒包含熔融核(22，24，26，28，30)颗粒并且这些填充颗粒的粒径沿着该柱变化。优选地，这些颗粒(22，24，26，28，30)是根据它们的平均粒径安排的，按从入口端(4)至出口端(6)渐增的平均粒径的顺序。该床可以包含多个床区段，并且每个床区段具有从在那个区段中的颗粒计算出的平均粒径，并且存在至少两个不同平均粒径的床区段，其中每个床的颗粒通过隔离物与相邻床的颗粒分开，该隔离物是液体可渗透的以允许通过流动相的流。可以用较低的每单位柱长度的压降提供高柱效率。

Description

色谱柱中或与其相关的改进
发明领域
本发明涉及液相色谱法的领域。
发明背景
液相(LC)色谱柱已经得到广泛地发展并且常规地用于分析型和制备型色谱法两者中。在液相色谱柱中分离包含多种组分的混合物的样品是通过以下方式实现的：将处于液体流动相的样品输送通过固定相，从而导致该样品分离成其多种组分，这是由于每种组分在流动相与固定相之间的不同分配(即，这些组分具有不同的分配系数)。在液相色谱法中，固定相典型地处于在柱(通常管状柱)内填充的颗粒床的形式。本发明涉及此种所谓的填充柱，其中该柱介质包含填充颗粒。
二氧化硅颗粒通常用作固定相床，尽管可以使用其他材料。无孔材料具有低样品容量。因此，通常使用多孔颗粒，其含有孔网络以增加固定相的表面积并且因此改进分离容量。较大的多孔颗粒倾向于具有对于样品的更长传质距离，这导致与用较小的多孔颗粒相比更慢的分离和更宽的保留时间峰。因此，减小多孔颗粒的尺寸以便改进分离的动力学和分辨率已成为趋势。这对于分离大生物分子(如例如蛋白质)是重要的。然而，使用较小多孔颗粒的结果是增加的流动阻力并且因此需要更高的操作压力来递送所需求的流动。更高的压力增加了仪器装备的成本和复杂性。
对于上述全多孔型颗粒(其中这些孔延伸穿过整个颗粒的本体)的一种替代方案已经使用所谓的熔融核颗粒，这些熔融核颗粒有时也被称为表面多孔型颗粒。这些是具有无孔核(也被称为熔融或实心核)的颗粒并且仅在包围该核的外部层或区域(也被称为壳)中是多孔的，即，它们仅在表面处是多孔的，而不是遍及这些颗粒的本体。这些颗粒具有小多孔颗粒的一些优点，例如由外部多孔壳提供的短传质距离以及因此高色谱效率，但由于该实心核使得能够使用较低的操作压力，总体粒径更大。由于更有效地分类更大、更重的颗粒的能力，熔融核颗粒还提供了具有比多孔颗粒更窄的粒径分布的可能性。
尽管使用熔融核颗粒已改进了可以用较低压力递送的柱效率，然而仍存在需要来在保持良好的柱效率的同时再进一步减少操作压力。
针对此背景，做出了本发明。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了一种含有填充颗粒的床的色谱柱，其中这些填充颗粒包含熔融核颗粒并且这些填充颗粒的粒径沿着该柱变化。
根据本发明的另一个方面，提供了一种色谱方法，该方法包括使含有待分离的样品的流动相流动通过含有填充颗粒的床的色谱柱，其中这些填充颗粒包含熔融核颗粒并且这些填充颗粒的粒径沿着该柱变化。
优选地，该床的颗粒是根据它们的粒径安排在该柱中，如以下进一步详细描述的，最优选按从入口端至出口端渐增的粒径的顺序。该颗粒的床可以包含如以下进一步详细描述的多个床区段。在此种实施例中，优选地至少一个床区段、更优选地每个床区段具有与其他一个或多个床区段不同的平均粒径(从在那个区段中的颗粒计算出的)。具有不同粒径的床区段是优选按从该柱的入口至出口渐增的粒径的顺序安排的。较小颗粒具有比较大颗粒更大的每单位体积的表面积，这样使得将样品装载到在该柱的入口端处的较小颗粒上需要更低的柱体积并且因此减小样品塞尺寸。然后在该柱中的其余颗粒作用在这个小样品塞上并且维持柱效率。相反地，如果使用随机粒径混合物，那么将样品装载到这些颗粒上将需要更大的柱体积并且因此样品塞尺寸将更大。然后在该柱中的其余颗粒将作用在这个更宽的样品塞上。
根据本发明的又另一个方面，提供了一种色谱柱，该柱含有填充颗粒的床，这些填充颗粒包含熔融核颗粒，其中该床包含多个床区段，并且每个床区段具有从在那个区段中的颗粒计算出的平均粒径，并且存在至少两个不同平均粒径的床区段，其中每个床的颗粒通过隔离物与相邻床的颗粒分开，该隔离物是液体可渗透的以允许通过流动相的流。该隔离物实质上防止来自一个区段的颗粒与相邻区段的颗粒混合。优选地，每个床区段具有与其他一个或多个区段不同的平均粒径。
优选地，这些床区段是根据它们的平均粒径安排的，最优选地按从入口端至出口端渐增的平均粒径的顺序。因此，最优选地，具有最小粒径的床区段被安排在入口端并且具有最大粒径的床区段被安排在出口端，任何另外的床区段优选按从入口至出口渐增的粒径的顺序被安排在中间。
在本发明的某些优选实施例中，该多个床区段被安排在该柱的多个单独的隔室中，即，每个床区段安排在该柱的一个单独的隔室中。在一个优选的实施例中，该柱包含可串联地连接在一起的多个子柱。当被连接在一起时，该系列子柱(相对短)提供该柱(相对长)。因此这些床区段可以各自被提供在一个对应的子柱中。螺纹配件、以及推入式配件是典型地在这些子柱之间的连接方式。使用子柱组件构型，与其他一个或多个床区段分开地并且独立于其他一个或多个床区段，这些床区段可以各自用所希望直径的填充颗粒来制备。这些床区段可以随后通过串联连接这些子柱而进行串联连接。这些子柱可以具有相同的长度，或者一个或多个子柱可以具有与其他一个或多个柱不同的长度。
这些床区段(以及因此含有这些床区段的隔室、或子柱)沿着该柱的长度串联地定位，即这样使得流动相流动通过一个第一床区段，然后通过一个第二床区段并且然后任选地通过任何另外的一个或多个床区段。这些床区段是自含式的，这样使得一个床区段的颗粒不能与相邻床区段的颗粒混合，从而将这些床区段分开。一种物理限制(隔离物)用于保持相邻的床区段分开并且改进该柱床的稳定性。使用液体-多孔隔离物或屏障作为在相邻的床区段之间的隔离物是一种用于确保这些床区段的自含性的手段(即，允许液体通过但不允许填充颗粒通过的隔离物)。滤芯(frit)(即，多孔滤芯)是用于此目的的一种合适的隔离物，如钢滤芯。其他隔离物可以是多孔网、或多孔单块、或多孔过滤器。
床区段(以及因此含有这些床区段的隔室、或子柱)的数目可以是2或更大的任何合适数目，优选3或更大。例如，可以使用2、3、4、5、6、7、8、9或10个床区段。然而，本发明不限于此类具体实施例并且可以使用更高数目的隔室。这些床区段可以具有相等或不等的长度。在一些实施例中，这些床区段中的至少一些具有彼此不同的长度。
每个隔室可以作为单个柱的一个单独的分隔区段被提供，即，每个床区段可以被提供在单个柱的一个单独的分隔区段中。优选地，然而，每个隔室作为一个单独的柱部分(子柱)被提供，即，每个床区段被提供在一个单独的柱部分(子柱)中，并且这些柱部分(子柱)串联地连接在一起。每个柱部分(子柱)可以优选通过螺纹配合、或通过推入配合连接到相邻的部分(子柱)。
在此术语熔融核颗粒是指一种表面多孔型颗粒，其中一个实质上无孔的核被一个多孔的外部区域或壳包围。
优选地，这些填充颗粒以沿着该柱的粒径梯度进行安排。特别地，优选具有一个粒径梯度，其中这些粒径从该柱的入口端到该柱的出口端增加。
这些粒径可以沿着该柱以平滑梯度或阶跃梯度变化。平滑梯度可以是沿着该柱的一个恒定梯度(即，同一梯度)、或沿着该柱的非恒定梯度(即，具有不同的梯度)。该粒径梯度最优选从该入口端至该出口端是正的(即，粒径渐增)。分阶梯度可以包含沿着该柱的粒径上的任何数目n的阶跃变化，其中n是一或更大的整数值。因此，可以看到最简单的实施例是具有沿着该柱的粒径上的一个阶跃变化，具有例如：一个第一级别的颗粒具有位于最靠近该柱的入口端的小直径，并且一个第二级别的颗粒具有位于最靠近该柱的出口端的大直径。在此背景下，术语小和大是指这些颗粒相对于彼此的直径。
随着沿着该柱的长度的距离而变化的粒径是指该颗粒的总(即外部)直径。它是指在沿着该柱的给定距离处包含在穿过该柱的横截面中的粒径的平均值。
在一些实施例中，除了这些熔融核颗粒之外，一定比例的填充颗粒可以包含全多孔型颗粒。在此类实施例中，为全多孔型颗粒的填充颗粒的比例优选是少数的比例。希望地，当存在时，此类全多孔型颗粒被填充在该柱的入口端，例如比该第一或最小熔融核颗粒更靠近该入口。此外，这些全多孔型颗粒希望地具有小直径，典型地具有这些填充颗粒的最小粒径。然而，优选地这些填充颗粒基本上包含熔融核颗粒、或最优选完全由其组成。
这些熔融核颗粒的外部多孔层厚度优选应该是该固体核直径的至少5％但更优选至少10％。例如，如果该核是直径1μm，那么该多孔层的厚度应该理想地是至少0.1μm(即，10％)，并且如果该核是直径3μm，那么该多孔层的厚度应该理想地是至少0.3μm。该外部多孔层厚度应该优选是不大于2μm。该外部多孔层厚度典型地在0.2μm至2μm的范围内，例如在0.2μm至1μm的范围内。
具有有益用途的是如下熔融核颗粒，其中该外部多孔层的厚度对于所有颗粒是相似的或基本上相同的。因此，在此类实施例中，虽然这些熔融核颗粒的粒径随着沿着该柱的距离变化，但这些颗粒的多孔外层的厚度优选基本上不随着沿着该柱的距离变化。反而，在此类实施例中，这些熔融核颗粒的无孔核的直径随着沿着该柱的距离变化以从而改变总直径。因此，在具有包含多个床区段的床的实施例中，在所有床区段中的所有颗粒具有它们的外部多孔层的类似或基本上相同的厚度。这些颗粒的外部多孔层的沿着该柱长度的基本上恒定的厚度对于所有填充颗粒维持均匀的传质距离。这维持了该柱中的色谱效率和分辨率。然而，一些实施例是可能的，其中沿着从入口至出口的柱长度(即，随着该样品前进穿过该柱)，该外部多孔层的厚度可以减少。
优选地，这些填充颗粒的粒径随着沿着该柱的距离变化，这样使得较小颗粒被填充在该柱的入口端并且较大的颗粒被填充在该出口端。在该入口端处使用较小直径的颗粒意味着在该柱的装载样品的部分处存在最大的每单位体积的表面积，这维持了该柱的可装载性。在该出口端处使用较大直径的颗粒意味着与仅具有遍及整个柱的小颗粒的柱相比，可以减小该流的压力。
本发明提供以下优点：可以用较低的每单位柱长度的压降提供高柱效率。操作压力上的这种减小具有在减少的仪器装备成本方面的益处。此外，更长的柱可以用于给予更高的色谱效率，而没有需要施加到该流上的过大压力。该柱的可装载性通过提供在该柱的入口端处的最小颗粒来维持。优选地在该出口端处的较大颗粒用于减小压降。
该柱的床、或其任何一个或多个床区段除了这些熔融核颗粒之外还可以包含一定量的无孔颗粒，这可以减少样品的分散(当它穿过该柱时)并且改进峰锐度。典型地，此种无孔颗粒的量相对于熔融核颗粒的量是少数量。
合适的熔融核颗粒是以商业量可获得的并且已知用于它们的制造的方法。例如，熔融核颗粒在来自安捷伦公司(Agilent)的PoroshellTM柱和来自赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)的AccucoreTM柱中的高效液相色谱(HPLC)柱中是可商购的。
在US 3,505,785中描述的一种已知程序中，经由在充当固体核的无孔二氧化硅微球的表面上的二氧化硅胶体的多层涂层来制备熔融核二氧化硅颗粒。在那种方法中描述了在两层与三十层之间的胶体颗粒。另一种制备熔融核二氧化硅的方法是凝聚法，描述于J.J.Kirkland、F.A.Truszkowski、和C.H.Dilks Jr,G.S.Engel，色谱法杂志A(Journal ofChromatography A)，890(2000)3–13中，其中固体(即，无孔)二氧化硅微球通过一种聚合物和二氧化硅溶胶的凝聚物来涂覆，其中该聚合物通过在高温下加热基本上被去除。
前述技术使用在二氧化硅微颗粒的表面上的二氧化硅纳米颗粒作为形成熔融核颗粒的基础。US 2010/0051877 A中描述的另一种方法涉及二氧化硅微颗粒的表面的假形貌转换。在该方法过程中，该核颗粒的外层溶解并且再析出以形成在该表面上的多孔层。
另一种用于形成熔融核颗粒的技术描述于申请人的在2011年12月1日提交的专利申请号GB 1120665.3中(球上球颗粒)。
描述形成熔融核颗粒的以上参考文献的内容特此以它们的全部内容结合在本申请中。
根据用于形成熔融核颗粒的不同现有方法，这些熔融核颗粒可以具有许多不同形貌之一。例如，一个熔融核可以被小得多的颗粒的一个或多个层包围，较小颗粒的该一个或多个层形成该多孔外部层(所谓的球上球颗粒)。例如，该无孔核可用是一种微颗粒(直径1μm至100μm，特别地1μm至10μm)并且较小的颗粒可以是纳米颗粒(1nm至1000nm)。在其他实施例中，这些熔融核颗粒可以包含无孔核，该无孔核具有为多孔的改性外部区域。
这些熔融核颗粒的直径在它们的总(外部)尺寸上可以在从例如约1μm直径至约100μm直径，优选从1μm至10μm的范围内。这些颗粒在它们的外部尺寸上沿该柱的变化范围可以是例如，在该入口端具有在从约1-3μm(尤其1-2μm)直径的范围内的颗粒至在该出口端具有在5-10μm范围内的颗粒。许多用于测量粒径和大小的方法对于熟练技术人员是已知的，例如电区感测(electrozone sensing)、或动态光散射、或盘式离心、或图像分析、或电子显微镜。在此限定的粒径是指如由电区感测测量的尺寸。优选地，最大粒径(例如，在该出口处)与最小粒径(例如，在该入口处)的比率在从20:1至2:1的范围内、更优选在从10:1至2:1的范围内。该多孔外部层厚度优选不大于2μm，典型地不大于1μm，例如10nm至1000nm(1μm)。
在该入口端处的颗粒的表面积优选在从大于50m2/g、更优选大于100m2/g的范围内。在该出口端处的颗粒的表面积优选在从小于10m2/g的范围内。
根据本发明的色谱柱用于液相色谱法并且可以适合于分析型或制备型色谱法。它可以适合例如作为HPLC柱(在此该术语在其范围内包括超HPLC(UHPLC)柱)。然而，该柱不限于此类用途，而还可以用于希望维持柱效率但减小操作压力的任何设置中。
附图说明
图1示出了填充有根据本发明的熔融核颗粒的床的一种色谱柱的示意安排。
图2示意性地示出了具有一个外部多孔层和实心核的熔融核颗粒的结构。
图3示意性地示出了图1实施例的粒径梯度。
图4示意性地示出了可以用于本发明中的各种其他示例性粒径梯度。
图5示意性地示出了用于容纳多个具有不同粒径的柱床区段的根据本发明的拆卸后的UHPLC柱的分解图。
图6示意性地示出了呈组装后状态的图5的柱的纵向截面。
图7示意性地示出了根据本发明的一个实施例，该实施例包括容纳在四个子柱中的四个柱床区段。
图8示出了根据本发明的一个另外的实施例。
本发明实施例的描述
为了能够进一步理解本发明，但在不限制其范围的情况下，现在参考附图描述本发明的不同示例性实施例。
参见图1，示出了填充有根据本发明的颗粒的床的一种色谱柱(2)的示意安排。该图示出了该柱的截面侧视图，即，沿着该柱的长度纵向地取的截面。该柱包含一个通常由金属如例如不锈钢制成的管(8)。该柱具有在横向截面上(与长度正交的，即在通过线A-A或B-B的截面上)的圆形截面。该柱具有长度l、外部管直径w1、和内部管直径w2，如所示出的。该柱可以是由钢制成的并且具有圆形截面的HPLC柱。然而，应理解的是，取决于色谱应用可以使用所示出的实例之外的柱形状、几何结构和材料。
该柱具有一个入口端(4)和一个出口端(6)。在使用中，使一种含有有待分离为多种组分的样品的液体流动相从该入口端至该出口端流动通过该填充柱。该入口端插塞有一个多孔滤芯(10)，用于将这些填充颗粒保持在该柱中但允许液体流通过到该柱内。该出口端也插塞有一个多孔滤芯(12)，同样地用于将这些填充颗粒保持在该柱中但允许液体通过流出到例如检测器。
在已知的HPLC系统中，由于在该柱中填充小颗粒以便实现高柱效率，即，高色谱分辨率，在高压泵送下迫使一种流动相通过色谱柱。图1中示出的柱填充有根据本发明的颗粒以减小该柱中的压力而不损害柱效率。该柱填充有具有粒径梯度的熔融核颗粒，即，按渐增的粒径排列的颗粒。这些颗粒是二氧化硅颗粒(典型地是这种情况)，但在替代性实施例中可以由其他材料制成。如图2中所示，这些熔融核颗粒全都具有类似的外部多孔层厚度dl、以及从而具有类似的传质距离，但它们的熔融核直径(以及因此它们的总直径dp)不同。这些较小颗粒被填充在该柱的入口端以确保在该柱的引入样品的入口处的最大的每单位体积的表面积，从而维持有效的柱可装载性。在下游填充的较大颗粒用于减少迫使该流动相流动通过该柱需要的压力。因此，随着该样品从该入口朝向该出口行进穿过该柱床，这些填充熔融核颗粒的粒径增加。因此该柱床可以被认为包含多个床区段，这些床区段包含不同尺寸的颗粒。
在所示出的实施例中，在该入口端处，一定量的最小熔融核颗粒(22)被安排成抵靠入口滤芯(10)，并且与这些最小颗粒相邻填充的是一定量的稍大熔融核颗粒(24)。然而，这些稍大颗粒(24)具有与这些最小颗粒(22)相同的外部多孔层厚度。下一尺寸的熔融核颗粒(26)再大于这些颗粒(24)，并且一定量的它们抵靠这些颗粒(24)填充。大于这些颗粒(26)的一定量的甚至更大的熔融核颗粒(28)抵靠这些颗粒(26)填充。在该出口端，抵靠这些颗粒(28)填充一定量的最大尺寸的颗粒(30)，这些颗粒被安排为抵靠出口滤芯(12)。因此，在这个实施例中，按渐增的直径从该入口安排了五个不同级别的粒径(22)、(24)、(26)、(28)和(30)。在其他实施例中，可以存在少于或多于五个不同级别的粒径。然而，优选的是具有至少一个在该入口处的最小尺寸与在该出口处的最大尺寸之间的粒径。在一个示例性实施例中，这些颗粒级别(22)、(24)、(26)、(28)和(30)的粒径直径如下。级别(22)具有1.9μm的平均粒径，级别(24)具有2.7μm的平均粒径，级别(26)具有3.0μm的平均粒径，级别(28)具有5.0μm的平均粒径，并且级别(30)具有8.0μm的平均粒径。所示出的柱适合于HPLC，更确切地说UHPLC。
对在图1中示出的实施例的一种任选变体中，除了熔融核颗粒之外，还可以使用一定量的全多孔型颗粒。优选地，这些全多孔型颗粒具有这些熔融颗粒的最小直径或仍更小，并且被安排在该入口端。更优选地，这些全多孔型颗粒是当该流动相进入该柱时其首先遇到的颗粒。
参见图3，示意性地示出了图1柱实施例的粒径梯度，即示出了该柱的横向截面的平均粒径dp(随其沿着该柱的长度l变化时)。在从一个级别的粒径转变到另一个时看到粒径上的阶跃变化，图4示意性地示出了可以使用的各种其他示例性粒径梯度。图A示意性地代表一个具有恒定的粒径梯度的实施例，图B示意性地代表一个具有非恒定粒径梯度(即，具有梯度上的变化)的实施例，并且图C示意性地代表一个具有在两个级别粒径的最简单情况下的阶跃变化的实施例。
该柱床的稳定性可以通过使用用于保持具有不同粒径的这些柱床区段分开的物理手段来改进。参见图5，示出了用于容纳具有不同粒径的多个(在这种情况下两个)床区段的拆卸后的UHPLC柱(50)的分解图。参见图6，示出了呈组装后状态的柱(50)的纵向截面。柱(50)包含一个第一子柱(52)，该第一子柱在使用时在其中包含一个第一床区段(51)，该第一床区段包含总体上全都具有小粒径(相对于在下文描述的一个第二床区段中的颗粒)的熔融核颗粒。柱(50)还包含一个第二子柱(54)，该第二子柱在使用时在其中包含一个第二床区段(53)，该第二床区段包含总体上全都具有大粒径(相对于在该第一床区段中的级别)的熔融核颗粒。在这两个子柱中的熔融核颗粒具有基本上相同的外部多孔层厚度。该第一子柱被组装在该柱的入口侧并且该第二子柱被组装在该出口侧。第一和第二子柱(52)和(54)各自作为一个具有2.1mm×25mm柱(直径×长度)的1/4英寸配件被提供。
柱(50)是按以下顺序组装的。第一子柱件(52)在其入口端处带有一个阳(外)螺纹(56)。该第一子柱(以及因此整个柱)的入口端被一个液体多孔入口滤芯(58)封闭，该入口滤芯装配到一个标准UHPLC(1/4英寸)端部配件(60)内部。滤芯(58)是一种不锈钢有圈(collared)滤芯。该第一子柱件的阳螺纹(56)拧入在端部配件(60)内的一个阴(内)螺纹(62)直到入口滤芯(58)在第一子柱(52)与端部配件(60)之间是紧密的。端部配件(60)经由它的另一端(64)连接到管道系统(未示出)，该管道系统在使用中将泵送的流动相供应运输到该柱内。
第一子柱(52)的另一端带有另一个阳螺纹(66)，该阳螺纹拧入在第二子柱(54)的一端的一个阴螺纹(76)中。从而，该第一和第二子柱可以连接在一起。将这两个子柱的填充颗粒床保持分开并且因此通过一个液体多孔滤芯(78)为该柱床提供稳定性，该滤芯装配在这两个子柱之间并且因此在这两个床区段(51)、(53)之间。滤芯(78)是一种0.5微米的PEEK有圈滤芯。该第一子柱件的阳螺纹(66)拧入在第二子柱内的阴螺纹(76)中直到滤芯(78)在第一与第二子柱(52)之间是紧密的。
第二子柱(54)的另一个出口端带有一个阳螺纹(86)。该出口端被一个液体多孔出口滤芯(88)封闭，该滤芯装配到一个标准UHPLC端部配件(1/4英寸)(90)内部。滤芯(88)是一种不锈钢有圈滤芯，与入口滤芯(58)相同。该第二子柱件的阳螺纹(86)拧入在端部配件(90)内的一个阴(内)螺纹(72)中直到出口滤芯(88)在第二子柱(54)与端部配件(90)之间是紧密的。端部配件(90)经由它的另一端(94)连接到管道系统(未示出)，该管道系统将洗出液从该柱运输到一个检测系统(未示出)。
这个实施例可以被认为通过一个低死体积系统(含有一个滤芯的阳/阴配件)将这些子柱(52)、(54)连接在一起。它使得分别具有较小和较大尺寸的熔融核颗粒(具有相同的外部多孔层厚度)的两个床(51)和(53)能够方便地制备并且被安排在它们自己对应的子柱(52)和(54)内，其中这些床的物理分离是通过一个处于滤芯(78)形式的多孔屏障提供的。从而提供了具备粒径梯度的稳定的床。
在其他实施例中，可以存在多于如所示的两个子柱，例如，在图7中。在这个实施例中，一个子柱(52)按图6中示出的方式被提供，如前所述连接到端部配件(60)并且在其另一端连接到第二子柱(54)(相同的零件由相同的参考号表示)。然而，在图6实施例中第二子柱(54)在其另一端连接到另一个端部配件(90)，而在图7实施例中第二子柱(54)连接到一个第三子柱(55)，该第三子柱具有与第二子柱(54)相同的构造。也就是说，第二子柱(54)的阳螺纹连接到第三子柱(55)的阴螺纹。进而第三子柱(55)连接到一个第四子柱(57)，该第四子柱也具有与第二子柱(54)和第三子柱(55)相同的构造。也就是说，第三子柱(55)的阳螺纹连接到第四子柱(57)的阴螺纹。最后，第四子柱(57)连接到端部配件(90)，即，第四子柱(57)的阳螺纹连接到端部配件(90)的阴螺纹。在其他实施例中，可以使用多于四个子柱。
使用如图7中所示的四个子柱使得能够使用四个不同尺寸的床区段。第一子柱(52)在使用中包含一个第一床区段A，该第一床区段包含总体上全都具有最小粒径(相对于其他床区段)的熔融核颗粒。第二子柱(54)在使用中包含一个第二床区段B，该第二床区段包含总体上全都具有更大粒径(相对于在该第一床区段A中的粒径级别)的熔融核颗粒。第三子柱(55)在使用中包含一个第三床区段C，该第三床区段再次包含总体上全都具有再更大粒径(相对于在该第二床区段B中的粒径级别更大)的熔融核颗粒。最后，第四子柱(57)在使用中包含一个第四床区段D，该第四床区段再一次包含总体上全都具有最大粒径(大于在该第三床区段C中的粒径级别)的熔融核颗粒。换句话说，A<B<C<D的平均粒径dp。虽然在这些不同床区段中的熔融核颗粒在它们的外粒径dp上是不同的，在所有四个子柱中的熔融核颗粒具有基本上相同的外部多孔层厚度(dl)，即A～B～C～D的dl。如之前所述，这些子柱(以及因此它们包含的床区段)通过在每个螺纹配件内部的滤芯与每个相邻子柱(床区段)分隔开。如之前所述第一子柱(52)和第二子柱(54)通过滤芯(78)分隔开，第二和第三子柱通过一个滤芯(108)分隔开并且第三和第四子柱通过一个滤芯(118)分隔开。用这些滤芯进行分隔为多区段式床安排提供了稳定性。
作为图5至7中示出的模块化、子柱构造的替代方案，在其他实施例中，单个柱120可以填充有多个尺寸级别的颗粒，其中具有隔离物，如位于相邻粒径级别之间的滤芯125，如图8中所示，其中A、B、C、D和E表示不同尺寸级别的熔融核颗粒的床，所有熔融核颗粒具有大致相同的外部多孔层厚度(即，A～B～C～D～E的dl)，其中A<B<C<D<E的粒径dp，并且流动相在由箭头所示的方向上流动。
以下表1示出了均匀尺寸床的数据，表示对于100mm长度的柱，柱的床介质的粒径dp(μm)如何影响HPLC压降(ΔP，巴)和对应的柱效率(理论塔板数，N)。表1示出了减小粒径增加柱效率(更高的N)但要求大大增加的压力。例如，使用8μm颗粒时，用50巴的压降实现具有5000的N值的色谱分离，而使用1.9μm颗粒时，但用高得多的520巴的压降实现22000的N值的分离(需要更高的外加压力)。本发明寻求解决要求此类较高压力的问题。对于表1和表2中涉及的颗粒，对于具有1.2μm直径核的1.9μm颗粒，该多孔层厚度是0.35μm(即，0.35+1.2+0.35＝1.9μm)。对于8μm颗粒以及所有其他的颗粒，该多孔层是0.5μm，例如(0.5+7.0+0.5)＝8μm等等。
表2示出了给出对于一个100mm(即，10cm)长度柱的压降(ΔP)和就塔板数(N)而言的柱效率的数据，对于数种不同情况，其中该10cm柱长度是由具有不同粒径特性曲线的多个颗粒床组成的。该表的第二至第六列表明由以下各种不同的粒径级别组成的10cm柱长度的厘米(cm)数：1.9μm、2.7μm、3μm、5μm和8μm。因此，该表的这些行代表填充有来自这五个级别的粒径的不同颗粒组合的不同柱。在使用多个尺寸级别时，这些级别按上升的尺寸顺序安排在该柱中，即最小尺寸级别放置在该入口处。该表的第七和第八列分别给出了对于每个不同的柱组成的压降(ΔP)和理论塔板数(N)。该表的第九和第十列分别表明了对于每种组成的压降(ΔP)和塔板数(N)作为相对于仅包含最小颗粒(1.9μm)的柱(其中该柱的所有10cm包含这些1.9μm的颗粒)的值的％变化。最后一列表明N上的相对％变化与ΔP上的相对％变化的％比率，％N/％ΔP。
从表2可以看出，与仅包含这些最小1.9μm颗粒的柱的情况相比，在该入口处具有少量的最小(1.9μm)颗粒和在该柱中的进一步下游填充的较大颗粒(按从入口至出口的多个粒径的梯度安排的)的柱仍可以实现高N值但具有跨过该柱的小得多的压降(因此要求较少的外加压力)。例如，与纯1.9μm 10cm柱相比，在该入口处具有2cm柱长度的1.9μm颗粒、随后是2cm柱长度的每种其他尺寸的颗粒的柱对于仅46％的压降(ΔP)产生80％的柱效率N，从而给出173％的％N/％ΔP比率。
表1
表2
如在此所使用的，包括在权利要求书中，除非上下文另有指示，这里的术语的单数形式被解释为包括复数形式，并且反之亦然。例如，除非上下文另外说明，单数引用如“一个(a)”或“一个(an)”表示“一个或多个”。
贯穿本说明书的说明书和权利要求书，词语“包括”、“包含”、“具有”和“含有”以及这些词的变形，例如“包括着”和“包括了”等，意味着“包括但不限于”，并且并非旨在(并且并不)排除其他成分。
应理解的是，可以在仍然落入本发明的范畴时对本发明的前述实施例进行变化。除非另有陈述，否则本说明书中披露的各个特点可以由具有相同、等效或相似作用的替代特征取代。因此，除非另外陈述，所披露的每个特征仅是一系列的等效或相似的属类特征的一个实例。
使用在此提供的任何一个和全部实例、或示例性语言(“例如(for instance)”、“如(such as)”、“举例而言(for example)”、“例如(e.g.)”以及相似语言)，仅旨在更好地说明本发明并且不指示对本发明的范围进行限制，除非另外要求。本说明书中的任何语言都不应当被理解为是在指示：任何未提出权利要求的元件是对本发明的实现至关重要的。
本说明书中所披露的任何步骤都可以任何顺序进行或者同时进行，除非另外陈述或上下文另外要求。
所有在本说明书中所披露的特征可以任何组合方式进行组合，这类特征和/或步骤中至少一些相互排斥的组合除外。具体而言，本发明的优选特征适用于本发明的所有方面并且可以以任何组合方式使用。同样，非本质的组合形式中描述的特征可以单独使用(不进行组合)。

Claims (22)

1.一种含有填充颗粒的床的色谱柱，其中这些填充颗粒包含熔融核颗粒并且该色谱柱的入口端插塞有一个多孔滤芯，用于将这些填充颗粒保持在该柱中但允许液体通过流出，该床的这些颗粒根据它们的粒径被安排在该柱中，按从该柱的入口端至出口端粒径渐增的顺序。
2.如权利要求1所述的色谱柱，其中这些熔融核颗粒的外部多孔层的厚度对于所有颗粒是基本上相同的。
3.如权利要求1或2所述的色谱柱，其中该颗粒的床包含多个床区段并且至少一个床区段具有与其他一个或多个床区段不同的、从在那个床区段中的颗粒计算出的平均粒径。
4.如权利要求3所述的色谱柱，其中该多个床区段被安排在该柱的多个分开的隔室中。
5.如权利要求3所述的色谱柱，其中该多个床区段是沿着该柱的长度串联地安排的。
6.如权利要求3所述的色谱柱，其中该床区段的数目是从3至10个。
7.如权利要求3所述的色谱柱，其中每个床区段的颗粒通过隔离物与相邻床区段的颗粒分开，该隔离物是液体可渗透的以允许通过流动相的流。
8.如权利要求7所述的色谱柱，其中每个隔离物实质上防止来自一个区段的颗粒与相邻区段的颗粒混合。
9.如权利要求7所述的色谱柱，其中该隔离物是滤芯。
10.如权利要求3所述的色谱柱，其中这些床区段是根据它们的平均粒径按从该柱的入口端至出口端平均粒径渐增的顺序安排的。
11.如权利要求3所述的色谱柱，其中该柱包含可串联地连接在一起的多个子柱。
12.如权利要求11所述的色谱柱，其中这些床区段各自被提供在对应的子柱中。
13.如权利要求11所述的色谱柱，其中这些子柱是通过螺纹配件可连接在一起的。
14.如权利要求13所述的色谱柱，其中隔离物位于在子柱之间的螺纹配件中，该隔离物是液体可渗透的以允许通过流动相的流。
15.如权利要求3所述的色谱柱，其中每个床区段包含不同尺寸级别的颗粒以形成梯度。
16.如权利要求3所述的色谱柱，其中这些床区段具有相等的长度。
17.如权利要求3所述的色谱柱，其中这些床区段中的至少一些具有不同的长度。
18.如权利要求1所述的色谱柱，其中这些填充颗粒是以沿着该柱的粒径梯度安排的，该粒径梯度从该柱的入口端至该柱的出口端增加，并且这些粒径根据平滑的梯度沿着该柱变化。
19.如权利要求1所述的色谱柱，其中这些填充颗粒是以沿着该柱的粒径梯度安排的，该粒径梯度从该柱的入口端至该柱的出口端增加，并且这些粒径根据阶跃的梯度沿着该柱变化。
20.如权利要求1所述的色谱柱，其中除了这些熔融核颗粒之外，少数比例的填充颗粒包含全多孔型颗粒。
21.一种色谱方法，包括使含有待分离的样品的流动相流动通过根据以上任何一项权利要求所述的色谱柱。
22.如权利要求21所述的色谱方法，其中该色谱是HPLC。
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