WO2014034781A1 - 検出装置及び検出方法 - Google Patents

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WO2014034781A1
WO2014034781A1 PCT/JP2013/073147 JP2013073147W WO2014034781A1 WO 2014034781 A1 WO2014034781 A1 WO 2014034781A1 JP 2013073147 W JP2013073147 W JP 2013073147W WO 2014034781 A1 WO2014034781 A1 WO 2014034781A1
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hydrophobic solvent
biological sample
image sensor
detection apparatus
hydrophilic solvent
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秀▲ヒョン▼ 金
博行 野地
亮太 飯野
太田　淳
徳田　崇
清隆 笹川
俊彦 野田
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国立大学法人東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to a detection apparatus and a detection method, and more particularly to an apparatus capable of detecting a biological sample.
  • Non-Patent Document 1 a biological sample detection device including a microchamber array having a plurality of storage units for storing biological samples and a CMOS image sensor having pixels provided corresponding to each of the storage units is disclosed.
  • an object of the present invention is to provide a detection apparatus and a detection method capable of detecting a biological sample with high sensitivity.
  • a detection apparatus is a detection apparatus including a microchamber array having a plurality of storage portions filled with a hydrophilic solvent containing a biological sample, and an image sensor provided with pixels corresponding to the storage portions.
  • the micro-chamber array includes a flow passage communicating with the opening of the housing portion, a hydrophobic solvent supply portion connected to the flow passage, and the hydrophilic solvent capable of entering and exiting the flow passage.
  • the hydrophobic solvent supply unit allows the hydrophobic solvent to flow into the flow passage by a force applied from the outside.
  • the detection method includes a step of filling a plurality of storage units with a hydrophilic solvent containing a biological sample, a step of irradiating the storage unit with excitation light, and a fluorescence reaction of the sample for each of the storage units.
  • a step of detecting with a sensor, and the step of filling the hydrophilic solvent includes a step of pouring the hydrophilic solvent from an opening of the housing portion, and a step of closing the opening with a hydrophobic solvent. It is characterized by.
  • the concentration of the biological sample and the reagent stored in the container can be prevented from being lowered. Measurement sensitivity can be improved.
  • FIG. 2A is a top view of an image sensor
  • FIG. 2B is a top view of a micro chamber array
  • FIG. 3A is a perspective view showing the manufacturing method of the detection device according to the first embodiment step by step
  • FIG. 3A is a step of fixing the Si substrate to the image sensor
  • FIG. 3B is a step of forming an Al film and a resist on the Si substrate
  • 3C shows a stage where a pattern is formed in the resist
  • FIG. 3D shows a stage where a through hole is formed in the Al film
  • FIG. 3E shows a stage where a through hole is formed in the Si substrate
  • FIG. 3F shows a stage where the resist and the Al film are removed.
  • FIG. FIG. 4A is a perspective view showing the manufacturing method of the detection device according to the first embodiment step by step
  • FIG. 4A is a step in which an Al pattern is formed on the back surface of the image sensor
  • FIG. FIG. 4D is a diagram showing a stage where the detection apparatus is fixed to the substrate
  • FIG. 4D is a stage where the detection apparatus is covered with resin.
  • FIG. 5A is a cross-sectional view showing a use state of the detection apparatus according to the first embodiment
  • FIG. 5A is a stage where a hydrophilic solvent is introduced into a microchamber array
  • FIG. 5B is a stage where a container is filled with the hydrophilic solvent
  • FIG. It is a figure which shows the step which sealed the opening part with the hydrophobic solvent.
  • FIG. 7A is an incident angle of 0 degree
  • FIG. 7B is a case where an incident angle is 45 degree
  • FIG. 9A is a diagram illustrating a result of detection by the detection apparatus according to the first embodiment
  • FIG. 9A is an image of the microchamber array observed from above with a microscope
  • FIG. 9B is a detection result of the image sensor after 10 minutes
  • FIG. 9C shows the detection result of the image sensor after 30 minutes
  • FIG. 9D shows the detection result of the image sensor after 60 minutes.
  • FIG. 10A is a graph showing the relationship between the detection time and the detection result of the detection apparatus according to the first embodiment
  • FIG. 10A shows the result of measuring the detection intensity by the detection apparatus
  • FIG. 10B is the concentration of the fluorescent dye using a conventional optical microscope. Is the result of detecting. It is sectional drawing which shows the detection apparatus which concerns on 2nd Embodiment, FIG. 11A is a state before use, FIG. 11B is a use state (1), FIG. 11C is a figure which shows a use state (2).
  • the detection device 1 includes an image sensor 2, an interference filter 3, and a microchamber array 4.
  • the detection device 1 accommodates a hydrophilic solvent 42 containing a biological sample in the microchamber array 4 and detects the fluorescence reaction of the biological sample with the image sensor 2.
  • the biological sample is, for example, a biomolecule such as a protein, an antibody, or a nucleic acid, or a virus particle, and reacts with a reagent.
  • a biomolecule such as a protein, an antibody, or a nucleic acid, or a virus particle
  • FDG fluorodeoxyglucose
  • beads can be used as the reagent.
  • the beads preferably have an average particle diameter of 1 ⁇ m to 4 ⁇ m.
  • the average particle diameter means a numerical value measured using an electron microscope observation or a dynamic light scattering method.
  • the detection apparatus 1 has a microchamber array 4 mounted on an image sensor 2 via an interference filter 3.
  • a CMOS sensor can be used as the image sensor 2.
  • the image sensor 2 includes a plurality of pixels 5 having a predetermined size and a bonding pad portion 7.
  • the interference filter 3 is fixed on the pixel 5 of the image sensor 2 with an adhesive, and prevents the excitation light applied to the microchamber array 4 from entering the pixel 5 of the image sensor 2.
  • the microchamber array 4 includes a chamber body 6 made of a plate-like member made of glass, silicon, polymer resin, or the like, and a plurality of accommodating portions 8 formed in the chamber body 6.
  • the chamber body 6 preferably has a hydrophobic surface. Hydrophobic has the same meaning as lipophilicity and means that the affinity with the hydrophobic solvent 44 is higher than the affinity with the hydrophilic solvent 42.
  • a water-repellent resin or a fluorine-based polymer resin can be used for the surface of the chamber body 6.
  • an amorphous fluororesin having high hydrophobicity and low toxicity to a biological sample can be suitably used.
  • the amorphous fluororesin can be selected from, for example, CYTOP (registered trademark), TEFLON (registered trademark) AF2400, and TEFLON (registered trademark) AF1600.
  • the accommodating portion 8 is a through hole formed in the thickness direction from the surface of the chamber body 6.
  • the container 8 needs to have a sufficiently high concentration of the biological sample and the reagent in order to efficiently react the reagent and the biological sample. Therefore, the volume is preferably a femtoliter class.
  • the image sensor 2 includes a plurality of pixels 5 having a predetermined size.
  • the image sensor 2 has a plurality of square pixels 5 each having a side length of 7.5 ⁇ m.
  • the accommodating portions 8 are continuously provided with a predetermined interval.
  • interval is set to the length which can interrupt
  • the microchamber array 4 has a plurality of accommodating portions 8 formed with an interval of 15 ⁇ m.
  • the microchamber array 4 is fixed on the image sensor 2 so that one container 8 corresponds to one pixel 5.
  • a shielding material containing a black dye it is preferable to apply a shielding material containing a black dye to the interference filter 3 and the side wall between the microchamber array 4 and the image sensor 2. Thereby, it is possible to prevent the excitation light from entering the pixels 5 of the image sensor 2 from the gap between the interference filter 3 and the microchamber array 4 and the image sensor 2.
  • an adhesive 14 (CYTOP (registered trademark) in this embodiment) is applied to a thickness of 2 ⁇ m on the pixel 5 of the image sensor 11 having a thickness of 150 ⁇ m.
  • an Al film 16 having a thickness of 200 nm is formed on the Si substrate 12 by vapor deposition, and a resist 18 is provided on the Al film 16 (FIG. 3B).
  • a pattern is formed in the resist 18 and a through hole 20 is formed (FIG. 3C).
  • a through hole 24 is formed in the Al film 16 by wet etching (FIG. 3D).
  • a through hole 26 is formed in the Si substrate 12 by dry etching (Deep Reactive Ion Etching: DRIE) (FIG. 3E).
  • DRIE Deep Reactive Ion Etching: DRIE
  • the resist 18 and the Al film 16 are removed with a mixed acid (acetic acid, phosphoric acid, nitric acid, pure water (volume ratio 4: 4: 1: 1)) (FIG. 3F).
  • an Al pattern 32 is formed on the back surface of the image sensor 11 (FIG. 4A), and the outer shape is formed by DRIE. Processing can be performed to obtain the detection device 1 (FIG. 4B).
  • the formed detection device 1 is fixed on the polyimide substrate 34 and wire-bonded at the bonding pad portion 7 (FIG. 4C).
  • the bonding wire 36 and the bonding pad portion 7 are covered with an epoxy resin 40. Further, a shielding material 38 containing a black dye is provided between the interference filter 3, the microchamber array 4 and the image sensor 2 (FIG. 4D).
  • a hydrophilic solvent 42 containing a biological sample and a reagent is introduced into the accommodating portion 8 of the microchamber array 4 (FIG. 5A).
  • the hydrophilic solvent 42 is, for example, at least one selected from the group consisting of water, hydrophilic alcohol, hydrophilic ether, ketone, nitrile solvent, dimethyl sulfoxide (DMSO), and N, N-dimethylformamide (DMF), or A mixture containing this can be used.
  • the detector 1 is deaerated by leaving it in a reduced pressure environment. Thereby, the air in the accommodating part 8 can be removed and the hydrophilic solvent 42 containing a biological sample can be efficiently introduce
  • the hydrophobic solvent 44 is introduced around the opening 10 of the housing 8 (FIG. 5C).
  • the hydrophobic solvent 44 may be any solvent that does not mix with the hydrophilic solvent 42, and may be, for example, a saturated hydrocarbon, an unsaturated hydrocarbon, an aromatic hydrocarbon, silicone oil, perfluorocarbon, a halogen-based solvent, or a hydrophobic ionic liquid. At least one selected from the group consisting of or a mixture containing the same can be suitably used.
  • a droplet covered with the hydrophobic solvent 44 is formed in each storage unit 8, and a biological sample is sealed in the storage unit 8. it can. Thereby, a biological sample can be enclosed in the accommodating part 8 of a femtoliter class.
  • the microchamber array 4 of the detection apparatus 1 is irradiated with excitation light from the light source 46 (FIG. 6).
  • the fluorescent substrate is decomposed by a predetermined enzyme bound to the biological sample to release the fluorescent substance.
  • This fluorescent material is detected by the pixel 5 ⁇ / b> A corresponding to each accommodating portion 8 through the interference filter 3.
  • the fluorescent material is not detected in the corresponding pixels 5B and 5C between the storage portions that are not filled with the hydrophilic solvent and the storage portions.
  • the detection device 1 seals the opening 10 of the storage unit 8 with the hydrophobic solvent 44 and confines the hydrophilic solvent 42 containing the biological sample in the storage unit 8, so that the biological sample stored in the storage unit 8
  • the measurement sensitivity can be improved by preventing a decrease in the concentration of the reagent.
  • the detection device 1 detects the number of the storage units 8 in which the reagent is stored and the number of the storage units 8 in which the reagent that has captured the biological sample is stored. The ratio of the number of captured reagents can be calculated. This makes it possible to quantify the concentration of the target molecule.
  • the image sensor 2 can detect the presence or absence of the reagent in each storage unit 8 and whether or not the reagent capturing the biological sample is stored in the pixel 5 corresponding to each storage unit 8. Therefore, it is possible to reduce the size of the detection system without requiring an optical microscope as in the prior art, and to increase the speed of detection work.
  • the manufactured microchamber array 4 of the detection apparatus 1 is formed so that the thickness is 60 ⁇ m, the effective length of the accommodating portion 8 is 4 ⁇ m, and the interval between the accommodating portions 8 is 15 ⁇ m.
  • the image sensor 2 is a CMOS sensor having a chip size of 1.2 mm ⁇ 3.6 mm, the length of one side of the pixel 5 is 7.5 ⁇ m, and the array size is 120 ⁇ 268.
  • the excitation light blue light selected from white light from a mercury lamp by a blue interference filter (transmission center wavelength 469 nm, wavelength width 35 nm) was used.
  • the excitation light irradiated to the microchamber array 4 is preferably irradiated obliquely from above to the opening 10 of the housing portion 8. That is, when the excitation light is irradiated in the vertical direction to the opening 10 of the housing portion 8, the excitation light is directly incident on the pixel 5 of the image sensor 2.
  • FIG. 7B when the opening 10 of the housing portion 8 is irradiated obliquely from above, the image sensor 2 does not detect the excitation light, so that the fluorescent substance can be detected more reliably. .
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between the incident angle of the excitation light and the detection intensity in the image sensor 2, where ⁇ is the result with the microchamber array 4 and ⁇ is the result without the microchamber array 4.
  • the incident angle refers to an angle formed by an axis extending in the vertical direction and an axis parallel to the direction in which the excitation light is incident with the vertical direction being 0 degree. From this result, it was confirmed that the microchamber array 4 can block the excitation light by changing the incident angle.
  • FIG. 9 is a diagram showing a result detected by the detection apparatus 1 according to the present embodiment.
  • the hydrophilic solvent 42 a phosphate buffer solution, ⁇ -gal ( ⁇ -galactosidase: 10 nM) as a biological sample, and FDG (4 mM) as a reagent were used.
  • FIG. 9A is an image of the microchamber array 4 observed from above with a microscope. Since each storage part 8 is shining brightly, it is confirmed that the biological sample that has reacted with the reagent is stored in each storage part 8.
  • 9B to 9D show detection results of the detection apparatus 1 in A in FIG. 9A. It was confirmed that the fluorescence reaction progressed with time, and the number of pixels 5 for detecting the fluorescence reaction increased accordingly.
  • FIG. 10A is a graph showing the relationship between the detection time and the detection intensity in the detection apparatus 1. From this result, it was confirmed that the detection apparatus 1 according to the present embodiment can obtain a detection result comparable to the result of the conventional optical microscope (FIG. 10B).
  • the detection apparatus 50 shown in the figure includes an image sensor 2, an interference filter 3 (not shown in the figure), a main body 52, and a microchamber array 4.
  • the main body 52 is composed of a cylindrical member having an open bottom surface and a closed top surface.
  • the image sensor 2 is provided so as to close the opening on the bottom surface of the main body 52.
  • a flow path 54 is formed on the microchamber array 4 provided on the image sensor 2.
  • the flow passage 54 communicates with each accommodating portion 8 of the microchamber array 4 via each opening 10.
  • the flow path 54 and all the accommodating portions 8 are filled with the hydrophilic solvent 42.
  • a hydrophobic solvent supply unit 56 is provided at one end of the flow passage 54.
  • a hydrophobic solvent 44 is accommodated in the hydrophobic solvent supply unit 56.
  • a deformation part 62 On the upper surface of the main body 52 of the hydrophobic solvent supply part 56, a deformation part 62 that can be elastically deformed by an external force is provided.
  • the main body 52 On the upper surface of the main body 52 , a pair of through holes 58 that allow the flow passage 54 and the outside to communicate with each other and a lid portion 60 that closes the through holes 58 are detachably provided.
  • the main body 52 preferably has an internal height A equal to or less than the size of the oil droplets of the hydrophobic solvent 44.
  • the internal height A By setting the internal height A to be equal to or less than the size of the oil droplets, the hydrophobic solvent 44 and the hydrophilic solvent 42 are not mixed and are held in a separated state as shown in the figure. Therefore, the boundary between the flow passage 54 and the hydrophobic solvent supply unit 56 does not require a member that partitions each other.
  • the internal height A is preferably 100 ⁇ m or less.
  • the lid 60 is removed, and the hydrophilic solvent 42 containing the biological sample and the reagent 65 is introduced into the flow passage 54 from one through hole 58. Thereby, the reagent 65 is accommodated in each accommodating part 8.
  • the detection device 50 can enclose the biological sample in the accommodating portion 8 by a single operation after introducing the hydrophilic solvent 42 including the biological sample and the reagent 65. Therefore, since the preparation for allowing the hydrophobic solvent 44 to flow in can be omitted, the inspection work can be further simplified.
  • this embodiment demonstrated the case where the boundary of the flow path 54 and the hydrophobic solvent supply part 56 did not have a member which divides each other, this invention is not limited to this.
  • a partition may be provided at the boundary between the flow passage 54 and the hydrophobic solvent supply unit 56. The partition is formed so as to be ruptured by a force applied to the deforming portion 62.
  • the hydrophobic solvent 44 is reliably accommodated in the hydrophobic solvent supply unit 56 by the partition walls. Then, by applying a force to the deforming portion 62, the force is transmitted to the partition wall via the hydrophobic solvent 44 accommodated in the hydrophobic solvent supply portion 56. When the partition is broken by the transmitted force, the hydrophobic solvent 44 accommodated in the hydrophobic solvent supply unit 56 flows into the flow passage 54, and the droplets covered with the hydrophobic solvent 44 are put in each accommodation unit 8. It is possible to form and enclose a biological sample in the accommodating portion 8.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment, and can be appropriately changed within the scope of the gist of the present invention.
  • the present invention is not limited to this, and the number of through holes 58 may be one.
  • SYMBOLS 1 Detection apparatus 2: Image sensor 4: Micro chamber array 5: Pixel 8: Accommodating part 10: Opening part 42: Hydrophilic solvent 44: Hydrophobic solvent 54: Flow path 56: Hydrophobic solvent supply part 58: Through-hole 62 : Deformation part

Abstract

高感度に生体試料を検出することができる検出装置及び検出方法を提供する。生体試料を含む親水性溶媒を充填する複数の収容部（８）を有するマイクロチャンバーアレイ（４）と、前記収容部（８）に対応して画素５が設けられているイメージセンサ（２）とを備える検出装置（５０）において、前記マイクロチャンバーアレイ（４）は、前記収容部（８）の開口部（１０）に連通している流通路（５４）と、前記流通路（５４）に連設されている疎水性溶媒供給部（５６）と、前記流通路（５４）に対し前記親水性溶媒（４２）が出入り可能な貫通穴（５８）とを有し、前記疎水性溶媒供給部（５６）は外部から加えられた力によって疎水性溶媒（４４）を前記流通路（５４）に流入させることを特徴とする。

Description

検出装置及び検出方法
　本発明は、検出装置及び検出方法に関し、特に生体試料を検出することができる装置に関する。
　光学顕微鏡により生きた（活性を有する）タンパク質、核酸などの生体試料の個々の運動を直接的に観察できるようになって以来、主として、光学顕微鏡を用いた測定により、生体試料の分子レベルの機能や活性を検査する方法が採用されている。個々の対象物となる分子を識別するためには、それら分子に蛍光色素、金コロイド又は微小粒子（ポリスチレンビーズ、磁気ビーズなど）の試薬が付加され、光学顕微鏡の分解能では見ることのできない大きさの分子の存在を可視化するといったことが行われる。
　ところが、上記方法の場合、大型かつ高価な光学顕微鏡が必要であり、さらに生体試料を直接観察し生体試料の存在をカウントする必要があるので、高速かつ容易に検査をすることができない、という問題があった。
　これに対し、生体試料を収容する複数の収容部を有するマイクロチャンバアレイと、当該収容部毎に対応して設けられた画素を有するＣＭＯＳイメージセンサとを備える生体試料の検出装置が開示されている（例えば、非特許文献１）。
Complementary Metal-Oxide-SemiconductorImage Sensor with Microchamber Array for Fluorescent Bead Counting, KiyotakaSasagawa, et al., JAPANESE JOURNAL OF APPLIED PHYSICS, 51 (2012) 02BL01
　しかしながら、上記非特許文献１では全ての収容部の開口部は流路で連通しているため、収容部内に収容される生体試料や試薬の濃度が低くなってしまい、測定感度が低下してしまう、という問題があった。
　そこで本発明は、高感度に生体試料を検出することができる検出装置及び検出方法を提供することを目的とする。
　本発明に係る検出装置は、生体試料を含む親水性溶媒を充填する複数の収容部を有するマイクロチャンバーアレイと、前記収容部に対応して画素が設けられているイメージセンサとを備える検出装置において、前記マイクロチャンバーアレイは、前記収容部の開口部に連通している流通路と、前記流通路に連設されている疎水性溶媒供給部と、前記流通路に対し前記親水性溶媒が出入り可能な貫通穴とを有し、前記疎水性溶媒供給部は外部から加えられた力によって疎水性溶媒を前記流通路に流入させることを特徴とする。
　本発明に係る検出方法は、複数の収容部に生体試料を含む親水性溶媒を充填する工程と、前記収容部に励起光を照射する工程と、前記試料の蛍光反応を前記収容部毎にイメージセンサで検出する工程とを備え、前記親水性溶媒を充填する工程は、前記収容部の開口部から前記親水性溶媒を流し込む工程と、前記開口部を疎水性溶媒で閉塞する工程とを有することを特徴とする。
　本発明によれば、収容部の開口部を疎水性溶媒で封止し収容部に生体試料を含む親水性溶媒を閉じ込めるので、収容部内に収容される生体試料や試薬の濃度の低下を防いで測定感度を向上することができる。
第１実施形態に係る検出装置の全体構成を示す分解斜視図である。 第１実施形態に係る検出装置のイメージセンサ及びマイクロチャンバーアレイの構成を示す平面図であり、図２Ａはイメージセンサの平面図、図２Ｂはマイクロチャンバーアレイの平面図、図２Ｃはイメージセンサにマイクロチャンバーアレイを重ねた状態の平面図である。 第１実施形態に係る検出装置の製造方法を段階的に示す斜視図であり、図３ＡはイメージセンサにＳｉ基板を固定する段階、図３ＢはＳｉ基板上にＡｌ膜及びレジストを形成した段階、図３Ｃはレジストにパターンを形成した段階、図３ＤはＡｌ膜に貫通穴を形成した段階、図３ＥはＳｉ基板に貫通穴を形成した段階、図３Ｆはレジスト及びＡｌ膜を除去した段階を示す図である。 第１実施形態に係る検出装置の製造方法を段階的に示す斜視図であり、図４Ａはイメージセンサの裏面にＡｌのパターンを形成した段階、図４Ｂは外形を加工した段階、図４Ｃはポリイミド基板に検出装置を固定した段階、図４Ｄは検出装置を樹脂で覆った段階を示す図である。 第１実施形態に係る検出装置の使用状態を示す断面図であり、図５Ａは親水性溶媒をマイクロチャンバーアレイに導入した段階、図５Ｂは収容部に親水性溶媒を充填した段階、図５Ｂは疎水性溶媒で開口部を封止した段階を示す図である。 第１実施形態に係る検出装置の使用状態を示す図である。 第１実施形態に係る検出装置の励起光の入射角度とイメージセンサの検出画像とを示す図であり、図７Ａは入射角度が０度、図７Ｂは入射角度が４５度の場合である。 第１実施形態に係る検出装置の励起光の入射角度とイメージセンサにおける検出強度の関係を示すグラフである。 第１実施形態に係る検出装置で検出した結果を示す図であり、図９Ａはマイクロチャンバーアレイを上方からマイクロスコープで観察した画像、図９Ｂは１０分経過後のイメージセンサでの検出結果、図９Ｃは３０分経過後のイメージセンサでの検出結果、図９Ｄは６０分経過後のイメージセンサでの検出結果である。 第１実施形態に係る検出装置の検出時間と検出結果との関係を示すグラフであり、図１０Ａは検出装置により検出強度を測定した結果、図１０Ｂは従来の光学顕微鏡を用いて蛍光色素の濃度を検出した結果である。 第２実施形態に係る検出装置を示す断面図であり、図１１Ａは使用前の状態、図１１Ｂは使用状態（１）、図１１Ｃは使用状態（２）を示す図である。
　（第１実施形態）
　以下、図面を参照して本発明の実施形態について詳細に説明する。
　図１に示す検出装置１は、イメージセンサ２と、干渉フィルタ３と、マイクロチャンバーアレイ４とを備える。検出装置１は、マイクロチャンバーアレイ４に生体試料を含む親水性溶媒４２を収容し、当該生体試料の蛍光反応をイメージセンサ２で検出する。
　本実施形態の場合、生体試料とは例えばタンパク質、抗体、核酸などの生体分子やウイルス粒子等であり、試薬と反応する。試薬としては例えば、ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース）や、ビーズを用いることができる。
　ビーズは、平均粒子径１μｍ～４μｍであることが好ましい。ビーズの平均粒子径を小さくすることにより、ビーズをマイクロチャンバーアレイ４へ効率的に封入できると共に、マイクロチャンバーアレイ４の高密度化を図ることができる。なお、「平均粒子径」とは、ここでは電子顕微鏡観察又は動的光散乱法を用いて測定した数値をいう。
　本実施形態の場合、検出装置１はイメージセンサ２上に干渉フィルタ３を介してマイクロチャンバーアレイ４が搭載されている。イメージセンサ２は、例えばＣＭＯＳセンサを用いることができる。イメージセンサ２は、所定の大きさの画素５が複数形成されていると共に、ボンディングパッド部７が設けられている。干渉フィルタ３は、接着剤によってイメージセンサ２の画素５上に固着されており、マイクロチャンバーアレイ４に照射される励起光がイメージセンサ２の画素５に入射することを防止する。
　マイクロチャンバーアレイ４は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等で形成された板状部材からなるチャンバー本体６と、当該チャンバー本体６に形成された複数の収容部８とを有する。チャンバー本体６は、表面が疎水性を有することが好ましい。疎水性とは、親油性と同じ意味であり、疎水性溶媒４４との親和性が親水性溶媒４２との親和性よりも高いことをいう。この場合チャンバー本体６表面は、例えば撥水性の樹脂、フッ素系高分子樹脂等を用いることができる。フッ素系高分子樹脂としては、高い疎水性を有し、かつ、生体試料に対する毒性が低いアモルファスフッ素樹脂等を好適に用いることができる。アモルファスフッ素樹脂としては、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２４００、及びＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ１６００から選択することができる。
　収容部８は、チャンバー本体６表面から厚さ方向に穿設された貫通穴である。収容部８は、試薬と生体試料を効率的に反応させるため、生体試料及び試薬の濃度を十分に高くする必要があり、そのため容積がフェムトリットルクラスであることが好ましい。
　図２Ａに示すようにイメージセンサ２は、所定の大きさを有する画素５が複数連設されている。本実施形態の場合、イメージセンサ２は１辺の長さが７．５μｍの正方形の画素５を複数有する。
　図２Ｂに示すようにマイクロチャンバーアレイ４は、収容部８が所定の間隔を開けて連設されている。当該間隔は、入射した励起光を遮断し得る長さに設定される。本実施形態の場合、マイクロチャンバーアレイ４は１５μｍの間隔を開けて形成された収容部８を複数有する。
　図２Ｃに示すように、マイクロチャンバーアレイ４は、１個の収容部８が１個の画素５に対応するようにイメージセンサ２上に固定される。
　また本図には図示しないが、干渉フィルタ３と、マイクロチャンバーアレイ４及びイメージセンサ２の間の側壁に、黒色の染料を含有する遮蔽材を塗布するのが好ましい。これにより、干渉フィルタ３と、マイクロチャンバーアレイ４及びイメージセンサ２の間の隙間から励起光がイメージセンサ２の画素５に入射することを防ぐことができる。
　次に、本実施形態に係る検出装置１の製造方法について説明する。まず、厚さ１５０μｍのイメージセンサ１１の画素５上に接着剤（本実施形態の場合、ＣＹＴＯＰ（登録商標））１４を２μｍの厚さに塗布する。次いで、１８０℃で加熱しながら一面に厚さ３μｍの干渉フィルタ３を設けた厚さ６０μｍのＳｉ基板１２を、干渉フィルタ３の表面を上記接着剤１４に重ね、干渉フィルタ３を介してＳｉ基板１２とイメージセンサ１１とを固定する（図３Ａ）。
　次いで、Ｓｉ基板１２上に２００ｎｍの厚さのＡｌ膜１６を蒸着法により形成し、当該Ａｌ膜１６上にレジスト１８を設ける（図３Ｂ）。
　次いで、レジスト１８にパターンを形成し貫通穴２０を穿設する（図３Ｃ）。ボンディングパッド部７を保護する厚膜レジスト２２を形成した後で、ウェットエッチングによりＡｌ膜１６に貫通穴２４を形成する（図３Ｄ）。
　さらにドライエッチング（Deep Reactive Ion Etching : DRIE）によりＳｉ基板１２に貫通穴２６を形成する（図３Ｅ）。次いで、レジスト１８及びＡｌ膜１６を混酸（酢酸，リン酸，硝酸，純水(体積比4：4：1：1)）により除去する（図３Ｆ）。
　次いで、ガラス基板２８上に載置してボンディングパッド部７を保護する厚膜レジスト３０を形成した後で、イメージセンサ１１の裏面にＡｌのパターン３２を形成し（図４Ａ）、さらにDRIEにより外形加工を施して検出装置１を得ることができる（図４Ｂ）。
　形成された検出装置１は、ポリイミド基板３４上に固定され、ボンディングパッド部７においてワイヤボンディングされる（図４Ｃ）。
　ボンディングワイヤ３６、及びボンディングパッド部７はエポキシ樹脂４０で覆われている。また、干渉フィルタ３と、マイクロチャンバーアレイ４及びイメージセンサ２の間に、黒色の染料を含有する遮蔽材３８が設けられている（図４Ｄ）。
　次に、上記のように構成された検出装置１の動作及び効果を説明する。まず、生体試料と試薬とを含む親水性溶媒４２をマイクロチャンバーアレイ４の収容部８に導入する（図５Ａ）。親水性溶媒４２は例えば、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を用いることができる。
　次いで、検出装置１を減圧環境下に放置することにより、脱気をする。これにより、収容部８内の空気を除去し、生体試料を含む親水性溶媒４２を収容部８に効率的に導入することができる（図５Ｂ）。
　次いで収容部８の開口部１０周辺に疎水性溶媒４４を導入する（図５Ｃ）。疎水性溶媒４４は、親水性溶媒４２と混ざらない溶媒であればよく、例えば飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。
　疎水性溶媒４４を収容部８の開口部１０周辺に導入することにより、各収容部８に疎水性溶媒４４により覆われた液滴を形成し、収容部８内に生体試料を封入することができる。これにより、生体試料をフェムトリットルクラスの収容部８に封入することができる。
　次いで、検出装置１のマイクロチャンバーアレイ４に対し、光源４６から励起光を照射する（図６）。生体試料に結合した所定の酵素によって蛍光基質が分解されて蛍光物質が遊離する。この蛍光物質を干渉フィルタ３を介して各収容部８に対応する画素５Ａで検出する。一方、親水性溶媒が充填されなかった収容部及び収容部同士の間に対応する画素５Ｂ，５Ｃにおいて蛍光物質は検出されない。
　これにより、検出装置１は、収容部８の開口部１０を疎水性溶媒４４で封止し収容部８に生体試料を含む親水性溶媒４２を閉じ込めるので、収容部８内に収容される生体試料や試薬の濃度の低下を防いで測定感度を向上することができる。
　また、検出装置１は、試薬が収容されている収容部８の数と、生体試料を捕捉した試薬が収容されている収容部８の数とを検出して、試薬の全数のうちターゲット分子を捕捉した試薬の数の割合を算出することができる。これにより、ターゲット分子の濃度を定量化することが可能となる。
　しかも、本実施形態の場合、イメージセンサ２は各収容部８に対応した画素５において各収容部８の試薬の有無及び生体試料を捕捉した試薬が収容されているか否かを検出することができるので、従来のように光学顕微鏡を必要とせず検出システムの小型化を図ることができると共に、検出作業の高速化を図ることができる。
　次に、実際に製造した検出装置１を用いて行った評価について説明する。製造した検出装置１のマイクロチャンバーアレイ４は、厚さが６０μｍ、収容部８の有効長さが４μｍ、収容部８同士の間の間隔が１５μｍとなるように形成されている。イメージセンサ２は、チップサイズが１．２ｍｍ×３．６ｍｍのＣＭＯＳセンサを用い、画素５の１辺の長さが７．５μｍ、アレイサイズが１２０×２６８とした。
　まず、励起光の適切な入射角度について確認した。励起光には水銀ランプからの白色光を青色干渉フィルタ（透過中心波長469nm，波長幅35nm）により選択した青色光を用いた。マイクロチャンバーアレイ４に対し照射する励起光は、図７に示すように、収容部８の開口部１０に対し斜め上方から照射するのが好ましい。すなわち収容部８の開口部１０に対し、垂直方向に励起光を照射した場合、イメージセンサ２の画素５に励起光が直接入射してしまう。これに対し、図７Ｂに示すように、収容部８の開口部１０に対し斜め上方から照射した場合、イメージセンサ２は当該励起光を検出しないので、より確実に蛍光物質を検出することができる。
　図８は、励起光の入射角度とイメージセンサ２における検出強度の関係を示すグラフであり、●はマイクロチャンバーアレイ４あり、□はマイクロチャンバーアレイ４なしの結果である。入射角度は、鉛直方向を０度とし、当該鉛直方向の伸びる軸と励起光が入射する方向に平行な軸とのなす角をいう。この結果から入射角度を変えることによりマイクロチャンバーアレイ４が励起光を遮断し得ることが確認できた。
　図９は、本実施形態に係る検出装置１で検出した結果を示す図である。なお、親水性溶媒４２としてリン酸緩衝液、生体試料としてβ－ｇａｌ（β-galactosidase：１０ｎＭ）、試薬としてＦＤＧ（４ｍＭ）を用いた。
　図９Ａはマイクロチャンバーアレイ４を上方からマイクロスコープで観察した画像である。各収容部８が明るく光っていることから、各収容部８に試薬と反応した生体試料が収容されていることが確認される。
　図９Ｂ～図９Ｄは、図９Ａ中のＡにおける検出装置１の検出結果を示す。時間経過と共に蛍光反応が進み、それに伴い蛍光反応を検出する画素５が増加していることが確認された。
　図１０Ａは検出装置１における検出時間と検出強度との関係を示すグラフである。この結果から、本実施形態に係る検出装置１は、従来の光学顕微鏡の結果（図１０Ｂ）と遜色のない検出結果を得られることが確認された。
　（第２実施形態）
　次に本発明の第２実施形態に係る検出装置１について図１１を参照して説明する。上記第１実施形態と同様の構成については同様の符号を付し、簡略のため説明を省略する。
　本図に示す検出装置５０は、イメージセンサ２と、干渉フィルタ３（本図には図示しない）と、本体５２と、マイクロチャンバーアレイ４とを備える。
　本体５２は、底面が開口しており、上面が閉塞している筒状の部材で構成されている。本体５２の底面の開口を塞ぐようにイメージセンサ２が設けられている。イメージセンサ２上に設けられたマイクロチャンバーアレイ４上には流通路５４が形成されている。流通路５４はマイクロチャンバーアレイ４の各収容部８とそれぞれの開口部１０を介して連通している。流通路５４及び全ての収容部８は親水性溶媒４２で満たされている。
　流通路５４の一端には疎水性溶媒供給部５６が設けられている。疎水性溶媒供給部５６には疎水性溶媒４４が収容されている。疎水性溶媒供給部５６の本体５２上面には、外力で弾性変形可能な変形部６２が設けられている。
　本体５２の上面には、流通路５４と外部とを連通する一対の貫通穴５８と、当該貫通穴５８を閉塞する蓋部６０とが着脱自在に設けられている。本体５２は、内部の高さＡが疎水性溶媒４４の油滴の大きさ以下であることが好ましい。内部の高さＡを油滴の大きさ以下とすることにより、疎水性溶媒４４と親水性溶媒４２が混ざり合わずに本図に示すように分離した状態で保持される。したがって、流通路５４と疎水性溶媒供給部５６との境界は互いを区画する部材を必要としない。通常、水中において安定な油滴の大きさは１００μｍ程度であるので、内部の高さＡは、１００μｍ以下であることが好ましい。
　次に上記のように構成された検出装置５０の動作及び効果について説明する。まず、図１１Ｂに示すように、蓋部６０を取り外し、一方の貫通穴５８から生体試料と試薬６５を含む親水性溶媒４２を流通路５４内に導入する。これにより、試薬６５は各収容部８に収容される。
　次いで、疎水性溶媒供給部５６の変形部６２に対し外部から力を付加し、変形部６２を弾性変形させる。この力により疎水性溶媒供給部５６に収容されていた疎水性溶媒４４が流通路５４内に流入し、各収容部８に疎水性溶媒４４により覆われた液滴を形成し、収容部８内に生体試料を封入することができる。
　本実施形態に係る検出装置５０は、生体試料と試薬６５を含む親水性溶媒４２を導入した後、１回的な動作で収容部８内に生体試料を封入することができる。したがって疎水性溶媒４４を流入させる準備を省略することができるので、検査作業をより簡略化することができる。
　なお、本実施形態では、流通路５４と疎水性溶媒供給部５６との境界は互いを区画する部材がない場合について説明したが、本発明はこれに限られない。例えば、流通路５４と疎水性溶媒供給部５６との境界に隔壁を設けることとしてもよい。当該隔壁は、変形部６２に付加された力によって破断可能に形成される。
　これにより、生体試料と試薬６５とを含む親水性溶媒４２を流通路５４内に導入した段階では疎水性溶媒４４は隔壁によって疎水性溶媒供給部５６に確実に収容されている。そして、変形部６２に力を付加することによって、当該力が疎水性溶媒供給部５６に収容されている疎水性溶媒４４を介して隔壁に伝達される。伝達された力によって隔壁が破断すると、疎水性溶媒供給部５６に収容されていた疎水性溶媒４４が流通路５４内に流入し、各収容部８に疎水性溶媒４４により覆われた液滴を形成し、収容部８内に生体試料を封入することができる。
　このように流通路５４と疎水性溶媒供給部５６との境界に隔壁を設けることにより、生体試料と試薬６５とを含む親水性溶媒４２を流通路５４内に導入した段階、すなわち試薬６５が各収容部８に収容される段階において疎水性溶媒４４が流通路５４内に進入することをより確実に防ぐことができるので、作業の確実性を向上することができる。
（変形例）
　本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲内で適宜変更することが可能である。
　上記第２実施形態では、一対の貫通穴５８を設けた場合について説明したが、本発明はこれに限らず、貫通穴５８は１個でもよい。
１　　　　：検出装置
２　　　　：イメージセンサ
４　　　　：マイクロチャンバーアレイ
５　　　　：画素
８　　　　：収容部
１０　　　：開口部
４２　　　：親水性溶媒
４４　　　：疎水性溶媒
５４　　　：流通路
５６　　　：疎水性溶媒供給部
５８　　　：貫通穴
６２　　　：変形部

Claims (7)

  1. 生体試料を含む親水性溶媒を充填する複数の収容部を有するマイクロチャンバーアレイと、
    前記収容部に対応して画素が設けられているイメージセンサと
    を備える検出装置において、
    前記マイクロチャンバーアレイは、
    前記収容部の開口部に連通している流通路と、
    前記流通路に連設されている疎水性溶媒供給部と、
    前記流通路に対し前記親水性溶媒が出入り可能な貫通穴と
    を有し、
    前記疎水性溶媒供給部は外部から加えられた力によって疎水性溶媒を前記流通路に流入させる
    ことを特徴とする検出装置。
  2. 前記疎水性溶媒供給部と前記流通路の間に前記力によって破断可能な隔壁が設けられていることを特徴とする請求項１に記載の検出装置。
  3. 前記疎水性溶媒供給部は外部から加えられた力によって弾性変形可能な変形部を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の検出装置。
  4. 前記流通路に前記試料を含まない前記親水性溶媒が充填されていることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の検出装置。
  5. 前記貫通穴を閉塞する開閉可能な蓋部が設けられていることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の検出装置。
  6. 複数の収容部に生体試料を含む親水性溶媒を充填する工程と、
    前記収容部に励起光を照射する工程と、
    前記試料の蛍光反応を前記収容部毎にイメージセンサで検出する工程と
    を備え、
    前記親水性溶媒を充填する工程は、
    前記収容部の開口部から前記親水性溶媒を流し込む工程と、
    前記開口部を疎水性溶媒で閉塞する工程と
    を有することを特徴とする検出方法。
  7. 前記励起光を前記開口部に対し斜め上方から照射することを特徴とする請求項６に記載の検出方法。
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