CN101947124A - 一种集成式微流控芯片装置及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种集成式微流控芯片装置及其使用方法，其特征在于：它包括上层的微管道层和下层的微坑阵列层，且所述微管道层紧密连接在所述微坑阵列层上部；所述微管道层下部设置有与所述微坑阵列层相通的微管道，且所述微管道的高度大于流经所述微管道的卵细胞直径；所述微管道层上还设置有与所述微管道连通的管道入口和管道出口；所述微坑阵列层上设置有一个以上用来定位卵细胞的微坑，且所述微坑沿流体流动方向和垂直流体流动方向呈阵列排布。本发明的微流控芯片成本低廉，集成性高，操作方便，在辅助生殖领域和受精及胚胎早期发育机制研究中具有广阔的应用前景。

Description

一种集成式微流控芯片装置及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种微流控芯片装置及其使用方法，特别是关于一种能够集成完成单卵细胞定位、体外受精、快速换液、胚胎培养和胚胎回收的集成式微流控芯片装置及其使用方法。

背景技术

体外受精技术是指运用医学技术和方法使精子和卵母细胞在体外完成受精的过程，它是目前解决人类不孕不育问题的重要临床治疗手段。目前在临床上采用的常规体外受精技术包括精卵细胞的获取与筛选、受精、换液及胚胎培养等步骤。其中，受精和胚胎培养过程均在培养皿中加盖矿物油的液滴中完成，而换液操作则由移液管或其他类似器具完成。受精过程和培养过程通常需要不同种类的培养液，因此在受精完成之后需要用移液管将卵细胞从受精培养液移到胚胎培养液中。虽然目前已有商用的培养液可以同时支持受精和胚胎培养(Complete HTF Medium with SSS^TM，IrvineScientific，Santa Ana，CA)，但是为了去除受精液中残留的精子和细胞碎片，移卵换液的步骤仍无法省略。另外，由于常规方法是在液滴中同时培养多个胚胎，无法在大规模胚胎培养的同时对每个胚胎的发育过程进行跟踪。

微流控芯片在体外受精研究中具有很大潜力。与常规的体外受精技术相比，在微流控芯片上可以灵活设计各种微管道和微结构，很容易实现对卵细胞进行操纵和定位，使受精过程具有很好的可控性；另外，由于微流控芯片具有集成性优势，可以将体外受精过程与胚胎培养集成在一枚芯片上完成。美国伊利诺伊大学在2001年申请了一项与卵细胞定位及体外受精相关的微流控芯片专利(US6193647B1)，在微管道中设计了收缩结构以对管道中卵细胞进行定位，但是这种方法会使卵细胞受到较大的流体剪切力作用而可能对其带来伤害，另外这种方法不适合对多个卵细胞进行同时定位。英国Central Research Laboratories公司在2004年申请了一项专利(WO 2005/023124A2)，将一连串的微坑顺序排布在一条较窄的微管道下方，这样，就可以用微管道将卵细胞依次送入微坑进行定位。虽然这一发明也声称其在卵细胞定位后可以用于后续的体外受精，但是该器件用于体外受精时有以下不足：1)该器件微管道宽度较窄，难以实现快速的精子进样及换液过程；2)该器件没有给出不同深度的微坑对卵细胞定位作用的影响；3)若想在受精完成之后继续进行胚胎培养，需要设法将卵细胞周围的多余精子和细胞碎片进行去除，这是该器件未曾考虑的问题；4)该器件对卵细胞或胚胎进行回收的过程比较复杂且可操作性较差，需要使用流体将细胞从微坑中冲出，或将器件倒置使卵细胞因重力而掉入管道，才能从管道出口处对其进行回收。因此，真正能够同时大规模定位单个卵细胞并可以集成完成受精过程、快速换液过程、胚胎培养过程和便捷的胚胎回收过程的器件还尚未被发明。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够集成完成单卵细胞定位、体外受精、快速换液、胚胎培养和胚胎回收的集成式微流控芯片装置及其使用方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种集成式微流控芯片装置，其特征在于：它包括上层的微管道层和下层的微坑阵列层，且所述微管道层紧密连接在所述微坑阵列层上部；所述微管道层下部设置有与所述微坑阵列层相通的微管道，且所述微管道的高度大于流经所述微管道的卵细胞直径；所述微管道层上还设置有与所述微管道连通的管道入口和管道出口；所述微坑阵列层上设置有一个以上用来定位所述卵细胞的微坑，且所述微坑沿流体流动方向和垂直流体流动方向呈阵列排布。

微坑阵列区域覆盖所述微管道的整个宽度，微坑之间的间距小于微坑的宽度，微坑深度大于卵细胞直径，并且在沿流体流动方向上的每一行所述微坑与其上一行的错位距离小于所述微坑宽度的一半。

所述微坑的形状为方形、圆形或其他形状；所述微坑的宽度约为所述卵细胞直径的2倍左右，且深度大于所述卵细胞直径的1.5倍。

所述微管道层和微坑阵列层采用聚二甲基硅氧烷作为制作材料。

在所述微坑阵列层底部贴设一层反射材料，并在所述微管道层上方增设一干涉仪。

一种上述集成式微流控芯片装置的使用方法，其包括以下步骤：1)单卵细胞定位过程：通过培养液辅助将卵细胞沿微管道层的微管道运送到微坑阵列层的某一个微坑上方，使卵细胞由于重力而落入微坑实现定位；2)体外受精过程：当卵细胞完成定位之后，再将精子加入微管道的管道入口处；3)快速换液过程：在受精完成之后，将新培养液从管道入口通入，替换旧的培养液，并清除微管道的多余精子和细胞碎片，以支持受精卵进行后续的胚胎发育；4)胚胎培养过程：在进行受精过程及胚胎培养过程时，将微流控芯片放入常规二氧化碳培养箱中或其他培养装置中，以提供适宜的培养环境；5)胚胎回收过程：当对微坑中的胚胎行回收时，可以将上层的微管道层向上掀开，使下层的微坑阵列层暴露在外面，并使用移液管直接从微坑中将需要的胚胎吸出。

在上述步骤2)中，受精过程可以采用以下两种方式：1)保持微管道中流体静止，让精子凭自身活力从管道入口游到微坑阵列区域，并进而游入微坑与卵细胞相遇；2)在微管道中产生流体运动，将精子推动到卵细胞所在微坑上方，使其更容易与卵细胞相遇。

在上述步骤3)中，换液过程可以采用以下两种换液方法：1)用移液管在管道入口加入新培养液，使管道入口和管道出口之间形成液面差，从而驱动微管道中的流体运动，以使微管道内的旧培养液被新培养液更换，同时去除微管道中多余的精子和细胞碎片；2)将管道入口通过管道与注射泵或其他进样装置相连，进而通过正压进样将新培养液送入微管道；或者将注射泵或其他进样装置与管道出口相连，而通过负压进样将管道入口中的新培养液送入微管道。

在上述步骤4)的胚胎发育过程中，使微管道中的培养液保持静止，或使其持续流动，或是间歇式流动。

将精子和卵细胞包封在微液滴内完成受精过程：①在完成卵细胞定位并将精子加入到卵细胞周围之后，将微管道中注入空气，排出微管道中的培养液，即可在每一个微坑中形成微液滴，从而将卵细胞和其周围的精子包封在微液滴之中；②为了防止微液滴挥发，再将微管道中通入矿物油或其他油相液体，对微液滴上方进行密封。

将受精卵或某一发育时期的胚胎包封在微液滴内完成胚胎培养过程：①在受精卵或某一发育时期的胚胎定位在微坑中之后，将微管道中注入空气，排出微管道中的培养液，即可在每一个微坑中形成微液滴，从而将受精卵或某一发育时期的胚胎包封在微液滴之中；②为了防止微液滴挥发，再将微管道中通入矿物油或其他油相液体，对微液滴上方进行密封。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明的微坑阵列层上设置有一个以上用来定位卵细胞的微坑，通过培养液辅助将卵细胞沿微管道层的微管道运送到微坑阵列层的某一个微坑上方，使卵细胞由于重力而落入微坑实现定位。由于每一枚卵细胞均被定位到特定的一个微坑之中，因此其在微坑阵列层中所处的位置也是唯一确定的。这样，就可以很容易地追踪每一枚卵细胞的受精和发育的全过程，从而为胚胎发育给出更全面的评价。2、本发明中微坑的具体尺寸可以按照不同物种卵细胞直径的差异而进行设计，以便对不同物种卵细胞进行定位，并能有效防止其被流体冲出或在受精时被精子从微坑中推出，保证了受精过程和换液过程顺利完成，同时换液过程还具有清除微管道和微坑中的多余精子和细胞碎片的作用。3、本发明的微坑结构简单，可以方便地使用常规的微加工工艺进行制作，因此成本更低。4、本发明在进行胚胎回收时，可以将芯片的上层微管道层与下层的微坑阵列层分离，这样就可以直接从微坑中吸取想要的胚胎，操作简单、快捷。5、本发明可与各种光学检测装置集成，对卵细胞从受精到后续的胚胎发育的部分或全部过程进行实时观察或监测。6、本发明还可以采用将精子和卵细胞包封在微液滴内完成受精过程，或是将受精卵或胚胎包封在微液滴内完成胚胎培养过程。由于微坑体积一般在纳升级别，也就使每一个微坑中形成了纳升量级的微液滴，并可以在其中完成体外受精。由于微液滴具有这种微小的体积，因此能够更好地保存受精卵在发育过程中的分泌物，促进其自身发育；另外，由于受精作用被局限在一个只有纳升体积的微小空间内，可以使精子有更大的几率遇到卵细胞并与其结合，有效减小了完成受精所需要的精子数目。综上所述，本发明的微流控芯片成本低廉，集成性高，操作方便，在辅助生殖领域和受精及胚胎早期发育机制研究中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明微流控芯片的一个实施例示意图

图2是本发明微流控芯片的另一个实施例示意图

图3是本发明微流控芯片与干涉仪集成的示意图

图4是本发明中换液过程的一个实施例示意图

图5是本发明中换液过程的另一个实施例示意图

图6是本发明中胚胎回收的一个实施例示意图

图7a～c是本发明中体外受精的一个实施例示意图

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

如图1所示，本发明的微流控芯片包括上层的微管道层1和下层的微坑阵列层2，且微管道层1紧密连接在微坑阵列层2上部。微管道层1下部设置有与微坑阵列层2相通的微管道3，且微管道3的高度大于流经微管道3的卵细胞4直径。微管道层1上还设置有与微管道3连通的管道入口5和管道出口6，管道入口5和管道出口6的结构可以灵活选择，可以是孔，也可以是容池(如图2所示)，或是作为接口与其他管道相连。微坑阵列层2上设置有一个以上用来定位卵细胞4的微坑7，且微坑7沿流体流动方向和垂直流体流动方向呈阵列排布。

上述实施例中，微坑阵列区域覆盖微管道3的整个宽度，并且在沿流体流动方向上的每一行微坑7之间可以错开一定距离进行排布(错位距离小于微坑7宽度的一半)，以便能捕获在微管道3中处于不同位置的卵细胞4。同时，微坑7之间的间距小于微坑7本身的宽度，以使卵细胞4更容易落入微坑7。

上述实施例中，微坑7的形状可以是方形，也可以是圆形或其他形状。微坑7的具体尺寸可以按照不同物种卵细胞直径的差异而进行设计，且其宽度比孵化后的囊胚的直径略大，以便为胚胎发育提供足够的空间。

此外，本发明的微流控芯片装置还可以进一步与干涉仪等光学检测装置集成：当微管道层1与微坑阵列层2均采用透光性好的材料制作时(如聚二甲基硅氧烷等)，可在微坑阵列层2底部贴设一层反射材料8，并在微管道层1上方增设一干涉仪9(如图3所示)。干涉仪9可对卵细胞4进行检测并成像，从而实现对卵细胞4的受精和发育全过程的实时观察。

本发明的微流控芯片装置的使用方法包括以下步骤：

1、单卵细胞定位过程：通过培养液辅助将卵细胞4沿微管道层1的微管道3运送到微坑阵列层2的某一个微坑7上方，使卵细胞4由于重力而落入微坑7实现定位(如图1所示)。由于每一枚卵细胞4均被定位到特定的一个微坑7之中，因此其在微坑阵列层2中所处的位置也是唯一确定的。这样，就可以很容易地追踪每一枚卵细胞4的受精和发育的全过程，从而为胚胎发育给出更全面的评价。

2、体外受精过程：当卵细胞完成定位之后，再将精子10加入微管道3的管道入口5处。受精过程可以采用以下两种方式：

1)保持微管道3中流体静止，让精子10凭自身活力从管道入口5游到微坑阵列区域，并进而游入微坑7与卵细胞4相遇。

2)在微管道3中产生流体运动，将精子10推动到卵细胞4所在微坑7上方，使其更容易与卵细胞4相遇。

3、快速换液过程：在受精完成之后，将新培养液从管道入口5通入，替换旧的培养液，并清除微管道3中的多余精子10和细胞碎片，以支持受精卵进行后续的胚胎发育。换液过程可以采用以下两种换液方法：

1)如图4所示，用移液管12在管道入口5加入新培养液，使管道入口5和管道出口6之间形成液面差，从而驱动微管道3中的流体运动(箭头指示了流动方向)，以使微管道3内的旧培养液被新培养液更换，同时去除微管道3中多余的精子10和细胞碎片。这种方法还可以同时配合用移液管12在管道出口6吸取废液。在换液过程中，微坑7可以有效地保护卵细胞4不被冲走。

2)如图5所示，将管道入口5通过管道与注射泵13相连，进而通过正压进样将新培养液送入微管道3。这种方法还可以将注射泵13与管道出口6相连，而通过负压进样将管道入口5中的新培养液送入微管道3。

此外，根据不同需要，可以采用增加微坑7深度的方法来提高其在高流速下对卵细胞4定位的能力。当微坑7的宽度约为卵细胞直径的2倍左右，且深度大于卵细胞直径的1.5倍时，可以获得较好的定位效果。以直径约为100μm的鼠卵作为实施例，当微坑7设计为宽200μm的正方形，微管道3高度设计为200μm时，对于深度分别为50、100、150和200μm的微坑7，刚好能将鼠卵从微坑7中冲出时对应的微管道3中的平均流速分别为0.128±0.011、0.500±0.035、5.10±0.42和15.4±0.9mm/s(五次重复实验)。也就是说，当微坑7深度大于150μm时，可以以5mm/s以上的流速进行快速换液操作，使得在几秒钟之内即可更换掉芯片内所有的培养液。

4、胚胎培养过程：在进行受精过程及胚胎培养过程时，可以将芯片放入常规二氧化碳培养箱中或其他培养装置中，以提供适宜的培养环境。在胚胎发育过程中，可以使微管道3中的培养液保持静止，也可以使其持续流动，或是间歇式流动。

5、胚胎回收过程：如图6所示，当对微坑7中的胚胎行回收时，可以将上层的微管道层1向上掀开，使下层的微坑阵列层2暴露在外面，这样就能够使用移液管12直接从微坑7中将需要的胚胎吸出。胚胎回收过程可以在囊胚阶段进行，也可以根据需要在胚胎发育的其他较早时期进行。

为了保证微管道层1和微坑阵列层2之间有较好且可逆的贴附性，并在胚胎回收时可以顺利将微管道层1掀起，可以使用聚二甲基硅氧烷作为微管道层1和微坑阵列层2的制作材料，这种材料有很好的粘附性，使微管道层1和微坑阵列层2能够可逆地贴附在一起而不会漏水。同时，还可以将微管道层1和微坑阵列层2之间容易发生漏水的区域(管道入口5和管道出口6)不可逆地键合在一起，而同时保证微管道层1在微坑阵列区域可以掀起。

此外，也可以采用将精子10和卵细胞4包封在微液滴内完成受精过程：如图7a～c所示，在完成卵细胞4定位并将精子10加入到卵细胞4周围之后，将微管道3中注入空气，排出微管道3中的培养液，即可在每一个微坑7中形成微液滴11，从而将卵细胞4和其周围的精子10包封在微液滴11之中。之后，为了防止微液滴11挥发，再将微管道3中通入矿物油或其他油相液体，对微液滴11上方进行密封。这种方法可以同时在微坑阵列层2的所有微坑7中制备微液滴11。由于微坑7体积一般在纳升级别，也就使每一个微坑7中形成了纳升量级的微液滴11，并可以在其中完成体外受精。由于微液滴11具有这种微小的体积，因此能够更好地保存受精卵在发育过程中的分泌物，促进其自身发育；另外，由于受精作用被局限在一个只有纳升体积的微小空间内，可以使精子10有更大的几率遇到卵细胞4并与其结合，有效减小了完成受精所需要的精子10数目。另外，同样的方法也可以用于将受精卵或某一发育阶段的胚胎包封在微液滴11内，以实现胚胎培养过程。

本发明仅以上述实施例进行说明，各部件的结构、设置位置、及其连接都是可以有所变化的，在本发明技术方案的基础上，凡根据本发明原理对个别部件进行的改进和等同变换，均不应排除在本发明的保护范围之外。

Claims (12)

1.一种集成式微流控芯片装置，其特征在于：它包括上层的微管道层和下层的微坑阵列层，且所述微管道层紧密连接在所述微坑阵列层上部；所述微管道层下部设置有与所述微坑阵列层相通的微管道，且所述微管道的高度大于流经所述微管道的卵细胞直径；所述微管道层上还设置有与所述微管道连通的管道入口和管道出口；所述微坑阵列层上设置有一个以上用来定位所述卵细胞的微坑，且所述微坑沿流体流动方向和垂直流体流动方向呈阵列排布。

2.如权利要求1所述的一种集成式微流控芯片装置，其特征在于：微坑阵列区域覆盖所述微管道的整个宽度，微坑之间的间距小于微坑的宽度，微坑深度大于卵细胞直径，并且在沿流体流动方向上的每一行所述微坑与其上一行的错位距离小于所述微坑宽度的一半。

3.如权利要求1所述的一种集成式微流控芯片装置，其特征在于：所述微坑的形状为方形、圆形或其他形状；所述微坑的宽度约为所述卵细胞直径的2倍左右，且深度大于所述卵细胞直径的1.5倍。

4.如权利要求2所述的一种集成式微流控芯片装置，其特征在于：所述微坑的形状为方形、圆形或其他形状；所述微坑的宽度约为所述卵细胞直径的2倍左右，且深度大于所述卵细胞直径的1.5倍。

5.如权利要求1或2或3或4所述的一种集成式微流控芯片装置，其特征在于：所述微管道层和微坑阵列层采用聚二甲基硅氧烷作为制作材料。

6.如权利要求5所述的一种集成式微流控芯片装置，其特征在于：在所述微坑阵列层底部贴设一层反射材料，并在所述微管道层上方增设一干涉仪。

7.一种如权利要求1～6之一所述的集成式微流控芯片装置的使用方法，其包括以下步骤：

1)单卵细胞定位过程：通过培养液辅助将卵细胞沿微管道层的微管道运送到微坑阵列层的某一个微坑上方，使卵细胞由于重力而落入微坑实现定位；

2)体外受精过程：当卵细胞完成定位之后，再将精子加入微管道的管道入口处；

3)快速换液过程：在受精完成之后，将新培养液从管道入口通入，替换旧的培养液，并清除微管道的多余精子和细胞碎片，以支持受精卵进行后续的胚胎发育；

4)胚胎培养过程：在进行受精过程及胚胎培养过程时，将微流控芯片放入常规二氧化碳培养箱中或其他培养装置中，以提供适宜的培养环境；

5)胚胎回收过程：当对微坑中的胚胎行回收时，可以将上层的微管道层向上掀开，使下层的微坑阵列层暴露在外面，并使用移液管直接从微坑中将需要的胚胎吸出。

8.如权利要求7的一种集成式微流控芯片装置的使用方法，其特征在于：在上述步骤2)中，受精过程可以采用以下两种方式：

1)保持微管道中流体静止，让精子凭自身活力从管道入口游到微坑阵列区域，并进而游入微坑与卵细胞相遇；

2)在微管道中产生流体运动，将精子推动到卵细胞所在微坑上方，使其更容易与卵细胞相遇。

9.如权利要求7所述的一种集成式微流控芯片装置的使用方法，其特征在于：在上述步骤3)中，换液过程可以采用以下两种换液方法：

1)用移液管在管道入口加入新培养液，使管道入口和管道出口之间形成液面差，从而驱动微管道中的流体运动，以使微管道内的旧培养液被新培养液更换，同时去除微管道中多余的精子和细胞碎片；

2)将管道入口通过管道与注射泵或其他进样装置相连，进而通过正压进样将新培养液送入微管道；或者将注射泵或其他进样装置与管道出口相连，而通过负压进样将管道入口中的新培养液送入微管道。

10.如权利要求7所述的一种微流控芯片装置的使用方法，其特征在于：在上述步骤4)的胚胎发育过程中，使微管道中的培养液保持静止，或使其持续流动，或是间歇式流动。

11.如权利要求7～10所述的一种微流控芯片装置的使用方法，其特征在于：将精子和卵细胞包封在微液滴内完成受精过程：

①在完成卵细胞定位并将精子加入到卵细胞周围之后，将微管道中注入空气，排出微管道中的培养液，即可在每一个微坑中形成微液滴，从而将卵细胞和其周围的精子包封在微液滴之中；

②为了防止微液滴挥发，再将微管道中通入矿物油或其他油相液体，对微液滴上方进行密封。

12.如权利要求7～11所述的一种微流控芯片装置的使用方法，其特征在于：将受精卵或某一发育时期的胚胎包封在微液滴内完成胚胎培养过程：

①在受精卵或某一发育时期的胚胎定位在微坑中之后，将微管道中注入空气，排出微管道中的培养液，即可在每一个微坑中形成微液滴，从而将受精卵或某一发育时期的胚胎包封在微液滴之中；

②为了防止微液滴挥发，再将微管道中通入矿物油或其他油相液体，对微液滴上方进行密封。

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