JP2018512116A - ｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚の作成及び選択 - Google Patents

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚の作成及び選択 Download PDF

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Abstract

体外受精のための卵細胞及び／又は精子の改善されたモニタリング、検査及び／又は培養の方法が本明細書に記載される。このほか、ｅｘ ｖｉｖｏでの着床前選択時の胚の改善されたモニタリング、検査及び／又は培養の方法が記載される。卵細胞、精子又は胚は、野生動物又は動物園の動物に由来するものであり得る。卵細胞、精子又は胚は哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、マウスなどであり得る。【選択図】図１

Description

[0001] 不妊を深刻な問題として抱える人は多い。体外受精は、生存妊娠が成立しないほか、既存の諸リスクを伴う多胎分娩の発生率が容認されないほど高くなるといった点で不成功に終わることが多い。着床前の胚を選択して単一の着床の成功率を高める方法があれば極めて有利になると考えられる。
[0002] 本発明のいくつかの実施形態は、ｅｘ ｖｉｖｏの着床前選択時の胚のモニタリング、検査及び／又は培養の改善に関する。このような実施形態では、単一の胚又は１群の胚の形態、内部マーカ、表面マーカ及び／又は分泌物をモニタすることができる。胚は動物胚、例えば家畜胚又は野生動物もしくは動物園の動物に由来する胚などであり得る。胚は、哺乳動物胚、例えばヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、マウスなどの胚であり得る。
[0003] 本発明のいくつかの実施形態は、体外受精用の卵細胞及び／又は精子のモニタリング、検査及び／又は培養の改善に関する。いくつかの実施形態では、単一の卵細胞又は１群の卵細胞の形態、内部マーカ、表面マーカ及び／又は分泌物をモニタすることができる。いくつかの実施形態では、単一の精子又は１群の精子の形態、内部マーカ、表面マーカ、分泌物及び／又は運動能をモニタすることができる。卵細胞及び精子は、１つ又は複数の動物、例えば家畜、野生動物及び／又は動物園の動物から採取されるものであり得る。卵細胞及び精子は、哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、マウスなどから採取されるものであり得る。
[0004] 本発明のいくつかの実施形態は、生存妊娠が得られる胚を１群の胚から選択することを可能にする装置に関する。いくつかの関連する実施形態は、卵細胞の受精及び／又は生存可能な胚が得られる卵細胞を１群の卵細胞から選択することを容易にする装置に関する。ほかの関連する実施形態は、卵細胞の受精及び／又は生存可能な胚が得られる精子を１群の精子からの選択することを容易にする装置に関する。
[0005] 一態様では、マイクロ流体装置で胚を作成する工程であって、マイクロ流体装置の隔離囲い内に卵細胞を導入することと、マイクロ流体装置内に少なくとも１つの精子を導入することと、卵細胞の受精を促す条件下で少なくとも１つの精子と卵細胞とを接触させることと、接触させた卵細胞と少なくとも１つの精子とをマイクロ流体装置内で、少なくとも卵細胞と少なくとも１つの精子とが胚を形成するのに十分な長さの時間にわたってインキュベートすることと、を含む工程が提供される。
[0006] 種々の実施形態では、隔離囲い内に卵細胞を導入することは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いることを含み得る。ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構造によって発生するものであり得る。種々の実施形態では、隔離囲い内に少なくとも１つの精子を導入することは、誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いることを含み得る。ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構造によって発生するものであり得る。
[0007] 種々の実施形態では、隔離囲い内に卵細胞を導入することは、エレクトロウェッティング力を用いることを含み得る。エレクトロウェッティング力はＯＥＷ構造によって発生するものであり得る。種々の実施形態では、隔離囲い内に少なくとも１つの精子を導入することはエレクトロウェッティング力を用いることを含み得る。エレクトロウェッティング力は、ＯＥＷ構造によって発生するものであり得る。
[0008] 他の実施形態では、隔離囲い内に卵細胞を導入することは、流体流動及び／又は重力を用いて卵細胞を輸送することを含み得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体装置内に少なくとも１つの精子を導入することは、流体流動及び／又は重力を用いて少なくとも１つの精子を輸送することを含み得る。
[0009] 種々の実施形態では、この工程は、卵細胞の状態を確認することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、この工程は、卵細胞の状態を確認することをさらに含み得るものであり、ここでは、マイクロ流体装置内に少なくとも１つの精子を導入する前に確認段階を実施し得る。いくつかの実施形態では、この工程は、卵細胞の状態を確認することをさらに含み得るものであり、ここでは、隔離囲い内に卵細胞を導入する前に確認段階を実施し得る。
[0010] 工程の種々の実施形態では、マイクロ流体装置内に少なくとも１つの精子を導入する前、卵細胞に少なくとも１つの調整処理を実施し得る。少なくとも１つの調整処理は、電気処理又は化学処理であり得る。少なくとも１つの調整処理は、体細胞への曝露であり得る。体細胞は卵丘細胞であり得る。いくつかの実施形態では、卵細胞を隔離囲い内で体細胞に曝露し得る。
[0011] 工程の種々の実施形態では、卵細胞の受精を促す条件は、卵細胞を取り囲む培地の組成を含み得る。種々の実施形態では、この工程は、マイクロ流体装置内に少なくとも１つの精子を導入する前に卵細胞を取り囲む培地の組成を変化させることをさらに含み得る。
[0012] 工程の他の実施形態では、マイクロ流体装置内に少なくとも１つの精子を導入した後に卵細胞に少なくとも１つの調整処理を実施し得る。少なくとも１つの調整処理は、電気処理又は化学処理であり得る。
[0013] 種々の実施形態では、この工程は、接触させた卵細胞と少なくとも１つの精子が胚を形成したことを判定する段階をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、胚が形成されたことを判定する段階は目視検査を含み得る。いくつかの実施形態では、胚が形成されたことを判定する段階は撮像を含み得る。他の実施形態では、胚が形成されたことを判定する段階は、卵細胞が導入された隔離囲い内にある分泌物又は隔離囲いから出る分泌物を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、分泌物の検出は、タンパク質又は核酸を検出することを含み得る。
[0014] 種々の実施形態では、この工程は、胚に少なくとも１つの調整処理を実施する段階をさらに含み得る。胚に実施する少なくとも１つの調整処理は、体細胞への曝露であり得る。いくつかの実施形態では、胚を暴露する体細胞は、卵丘細胞、子宮内膜細胞、無線毛分泌細胞、ＰＥＧ細胞又はその任意の組合せであり得る。他の実施形態では、胚を暴露する体細胞は、卵丘細胞ならびに子宮内膜細胞、無線毛分泌細胞及びＰＥＧ細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞である。
[0015] 工程の種々の実施形態では、卵細胞及び少なくとも１つの精子は、それぞれ哺乳動物から採取されるものであり得る。
[0016] 工程の種々の実施形態では、隔離囲いは、単一の卵細胞を収納し得る。マイクロ流体装置は複数の隔離囲いを含む。いくつかの実施形態では、複数の隔離囲いのうち２つ以上の隔離囲いにそれぞれ少なくとも１つの卵細胞を導入し得る。他の実施形態では、複数の隔離囲いのうち２つ以上の隔離囲いにそれぞれ単一の卵細胞を導入し得る。種々の実施形態では、マイクロ流体装置は、流体培地を含むよう設計されたチャネルをさらに含むものであり得、隔離囲いは、隔離領域及び連結領域を含むものであり得、ここでは、連結領域の近位開口部が隔離領域とチャネルとを流体連結する。隔離囲いの隔離領域は、拡散によってのみ、隔離領域内の流体培地の成分と、チャネル内の流体培地の成分とを交換し得る。
[0017] 工程の種々の実施形態では、この工程は、接触させた卵細胞と少なくとも１つの精子が胚を形成したことを判定する段階と、隔離囲い内の胚を取り囲む培地の組成を変化させることと、をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、胚が単細胞胚から桑実胚又は胞胚に発生するにつれて、培地の組成を２回以上変化させ得る。いくつかの実施形態では、培地の組成を変化させることは、培地のｐＨを変化させることを含み得る。
[0018] 工程の種々の実施形態では、この工程は、隔離囲いから胚を排出する段階をさらに含み得る。工程の種々の実施形態では、この工程は、マイクロ流体装置から胚を排出する段階をさらに含み得る。
[0019] 別の態様では、マイクロ流体装置内の少なくとも１つの生物学的微小物体の状態をモニタする工程が提供され、ここでは、生物学的微小物体は、胚、精子又は卵細胞から選択され、工程は、マイクロ流体装置の隔離囲い内に生物学的微小物体を導入する段階と、生物学的微小物体に培地を供給する段階と、生物学的微小物体によって産生された分泌物を分析する段階；及び生物学的微小物体の状態を判定する段階と、を含む。いくつかの実施形態では、生物学的微小物体に培地を供給する段階は、生存に必要な栄養素を供給するよう構成された培地を生物学的微小物体に供給することをさらに含み得る。
[0020] 工程の種々の実施形態では、供給する培地は、次の生物学的変化のために生物学的微小物体を活性化するのに必要な成分を含み得る。いくつかの実施形態では、次の生物学的変化は、受精又は胚発生の次の段階への進行であり得る。
[0021] 工程の種々の実施形態では、分泌物を分析する段階は、分泌物を捕捉ビーズで捕捉することを含み得る。いくつかの実施形態では、分泌物を分析する段階を隔離囲い内で、又は隔離囲いのすぐ近くで実施し得る。他の実施形態では、分泌物を分析する段階をマイクロ流体装置の外部で実施し得る。種々の実施形態では、分泌物を分析する段階は、タンパク質、核酸、上記のもののいずれかのフラグメント又はその任意の組合せを検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、分泌物を分析する段階を２回以上実施し得る。いくつかの実施形態では、分泌物を分析する段階を定期的に実施し得る。
[0022] 工程の種々の実施形態では、この工程は、生物学的微小物体を撮像する段階をさらに含み、ここでは、生物学的微小物体の少なくとも１つの画像を少なくとも１回の分泌物の分析とともに用いて、生物学的微小物体の状態を判定する。
[0023] 工程の種々の実施形態では、この工程は、隔離囲いから生物学的微小物体を排出する段階をさらに含む。
[0024] 工程の種々の実施形態では、生物学的微小物体は胚であり、ここでは、胚が生存可能であると判定した後に胚を排出し得る。種々の実施形態では、生物学的微小物体は胚であり、ここでは、胚が生存可能な胞胚であると判定した後に胚を排出し得る。
[0025] 別の態様では、マイクロ流体装置内の少なくとも１つの生物学的微小物体の状態をモニタする工程が提供され、ここでは、生物学的微小物体は、胚、精子又は卵細胞から選択され、工程は、マイクロ流体装置の隔離囲い内に生物学的微小物体を導入する段階と、生物学的微小物体に培地を供給する段階と、生物学的微小物体を撮像する段階と、生物学的微小物体の状態を判定する段階と、を含む。いくつかの実施形態では、生物学的微小物体に培地を供給する段階は、生存に必要な栄養素を供給するよう構成された培地を供給することを含む。
[0026] 工程の種々の実施形態では、生物学的微小物体を撮像する段階を２回以上実施し得る。いくつかの実施形態では、撮像する段階を定期的に実施し得る。他の実施形態では、撮像する段階を継続的に実施し得る。
[0027] 工程の種々の実施形態では、状態を判定する段階は、卵細胞の大きさ、形状又はその両方を判定することを含み得る。
[0028] 工程の種々の実施形態では、この工程は、判定した卵細胞の大きさ及び／又は形状に基づき、卵細胞に調整処理を実施するかどうかを決定する段階をさらに含む。
[0029]工程の種々の実施形態では、この工程は、判定した卵細胞の大きさ及び／又は形状に基づき、卵細胞の受精の準備をするかどうかを決定する段階をさらに含む。
[0030] 工程の種々の実施形態では、状態を判定する段階は、精子の大きさ、形状、運動能及び走化性反応のうちの少なくとも１つを判定することを含み得る。工程の種々の実施形態では、この工程は、判定した精子の大きさ、形状、運動能及び／又は走化性反応に基づき、精子に調整処理を実施するかどうかを決定する段階をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、精子に調整処理を実施するかどうかを決定する段階は、精子の大きさ、形状、運動能及び走化性反応のうちの少なくとも１つの状態の判定に基づくものであり得る。
[0031] 工程の種々の実施形態では、状態を判定する段階は、胚が形成されたかどうかを判定することを含み得る。工程の他の種々の実施形態では、状態を判定する段階は、胚の大きさ、形状及び細胞分裂の時期のうちの少なくとも１つを判定することを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞分裂の時期を胚の生存能の指標とし得る。
[0032] 別の態様では、マイクロ流体装置で単為発生胚を作成する方法が提供され、この方法は、マイクロ流体装置の隔離囲い内に卵母細胞を導入する段階と、刺激作用因子を加えて卵母細胞を単為発生胚に変換する段階と、を含む。
[0033] 方法の種々の実施形態では、卵母細胞は哺乳動物卵母細胞であり得る。種々の実施形態では、卵母細胞はヒト卵母細胞であり得る。方法の種々の実施形態では、単為発生胚はヘテロ接合型であり得る。他の実施形態では、単為発生胚はホモ接合型であり得る。
[0034] 方法の種々の実施形態では、刺激作用因子は、電気刺激、化学刺激又はその両方の組合せであり得る。いくつかの実施形態では、刺激作用因子は電気刺激であり得る。
[0035] 方法の種々の実施形態では、この方法は、隔離囲いから単為発生胚を排出する段階をさらに含み得る。方法の種々の実施形態では、この方法は、マイクロ流体装置から単為発生胚を排出する段階をさらに含み得る。
[0036] 方法の種々の実施形態では、この方法は、単為発生胚を１つ又は複数の胚性幹細胞（ＥＳＣ）に変換する段階をさらに含み得る。方法の種々の実施形態では、単為発生胚を１つ又は複数の胚性幹細胞に変換する段階は、孵化胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）を分離することをさらに含み得る。方法の種々の実施形態では、単為発生胚を１つ又は複数の胚性幹細胞に変換する段階は、マイクロ流体装置の隔離囲い内でＩＣＭを培養することをさらに含み得る。隔離囲い内でＩＣＭを培養する段階は、ＩＣＭとフィーダー細胞とを共培養することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＣＭとフィーダー細胞とを共培養する段階は、ＩＣＭが配置される隔離囲いに隣接した隔離囲い内にフィーダー細胞を配置することを含み得る。
[0037] 方法の種々の実施形態では、単為発生胚を１つ又は複数の胚性幹細胞に変換する段階は、ＩＣＭを１つ又は複数の胚性幹細胞（ＥＳＣ）に変換することをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＥＳＣは、実質的にホモ接合型であり得る。いくつかの実施形態では、実質的にホモ接合型のＥＳＣは、二倍体であり得、変異対立遺伝子に関してホモ接合型であり得る。他の実施形態では、１つ又は複数のＥＳＣは、実質的にヘテロ接合型であり得る。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＥＳＣは、卵母細胞のドナーとヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致するものであり得る。
[0038]本発明のいくつかの実施形態によるマイクロ流体装置及びそれに付随する制御装置とともに使用するシステムの例を示す図である。 [0039]本発明のいくつかの実施形態によるマイクロ流体装置を示す図である。 [0039]本発明のいくつかの実施形態によるマイクロ流体装置を示す図である。 [0040]本発明のいくつかの実施形態による隔離囲いを示す図である。 [0040]本発明のいくつかの実施形態による隔離囲いを示す図である。 [0041]本発明のいくつかの実施形態による隔離囲いの詳細を示す図である。 [0042]本発明の一実施形態によるマイクロ流体装置を示す図である。 [0043]本発明のいくつかの実施形態によるマイクロ流体装置及びそれに付随する制御装置とともに使用するシステムの具体例を示す図である。 [0044]本発明のいくつかの実施形態による撮像装置を示す図である。 [0045]流路と胚が位置する隔離囲いとを有するマイクロ流体装置の略図である。 [0046]流路内に位置するビーズを有する図４のマイクロ流体装置の略図である。隔離囲い内の胚が分析物を分泌し、これが流路内のビーズに向かって拡散し、ビーズによって捕捉され得る。一細胞期（図５Ａ）、二細胞期（図５Ｂ）、四細胞期（図５Ｃ）をはじめとする目的の細胞期を含めた胚発生過程の１つ又は複数の時点で結合した分析物の量及び種類についてビーズを分析し得る。 [0046]流路内に位置するビーズを有する図４のマイクロ流体装置の略図である。隔離囲い内の胚が分析物を分泌し、これが流路内のビーズに向かって拡散し、ビーズによって捕捉され得る。一細胞期（図５Ａ）、二細胞期（図５Ｂ）、四細胞期（図５Ｃ）をはじめとする目的の細胞期を含めた胚発生過程の１つ又は複数の時点で結合した分析物の量及び種類についてビーズを分析し得る。 [0046]流路内に位置するビーズを有する図４のマイクロ流体装置の略図である。隔離囲い内の胚が分析物を分泌し、これが流路内のビーズに向かって拡散し、ビーズによって捕捉され得る。一細胞期（図５Ａ）、二細胞期（図５Ｂ）、四細胞期（図５Ｃ）をはじめとする目的の細胞期を含めた胚発生過程の１つ又は複数の時点で結合した分析物の量及び種類についてビーズを分析し得る。
[0047] 本明細書には、本発明の例示的な実施形態及び応用が記載される。しかし、本発明は、これらの例示的な実施形態及び応用にも、本明細書でそれらが作動する方法又はそれらが記載される方法にも限定されない。さらに、図面は簡略化した図又は部分的な図を示す場合があり、図中の要素の寸法は強調などによって比率がずれている場合がある。さらに、本明細書で「〜上にある」、「〜と結合している」、「〜と連結されている」、「〜と接続されている」という用語又はこれと類似した語を使用する場合、ある要素が、直接別の要素上にある、別の要素と直接結合している、別の要素と直接連結されている、又は別の要素と直接接続されているか、その要素と別の要素との間に１つ又は複数の介在する要素が存在するかに関係なく、その要素（例えば、材料、層、基板など）が、別の要素「上にある」か、別の要素「と結合している」か、別の要素「と連結されている」か、又は別の要素「と接続されている」ことになり得る。このほか、文脈上別の意味を表す場合を除き、方向（例えば、上（ａｂｏｖｅ）、下（ｂｅｌｏｗ）、上（ｔｏｐ）、下（ｂｏｔｔｏｍ）、側方（ｓｉｄｅ）、上（ｕｐ）、下（ｄｏｗｎ）、下（ｕｎｄｅｒ）、上（ｏｖｅｒ）、上（ｕｐｐｅｒ）、下（ｌｏｗｅｒ）、水平、垂直、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」など）が記載される場合、それは相対的なものであり、単に例を挙げるほか、説明及び考察を容易にするために記載されるのであって、限定するためのものではない。さらに、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）に言及する場合、それは、列記される要素のみのうちのいずれか１つのもの、列記される要素の全部に満たないものの任意の組合せ及び／又は列記される要素全部の組合せを包含するものとする。本明細書の節の分割は、単に概観を容易にするためのものであって、考察される要素のいかなる組み合わせも限定するものではない。
[0048] 本明細書で使用される「実質的に」は、意図する目的に十分に効果があることを意味する。したがって、「実質的に」という用語は、当業者によって予想されると思われるが全体的な性能にはほとんど影響を及ぼさない絶対的又は完全な状態、寸法、測定値、結果などからのごくわずかなずれを許容するものである。数値もしくはパラメータ又は数値で表すことが可能な特徴に関して使用する場合、「実質的に」は１０％以内を意味する。
[0049] 「もの（ｏｎｅｓ）」という用語は２つ以上を意味する。
[0050] 本明細書で使用される「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上であり得る。
[0051] 本明細書で使用される「配置される」という用語は、「位置する」という意味を包含する。
[0052] 本明細書で使用される「マイクロ流体装置」とは、流体を保持するよう設計された１つ又は複数の別個のマイクロ流体回路を含み、各マイクロ流体回路が、相互に流体連結された（特に限定されないが）領域（１つ又は複数）、流路（１つ又は複数）、チャネル（１つ又は複数）、チャンバ（１つ又は複数）及び／又は囲い（１つ又は複数）を含めた回路要素と、流体（及び任意選択で、流体に浮遊している微小物体）がマイクロ流体装置に流入し、かつ／又はマイクロ流体装置から流出することができるよう設計された少なくとも２つの出入口とからなる、装置のことである。マイクロ流体装置のマイクロ流体回路は通常、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルと少なくとも１つのチャンバとを含み、約１ｍＬ未満、例えば約７５０μＬ未満、５００μＬ未満、２５０μＬ未満、２００μＬ未満、１５０μＬ未満、１００μＬ未満、７５μＬ未満、５０μＬ未満、２５μＬ未満、２０μＬ未満、１５μＬ未満、１０μＬ未満、９μＬ未満、８μＬ未満、７μＬ未満、６μＬ未満、５μＬ未満、４μＬ未満、３μＬ未満又は２μＬ未満の体積の流体を保持する。ある特定の実施形態では、マイクロ流体回路は、約１〜２μＬ、１〜３μＬ、１〜４μＬ、１〜５μＬ、２〜５μＬ、２〜８μＬ、２〜１０μＬ、２〜１２μＬ、２〜１５μＬ、２〜２０μＬ、５〜２０μＬ、５〜３０μＬ、５〜４０μＬ、５〜５０μＬ、１０〜５０μＬ、１０〜７５μＬ、１０〜１００μＬ、２０〜１００μＬ、２０〜１５０μＬ、２０〜２００μＬ、５０〜２００μＬ、５０〜２５０μＬ又は５０〜３００μＬを保持する。
[0053] 本明細書で使用される「ナノ流体装置」とは、約１μＬ未満、例えば約７５０、５００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１ｎＬ未満又はそれ以下の体積の流体を保持するよう設計された少なくとも１つの回路要素を含むマイクロ流体回路を有する、一種のマイクロ流体装置のことである。ナノ流体装置は通常、複数の回路要素（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００又はそれ以上の回路要素）を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの回路要素のうち１つ又は複数（例えば、全部）のものが、約１００ｐＬ〜１ｎＬ、１００ｐＬ〜２ｎＬ、１００ｐＬ〜５ｎＬ、２５０ｐＬ〜２ｎＬ、２５０ｐＬ〜５ｎＬ、２５０ｐＬ〜１０ｎＬ、５００ｐＬ〜５ｎＬ、５００ｐＬ〜１０ｎＬ、５００ｐＬ〜１５ｎＬ、７５０ｐＬ〜１０ｎＬ、７５０ｐＬ〜１５ｎＬ、７５０ｐＬ〜２０ｎＬ、１〜１０ｎＬ、１〜１５ｎＬ、１〜２０ｎＬ、１〜２５ｎＬ又は１〜５０ｎＬの体積の流体を保持するよう設計されている。他の実施形態では、少なくとも１つの回路要素のうち１つ又は複数（例えば、全部）のものが、約１００〜２００ｎＬ、１００〜３００ｎＬ、１００〜４００ｎＬ、１００〜５００ｎＬ、２００〜３００ｎＬ、２００〜４００ｎＬ、２００〜５００ｎＬ、２００〜６００ｎＬ、２００〜７００ｎＬ、２５０〜４００ｎＬ、２５０〜５００ｎＬ、２５０〜６００ｎＬ又は２５０〜７５０ｎＬの体積の流体を保持するよう設計されている。
[0054] 本明細書で使用される「マイクロ流体チャネル」又は「フローチャネル」は、マイクロ流体装置の流動領域であって、長さが水平寸法及び垂直寸法の両方よりもはるかに長い流動領域を指す。例えば、フローチャネルは、垂直寸法又は垂直寸法のいずれかの少なくとも５倍の長さ、例えば少なくとも１０倍の長さ、少なくとも２５倍の長さ、少なくとも１００倍の長さ、少なくとも２００倍の長さ、少なくとも５００倍の長さ、少なくとも１，０００倍の長さ、少なくとも５，０００倍の長さ又はそれ以上であり得る。いくつかの実施形態では、フローチャネルの長さは、間の任意の範囲を含めた約５０，０００ミクロン〜約５００，０００ミクロンの範囲内にある。いくつかの実施形態では、水平寸法は約１００ミクロン〜約１０００ミクロン（例えば、約１５０〜約５００ミクロン）の範囲内にあり、垂直寸法は約２５ミクロン〜約２００ミクロン、例えば約４０〜約１５０ミクロンの範囲内にある。フローチャネルは、マイクロ流体装置内で様々な空間的構造をとり得るものであり、したがって、完全に直線状の要素に限定されないことが留意される。例えば、フローチャネルは、以下の構造：曲線構造、曲げ構造、らせん構造、傾斜構造、下降傾斜構造、フォーク型構造（例えば、複数の異なる流路）及びその任意の組合せのうちのいずれかを有する１つ又は複数の区画を含み得る。さらに、フローチャネルは、その通路に沿って断面積が異なっており、フローチャネル内に所望の流体流動が生じるよう拡張及び狭窄しているものであり得る。
[0055] 本明細書で使用される「閉塞」という用語は一般に、目的とする微小物体がマイクロ流体装置内の２つの異なる領域又は回路要素の間を移動するのを（完全にではなく）部分的に妨げるのに十分な大きさの隆起又はそれに似た構造を指す。２つの異なる領域／回路要素は、例えば、マイクロ流体隔離囲いとマイクロ流体チャネル又はマイクロ流体隔離囲いの接続領域と隔離領域であり得る。
[0056] 本明細書で使用される「狭窄部」という用語は一般に、マイクロ流体装置の回路要素（又は２回路要素間の接合部）の幅が狭くなっている部分を指す。狭窄部は、例えば、マイクロ流体隔離囲いとマイクロ流体チャネルとの間の接合部又はマイクロ流体隔離囲の隔離領域と接続領域との間の接合部に位置し得る。
[0057] 本明細書で使用される「透明」という用語は、可視光が通過する際にそれを実質的に変化させずに通過させる材料を指す。
[0058] 本明細書で使用される「微小物体」という用語は一般に、本発明に従って分離及び収集され得る任意の微視的物体を指す。微小物体の非限定的な例としては、無生物微小物体、例えば微粒子；マイクロビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）ビーズなど）；磁気ビーズ；マイクロロッド；マイクロワイヤ；量子ドットなど；生物学的微小物体、例えば細胞（例えば、胚、卵母細胞、卵細胞、精子細胞、組織から分離した細胞、真核細胞、原生生物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、免疫細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞系由来の細胞、癌細胞、感染細胞、トランスフェクト及び／又は形質転換した細胞、レポーター細胞、原核細胞など）；生体小器官；小胞又は複合体；合成小胞；リポソーム（例えば、合成リポソーム又は膜調製物に由来するリポソーム）；脂質ナノラフト（Ｒｉｔｃｈｉｅら（２００９）「Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ Ｂｉｌａｙｅｒ Ｎａｎｏｄｉｓｃｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，４６４：２１１−２３１に記載されているもの）など；あるいは無生物微小物体と生物学的微小物体の組合せ（例えば、細胞と結合させたマイクロビーズ、リポソームでコートしたマイクロビーズ、リポソームでコートした磁気ビーズなど）が挙げられる。ビーズはさらに、共有結合又は非共有結合した他の部分／分子、例えば、アッセイに使用することが可能な蛍光標識、タンパク質、小分子シグナル伝達部分、抗原又は化学的／生物学的種などを有し得る。
[0059] 本明細書で使用される「細胞（１つ又は複数）の維持」という用語は、流体状成分及びガス状成分の両方と、任意選択で表面とを含み、細胞の生存及び／又は拡大を維持するのに必要な条件をもたらす環境を与えることを指す。
[0060] 流体培地の「成分」とは、培地中に存在する、溶媒分子、イオン、小分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝産物などを含めた任意の化学分子又は生化学分子のことである。
[0061] 本明細書で流体培地に関して使用される「拡散する」又は「拡散」は、流体培地の成分が濃度勾配に従って熱運動することを指す。
[0062] 「培地流」という語句は、主に拡散以外の任意の機序による流体培地のバルク移動を意味する。例えば、培地流は、流体培地がある地点から別の地点まで２地点間の圧力の差によって移動することを含み得る。このような流れは、液体の持続的な流れ、パルス状の流れ、周期的な流れ、ランダムな流れ、間欠的な流れもしくは往復の流れ又はその任意の組合せを含み得る。ある流体培地が別の流体培地に流入すると、培地の乱流及び混合が起こり得る。
[0063] 「実質的に流れがない」という語句は、経時的に平均値を求めた流体培地の流速が、物質（例えば、目的の分析物）の諸成分の流体培地内への拡散速度に満たないことを指す。このような物質の成分の拡散速度は、例えば、温度、諸成分の大きさ及び諸成分と流体培地との間の相互作用の強さに左右され得る。
[0064] 本明細書でマイクロ流体装置内の異なる領域に関して使用される「流体連結された」という語句は、異なる領域が実質的に流体培地などの流体で満たされているとき、各領域の流体が単一の流体を形成するよう連結されていることを意味する。これは、異なる領域内の流体（又は流体培地）の組成が必ず一致するという意味ではない。むしろ、マイクロ流体装置の流体連結された異なる領域内の流体は、溶質がそれぞれの濃度勾配に従って移動し、かつ／又は流体が装置の中を流れるため組成が流動的であり、組成が異なるものとなり得る（例えば、タンパク質、炭水化物、イオンをはじめとする分子などの溶質の濃度が異なり得る）。
[0065] マイクロ流体（又はナノ流体）装置は、「通過」領域と「非通過」領域とを含み得る。本明細書で使用される「通過」領域は、マイクロ流体回路の１つ又は複数の相互に流体連結された回路要素からなり、流体がマイクロ流体回路の中を流れる際に各回路要素に培地が流れる。通過領域の回路要素は、例えば、領域、チャネル及びチャンバの全部もしくは一部分を含み得る。本明細書で使用される「非通過」領域は、マイクロ流体回路の１つ又は複数の相互に流体連結された回路要素からなり、流体がマイクロ流体回路の中を流れる際に各回路要素には実質的に流体が流れない。非通過領域は通過領域と流体連結されていてよいが、ただし、流体連結は、通過領域と非通過領域との間で拡散は可能であるが、培地の流れは実質的に可能ではない構造を有する。したがって、マイクロ流体装置は、実質的に通過領域内の培地の流れから非通過領域を分離するが、実質的に通過領域と非通過領域との間の拡散性の流体連絡は可能な構造を有し得る。例えば、マイクロ流体装置のフローチャネルは通過領域の一例であり、マイクロ流体装置の隔離領域（のちにさらに詳細に説明する）は非通過領域の一例である。
[0066] 本明細書で使用される「流路」は、培地流の経路を定め、培地流に曝される１つ又は複数の流体連絡された回路要素（例えば、チャネル（１つ又は複数）、領域（１つ又は複数）、チャンバ（１つ又は複数）など）を指す。したがって、流路はマイクロ流体装置の通過領域の一例である。ほかの回路要素（例えば、非通過領域）が、流路の培地流に曝されずに流路を含む回路要素と流体連絡されていてよい。
[0067] 本明細書で使用される場合、μｍはマイクロメートルを意味し、μｍ３は立方マイクロメートルを意味し、ｐＬはピコリットルを意味し、ｎＬはナノリットルを意味し、μＬ（又はｕＬ）はマイクロリットルを意味する。
[0068] 本明細書で使用される「胚」は、受精卵から生じ、着床前の任意の発生段階にあるものである。したがって、胚という用語は、接合子、桑実胚、胞胚などを包含する。
[0069] 本発明の諸実施形態は、胚、精子又は卵細胞などの生物学的微小物体の状態のモニタリングを可能にするものであり、生物学的微小物体はマイクロ流体（又はナノ流体）装置内に位置する。モニタリングは、光学的分析、化学的分析及び／又は電気的分析を含み得る。モニタリングはさらに生物学的微小物体の調整処理を含んでよく、この調整処理は生物学的微小物体の光学的分析、化学的分析及び／又は電気的分析の前及び／又は後に実施してよい。生物学的微小物体の状態は、ほかの対応する生物学的微小物体と比較して判定することができる。あるいは、所定の特徴と比較して生物学的微小物体の状態を判定してもよい。このような所定の特徴は、健康状態及び生存能と相関するものであり得る。
[0070] いくつかの実施形態では、生物学的微小物体の状態をモニタする前に、生物学的微小物体をマイクロ流体装置内又は装置内の隔離囲いなどの特定の領域内に負荷する。マイクロ流体装置は、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルと１つ又は複数（例えば、複数）の隔離囲いとを含む第一の領域を有し、ここでは、囲いがチャネルに開口している。各囲いは隔離領域と接続領域とを有するよう設計されていてよく、ここでは、隔離領域は、拡散によってのみ隔離領域内の流体培地の成分と、チャネル内の流体培地の成分とを交換する。マイクロ流体装置の第一の領域は、卵母細胞、卵細胞又は胚などの生物学的微小物体が各隔離囲い内に１個ずつ維持され得る場所となり得る。いくつかの実施形態では、精子も隔離囲い内に保管され得るが、隔離囲い内にグループとして維持されるか、隔離囲い内に個別に維持され得る。
[0071] いくつかの実施形態では、マイクロ流体装置は第二の領域をさらに含み得る。第二の領域は、選択領域であり得、第一の領域の上流に位置し得る。選択領域は、第一の領域のチャネル（存在する場合）と連結され得る少なくとも１つのチャネルを含み得る。任意選択で、選択領域は隔離囲いを含まないものであり得る（例えば、選択領域は、チャネルからなるもの又はチャネルから実質的になるものであり得る）。選択領域内のチャネルの長さは第一の領域のチャネルの長さと同じであり得るか、選択領域内のチャネルの長さは、第一の領域内のチャネルの長さの１倍、２倍、３倍、５倍、７倍、９倍又は２５であり得る。選択領域は、入口と隔離領域との間に配置され得る。
[0072] 選択領域を用いて、取り込まれた生物学的微小物体のうち隔離領域内の選択された隔離囲い内に配置するもの又は選択領域そのものの中で検査するものを選択し得る。選択領域内の延長チャネルを用いて、マイクロ流体装置内に導入された精子の遊泳領域を設け得る。遊泳領域（延長チャネル）は、最も運動性の高い（適応性のある）精子を選択し得る。最も速い精子は、遅く適応性のない精子が卵細胞に到達する前に卵細胞の入った隔離囲いに到達する（参照により全体が本明細書に組み込まれるＧａｒｃｉａら，米国特許第９，０７９，１８９号を参照されたい）。
[0073] 生物学的微小物体又は微小物体、例えば、特に限定されないがビーズなどの負荷には、流体流動、重力、誘電泳動（ＤＥＰ）力、エレクトロウェッティング、磁力又はその任意の組合せを用いることができる。ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構造などによって光学的に、かつ／又は時間的／空間的パターンで電極／電極領域を活性化させることなどによって電気的に発生させることができる。同じように、エレクトロウェッティング力をオプトエレクトロウェッティング（ＯＥＷ）構造などによって光学的に、かつ／又は電極／電極領域を時間的空間的パターンで活性化させることなどによって電気的に生じさせ得る。
[0074] いくつかの実施形態では、マイクロ流体装置内で生物学的微小物体が形成された（例えば、マイクロ流体装置内での卵細胞の受精による胚形成）後に、その状態をモニタする。このような実施形態では、受精前に卵細胞及び／又は精子をモニタし、胚形成後に生じた胚をモニタすることができる。
[0075] モニタリング。いくつかの実施形態では、生物学的微小物体のモニタリングは、生物学的微小物体がマイクロ流体装置内にある間にその形態及び／又は運動を検出することを含む。このような検出は、顕微鏡による観察あるいは生物学的微小物体を１回もしくは複数回（例えば、定期的に）又は継続的に（例えば、ビデオで録画する）撮像することを含み得る。胚では、このような観察又は撮像を用いて、大きさ、形状及び細胞分裂の時期を判定することができる。細胞分裂の時期は胚生存能の指標として用いることができる。卵細胞では、このような観察又は撮像を用いて、大きさ及び形状を評価することができる。精子では、このような観察又は撮像を用いて、大きさ、形状、運動能及び／又は走化性反応を評価することができる。卵細胞及び精子の両方には、隔離囲い内又はその上流の選択領域内のチャネル内で形態及び／又は運動をモニタすることによって可能な評価（例えば、卵細胞又は精子の状態の確認）により、調整処理（刺激をはじめとする増強処理を含み得る）を実施して卵細胞又は精子の生存能及び／又は活性を増大させる判断が下され得る。モニタリング及び／又は評価は、受精処置過程の１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上の時点で実施し、受精後の１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上の時点で継続し得る。卵細胞の状態は、隔離囲いの隔離領域内に卵細胞を配置する前に（例えば、マイクロ流体チャネル内で）確認しても、あるいは卵細胞が既に隔離囲いの隔離領域内に配置されているときに確認してもよい。
[0076] 形態学的検査。本明細書に記載されるマイクロ流体装置及び隔離囲いの中での可視化を容易であれば、精子及び／又は胚の形態学的評価及び順位付けを実施する機会が増える。目視検査は、顕微鏡を用いる目視検査、マイクロ流体装置を含む機器の光学系による撮像又はビデオ画像の取得を含んでよく、これらは遠隔で映写又はアクセスし得る。１つの非限定的な例では、科学作業グループの合意によって確立された評価を用いて、卵母細胞、卵細胞又は胚の品質の評価及び順位付けを実施し得る。「Ｔｈｅ Ｉｓｔａｎｂｕｌ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ ｅｍｂｒｙｏ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ：ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ａｎ ｅｘｐｅｒｔ ｍｅｅｔｉｎｇ」，Ｈｕｍａｎ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．６．ｐｐ１２７０−１２８３（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）には順位付けの基準がいくつか記載されている。細胞質の特徴、前核の特徴、極体の挙動（例えば、第二極体の位置）及び胚の分裂に関して標準比較を実施してもよい。さらに、形態運動的（ｍｏｒｐｈｏｋｉｎｅｔｉｃ）変数を用いて生存可能な胚を判定してもよい。いくつかの有用な比較物は、５細胞に分裂するのにかかる時間（約４８〜約５７時間）；３細胞から４細胞に分裂するまでの時間（約０．７６時間未満）；及び細胞分裂の第二周期の持続時間（２細胞への分裂から３細胞への分裂までの時間、約１２時間未満）であり得る（Ｍｉｌａｃｈｉｃｈ，ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓ．Ｉｎｔｌ．２０１４，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ３０６５０５）。いくつかの実施形態では、分裂の程度が胚発生の質に逆相関することがあり、そのような分裂を厳密に調べることができることが、本明細書に記載されるマイクロ流体装置での胚培養の利点である。
[0077] 非侵襲的分析。いくつかの実施形態では、生物学的微小物体の状態のモニタリングは、生物学的微小物体の１つ又は複数の分泌物を分析することを含む。分泌物は、タンパク質、核酸、炭水化物、代謝産物、上記のもののいずれかのフラグメント又はその任意の組合せを含み得る。分析は例えば、このような分泌物のプロテオミクス評価及び／又はゲノム評価を含み得る。いくつかの実施形態では、分泌物がマイクロ流体装置内に位置する間に、その一部又は全部を分析することができる。他の実施形態では、分泌物がマイクロ流体装置から排出された後、その一部又は全部を分析することができる。例えば、隔離囲い内の流体のアリコートを採取し、その中に存在する分泌物を分析することができる。アリコートをマイクロ流体装置内で、又はそこから排出された後で、適切な試薬（例えば、アリコート中の分泌物と反応して検出可能なシグナルを発生する試薬）と組み合わせることができる。上記のものに代えて、又はこれに加えて、隔離囲い内の生物学的微小物体（１つ又は複数）の分泌物を１つ又は複数の捕捉ビーズで捕捉し、マイクロ流体装置内で、又はそこから排出された後、その捕捉ビーズに結合した分泌物を分析することができる。いくつかの実施形態では、分泌物の分析を経時的に繰り返し、隔離囲い内の生物学的微小物体の時間分解分泌プロファイルを作成することができる。
[0078] いくつかの実施形態では、分泌分析（例えば、単一時点の分泌プロファイル又は時間分解分泌プロファイル）及び／又はその他の情報（例えば、単一時点又は時間分解の形態学的データ及び／又は運動能に関するデータ）を用いて、さらに処理を実施する生物学的微小物体を選択することができる。例えば、分泌分析及び／又はその他の情報を用いて、受精させる卵細胞及び／又は精子を選択したり、着床させる胚を選択したりすることができる。米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号（２０１４年１０月２２日に出願された米国特許出願第１４／５２０，５６８号）及び米国特許出願公開第２０１５／０１６５４３６号（２０１４年１０月２２日に出願された米国特許出願第１４／５２１，４４７号）（全体が参照により本明細書に組み込まれる）には、マイクロ流体装置、具体的にはマイクロ流体装置１００、２００、２４０、２９０のいずれかで培養した細胞の分泌物を分析する例示的な方法が記載されている。
[0079] 本発明のいくつかの実施形態の利点としては、胚、精子、卵細胞又は卵母細胞などの生物学的微小物体の生存能を維持したままそれを限られた空間内に置き、その形態及び運動能の検出及び／又は追跡を可能にし、精確にアッセイするのに十分な濃度の分泌物を生じさせることが可能であることが挙げられる。マイクロ流体装置の隔離囲い内で卵細胞、胚又は精子が占める限られた空間の大きさは、ヒトの卵細胞又は胚の大きさの約５〜約５０倍の範囲内（例えば、約２ｎＬ〜約１０ｎＬ、約２ｎＬ〜約２０ｎＬ、約５ｎＬ〜約１５ｎＬ、約５ｎＬ〜約２０ｎＬ、約５〜約２５ｎＬ、約１０ｎＬ〜約２０ｎＬ、約１０ｎＬ〜約３０ｎＬ、約１０〜約４０ｎＬ又は約１０ｎＬ〜約５０ｎＬ）であり得る。その他の利点としては、ビーズを使用するか少量の培地を採取して分泌の時間応答を測定し；生物学的微小物体の局所環境を乱さずに培地のアリコート及び／又はビーズを移し；分泌又は放出された物質（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、代謝産物及び／又はそのフラグメント）を分析して生物学的微小物体の状態及び品質に関する情報を収集し、それにより好ましい（例えば、健常である、生存可能であるなど）生物学的微小物体の選択が可能になることが挙げられる。本明細書に記載されるマイクロ流体装置を用いて複数個の生物学的微小物体のうち１個のみを選択することが可能であるのは、マイクロ流体装置内の限定された場所の中に高い選択性で配置し、微小物体の状態と位置とを相関させることができる点で有利である。さらに、生物学的微小物体の取込み及び排出も同様に高度に選択的かつ特異的なものとなり得、本明細書に記載される方法の別の有利な態様となる。モニタリング及び撮像が容易であることは、この方法のさらなる有利な態様となる。さらに、物質を特異的かつ選択的に捕捉するアッセイビーズの取込みが容易であるため、生物学的微小物体を非侵襲的にアッセイが極めて柔軟性に富むものとなる。このほか、互いに十分に分離された極めて少量の培養物を使用することが可能であるため、特定の生物学的微小物体の状態をモニタし、任意選択でその生殖適応度を高めることが極めて特異的かつ選択的に可能である。あるいは、本明細書に記載される方法の上記の特性により、生殖補助の過程を進行させることから除外するべき生物学的微小物体の特定をより早い段階で、かつより正確に実施することが可能となり得る。上記の性能はいずれも、生殖補助（例えば、ヒトの生殖補助）の分野で、さらに範囲を広げれば生殖技術の分野で満たされていない喫緊の必要性に応えるものである。
[0080] 捕捉ビーズ。本明細書に記載される分析に使用するビーズは、ガラス、ポリマー材料及び磁性材料を含めた任意の適切な材料で作られたものであり得る。ビーズはさらに、捕捉物質、例えばオリゴヌクレオチド、タンパク質、抗体、抗原、多糖類又は卵細胞、精子もしくは胚から分泌又は放出される生体分子と結合するよう設計された合成分子などを結合させるための基質となるコーティング又はシェルを基材表面に有し得る。捕捉物質は、可溶性のものをはじめとする細胞外胚物質、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、代謝産物及び／又はそのフラグメントなどと結合し得る。検出は、可溶性又は細胞外の胚分泌物又はそのフラグメント全体を検出することを含み得る。
[0081] 分析。卵母細胞、卵細胞、精子又は胚などの生物学的微小物体に関して様々な非侵襲的分析を実施し得る。マイクロ流体装置内でｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する分析は、（例えば、母親由来の）ＤＮＡの混入による交絡作用を排除し、着床前に実施することが可能であり；目的とする単一胚を取り囲み、又は隣接し、典型的なＩＶＦ条件のものよりもはるかに少ない量の培地中で実施することが可能である点で有利である。したがって、胚遊離ＤＮＡをはじめとする分泌物質の濃度が大幅に増大することにより、目的とする細胞を取り囲む培地から効果的な被験物質を捕捉する確率が増大し得る。本明細書に記載される分析は、マイクロ流体装置内での分析物の収集を含む。マイクロ流体装置内で分析物を処理して、生物学的微小物体の状態又は評価した状態を得てもよい。あるいは、捕捉した分析物の処理（例えば、捕捉した核酸の増幅及びそれに続く増幅産物の検出）をマイクロ流体装置の外で実施してもよい。
[0082] 細胞遊離ＤＮＡ。目的とする欠陥に特異的な捕捉オリゴヌクレオチドを有する捕捉ビーズ上に細胞遊離ＤＮＡを捕捉することによって、卵母細胞、卵細胞、精子又は卵細胞の単一遺伝子欠陥の検出が可能となり得る。卵細胞もしくは胚を収納している隔離囲い内又は隔離囲いの近位開口部に隣接するマイクロ流体チャネル内で単一の卵細胞又は胚から、捕捉ビーズ上に捕捉できる程度の量のＤＮＡが放出され得る。捕捉ビーズは、全核酸を補足するか、核酸の１つ又は複数の特定のサブセット（例えば、ｇＤＮＡ、ｍＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）を補足し得るよう設計されたビーズと結合又は会合した捕捉物質を有し得る。捕捉物質は、特に限定されないが電荷親和性又は配列相補性などの相互作用に基づくものであり得る。マイクロリットル量の使用済み細胞培地には、捕捉し、蛍光間隙ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析によりαサラセミアの原因となるαグロビン遺伝子欠失を検出する分析に供するのに十分な細胞遊離ＤＮＡが含まれていることが明らかにされている（Ｗｕら，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１５；９４；ｅ６６９）。標的遺伝子の１つ又は複数の領域に特異的な捕捉オリゴヌクレオチドを設計することによって、ほかの単一遺伝子欠陥（例えば、テイ・サックス病、ＢＲＣＡ又は嚢胞性線維症）も検出し得る。このような結合オリゴヌクレを有する捕捉ビーズは、大量並列シーケンシング（次世代シーケンシング（ＮＧＳ））、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、二重分子ビーコンレポータープローブを用いるリアルタイムＰＣＲ又はマイクロアレイ検出による検出に十分なＤＮＡを捕捉し得る。ネステッドＰＣＲを用いて、捕捉したＤＮＡを十分に増幅すると同時に高サイクル数によるエラーを減らし得る。ＰＣＲ反応に標識の異なる対照試料を用いて比較ゲノムハイブリダイゼーションを実施することにより、バイアスのかかったＰＣＲの影響を抑え得る。
[0083] 単一遺伝子欠陥以外にも、卵母細胞、卵細胞又は胚の異数性分析に、効率的に増幅した低投入量の試料を用いるＳＮＰアレイを用い得る。異数性分析にはｄＰＣＲを用いてもよく、この場合、目的とする染色体の多型対立遺伝子に対するプライマーにより、異数体の卵母細胞、卵細胞又は胚に正倍数体のものとは異なるバランスのシグナルを付与することができる。多重定量蛍光ＰＣＲ（ＱＦ−ＰＣＲ）にショートタンデムリピート（ＳＴＲ）マイクロサテライトフラグメント解析を用いて異数性を検出し得る。Ｘ染色体及びＹ染色体の異数性に対する１０重ＱＦ−ＰＣＲパネルが明らかにされている。このパネルは２つの常染色体ＳＴＲを含むものである（Ｘｉｅ，ＰＬＯＳ ｏｎｅ ２０１４：９：ｅ１０６３０７）。最近開発された別のパネルは、１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、Ｘ染色体及びＹ染色体異数性を対象とし、相同遺伝子定量的ＰＣＲ（ＨＧＱ−ＰＣＲ）を用いて、より時間のかかる核型分析法と同じコピー数に関する情報を得るものである（Ｌｏｎｇ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｒｅｐｏｒｔｓ：２０１３：８：１６０１−１６０５）。同胞の組織適合性を検査する際に、ＳＴＲ解析を用いてヒト白血球抗原の一致を判定し得る。ＰＣＲ増幅のエラーが少ない場合、全ゲノム分析（ＷＧＡ）によって最大量の情報が得られる。着床前又は受精の判定に関する遺伝情報に主眼を置くパネルをマイクロ流体スケールで得られた使用済みの培地又は胚の分泌物の試料に用いれば、極めて重要な情報が得られる。
[0084] 胚の適応度の全般的な測定は、全ＤＮＡを捕捉し、次いでｍｔＤＮＡ／ｇＤＮＡ比を検出することによって実施し得る。初期胚では、ｍｔＤＮＡの存在量の増大が分裂速度と強く相関し得る。分裂速度が速いことは、発生及び着床が成功する可能性が低いことを示し得る。
[0085] タンパク質。オートクリン分泌物又はパラクリン分泌物は、ビーズ上での抗体捕捉によってモニタし得る。リポカリン−１のレベルの増大と胚の異数性との間には相関があることがわかっており、このタンパク質に対する抗体を含むビーズは、チップ外での分析に十分なタンパク質（例えば、卵細胞を保持する隔離囲いの中で、又はそこから分散するもの）を捕捉し得る。この方法で多数のタンパク質産物が検出されれば、定量化が促進され得る。ほかにも、（胚セクレトームから）可溶性の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、マクロファージ刺激タンパク質α（ＭＳＰ−α）；幹細胞因子（ＳＣＦ）、ケモカイン（ＣＸＣ−モチーフ）リガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド受容体３（ＴＲＡＩＬＲ３）、マクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ−１β）及びＧＭ−ＣＳＦを含めた他のタンパク質と異数性との相関を分析し得る。
[0086] 層化法としての電場下での物理的挙動の非侵襲的分析。いくつかの実施形態では、マイクロ流体装置内の誘電泳動場を用いて品質の高い卵母細胞、卵細胞又は胚を識別し得る。これらの細胞は分極性であるため、誘電泳動場を用いて、特定の細胞が導電率の低い培地（例えば、０．３Ｍソルビトール）中、場の影響下で移動する速度を分類し得る。いくつかの実施形態では、卵母細胞、卵細胞又は胚などの微小物体は、より完全に発生したものの方が比較的発生の進んでいない微小物よりも相対的に速く移動する。これは、遺伝子発現の差によって転写レベルに差が生じることによると考えられる。本明細書に記載されるマイクロ流体装置では、必要に応じて迅速に培地の交換を遂行することができる。微小物体を囲い内又はチャネル内で検査し、既知の場所に戻し、その位置を検査結果と相関させることができる（Ｇａｒｃｉａら，米国特許第９，０７９，１８９号）。
[0087] フィーダー細胞に近接した培養。本発明の諸実施形態はほかにも、適切な成長及び発生を促進し、生存妊娠の可能性を増大させ、かつ／又は生存妊娠が生じないと思われる胚に負の選択圧をかけやすくするフィーダー細胞に近接して生物学的微小物体（例えば、胚、卵細胞、卵母細胞）を培養することを可能にする。フィーダー細胞は、生物学的微小物体がフィーダー細胞の分泌物をサンプリングできるようにマイクロ流体装置の外部又は内部に位置し得る。例えば、マイクロ流体装置の内部に位置する場合、フィーダー細胞は、培地がマイクロ流体装置に入る前に流れるチャンバ内に位置し得る。マイクロ流体装置の内部に位置する場合、フィーダー細胞は、生物学的微小物体がフィーダー細胞の分泌物をサンプリングするように、共通流路の生物学的微小物体の上流にある領域（例えば、チャンバ）内に位置し得る。あるいは、フィーダー細胞は、生物学的微小物体と同じ隔離囲い内に位置し得る。フィーダー細胞は、例えば、子宮細胞、子宮内膜細胞、無線毛分泌細胞もしくは卵管（例えば、輸卵管又はファロピウス管）由来のＰＥＧ細胞の集団、卵巣（卵丘細胞）又はその組合せであり得る。フィーダー細胞としての卵丘細胞は、グルコース及びシステインをそれぞれ含有する標準培地から卵母細胞、卵細胞又は胚が代謝することが不可能な濃度で不可欠なピルビン酸及びシステインの濃度を供給し得る。卵丘細胞と任意選択で組み合わせた子宮細胞（又は子宮内膜細胞、無線毛分泌細胞及び／又はＰＥＧ細胞）は、正常な胚発生を維持する栄養素及び／又はシグナルを供給し得る。フィーダー細胞は、例えば将来の母親（例えば、生物学的母親又は代理母）から抽出することができる。あるいは、フィーダー細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏの細胞増殖を維持するのに従来用いられている線維芽細胞をはじめとする種類の細胞であり得る。
[0088] 培地。本発明の実施形態はほかにも、胚の初期発生の間（例えば、着床前培養相）の培地の最適化を可能にする。胚をマイクロ流体装置の囲い内で培養する場合、胚は還流される培地を拡散を介してサンプリングする。したがって、胚のモニタリング及び／又は上記の胚からの分泌物のサンプリングに応じて培地の組成を変化させることができる。培地の組成は、胚の培養期間中２回、３回、４回又はそれ以上変化させ得る。胚の培養期間に使用する培地の組成は、受精期間に使用した培地の組成から変化させてよく、受精期間に使用した培地自体は２回、３回又はそれ以上変化させ得る。胚が単細胞胚から桑実胚又は胞胚に発生するにつれて、培地の組成を１回又はそれ以上変化させ得る。例えば、胚発生過程の時期によってｐＨが異なるのが好ましいことが明らかにされている。したがって、培地を切り替えれば、観察される胚の特性に応じたｐＨの最適化が可能になる。
[0089] 受精前の評価から胚の着床前後までのワークフロー全体を通じて単一の培地を使用してもよく、任意選択で、卵母細胞活性化処置にも単一の培地を使用してよい。「汎用」培地の非限定的な例としては、Ｇ−ＴＬ（商標）（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社）及びＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＣＳＣ−Ｃ、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が挙げられる。他の実施形態では、培地を自然に連続になるよう設計し、卵母細胞／卵細胞／胚発生の特定の時間枠に使用し得る。連続培地系の一例には、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社のＧ−ＧＡＭＥＴＥ（商標）、Ｇ−１（商標）（核形成前から第２〜３日）、Ｇ−２（商標）（第３日から胚盤胞）のシリーズがある。いくつかの実施形態では、ＯＥＴ構造又はＯＥＷ構造を有するマイクロ流体装置内で使用するのに導電率が最適になるよう培地を設計し得る。適切な培地は、考え得る成分の中でもとりわけ、グルコース、フルクトース、ピルビン酸塩、デキストラン、タウリン、緩衝剤（特に限定されないが、炭酸水素塩、クエン酸塩、リン酸塩、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）又はモルホリノプロパン−１−スルホン酸（ＭＯＰＳ）を含む）、レチノイン酸、ヒアルロナン及び／又はヒアルロン酸／その塩、アミノ酸（全アミノ酸、ただし、ある特定の用途には、システイン及び非必須アミノ酸、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、アラニンなど）、抗酸化剤（特に限定されないが、システアミン、ビタミン（特に限定されないが、ビタミンＢに関連するナイアシンアミド、チアミン、ピリドキシン及び／又はリボフラビン、ビタミンＥに関連するトコフェロール及びトコトリエノールを含む）を含む）、サイトカイン（特に限定されないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む）、抗菌剤（例えば、ゲンタマイシン、テトラサイクリン）ならびに／あるいはキレート剤（非限定的な一例にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）がある）のうちの１つ又は複数のものを含有し得る。
[0090] いくつかの実施形態では、培地はシステインを含むものであり得、この場合、システインは、約１マイクロモル〜約５００マイクロモル；約１０マイクロモル〜約２５０マイクロモル；約５０マイクロモル〜約１５０マイクロモルの範囲又はそのいずれかに含まれる任意の値の濃度で存在する。種々の実施形態では、培地はシステアミンを含むものであり得、この場合、システアミンは、約５マイクロモル〜約１０００マイクロモル、約５０マイクロモル〜約５００マイクロモル、約１００マイクロモル〜約３００マイクロモルの範囲又はそのいずれかに含まれる任意の値の濃度で存在する。
[0091] いくつかの実施形態では、培地は、卵母細胞／卵細胞／胚／精子と同じ種の血清を含有し得る。いくつかの実施形態では、卵母細胞／卵細胞／胚／精子とは異なる種の血清を含有し得る。異なる種は異なる哺乳動物種であり得る。他の実施形態では、培地は無血清のものであり得る。
[0092] 培地中にカチオン塩（特に限定されないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム又は乳酸ナトリウムを含む）が存在してよく、培養期間中に導電率を様々なレベルに制御し得る。特に、誘電泳動力又はオプトエレクトウェッティング（ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｏｗｅｔｔｉｎｇ）を使用しない培養期間中に導電率を増大させ得る。誘電泳動又はエレクトロウェッティングを用いて操作する期間に塩含有量を低下させて低導電率の培地を供給し得る。異なる種類の培地中を容易に流れることができることにより、都合に合わせて導電率を変化させることが可能になり、したがって、生物学的微小物体の低導電率の培地への曝露が短期間に限定される。
[0093] 多数の様々な培地が市販されており、マイクロ流体装置内で使用するのに適したものもある。市販の培地としては、特に限定されないが：Ｇ−ＩＶＦ（商標）及びＧ−ＩＶＦ（商標）ＰＬＵＳ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社）；Ｇ−ＴＬ（商標）（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社）；Ｇ−ＭＯＰＳ（商標）（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社）；Ｇ−ＧＡＭＥＴＥ（商標）（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社）；ヒト卵管液（ＨＴＦ）、改変ＨＴＦ及び（Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）ＳＳＳ（商標）含有完全ＨＴＦ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｅｎｔｉｆｉｃ社）；改変Ｈａｍ Ｆ１０又はＦ１５基本培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）；Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）；Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ Ｈａｎｄｌｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）；Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｕｌｔｉｂｌａｓｔ（登録商標）培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）；Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＰＩ（登録商標）培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）；ＳＳＳ（商標）含有Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｅａｒｌｙ Ｃｌｅａｖａｇｅ（登録商標）培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）；（Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）ＤＳＳ含有Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｅａｒｌｙ Ｃｌｅａｖａｇｅ（登録商標）培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）；Ｑｕｉｎｎ’ｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）（Ｓａｇｅ（登録商標）培地）；ｇｌｏｂａｌ（登録商標）培地（ＬｉｆｅＧｌｏｂａｌ（登録商標）Ｇｒｏｕｐ社）；Ｇ−１（商標）及びＧ−２（商標）シリーズ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社）；Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｆｅｒｔ（商標）（ＯＲＩＧＩＯ（登録商標）社）；Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｆｅｒｔ（商標）／Ｃｌｅａｖ（商標）（ＯＲＩＧＩＯ（登録商標）社）；Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｃｌｅａｖ（商標）／Ｂｌａｓｔ（商標）（ＯＲＩＧＩＯ（登録商標）社）；Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｂｌａｓｔ（商標）（ＯＲＩＧＩＯ（登録商標）社）；Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＩＶＦ（ＯＲＩＧＩＯ（登録商標）社）；ＢｌａｓｔＧｅｎ（商標）（ＯＲＩＧＩＯ（登録商標）社）；ＩＳＭ１（商標）（ＯＲＩＧＩＯ（登録商標）社）；ＥｍｂｒｙｏＧｅｎ（登録商標）（ＯＲＩＧＩＯ（登録商標）社）；ＢｌａｓｔＡｓｓｉｓｔ（商標）（ＯＲＩＧＩＯ（登録商標）社）；ＥｌｌｉｏＳｔｅｐ ２（Ｅｌｌｉｏｓ ＢｉｏＭｅｄｉａ社）；ＢＭＩ（Ｅｌｌｉｏｓ ＢｉｏＭｅｄｉａ社）；ＳＭＡＲＴ２（Ｅｌｌｉｏｓ ＢｉｏＭｅｄｉａ社）；ＧＭ５０１（Ｇｙｎｅｍｅｄ社）；ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ（登録商標）ＨＴＦ（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ社）；ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ（登録商標）ＩＶＣ−ＯＮＥ（商標）（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ社）；ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ（登録商標）ＩＶＣ−ＴＷＯ（商標）（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ社）；ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ（登録商標）ＩＶＣ−ＴＨＲＥＥ（商標）（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ社）；ならびにＳｙｄｎｅｙ ＩＶＦ卵割／胚盤胞培地（Ｃｏｏｋ社）が挙げられる。
[0094] 活性化処置の培地。活性化のための培地は、上記の培地のうちの１つを用いるものであり得る。いくつかの実施形態では、培地は、改変Ｈａｍ培地、Ｇ−ＧＡＭＥＴＥ（商標）；Ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ Ｈａｎｄｌｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ又はこれと同様のいずれかの培地であり得る。いくつかの実施形態では、培地は、さらに血清が存在するものであり得る。あるいは、培地は無血清のものであり得る。いくつかの実施形態では、培地は無タンパク質、無ヒポキサンチン及び無抗生物質のものである。
[0095] 動的培養条件。いくつかの実施形態では、培養期間の一部又は全体にわたって動的条件を用いて、胚発生を促進することができる穏やかな刺激を加え得る。動的条件は、傾斜、灌流、回転又は振動のうちの１つ又は複数のものを含み得る。
[0096] マイクロ流体装置内の隔離囲いの配置。本発明の諸実施形態はほかにも、例えば子宮細胞又は子宮内膜細胞に近接させて囲いを整列又は配置することのほか、任意選択で、囲いに細胞を付着させ胚をとどまらせることを含み得る。次いで、胚からの分泌物及び胚の形態をモニタして、生存能が最も高い胚を特定することができる。評価に基づき、 胚（例えば、胞胚）を隔離囲いから排出し、マイクロ流体装置から排出して、将来の母親の中に着床させる。このようにして、モニタリングを進めながら好ましい胚の健康状態及び健全性を達成することができる。
[0097] 本発明の諸実施形態はほかにも、精子及び／又は卵細胞（又は卵母細胞）を個別に又はグループとして囲いの中に隔離すること、その分泌物及び形態を測定することならびにそれぞれの分泌物及び／又は形態に基づいて選択した精子と卵細胞を組み合わせて受精卵を形成させることを含み得る。次いで、上記のように、分泌及び／又は形態の適合性によって発生中の胚をモニタすることができる。これを精子、卵及び／又は胚を選択する既知の方法を利用するワークフローとして統合し、妊娠転帰を改善することができる。
[0098] 本発明の諸実施形態はほかにも、ある期間にわたって卵管及び／又は子宮の環境を刺激する微小環境をもたらすことができる。このことは、例えば、子宮細胞、子宮内膜細胞又は輸卵管もしくは卵管由来の細胞；このような細胞型の分泌物；培地のｐＨの調節；培地中の増殖因子の調節；ならびに／あるいはその他の当該技術分野で公知の条件の導入し環境を制御することによって達成することができる。
[0099] さらに、隔離囲いは、生物学的微小物体（１つ又は複数）から精確な分析が可能な程度の濃度の分泌物が得られるようにする大きさであり得る。したがって、例えば、隔離囲いは少なくとも２×１０６μｍ３、３×１０６μｍ３、４×１０６μｍ３、５×１０６μｍ３、６×１０６μｍ３、７×１０６μｍ３、８×１０６μｍ３、９×１０６μｍ３、１×１０７μｍ３又はそれ以上の容積を含み得る。隔離囲いは、ｘ、ｙ及びｚの各寸法が少なくとも隔離囲いが保持するよう設計された微小物体の直径とほぼ同じである、立方体などの形状を有し得る。例えば、ヒト卵細胞は直径が約１２０ミクロンであり、したがって、ヒト卵細胞を保持するよう設計された隔離囲いのｘ、ｙ、ｚの各寸法は少なくとも１００ミクロン、１１０ミクロン、１２０ミクロン、１３０ミクロン、１４０ミクロン、１５０ミクロン又はそれ以上であり得る。
[0100] いくつかの実施形態では、胚、精子、卵母細胞又は卵細胞などの生物学的微小物体の健康状態及び生存能を高めるようマイクロ流体装置の内部表面（例えば、隔離囲いの内部表面）を調整することができる。例えば、内部表面を天然ポリマー（例えば、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル又はヒアルロン酸）、合成ポリマー（例えば、ＰＥＧ又は天然ポリマーセグメントで修飾したＰＥＧ）、タンパク質、多糖類、上記のいずれかのものの誘導体又はその組合せなどのポリマーでコートすることができる。上記のものに代えて、又はこれに加えて、上皮細胞又は線維芽細胞などの支持細胞の分泌物で内部表面を調整することができる。このような細胞の例としては、卵丘細胞、子宮内膜細胞、無線毛分泌細胞及び卵管由来のＰＥＧ細胞が挙げられる。
[0101] 生物学的微小物体の調整処理。いくつかの実施形態では、卵細胞と１つ又は複数の精子とを接触させる際の受精の成功を促進するため、調整処理を実施する。
[0102] 電気処理。いくつかの実施形態では、１つ、複数又は全部の隔離囲いをさらに、そこに位置する微小物体に電気刺激が加えられるよう設計し得る。電気刺激は、配置された位置でＤＥＰ（ＯＥＴ）基板又はエレクトロウェッティング基板を調節することによって加え得る。あるいは、囲いが、フォトリソグラフィーにより作製され得る二次元平面又は三次元電極を有していても、ワイヤー型電極（白金、塩化銀／銀など）を有していてもよい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体装置がＤＥＰ（ＯＥＴ）構造又はエレクトロウェッティング（ＯＥＷ）構造を有する底基板と、通常は上部電極とを有するものである場合、下部の基板に電圧を加える。基板は、光が当たるとすぐに低抵抗状態に切り替わる。隔離囲い中の培地は、導電率が照らされる基板のものよりも高い約０．０１Ｓ／Ｍとなるよう構成してよく、囲いを満たす培地全体にわたって、加えた場の大部分が低下する。隔離囲い内のチャンバの高さが約３０〜約１５０ミクロンである場合、卵細胞をマイクロポレートするのに必要な電場は、約０．１〜約５．０ｋＶ／ｃｍｋＶ／ｃｍ、約０．１ｋＶ／ｃｍ、０．３ｋＶ／ｃｍ、０．５ｋＶ／ｃｍ、０．７ｋＶ／ｃｍ、０．９ｋＶ／ｃｍ、１．０ｋＶ／ｃｍ、１．２ｋＶ／ｃｍ、１．４ｋＶ／ｃｍ、１．６ｋＶ／ｃｍ、１．８ｋＶ／ｃｍ、２．０．２．４ｋＶ／ｃｍ、２．６ｋＶ／ｃｍ、２．８ｋＶ／ｃｍ、３．０ｋＶ／ｃｍ、３．３ｋＶ／ｃｍ、３．５ｋＶ／ｃｍ、３．７ｋＶ／ｃｍ、４．０ｋＶ／ｃｍ、４．３ｋＶ／ｃｍ、４．５ｋＶ／ｃｍ、４．７ｋＶ／ｃｍもしくは約５．０ｋＶ／ｃｍの範囲内又はその範囲内の任意の値であり得る。いくつかの実施形態では、電場は約１．４ｋＶ／ｃｍであり得る。２電極間にかける必要のある電位は、チャンバの高さによって異なる。電気活性化時に使用する培地は、卵母細胞、卵細胞又は胚の培養に使用する培地によって異なり得る。
[0103] 種々の実施形態で電気刺激を加え得る。一実施形態では、卵細胞を精子に曝露した後に電気刺激を加え得る。例えば、卵細胞が精子の侵入によって活性化されず、このため、胚発生を進行させることができないことがある。精子が、胚発生を促進するのに必要な細胞内カルシウム濃度の上昇を引き起こすことができないことがある。電気インパルスの印加は、受精卵細胞の発生を惹起するのに必要な細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、電気刺激時又は電気刺激後にイオノフォアも存在し得る。電気インパルスが引き起こすマイクロポレーションによってイオノフォア及び／又はカルシウムイオンが通過し、正常に機能する精子による受精が引き起こすカルシウム（Ｃａ＋２）過渡電流の代わりになるか、これを引き起こす。
[0104] 他の実施形態では、精子の不在下で電気刺激を加えて卵母細胞の単為発生を惹起し得る。このように人為的に始動させた細胞は、細胞分裂を経ない減数分裂を再開する。これは、イオノマイシン及び／又はカルシウム２＋イオンなどのイオノフォアの存在下で実施しても、電気刺激のみで刺激してもよい。これは、電気融合に特異的に設計した培地中で実施し得る。例えば、マイクロ流体装置の基板内にＤＥＰ（例えば、ＯＥＴ）構造又はエレクトロウェッティング（例えば、ＯＥＷ）構造が存在する場合、エレクトロポレーション培地の導電率は約０．０１Ｓ／Ｍであるか、約０．００１〜１Ｓ／Ｍの範囲内であり得る。ヒト卵母細胞の単為発生を誘導する場合、発生は満期までは進行しない。しかし、単為発生させたヒト胚は、桑実胚期を経て胚盤胞の状態（３２〜６４細胞、第４〜５日）まで達し得る。この単為発生胚盤胞を用いてヒト胚性幹細胞系を確立し得る。胚盤胞を孵化させ、内部細胞塊（ＩＣＭ）を分離し、しかるべきフィーダー細胞（例えば、順次実施し得る脾細胞、線維芽細胞）と共培養し得る。共培養後、初代胚性幹細胞のコロニーが確立され得る。ｈＥＳＣ細胞を分離し培養し得る。
[0105] 単為発生胚盤胞から胚性幹細胞に変換する段階は、マイクロ流体装置内で実施し得る。他の実施形態では、単為発生胚盤胞をマイクロ流体装置から排出させて、残りの段階を他の機器内で実施し得る。また別の実施形態では、ＩＣＭを孵化胚盤胞からチップ外に分離した後、刺激を実施したものと同じマイクロ流体チップ又はこれと同様のマイクロ流体チップ上でＩＣＭとフィーダー細胞との共培養を実施し得る。ＩＣＭは隔離囲いの隔離領域内に配置してよく、フィーダー細胞は同じ隔離囲い又は隣接する隔離囲いの中で共培養してよい。
[0106] 胚性幹細胞コロニーに変換した後、マイクロ流体装置からｈＥＳＣを排出させて、さらに拡大、保存又は使用し得る。
[0107] 特に限定されないが他の哺乳動物（例えば、マウス）を含めた他の種の胚細胞系を確立するには、非ヒト卵母細胞からの単為発生胚にこれと同じ段階を用いる。
[0108] 卵母細胞の発生段階のいずれの時期に刺激を加えるかによって、単為発生ｈＥＳＣは実質的にホモ接合型又は実質的にヘテロ接合型になり得、通常は二倍体になり得る。中期Ｉの段階で減数分裂を阻止して卵母細胞を刺激すると、実質的にヘテロ接合型のｈＥＳＣが得られる。第二極体排出後に減数分裂を阻止して刺激を加えると、実質的にホモ接合型のｈＥＳＣが得られる。卵母細胞の発生段階の中期１から第二極体排出前の間に刺激を加えると、ヘテロ接合型とホモ接合型が混在するｈＥＳＣが得られる。
[0109] いくつかの実施形態では、ヒト未授精卵母細胞の単為発生を用いて多能性幹細胞を作成し得る。いくつかの実施形態では、ｈＥＳＣは、卵母細胞ドナーとＨＬＡ（ヒト白血球抗原）が一致したものであり得る。あるいは、電気刺激で単為発生させて誘導したｈＥＳＣから遺伝子を操作せずに疾患ｈＥＳＣ細胞系を確立し、変異を有する二倍体ホモ接合型のｈＥＳＣを生じさせ得る。
[0110] 化学処理。いくつかの実施形態では、受精段階での成功の確率を高めるため、卵細胞又は卵母細胞を化学物質で処理し得る。化学物質は、小分子物質であっても生体分子物質であってもよい。いくつかの実施形態では、精子に曝露する前、卵細胞又は卵母細胞の培地に化学物質、例えば特に限定されないが、イオノマイシン、カルシマイシン、塩化ストロンチウム及び／又は塩化カルシウムなどを添加し得る。
[0111] いくつかの実施形態では、精子をホスホリパーゼＣζに曝露して、精子が正常な胚発生を惹起するのに必要なＣａ＋２過渡電流を引き起こす能力を回復させることにより、受精能のない精子に正常な機能を回復させることが可能であり得る。ほかの隔離囲いの中に存在する卵細胞から分離された隔離囲いの中で精子を上記のように処理してもよく、あるいはチップ外で精子を処理してもよい。精子の運動に関与することが知られている環状アデノシン一リン酸の分解を阻害するホスホジエステラーゼ阻害剤の１つであるペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｉｎｅ）で処理することにより、精子の運動能を増大させ得る。いくつかの実施形態では、精子に十分な運動能も侵入能もみられない場合、ＯＥＴによって発生させたＤＥＰ力を用いて精子を卵細胞内に侵入させ得る。
[0112] 体細胞への曝露。いくつかの実施形態では、調整処理は体細胞への曝露を含んでよく、このような体細胞としては、特に限定されないが、子宮細胞、子宮内膜細胞、卵丘顆粒膜細胞、介在性ＰＥＧ細胞及び卵管の無線毛分泌細胞が挙げられ、いずれの細胞も高濃度のカリウム、炭酸水素塩、アルギニン、アラニン及びグルタミン酸塩ならびに／あるいは生理学的に適切な濃度及び発生に適切な濃度のプロスタグランジンを産生し得る。精子を導入する前に卵細胞又は卵母細胞を卵丘顆粒膜細胞に曝露し得る。卵細胞と精子から胚が形成された後の調整処理は、卵丘顆粒膜細胞、子宮細胞、子宮内膜細胞、介在性ＰＥＧ細胞、無線毛非分泌細胞又はその任意の組合せへの曝露を含み得る。いくつかの実施形態では、卵丘顆粒膜細胞ならびに子宮内膜細胞、介在性ＰＥＧ細胞及び無線毛非分泌細胞からなる群のうちの１つへの曝露を含み得る調整処理を胚に実施し得る。体細胞への曝露は、直接的なもの（例えば、同じ隔離囲い内）であっても間接的なもの（例えば、隣接又は近接した隔離囲いの中）であってもよく、この場合、体細胞からの分泌物が拡散により、卵細胞、卵母細胞又は胚が収納された隔離囲いの中に移行し得る。
[0113] 活性化のレスキュー。いくつかの実施形態では、最初の受精を卵細胞上で試み、撮像及び／又は検査によるモニタリングで胚発生が進行していないことが明らかになり得る。このような場合、上記の調整処理の一部又は全部を用いて活性化をレスキューし、第二減数分裂を開始させ、前核を形成させ、胚の正常な発生まで進行させる。
[0114] ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性化及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟。いくつかの実施形態では、調整処理を実施して卵母細胞／卵細胞又は精子を活性化し、続く生物学的変化を起こさせる。例えば、マイクロ流体装置内に導入した卵母細胞又は卵細胞を本明細書に記載される通りにモニタ及び検査し、受精する機会が十分にある程度までは発生していないことが明らかになり得る。
[0115] 上記のように、特に限定されないがホスホリパーゼＣζ又はペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｉｎｅ）などの薬剤で精子を処理して、精子の受精を活性化し得る。
[0116] 調整処理を実施して、卵母細胞又は卵細胞を胚発生能が増強され受精しやすいさらに成熟した状態に進行させ得る。卵母細胞又は卵細胞をさらに成熟した状態（中期Ｉ、中期ＩＩ）まで進行させ得る調整処理のいくつかの非限定的な例としては、ｉｎｃｌｕｄｅ ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、レチノイド（レチノイン酸を含む）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エストラジオール１７β（Ｅ２）、卵胞液減数分裂活性化ステロール（４，４−ジメチル−５α−コレステ−８，１４，２４−トリエン−３β−オール）、脳由来向神経因子、インスリン様成長因子１、メラトニン、ホスホリパーゼＣζ及び／又はリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、調整用化学物質への卵母細胞又は卵細胞の曝露を卵丘顆粒膜細胞の存在下で実施し得る。
[0117] 共培養。いくつかの実施形態では、卵母細胞と子宮細胞、子宮内膜細胞、卵丘顆粒膜細胞、介在性ＰＥＧ細胞、卵官の無線毛分泌細胞又はその組合せとを共培養することによって、卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの成熟を実施し得る。
[0118] マイクロ流体装置ならびにそのような装置を稼働及び観察するシステム。マイクロ流体装置１００ならびに卵細胞、卵母細胞及び／又は精子の選択及び評価を含めたｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚作成に使用することができるシステム１５０を図１に示す。図中のマイクロ流体装置１００の斜視図は、マイクロ流体装置１００内部の部分図を示すため、そのカバーを一部切り取った状態で示されている。マイクロ流体装置１００は概略的には、流体培地１８０が流れることができる流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含み、流体培地１８０は任意選択で、１つ又は複数の微小物体（不掲載）をマイクロ流体回路１２０に運び込み、かつ／又は同回路の中を運ぶ。図１には単一のマイクロ流体回路１２０が示されているが、適切なマイクロ流体装置は、このようなマイクロ流体回路を複数（例えば、２つ又は３つ）含み得る。いずれにしても、マイクロ流体装置１００をナノ流体装置になるよう設計することができる。図１に示される実施形態では、マイクロ流体回路１２０は複数のマイクロ流体隔離囲い１２４、１２６、１２８及び１３０を含み、各囲いは流路１０６と流体連絡した１つ又は複数の開口部を有する。のちにさらに記載するように、マイクロ流体隔離囲いは、培地１８０が流路１０６を流れるときにも微小物体をマイクロ流体装置１００などのマイクロ流体装置内に保持するよう最適化された様々な特徴及び構造を含む。ただし、上記の内容に戻る前に、マイクロ流体装置１００及びシステム１５０について簡潔に説明する。
[0119] 図１に概略的に示されるように、マイクロ流体回路１２０は筺体１０２によって画定される。筺体１０２は物理的に様々な構造をとり得るが、図１に示される例では、筺体１０２は支持構造物１０４（例えば、土台）と、マイクロ流体回路構造１０８と、カバー１１０とを含むものとして図示されている。支持構造物１０４、マイクロ流体回路構造１０８及びカバー１１０は互いに接着していてよい。例えば、マイクロ流体回路構造１０８は支持構造物１０４の内表面１０９上に配置されていてよく、カバー１１０はマイクロ流体回路構造１０８の上に配置されていてよい。マイクロ流体回路構造１０８は、支持構造物１０４及びカバー１１０とともにマイクロ流体回路１２０の諸要素を画定し得る。
[0120] 図１に示されるように、支持構造物１０４はマイクロ流体回路１２０の底部にあってよく、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の頂部にあってよい。あるいは、支持構造物１０４及びカバー１１０はほかの向きに配置されていてよい。例えば、支持構造物１０４がマイクロ流体回路１２０の頂部にあってよく、カバー１１０がマイクロ流体回路１２０の底部にあってよい。いずれにしても、それぞれが筺体１０２に入る、又は筺体１０２を出る通路を含む１つ又は複数の出入口１０７が存在し得る。通路の例としては、バルブ、ゲート、通過穴などが挙げられる。図のように、出入口１０７は間隙によって形成される通過穴である。しかし、出入口１０７は、筺体１０２のカバー１１０などの他の構成要素に位置していてもよい。図１には出入口１０７が１つのみ示されているが、マイクロ流体回路１２０は出入口１０７を２つ以上有し得る。例えば、マイクロ流体回路１２０に入る流体の入口として機能する第一の出入口１０７が存在してよく、マイクロ流体回路１２０を出る流体の出口として機能する第二の出入口１０７が存在してよい。出入口１０７が入口として機能するか出口として機能するかは、流体が流路１０６を流れる方向によって決まり得る。
[0121] 支持構造物１０４は、１つ又は複数の電極（不掲載）と基板又は複数の相互接続された基板とを含み得る。例えば、支持構造物１０４は、それぞれが電極に電気的に接続された１つ又は複数の半導体基板を含み得る（例えば、半導体基板の全部又は一部が単一の電極に電気的に接続されていてよい）。支持構造物１０４はさらに、プリント回路基板アセンブリ（「ＰＣＢＡ」）を含み得る。例えば、半導体基板（１つ又は複数）がＰＣＢＡ上に取り付けられてよい。
[0122] マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の回路要素を画定し得る。このような回路要素は、マイクロ流体回路１２０が流体で満たされたときに互いに流体連結され得る空間又は領域、例えばフローチャネル、チャンバ、囲い、トラップなどを含み得る。図１に示されるマイクロ流体回路１２０では、マイクロ流体回路構造１０８は、フレーム１１４とマイクロ流体回路材料１１６とを含む。フレーム１１４は、マイクロ流体回路材料１１６を部分的に又は完全に囲っていてよい。フレーム１１４は、例えば、実質的にマイクロ流体回路材料１１６を取り囲む比較的堅固な構造物であり得る。例えば、フレーム１１４は金属材料を含み得る。
[0123] マイクロ流体回路材料１１６には、空洞などによる模様があり、マイクロ流体回路１２０の回路要素及び相互連結を画定し得る。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過性であり得る可変ポリマー（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）など）などの軟質材料を含み得る。マイクロ流体回路材料１１６を構成し得る材料のその他の例としては、成形ガラス、シリコーン（例えば、感光性シリコーン又は「ＰＰＳ」）などのエッチング可能な材料、フォトレジスト（例えば、ＳＵ８）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、このような材料、ひいてはマイクロ流体回路材料１１６は、堅固であり、かつ／又は実質的にガス不透過性であり得る。いずれにしても、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造物１０４の上、フレーム１１４の内側に配置され得る。
[0124] カバー１１０は、フレーム１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と一体になった部分であり得る。あるいは、図１に示されるように、カバー１１０は構造的に異なる要素であり得る。カバー１１０は、フレーム１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同じ材料又は異なる材料を含み得る。支持構造物１０４も同じく、図のようにフレーム１１４又はマイクロ流体回路材料１１６と分離した構造物であっても、フレーム１１４又はマイクロ流体回路材料１１６と一体になった部分であってもよい。フレーム１１４及びマイクロ流体回路材料１１６も同じく、図１に示されるように別個の構造物であっても、同じ構造物の一体となった部分であってもよい。
[0125] いくつかの実施形態では、カバー１１０は剛体材料を含み得る。剛体材料は、ガラス又はこれと類似した特性を有する材料であり得る。いくつかの実施形態では、カバー１１０は変形可能な材料を含み得る。変形可能な材料は、ＰＤＭＳなどのポリマーであり得る。いくつかの実施形態では、カバー１１０は、剛体材料及び変形可能な材料の両方を含み得る。例えば、カバー１１０の１つ又は複数の部分（例えば、隔離囲い１２４、１２６、１２８、１３０の上に位置する１つ又は複数の部分）は、カバー１１０の剛体材料と接合する変形可能な材料を含み得る。いくつかの実施形態では、カバー１１０はさらに、１つ又は複数の電極を含み得る。１つ又は複数の電極は酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）などの導電性酸化物を含んでよく、導電性酸化物はガラス又はこれと同様に絶縁性の材料に塗布されていてよい。あるいは、１つ又は複数の電極は柔軟な電極、例えば、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）などの変形可能な材料に単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子の塊又はその組合せを埋め込んだものなどであり得る。マイクロ流体装置に使用することができる柔軟な電極は、例えば米国特許出願公開第２０１２／０３２５６６５号（Ｃｈｉｏｕら）（その内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、細胞の付着、生存能及び／又は成長を支えるよう（例えば、マイクロ流体回路１２０に向かって内向きの表面の一部又は全部を調整することによって）カバー１１０を改変し得る。改変は、合成又は天然のポリマーを塗布することを含み得る。いくつかの実施形態では、カバー１１０及び／又は支持構造物１０４は光を透過させるものであり得る。カバー１１０はこのほか、ガス透過性の材料（例えば、ＰＤＭＳ又はＰＰＳ）を少なくとも１つ含み得る。
[0126] 図１にはほかにも、マイクロ流体装置１００などのマイクロ流体装置を稼働及び制御するシステム１５０が示されている。図のように、システム１５０は電源１９２と、撮像装置１９４と、傾動装置１９０とを含む。
[0127] 電源１９２は、マイクロ流体装置１００及び／又は傾動装置１９０に電力を供給し、必要に応じてバイアス電圧又はバイアス電流を加え得る。電源１９２は、例えば１つ又は複数の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）の電圧源又は電流源を含み得る。撮像装置１９４は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉するデジタルカメラなどの装置を含み得る。いくつかの場合には、撮像装置１９４はさらに、高フレーム率かつ／又は（例えば、微光用途に）高感度の検出器を含む。撮像装置１９４はこのほか、マイクロ流体回路１２０内に刺激用の放射線ビーム及び／又は光ビームを当て、マイクロ流体回路１２０（又はそこに含まれる微小物体）から反射又は放射された放射線ビーム及び／又は光ビームを収集する機構を含み得る。放射される光ビームは、可視スペクトルの含まれるものであってよく、例えば蛍光放射を含み得る。反射される光ビームは、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）もしくはキセノンアーク灯ランプなどの広域スペクトルランプから発生し反射された放射光を含み得る。図３に関して記載するように、撮像装置１９４はさらに、接眼レンズの有無を問わず顕微鏡（又は光学縦列）を含み得る。
[0128] システム１５０はさらに、マイクロ流体装置１００を１つ又は複数の回転軸の周りに回転させるよう設計された傾動装置１９０を含む。いくつかの実施形態では、傾動装置１９０は、マイクロ流体装置１００（ひいてはマイクロ流体回路１２０）を水平方向（すなわち、ｘ軸及びｙ軸に対して０°）、垂直方向（すなわち、ｘ軸及びｙ軸に対して９０°）又はその間の任意の方向に保持できるように、マイクロ流体回路１２０を含む筺体１０２を少なくとも１つの軸の周囲で支え、かつ／又は保持するよう設計されている。軸に対するマイクロ流体装置１００（及びマイクロ流体回路１２０）の方向のことを本明細書ではマイクロ流体装置１００（及びマイクロ流体回路１２０）の「傾き」と呼ぶ。例えば、傾動装置１９０は、マイクロ流体装置１００をｘ軸に対して０．１°、０．２°、０．３°、０．４°、０．５°、０．６°、０．７°、０．８°、０．９°、１°、２°、３°、４°、５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、９０°又はその間の任意の角度に傾けることができる。水平方向（ひいてはｘ軸及びｙ軸）とは、重力によって定められる縦軸に対して垂直であることと定義される。傾動装置はこのほか、マイクロ流体装置１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸及び／又はｙ軸に対して９０°を超える任意の角度に傾けたり、マイクロ流体装置１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸又はｙ軸に対して１８０°傾けて完全に反転させたりすることができる。同様に、いくつかの実施形態では、傾動装置１９０は、マイクロ流体回路１２０の流路１０６をはじめとする一部分によって定められる回転軸の周りにマイクロ流体装置１００（及びマイクロ流体回路１２０）を傾ける。
[0129] いくつかの場合には、マイクロ流体装置１００を１つ又は複数の隔離囲いの上方又は下方に位置するように垂直方向に傾ける。ここで使用される「上方」という用語は、流路１０６が、重力によって定められる縦軸上で１つ又は複数の隔離囲いよりも高い位置にあることを表す（すなわち、流路１０６の上方にある隔離囲い内の物体は、流路内の物体よりも重力ポテンシャルエネルギーが大きいことになる）。ここで使用される「下方」という用語は、流路１０６が、重力によって定められる縦軸上で１つ又は複数の隔離囲いよりも低い位置にあることを表す（すなわち、流路１０６の下方にある隔離囲い内の物体は、流路内の物体よりも重力ポテンシャルエネルギーが小さいことになる）。
[0130] いくつかの場合には、傾動装置１９０は、マイクロ流体装置１００を流路１０６に平行な軸の周りに傾ける。さらに、流路１０６が１つ又は複数の隔離囲いの真上又は真下に位置せずにその上方又は下方に位置するように、マイクロ流体装置１００を９０°未満の角度に傾けることができる。別の場合には、傾動装置１９０は、マイクロ流体装置１００を流路１０６に垂直な軸の周りに傾ける。また別の場合には、傾動装置１９０は、マイクロ流体装置１００を流路１０６に平行でも垂直でもない軸の周りに傾ける。
[0131] システム１５０はさらに、培地供給源１７８を含み得る。培地供給源１７８（例えば、容器、貯蔵器など）は、それぞれが異なる流体培地１８０を保持する複数の区画又は容器を含み得る。したがって、培地供給源１７８は、図１に示されるように、マイクロ流体装置１００の外部にあるか、同装置から切り離されている装置であり得る。あるいは、培地供給源１７８は、全体又は一部がマイクロ流体装置１００の筺体１０２の内部に位置し得る。例えば、培地供給源１７８は、マイクロ流体装置１００の一部である貯蔵器を含み得る。
[0132] 図１にはほかにも、システム１５０の一部を構成しマイクロ流体装置１００と連動させて使用することができる制御／モニタリング装置１５２の例の簡略ブロック図が示されている。図のように、このような制御／モニタリング装置１５２の例は、培地供給源１７８を制御する培地モジュール１６０と、マイクロ流体回路１２０内の微小物体（不掲載）及び／又は培地（例えば、培地の液滴）の移動及び／又は選択を制御する動力モジュール１６２と、画像（例えば、デジタル画像）を捕捉する撮像装置１９４（例えば、カメラ、顕微鏡、光源又はその任意の組合せ）を制御する撮像モジュール１６４と、傾動装置１９０を制御する傾動モジュール１６６とを含む、主制御装置１５４を含む。制御装置１５２はほかにも、マイクロ流体装置１００に関するその他の機能を制御、モニタリング又は実行するその他のモジュール１６８を含み得る。図のように、装置１５２はさらに、ディスプレイ装置１７０及び入力／出力装置１７２を含み得る。
[0133] 主制御装置１５４は、制御モジュール１５６とデジタル記憶装置１５８とを含み得る。制御モジュール１５６は、例えば、記憶装置１５８に一時的でないデータ又はシグナルとして保存されている機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコードなど）に従って稼働するよう設計されているデジタル処理装置を含み得る。上記のものに代えて、又はこれに加えて、制御モジュール１５６は、ハードウェアに組み込まれたデジタル回路及び／又はアナログ回路を含み得る。培地モジュール１６０、動力モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾動モジュール１６６及び／又はその他のモジュール１６８も同様に設計されていてよい。したがって、本明細書でマイクロ流体装置１００又はその他の任意のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして記載される機能、処理作業、動作又は処理の諸段階は、上記のように設計された主制御装置１５４、培地モジュール１６０、動力モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾動モジュール１６６及び／又はその他のモジュール１６８のいずれか１つ又は複数のものによって実行され得る。同様に、主制御装置１５４、培地モジュール１６０、動力モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾動モジュール１６６及び／又はその他のモジュール１６８は、本明細書に記載される任意の機能、処理、作業、動作又は段階に使用するデータを送信及び受信するよう伝達可能に接続されていてよい。
[0134] 培地モジュール１６０は培地供給源１７８を制御する。例えば、培地モジュール１６０は、選択された流体培地１８０を（例えば、入口１０７から）筺体１０２に投入するよう制御することができる。培地モジュール１６０はこのほか、筺体１０２から（例えば、出口（不掲載）から）の培地の除去を制御することができる。このように、マイクロ流体回路１２０に１つ又は複数の培地を選択的に投入し除去することができる。培地モジュール１６０はほかにも、マイクロ流体回路１２０内の流路１０６の流体培地１８０の流れを制御することができる。例えば、いくつかの実施形態では、傾動モジュール１６６が傾動装置１９０にマイクロ流体装置１００を所望の傾斜角度に傾けさせる前に、培地モジュール１６０が流路１０６内の培地１８０及び筺体１０２を通る培地１８０の流れを停止させる。
[0135] 動力モジュール１６２は、マイクロ流体回路１２０内の微小物体（不掲載）の選択、捕捉及び移動を制御するよう設計され得る。のちに図２Ａ及び図２Ｂに関して記載するように、筺体１０２は、誘電泳動（ＤＥＰ）構造、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構造及び／又はオプトエレクトロウェッティング（ＯＥＷ）構造（図１には不掲載）を含んでよく、動力モジュール１６２は、電極及び／又はトランジスタ（例えば、フォトトランジスタ）の活性化を制御して、流路１０６及び／又は隔離囲い１２４、１２６、１２８、１３０の中の微小物体（不掲載）及び／又は培地の液滴（不掲載）を選択し移動させることができる。
[0136] 撮像モジュール１６４は撮像装置１９４を制御することができる。例えば、撮像モジュール１６４は、撮像装置１９４の画像データを受信し処理することができる。撮像装置１９４の画像データは、撮像装置１９４によって捕捉された任意の種類の情報（例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識などの標識の蓄積などの有無）を含み得る。撮像モジュール１６４はさらに、撮像装置１９４によって捕捉された情報を用いて、マイクロ流体装置１００内での対象物（例えば、微小物体、培地の液滴）の位置及び／又はそのような対象物の移動速度を算出することができる。
[0137] 傾動モジュール１６６は、傾動装置１９０の傾動動作を制御することができる。上記のようにものに代えて、又はこれに加えて、傾動モジュール１６６は、重力による微小物体の１つ又は複数の隔離囲いへの移行が最適になるよう傾動の速度及びタイミングを制御することができる。傾動モジュール１６６は、撮像モジュール１６４と伝達可能に接続されており、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は培地の液滴の動きを表すデータを受信する。傾動モジュール１６６は、このデータを用いてマイクロ流体回路１２０の傾きを調節し、微小物体及び／又は培地の液滴がマイクロ流体回路１２０内を移動する速度を調節し得る。傾動モジュール１６６はこのほか、このデータを用いて、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は培地の液滴の位置を繰り返し調節し得る。
[0138] 図１に示される例では、マイクロ流体回路１２０は、マイクロ流体チャネル１２２と隔離囲い１２４、１２６、１２８、１３０とを含むものとして示されている。各囲いはチャネル１２２への開口部を含むが、それ以外にも、囲いが流体培地１８０及び／又はチャネル１２２の流路１０６もしくはほかの囲いの中の微小物体から微小物体を囲いの内側に実質的に隔離することができるよう取り囲まれている。いくつかの場合には、囲い１２４、１２６、１２８、１３０は、マイクロ流体回路１２０内で１つ又は複数の微小物体を物理的に囲うよう設計されている。本発明による隔離囲いは、のちに詳細に記載及び図示するように、ＤＥＰ、ＯＥＴ、ＯＥＷ、流体流動及び／又は重力とともに使用するのに最適化された様々な形状、表面及び特徴を含み得る。
[0139] マイクロ流体回路１２０は、任意の数のマイクロ流体隔離囲いを含み得る。５つの隔離囲いが示されているが、マイクロ流体回路１２０の隔離囲いは、これより少なくても多くてもよい。図のように、マイクロ流体回路１２０のマイクロ流体隔離囲い１２４、１２６、１２８及び１３０は、それぞれ異なる特徴及び形状を含み、胚の作成に有用な１つ又は複数の利益、例えば１個の卵細胞を隣接する卵細胞から分離することなどをもたらし得る。検査、刺激及び受精はいずれも個別に実施してよく、いくつかの実施形態では、個々の時間尺度で実施し得る。いくつかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数の同一のマイクロ流体隔離囲いを含む。いくつかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は複数のマイクロ流体隔離囲いを含み、ここでは、２つ以上の隔離囲いが、胚作成に異なる利益をもたらす異なる構造及び／又は特徴を含む。非限定的な１つの例は、ある種類の囲い内で卵細胞を維持し、これと異なる囲い内で精子を維持することを含み得る。別の実施形態では、少なくとも１つの隔離囲いが、卵細胞を電気により活性化するのに適した電気的接触を有するよう設計されている。さらに別の実施形態では、周囲の隔離囲いからの分泌物が、それぞれの囲いから卵細胞が収納された囲いの中に拡散し得るように、異なる種類の細胞（例えば子宮細胞、子宮内膜細胞、卵管（例えば、輸卵管又はファロピウス管）由来のＰＥＧ（介在性）細胞、卵丘細胞又はその組合せ）が、卵細胞が収納された隔離囲いに隣接した隔離囲い内に配置されてよく、これは、マクロスケールのｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養及び受精では不可能なことである。胚作成に有用なマイクロ流体装置は、隔離囲い１２４、１２６、１２８及び１３０又はその変形のいずれかを含むか、図４及び図５Ａ〜Ｃに示される囲い４３０のように設計された囲いを含み得る。
[0140] 図１に示される実施形態では、単一のチャネル１２２及び流路１０６が示されている。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路１０６を含むよう設計された複数のチャネル１２２を含み得る。マイクロ流体回路１２０はさらに、流路１０６及び流体培地１８０と流体連通した注入バルブ又は入口１０７を含んでよく、それにより、流体培地１８０は入口１０７からチャネル１２２に入ることができる。いくつかの場合には、流路１０６は単一の経路を含む。いくつかの場合には、単一の経路がジグザグ模様に配置されており、それにより、流路１０６がマイクロ流体装置１００の中を交互方向に２回以上通る。
[0141] いくつかの場合には、マイクロ流体回路１２０は平行な複数のチャネル１２２及び流路１０６を含み、ここでは、各流路１０６内の流体培地１８０が同じ方向に流れる。いくつかの場合には、各流路１０６内の流体培地が、順方向又は逆方向のうちの少なくとも一方に流れる。いくつかの場合には、複数の隔離囲いが（例えば、チャネル１２２に対して）、目的の微小物体を平行に負荷することができるよう設計されている。
[0142] いくつかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０はさらに、１つ又は複数の微小物体トラップ１３２を含む。トラップ１３２は一般に、チャネル１２２の境界をなす壁面の中に形成され、１つ又は複数のマイクロ流体隔離囲い１２４、１２６、１２８、１３０の開口部の反対側に位置し得る。いくつかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から単一の微小物体を受け取るか捕捉するよう設計されている。いくつかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から複数の微小物体を受け取るか捕捉するよう設計されている。いくつかの場合には、トラップ１３２は、単一の目的微小物体とほぼ同じ容積を含む。
[0143] トラップ１３２はさらに、目的微小物体がトラップ１３２内に流れ込みやすくするよう設計された開口部を含み得る。いくつかの場合には、トラップ１３２は、単一の目的微小物体の寸法とほぼ同じ高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、開口部より大きい微小物体は微小物体トラップに侵入できない。トラップ１３２はさらに、目的微小物体をトラップ１３２内に保持しやすくするよう設計されたほかの特徴を含み得る。いくつかの場合には、トラップ１３２は、マイクロ流体装置１００をチャネル１２２に平行な軸の周りに傾けると、捕捉された微小物体が微小物体を隔離囲いの開口部に流れ込ませる経路上のトラップ１３２に存在するように、マイクロ流体隔離囲いの開口部に対してチャネル１２２の反対側に一直線に位置する。いくつかの場合には、トラップ１３２は、トラップ１３２を通る流れを促進し、それによりトラップ１３２に微小物体が捕捉される可能性を増大させるため、目的微小物体よりも小さい支通路１３４を含む。
[0144] いくつかの実施形態では、１つ又は複数の電極（不掲載）を介して（例えば、流路内及び／又は隔離囲い内の）流体培地１８０全体に誘電泳動（ＤＥＰ）力をかけて、そこに位置する微小物体を操作、輸送、分離及び選別する。例えば、いくつかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０の１つ又は複数の部分にＤＥＰ力をかけて、単一の微小物体を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離囲いの中に移行させる。いくつかの実施形態では、ＤＥＰ力を用いて、隔離囲い（例えば、隔離囲い１２４、１２６、１２８又は１３０）の中の微小物体がそこから移動しないようにする。さらに、いくつかの実施形態では、ＤＥＰ力を用いて、既に本発明の教示に従って収集した微小物体を選択的に隔離囲いから除去する。いくつかの実施形態では、ＤＥＰ力は光電子ピンセット（ＯＥＴ）力を含む。
[0145] 他の実施形態では、１つ又は複数の電極（不掲載）を介してマイクロ流体装置１００の支持構造物１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ又は複数の位置（例えば、流路及び／又は隔離囲いを画定している位置）にオプトエレクトロウェッティング（ＯＥＷ）力をかけて、マイクロ流体回路１２０内に位置する液滴を操作、輸送、分離及び選別する。例えば、いくつかの実施形態では、ＯＥＷ力を支持構造物１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ又は複数の位置にかけて、単一の液滴を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離囲いの中に移動させる。いくつかの実施形態では、ＯＥＷ力を用いて、隔離囲い（例えば、隔離囲い１２４、１２６、１２８又は１３０）の中の液滴がそこから移動しないようにする。さらに、いくつかの実施形態では、ＯＥＷ力を用いて、既に本発明の教示に従って収集した液滴を選択的に隔離囲いから除去する。
[0146] いくつかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力を流動力及び／又は重力などのほかの力と組み合わせて、マイクロ流体回路１２０の中の微小物体及び／又は液滴を操作、輸送、分離及び選別する。例えば、流路１０６及びその中に位置する微小物体がマイクロ流体隔離囲いの上方に位置するよう（例えば、傾動装置１９０によって）筺体１０２を傾け、重力により微小物体及び／又は液滴を囲いの中に輸送することができる。いくつかの実施形態では、ほかの力をかける前にＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力をかけることができる。他の実施形態では、ほかの力をかけた後にＤＥＰ及び／又はＯＥＷ力をかけることができる。また別の場合には、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力をほかの力と同時にかけたり、ほかの力と交互にかけたりすることができる。
[0147] 図２Ａ〜図２Ｆに、本発明の実施に用いることができるマイクロ流体装置の種々の実施形態を示す。図２Ａは、マイクロ流体装置２００が光学作動式動電型装置として設計された実施形態を示している。光学作動式動電型装置は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構造を有する装置及びオプトエレクトロウェッティング（ＯＥＷ）構造を有する装置を含め様々なものが当該技術分野で公知である。適切なＯＥＴ構造の例は以下の米国特許文献（それぞれ全体が参照により本明細書に組み込まれる）：米国再発行特許第４４，７１１号（Ｗｕら）（最初に米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）；及び米国特許第７，９５６，３３９号（Ｏｈｔａら）で説明されている。ＯＥＷ構造の例は米国特許第６，９５８，１３２号（Ｃｈｉｏｕら）及び米国特許出願公開第２０１２／００２４７０８号（Ｃｈｉｏｕら）（ともにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）で説明されている。光学作動式動電型装置のまた別の例としては、ＯＥＴ／ＯＥＷ構造の組合せが挙げられ、その例が米国特許出願公開第２０１５０３０６５９８号（Ｋｈａｎｄｒｏｓら）及び同第２０１５０３０６５９９号（Ｋｈａｎｄｒｏｓら）ならびにそれに対応するＰＣＴ出願、国際公開第２０１５／１６４８４６号及び国際公開第２０１５／１６４８４７号（いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に示されている。
[0148] 卵母細胞、卵細胞又は胚を配置、培養及び／又はモニタすることができる囲いを有するマイクロ流体装置の例が、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号（出願番号第１４／０６０，１１７号、２０１３年１０月２２日に出願）、米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号（出願番号第１４／５２０，５６８号、２０１４年１０月２２日に出願）及び米国特許出願公開第２０１５／０１６５４３６号（出願番号第１４／５２１，４４７号、２０１４年１０月２２日に出願）（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に既に記載されている。このほか、米国特許出願第１４／５２０，５６８号及び同第１４／５２１，４４７号には、マイクロ流体装置で培養した細胞の分泌物を分析する例示的な方法が記載されている。上記の各出願にはさらに、光電子ピンセット（ＯＥＴ）などの誘電泳動（ＤＥＰ）力を発生するよう設計されたマイクロ流体装置又はオプトエレクトロウェッティング（ＯＥＷ）を発生するよう設計されたマイクロ流体装置が記載されている。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号の図２に示されている光電子ピンセット装置は、本発明の実施形態に用いて個々の生物学的微小物体又は１群の生物学的微小物体を選択し移動させることができる装置の一例である。
[0149] マイクロ流体装置動力構造。上記のように、システムの制御／モニタリング装置は、マイクロ流体装置のマイクロ流体回路内の微小物体又は液滴などの対象物を選択し移動させる動力モジュールを含み得る。マイクロ流体装置は、移動させる対象物をはじめとする考慮事項の種類に応じて様々な動力構造を有し得る。例えば、マイクロ流体回路内の微小物体を選択し移動させるのに誘電泳動（ＤＥＰ）構造を用いることができる。したがって、マイクロ流体装置１００の支持構造物１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０中の微小物体に選択的にＤＥＰ力を誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体の集団を選択し、捕捉し、かつ／又は移動させるＤＥＰ構造を含み得る。あるいは、マイクロ流体装置１００の支持構造物１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０中の液滴に選択的にＥＷ力を誘導し、それにより個々の液滴又は液滴の集団を選択し、捕捉し、かつ／又は移動させるエレクトロウェッティング（ＥＷ）構造を含み得る。
[0150] ＤＥＰ構造を含むマイクロ流体装置２００の一例を図２Ａ及び図２Ｂに示す。簡略化のため、図２Ａ及び図２Ｂには、開口領域／チャンバ２０２を有するマイクロ流体装置２００の筺体１０２の一部分の垂直横断面図及び水平横断面図がそれぞれ示されているが、領域／チャンバ２０２は、成長チャンバ、隔離囲い、流動領域又はフローチャネルなどのさらに詳細な構造を有する流体回路要素の一部であり得ることを理解するべきである。さらに、マイクロ流体装置２００は、ほかの流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体装置２００は、本明細書でマイクロ流体装置１００に関して記載したような複数の成長チャンバもしくは隔離囲い及び／又は１つもしくは複数の流動領域もしくはフローチャネルを含み得る。マイクロ流体装置２００の任意のこのような流体回路要素又はその選択部分にＤＥＰ構造を組み込んでもよい。さらに、上記又は下記のマイクロ流体装置の構成要素及びシステム構成要素をマイクロ流体装置２００に組み込み、かつ／又は同装置と組み合わせて使用してもよいことが理解されるべきである。例えば、上記の制御／モニタリング装置１５２を含むシステム１５０を、培地モジュール１６０、動力モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾動モジュール１６６及びその他のモジュール１６８のうちの１つ又は複数のものを含むマイクロ流体装置２００とともに使用してもよい。
[0151] 図２Ａからわかるように、マイクロ流体装置２００は、底部電極２０４と底部電極２０４を覆う電極活性化基板２０６とを有する支持構造物１０４及び上部電極２１０を有するカバー１１０を含み、上部電極２１０と底部電極２０４は相隔たっている。上部電極２１０及び電極活性化基板２０６は、領域／チャンバ２０２の対向する表面を画定する。したがって、領域／チャンバ２０２に含まれる培地１８０が上部電極２１０と電極活性化基板２０６との間に抵抗接続をもたらす。このほか、底部電極２０４及び上部電極２１０と接続され、領域／チャンバ２０２内にＤＥＰ力を発生させる必要があるときに電極間にバイアス電圧を生じさせるよう設計された電源２１２が示されている。電源２１２は、例えば交流（ＡＣ）電源であり得る。
[0152] ある特定の実施形態では、図２Ａ及び図２Ｂに示されるマイクロ流体装置２００は光学作動式ＤＥＰ構造を有し得る。したがって、動力モジュール１６２によって制御され得る光源２２０からの光２２２のパターンを変化させることにより、電極活性化基板２０６の内表面２０８の領域２１４にあるＤＥＰ電極のパターン変化を活性化及び不活性化することができる（以降、ＤＥＰ構造を有するマイクロ流体装置の領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図２Ｂに示されるように、電極活性化基板２０６の内表面２０８に当てた光パターン２２２により、選択したＤＥＰ電極領域２１４ａ（白で示した部分）を正方形などのパターンで照らすことができる。以降、照らされていないＤＥＰ電極領域２１４（クロス斜線で影を付けた部分）を「暗い」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。暗いＤＥＰ電極領域２１４それぞれにおいて、ＤＥＰ電極活性化基板２０６の端から端まで（すなわち、底部電極２０４から流動領域１０６の培地１８０と接している電極活性化基板２０６の内表面２０８まで）の相対電気インピーダンスは、領域／チャンバ２０２内の培地１８０の端から端まで（すなわち、電極活性化基板２０６の内表面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）の相対電気インピーダンスよりも大きい。一方、照らされるＤＥＰ電極領域２１４ａはそれぞれの領域において、電極活性化基板２０６の端から端までの相対インピーダンスが、領域／チャンバ２０２内の培地１８０の端から端までの相対インピーダンスよりも小さい。
[0153] 電源２１２が稼働すると、上記のＤＥＰ構造により、照らされたＤＥＰ電極領域２１４ａと隣接する暗いＤＥＰ電極領域２１４との間の流体培地１８０に電場勾配が生じ、次いでこれにより局所ＤＥＰ力が生じて、流体培地１８０中の付近の微小物体（不掲載）を引き付けたり遠ざけたりする。したがって、光源２２０からマイクロ流体装置２００内に投射される光パターン２２２を変化させることによって、領域／チャンバ２０２の内表面２０８にある多数の異なるこのようなＤＥＰ電極領域２１４において、流体培地１８０中の微小物体を引き付けたり遠ざけたりするＤＥＰ電極を選択的に活性化及び不活性化することができる。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き付けるか遠ざけるかは、電源２１２の周波数ならびに培地１８０及び／又は微小物体不掲載）の誘電特性などのパラメータに左右され得る。
[0154] 図２Ｂに示した照らされるＤＥＰ電極領域２１４ａの正方形パターン２２４は一例にすぎない。装置２００内に投射する光のパターン２２２によって、任意のパターンのＤＥＰ電極領域２１４を照らす（それにより活性化する）ことができ、光パターン２２２を変化又は移動させることによって、照らす／活性化するＤＥＰ電極領域２１４のパターンを繰り返し変化させることができる。
[0155] いくつかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、光伝導材料を含むか、これよりなるものであり得る。このような実施形態では、電極活性化基板２０６の内表面２０８は単調なものであり得る。例えば、電極活性化基板２０６は、水素化アモルファスシリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、これよりなるものであり得る。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば水素を約８％〜４０％（１００×水素原子数／水素原子とケイ素原子の総数で算出される）含み得る。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は、厚さが約５００ｎｍ〜約２．０μｍであり得る。このような実施形態では、光パターン２２２に従って、電極活性化基板２０８の内表面２０８の任意の場所に任意のパターンでＤＥＰ電極領域２１４を生じさせることができる。したがって、ＤＥＰ電極領域２１４の数及びパターンは固定されたものである必要はないが、光パターン２２２に対応するものであり得る。上記のような光伝導層を含むＤＥＰ構造を有するマイクロ流体装置の例は、例えば米国再発行特許第４４，７１１号（Ｗｕら）（最初に米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に既に記載されている。
[0156] 他の実施形態では、電極活性化基板２０６は、複数のドープ層、電気絶縁層（又は電気絶縁領域）及び半導体の分野で知られているような半導体を組み込んだ回路を形成する導電層を含む基板を含み得る。例えば、電極活性化基板２０６は、例えば側面双極性フォトトランジスタを含めた複数のフォトトランジスタを含んでよく、各フォトトランジスタはＤＥＰ電極領域２１４に対応している。あるいは、電極活性化基板２０６は、フォトトランジスタスイッチによって制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含んでよく、このような電極はそれぞれＤＥＰ電極領域２１４に対応している。電極活性化基板２０６は、このようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタによって制御される電極のパターンを含み得る。このパターンは例えば、図２Ｂに示されるような、フォトトランジスタ又はフォトトランジスタに制御され行と列の形で配置された実質的に正方形の電極の配列であり得る。あるいは、このパターンは、フォトトランジスタ又はフォトトランジスタに制御され六方格子を形成する実質的に六角形の電極の配列であり得る。パターンを問わず、電気回路要素が電極活性化基板２０６の内表面２０８にあるＤＥＰ電極領域２１４と底部電極２１０との間に電気的接続を形成してよく、光パターン２２２によって、これらの電気的接続（すなわち、フォトトランジスタ又は電極）を選択的に活性化及び不活性化することができる。活性化されない場合、各電気的接続のインピーダンスが高いため、対応するＤＥＰ電極領域２１４において、電極活性化基板２０６の端から端まで（すなわち、底部電極２０４から領域／チャンバ２０２内の培地１８０と接する電極活性化基板２０６の内表面２０８まで）の相対インピーダンスが、培地１８０の端から端まで（すなわち、電極活性化基板２０６の内表面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）の相対インピーダンスよりも大きくなり得る。一方、光パターン２２２の光によって活性化すると、上記のように、照らされるＤＥＰ電極領域２１４それぞれにおいて、電極活性化基板２０６の端から端までの相対インピーダンスが培地１８０の端から端までの相対インピーダンスよりも小さくなり、それにより、対応するＤＥＰ電極領域２１４のＤＥＰ電極が活性化される。したがって、光パターン２２２によって決定する形で、領域／チャンバ２０２内の電極活性化基板２０６の内表面２０８にある多数の異なるＤＥＰ電極領域２１４において、培地１８０中の微小物体（不掲載）を引き付けたり遠ざけたりするＤＥＰ電極を選択的に活性化及び不活性化することができる。
[0157] フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体装置の例は、例えば米国特許第７，９５６，３３９号（Ｏｈｔａら）（例えば、図２１及び図２２に示される装置３００ならびにその説明を参照されたい）（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に既に記載されている。フォトトランジスタスイッチによって制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体装置の例は、例えば米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Ｓｈｏｒｔら）（例えば、図面全体を通じて示される装置２００、４００、５００、６００及び９００ならびにその説明を参照されたい）（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に既に記載されている。
[0158] ＤＥＰ構造を有するマイクロ流体装置のいくつかの実施形態では、上部電極２１０が筺体１０２の第一の壁（又はカバー１１０）の一部となっており、電極活性化基板２０６及び底部電極２０４が筺体１０２の第二の壁（又は支持構造物１０４）の一部となっている。第一の壁と第二の壁との間が領域／チャンバ２０２となり得る。他の実施形態では、電極２１０が第二の壁（又は支持構造物１０４）の一部となっており、電極活性化基板２０６及び／又は電極２１０の一方又は両方が第一の壁（又はカバー１１０）の一部となっている。さらに別法として、光源２２０を用いて筺体１０２を下から照らしてもよい。
[0159] ＤＥＰ構造を有する図２Ａ〜図２Ｂのマイクロ流体装置２００では、動力モジュール１６２は、装置２００内に光パターン２２２を投射し、電極活性化基板２０６の内表面２０８のＤＥＰ電極領域２１４ａにおいて、微小物体を取り囲んで捕捉するパターン（例えば、正方形パターン２２４）で１つ又は複数のＤＥＰ電極の第一のセットを活性化することにより、領域／チャンバ２０２内の培地１８０中の微小物体（不掲載）を選択することができる。次いで、動力モジュール１６２は、光パターン２２２を装置２００に対して相対的に移動させ、ＤＥＰ電極領域２１４において１つ又は複数のＤＥＰ電極の第二のセットを活性化することにより、捕捉した微小物体を移動させることができる。別法として、装置２００を光パターン２２２に対して相対的に移動させてもよい。
[0160] 他の実施形態では、マイクロ流体装置２００は、電極活性化基板２０６の内表面２０８におけるＤＥＰ電極の光活性化に依存しないＤＥＰ構造を有し得る。例えば、電極活性化基板２０６は、少なくとも１つの電極を含む表面（例えば、カバー１１０）と反対側に位置し選択的に位置を指定して通電することが可能な電極を含み得る。スイッチ（例えば、半導体基板内のトランジスタスイッチ）を選択的に開閉してＤＥＰ電極領域２１４のＤＥＰ電極を活性化又は不活性化し、それにより領域／チャンバ２０２内の活性化ＤＥＰ電極付近に存在する微小物体（不掲載）に対して正味のＤＥＰ力を生じさせ得る。電源２１２の周波数ならびに及び領域／チャンバ２０２内の培地（不掲載）及び／又は微小物体の誘電特性などの特徴に応じて、ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き付けたり遠ざけたりし得る。（例えば、正方形パターン２２４を形成するＤＥＰ電極のセットにおいて）ＤＥＰ電極のセットを選択的に活性化及び不活性化することにより、領域／チャンバ２０２内の１つ又は複数の微小物体を捕捉し、領域／チャンバ２０２内を移動させることができる。図１の動力モジュール１６２は、このようなスイッチを制御し、それにより個々の１つのＤＥＰ電極を活性化及び不活性化して、領域／チャンバ２０２周辺のある特定の微小物体（不掲載）を選択し、捕捉し、移動させることができる。選択的に位置を指定して通電することが可能な電極を含むＤＥＰ構造を有するマイクロ流体装置は当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第６，２９４，０６３号（Ｂｅｃｋｅｒら）及び同第６，９４２，７７６号（Ｍｅｄｏｒｏ）（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に既に記載されている。
[0161] また別の例として、マイクロ流体装置２００はエレクトロウェッティング（ＥＷ）構造を有してもよく、ＥＷ構造は、ＤＥＰ構造に代わるものであっても、マイクロ流体装置２００のＤＥＰ構造を有する部分とは別個の部分に位置するものであってもよい。ＥＷ構造はオプトエレクトロウェッティング構造であっても誘電体上のエレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）構造であってもよく、ともに当該技術分野で公知のものである。いくつかのＥＷ構造では、支持構造物１０４は、誘電体層（不掲載）と底部電極２０４との間に挟まれた電極活性化基板２０６を有する。誘電体層は、疎水材料を含み、かつ／又は疎水材料でコートされたものであり得る。ＥＷ構造を有するマイクロ流体装置２００では、支持構造物１０４の内表面２０８が誘電体層又はその疎水コーティングの内表面となる。
[0162] 誘電体層（不掲載）は、１つ又は複数の酸化物層を含んでよく、厚さが約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ（例えば、約１２５ｎｍ〜約１７５ｎｍ）であり得る。ある特定の実施形態では、誘電体層は、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハーフニウム（ｈａｌｆｎｕｉｍ ｏｘｉｄｅ））などの酸化物の層を含み得る。ある特定の実施形態では、誘電体層は金属酸化物以外の誘電材料、例えば酸化ケイ素又は窒化物などを含み得る。正確な組成及び厚さに関係なく、誘電体層はインピーダンスが約１０ｋＯｈｍ〜約５０ｋＯｈｍであり得る。
[0163] いくつかの実施形態では、領域／チャンバ２０２に向かって内側に面する誘電体層の表面を疎水材料でコートする。疎水材料は、例えばフッ素化炭素分子を含み得る。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標））又はポリ（２，３−ジフルオロメチレニル−ペルフルオロテトラヒドロフラン）（例えば、ＣＹＴＯＰ（商標））などのペルフルオロ−ポリマーが挙げられる。疎水材料を構成する分子を誘電体層の表面と共有結合させることができる。例えば、疎水材料の分子をシロキサン基、ホスホン酸基又はチオール基などのリンカーによって誘電体層の表面と共有結合させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、疎水材料は、アルキル終端化シロキサン、アルキル終端化ホスホン酸又はアルキル終端化チオールを含み得る。アルキル基は、長鎖炭化水素（例えば、炭素が少なくとも１０個又は少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個もしくはそれ以上の鎖を有する）であり得る。あるいは、アルキル基の代わりにフッ素化（又は過フッ素化）炭素鎖を用いてもよい。したがって、例えば、疎水材料はフルオロアルキル終端化シロキサン、フルオロアルキル終端化ホスホン酸又はフルオロアルキル終端化チオールを含み得る。いくつかの実施形態では、疎水コーティングは、厚さが約１０ｎｍ〜約５０ｎｍである。他の実施形態では、疎水コーティングは、厚さが１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５〜３．０ｎｍ）である。
[0164] いくつかの実施形態では、エレクトロウェッティング構造を有するマイクロ流体装置２００のカバー１１０も疎水材料（不掲載）でコートする。疎水材料は、支持構造物１０４の誘電体層をコートするのに用いるものと同じ疎水材料であってよく、疎水コーティングは、実質的に支持構造物１０４の誘電体層上の疎水コーティングと同じ厚さであってよい。さらに、カバー１１０は、支持構造物１０４のように、誘電体層と上部電極２１０との間に挟まれた電極活性化基板２０６を含み得る。電極活性化基板２０６及びカバー１１０の誘電体層は、支持構造物１０４の電極活性化基板２０６及び誘電体層と組成及び／又は寸法が同じであってよい。したがって、マイクロ流体装置２００は、エレクトロウェッティング表面を２つ有し得る。
[0165] いくつかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、上記のような光伝導材料を含み得る。したがって、ある特定の実施形態では、電極活性化基板２０６は、水素化アモルファスシリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、これよりなるものであり得る。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば水素を約８％〜４０％（１００×水素原子数／水素原子とケイ素原子の総数で算出される）含み得る。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は、厚さが約５００ｎｍ〜約２．０μｍであり得る。あるいは、電極活性化基板２０６は、上記のように、フォトトランジスタスイッチによって制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含み得る。オプトエレクトロウェッティング構造を有するマイクロ流体装置は当該技術分野で公知であり、かつ／又は当該技術分野で公知の電極活性化基板で構築することができる。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Ｃｈｉｏｕら）（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）には、ａ−Ｓｉ：Ｈなどの光伝導材料を有するオプトエレクトロウェッティング構造が開示されており、上で参照した米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Ｓｈｏｒｔら）には、フォトトランジスタスイッチによって制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
[0166] したがって、マイクロ流体装置２００はオプトエレクトロウェッティング構造を有してよく、光パターン２２２を用いて電極活性化基板２０６内の光伝導ＥＷ領域又は光応答ＥＷ電極を活性化することができる。このように活性化された電極活性化基板２０６のＥＷ領域又はＥＷ電極は、支持構造物１０４の内表面２０８（すなわち、被覆誘電体層又はその疎水コーティングの内表面）でエレクトロウェッティング力を生じさせ得る。光パターン２２２を変化させて（又はマイクロ流体装置２００を光源２２０に対して相対的に移動させて）電極活性化基板２０６への入射を変化させることにより、支持構造物１０４の内表面２０８に接触している（例えば、水性媒体、溶液又は溶媒を含有する）液滴に領域／チャンバ２０２中に存在する不混和流体（例えば、油媒体）の中を移動させることができる。
[0167] 他の実施形態では、マイクロ流体装置２００はＥＷＯＤ構造を有してよく、電極活性化基板２０６は、活性化を光に依存せず選択的に位置を指定して通電することが可能な電極を含み得る。したがって、電極活性化基板２０６は、このようなエレクトロウェッティング（ＥＷ）電極のパターンを含み得る。このパターンは例えば、図２Ｂに示されるような、行と列の形で配置された実質的に正方形のＥＷ電極の配列であり得る。あるいは、このパターンは、六方格子を形成する実質的に六家系のＥＷ電極の配列であり得る。ＥＷ電極は、パターンを問わず、電気スイッチ（例えば、半導体基板内のトランジスタスイッチ）によって選択的に活性化することができる。電極活性化基板２０６内のＥＷ電極を選択的に活性化及び不活性化することによって、被覆誘電体層又はその疎水コーティングの内表面２０８に接触している液滴（不掲載）を領域／チャンバ２０２内で移動させることができる。図１の動力モジュール１６２は、このようなスイッチを制御し、それにより個々のＥＷ電極を活性化及び不活性化して、領域／チャンバ２０２周辺の特定の液滴を選択して移動させることができる。選択的に位置を指定して通電することが可能な電極を有するＥＷＯＤ構造を有するマイクロ流体装置は当該技術分野で公知であり、例えば米国特許第８，６８５，３４４号（Ｓｕｎｄａｒｓａｎら）（内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に既に記載されている。
[0168] マイクロ流体装置２００の構造に関係なく、電源２１２を用いて、マイクロ流体装置２００の電気回路に電力を供給する電位（例えば、ＡＣ電圧電位）を発生させることができる。電源２１２は、図１で参照される電源１９２と同じものであっても、その構成要素であってもよい。電源２１２は、上部電極２１０及び底部電極２０４にＡＣ電圧及び／又は電流を供給するよう設計することができる。ＡＣ電圧に関しては、電源２１２は、上記のように領域／チャンバ２０２内の個々の微小物体（不掲載）を捕捉し移動させるのに十分な大きさの正味のＤＥＰ力（又はエレクトロウェッティング力）を発生させ、かつ／又は同じく上記のように、領域／チャンバ２０２内の支持構造物１０４の内表面２０８（すなわち、誘電体層及び／又は誘電体層上の疎水コーティング）のウェッティング特性を変化させるのに十分な範囲の周波数及び電力（例えば、電圧又は電流）平均値又はピーク値をもたらすことができる。このような周波数の範囲及び電力平均値又はピーク値の範囲は当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Ｃｈｉｏｕら）、米国再発行特許第４４，７１１号（Ｗｕら）（最初に米国特許第７，６１２，３５５号として発行）のほか、米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Ｓｈｏｒｔら）、同第２０１５／０３０６５９８号（Ｋｈａｎｄｒｏｓら）及び同第２０１５／０３０６５９９（Ｋｈａｎｄｒｏｓら）を参照されたい。
[0169] 隔離囲い。一般的な隔離囲い２４４、２４６及び２４８の非限定的な例が、図２Ｃ及び図２Ｄに図示されるマイクロ流体装置２４０の内部に示されている。隔離囲い２４４、２４６及び２４８はそれぞれ、隔離領域２５８及び隔離領域２５８とチャネル１２２とを流体連結する接続領域２５４を画定する隔離構造２５０を含み得る。接続領域２５４は、チャネル１２２への近位開口部２５２と隔離領域２５８への遠位開口部２５６とを含み得る。接続領域２５４は、チャネル１２２から隔離囲い２４４、２４６、２４８に流れ込む流体培地（不掲載）の流れの最大侵入深度が隔離領域２５８の中に及ばないように設計することができる。したがって、接続領域２５４により、隔離囲い２４４、２４６、２４８の隔離領域２５８内に配置されている微小物体（不掲載）をはじめとする物質（不掲載）をチャネル１２２内の培地１８０の流れから隔離し、実質的にその影響を受けないようにすることができる。
[0170] したがって、チャネル１２２は通過領域の一例となり得、隔離囲い２４４、２４６、２４８の隔離領域２５８は非通過領域の一例となり得る。上記のように、チャネル１２２及び隔離囲い２４４、２４６、２４８は、１つ又は複数の流体培地１８０を含むように設計することができる。図２Ｃ〜図２Ｄに示される例では、出入口２４２がチャネル１２２と連結されており、流体培地１８０をマイクロ流体装置２４０内に導入したり、そこから除去したりすることを可能にしている。流体培地１８０を導入する前に、二酸化炭素ガスなどのガスでマイクロ流体装置に前処理を施してもよい。マイクロ流体装置２４０に流体培地１８０が入った後、チャネル１２２内の流体培地１８０の流れ２６０を選択的に発生及び停止させることができる。例えば、図のように、出入口２４２をチャネル１２２の異なった位置（例えば、両端）に配置し、入口として機能する一方の出入口２４２から出口として機能する他方の出入口２４２へ培地の流れ２６０を生じさせることができる。
[0171] 図２Ｅに、本発明による隔離囲い２４４の一例の詳細な図を示す。ほかにも微小物体２７０を示す。
[0172] 図からわかるように、隔離囲い２４４の近位開口部２５２を通過するマイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０の流れ２６０により、隔離囲い２４４に入り、かつ／又はそこを出る培地１８０の二次流２６２が生じ得る。隔離囲い２４４の隔離領域２５８内の微小物体２７０を二次流２６２から隔離するには、隔離囲い２４４の接続領域２５４（すなわち、近位開口部２５２から遠位開口部２５６までの）長さＬｃｏｎを二次流２６２の接続領域２５４内への侵入深度Ｄｐよりも長くするべきである。二次流２６２の侵入深度Ｄｐは、チャネル１２２を流れる流体培地１８０の速度のほか、チャネル１２２及び接続領域２５４のチャネル１２２への近位開口部２５２の構造に関連する様々なパラメータに左右される。所与のマイクロ流体装置では、チャネル１２２及び開口部２５２の構造が固定されるのに対し、チャネル１２２内の流体培地１８０の流れ２６０の速度は変化する。したがって、隔離囲い２４４それぞれに対して、二次流２６２の侵入深度Ｄｐが接続領域２５４の長さＬｃｏｎを超えないようにできるチャネル１２２内の流体培地１８０の流れ２６０の最大速度Ｖｍａｘを特定することができる。チャネル１２２内の流体培地１８０の流れ２６０の速度が最大速度Ｖｍａｘを超えない限り、生じる二次流２６２をチャネル１２２及び接続領域２５４に限定し、隔離領域２５８に入らないようにすることができる。このようにして、チャネル１２２内の培地１８０の流れ２６０によって微小物体２７０が隔離領域２５８から出ることはなくなる。むしろ、隔離領域２５８内に位置する微小物体２７０は、チャネル１２２内の流体培地１８０の流れ２６０に関係なく隔離領域２５８内にとどまることになる。
[0173] さらに、チャネル１２２内の培地１８０の流れ２６０の速度がＶｍａｘを超えない限り、チャネル１２２内の培地１８０の流れ２６０によって雑多な粒子（例えば、微粒子及び／又はナノ粒子）がチャネル１２２から隔離囲い２４４の隔離領域２５８内に移動することはない。したがって、接続領域２５４の長さＬｃｏｎが二次流２６２の最大侵入深度Ｄｐよりも長いと、ある隔離囲い２４４がチャネル１２２又は別の隔離囲い（例えば、図２Ｄの隔離囲い２４６、２４８）の雑多な粒子に汚染されるのを防ぐことができる。
[0174] チャネル１２２及び隔離囲い２４４、２４６、２４８の接続領域２５４は、チャネル１２２内の培地１８０の流れ２６０の影響を受け得るため、チャネル１２２及び接続領域２５４をマイクロ流体装置２４０の通過（又は流動）領域と見なすことができる。一方、隔離囲い２４４、２４６、２４８の隔離領域２５８は非通過（又は非流動）領域と見なすことができる。例えば、チャネル１２２内の第一の流体培地１８０中の成分（不掲載）は、実質的に第一の培地１８０の成分がチャネル１２２から接続領域２５４を通って隔離領域２５８内の第二の流体培地２８０内に拡散することのみによって、隔離領域２５８内の第二の流体培地２８０と混ざり合うことができる。同じように、隔離領域２５８内の第二の培地２８０の成分（不掲載）は、実質的に第二の培地２８０の成分が隔離領域２５８から接続領域２５４を通ってチャネル１２２内の第一の培地１８０内に拡散することのみによって、チャネル１２２内の第一の培地１８０と混ざり合うことができる。第一の培地１８０は、第二の培地２８０と同じ培地であっても異なる培地であってもよい。さらに、第一の培地１８０と第二の培地２８０は、最初は同じ培地であり、のちに（例えば、隔離領域２５８内の１つもしくは複数の細胞によって第二の培地２８０を調整することによって、又はチャネル１２２を流れる培地１８０を変えることによって）異なる培地になり得る。
[0175] チャネル１２２内の流体培地１８０の流れ２６０によって生じる二次流２６２の最大侵入深度Ｄｐは、上記のようにいくつかのパラメータに左右され得る。このようなパラメータの例としては、チャネル１２２の形状（例えば、チャネルによって、培地が接続領域２５４内に向ったり、培地が接続領域２５４からそれたり、培地が実質的に接続領域２５４のチャネル１２２への近位開口部２５２に垂直の方向に向かったりし得る）；近位開口部２５２でのチャネル１２２の幅Ｗｃｈ（又は断面積）；及び近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）；チャネル１２２内の流体培地１８０の流れ２６０の速度Ｖ；第一の培地１８０及び／又は第二の培地２８０の粘度などが挙げられる。
[0176] いくつかの実施形態では、チャネル１２２及び隔離囲い２４４、２４６、２４８の寸法がチャネル１２２内の流体培地１８０の流れ２６０のベクトルに従う方向に向かい：チャネル幅Ｗｃｈ（又はチャネル１２２の断面積）が実質的に培地１８０の流れ２６０に垂直であり；開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）が実質的にチャネル１２２内の培地１８０の流れ２６０に平行であり；かつ／又は接続領域の長さＬｃｏｎが実質的にチャネル１２２内の培地１８０の流れ２６０に垂直であり得る。上記のものは単なる例であって、チャネル１２２と隔離囲い２４４、２４６、２４８の相対的な位置は、互いに別の方向であってもよい。
[0177] 図２Ｅに示されるように、接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは、近位開口部２５２から遠位開口部２５６まで均一であり得る。したがって、遠位開口部２５６での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは、近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎに関して本明細書で確認されるいずれかの範囲内であり得る。あるいは、遠位開口部２５６での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは、近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎより大きくてもよい。
[0178] 図２Ｅに示されるように、遠位開口部２５６での隔離領域２５８の幅は、実質的に近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎと同じであり得る。したがって、遠位開口部２５６での隔離領域２５８の幅は、近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎに関して本明細書で確認されるいずれかの範囲内であり得る。あるいは、遠位開口部２５６での隔離領域２５８の幅は、近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎより大きくても小さくてもよい。さらに、遠位開口部２５６は近位開口部２５２より小さくてもよく、接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは近位開口部２５２と遠位開口部２５６との間で狭くなっていてもよい。例えば、種々の異なる形状を用いて（例えば、接続領域に面取りを施して、接続領域をはすに切って）、接続領域２５４を近位開口部と遠位開口部との間で狭くし得る。さらに、接続領域２５４の任意の部分又はサブ部分を狭くしてもよい（例えば、接続領域の近位開口部２５２に隣接する部分）。
[0179] 隔離囲い（例えば、１２４、１２６、１２８、１３０、２４４、２４６又は２４８）の種々の実施形態では、複数の微小物体を収納するよう隔離領域（例えば、２５８）を設計する。他の実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はこれと同程度の比較的少数の微小物体のみを収納するよう隔離領域を設計し得る。したがって、隔離領域の容積は、例えば少なくとも４×１０５立方ミクロン、８×１０５立方ミクロン、１×１０６立方ミクロン、２×１０６立方ミクロン、４×１０６立方ミクロン、６×１０６立方ミクロン又はそれ以上であり得る。
[0180] 隔離囲いの種々の実施形態では、近位開口部（例えば、２５２）でのチャネル１２２の幅Ｗｃｈは、以下のいずれかの範囲内にあり得る：５０〜１０００ミクロン、５０〜５００ミクロン、５０〜４００ミクロン、５０〜３００ミクロン、５０〜２５０ミクロン、５０〜２００ミクロン、５０〜１５０ミクロン、５０〜１００ミクロン、７０〜５００ミクロン、７０〜４００ミクロン、７０〜３００ミクロン、７０〜２５０ミクロン、７０〜２００ミクロン、７０〜１５０ミクロン、９０〜４００ミクロン、９０〜３００ミクロン、９０〜２５０ミクロン、９０〜２００ミクロン、９０〜１５０ミクロン、１００〜３００ミクロン、１００〜２５０ミクロン、１００〜２００ミクロン、１００〜１５０ミクロン及び１００〜１２０ミクロン。上記のものは単なる例であり、チャネル１２２の幅Ｗｃｈはこれ以外の範囲（例えば、上記のいずれかの終点によって定められる範囲）内であってもよい。さらに、隔離囲いの近位開口部以外のチャネルの領域において、チャネル１２２のＷｃｈを上記のいずれかの範囲内になるよう選択することができる。
[0181] いくつかの実施形態では、隔離囲いは、断面高さが約３０〜約２００ミクロン又は約５０〜約１５０ミクロンである。いくつかの実施形態では、隔離囲いは、断面積が約１００，０００〜約２，５００，０００平方ミクロン又は約２００，０００〜約２，０００，０００平方ミクロンである。いくつかの実施形態では、接続領域は、断面高さが対応する隔離囲いの断面高さと一致する。いくつかの実施形態では、接続領域は、断面幅が約５０〜約５００ミクロン又は約１００〜約３００ミクロンである。
[0182] 隔離囲いの種々の実施形態では、近位開口部２５２でのチャネル１２２の高さＨｃｈは、以下のいずれかの範囲内であり得る：２０〜１００ミクロン、２０〜９０ミクロン、２０〜８０ミクロン、２０〜７０ミクロン、２０〜６０ミクロン、２０〜５０ミクロン、３０〜１００ミクロン、３０〜９０ミクロン、３０〜８０ミクロン、３０〜７０ミクロン、３０〜６０ミクロン、３０〜５０ミクロン、４０〜１００ミクロン、４０〜９０ミクロン、４０〜８０ミクロン、４０〜７０ミクロン、４０〜６０ミクロン又は４０〜５０ミクロン。上記のものは単なる例であり、チャネル１２２の高さＨｃｈはこれ以外の範囲（例えば、上記のいずれかの終点によって定められる範囲）内であってもよい。隔離囲いの近位開口部以外のチャネルの領域において、チャネル１２２の高さＨｃｈを上記のいずれかの範囲内になるよう選択することができる。
[0183] 隔離囲いの種々の実施形態では、近位開口部２５２でのチャネル１２２の断面積は、以下のいずれかの範囲内であり得る：５００〜５０，０００平方ミクロン、５００〜４０，０００平方ミクロン、５００〜３０，０００平方ミクロン、５００〜２５，０００平方ミクロン、５００〜２０，０００平方ミクロン、５００〜１５，０００平方ミクロン、５００〜１０，０００平方ミクロン、５００〜７，５００平方ミクロン、５００〜５，０００平方ミクロン、１，０００〜２５，０００平方ミクロン、１，０００〜２０，０００平方ミクロン、１，０００〜１５，０００平方ミクロン、１，０００〜１０，０００平方ミクロン、１，０００〜７，５００平方ミクロン、１，０００〜５，０００平方ミクロン、２，０００〜２０，０００平方ミクロン、２，０００〜１５，０００平方ミクロン、２，０００〜１０，０００平方ミクロン、２，０００〜７，５００平方ミクロン、２，０００〜６，０００平方ミクロン、３，０００〜２０，０００平方ミクロン、３，０００〜１５，０００平方ミクロン、３，０００〜１０，０００平方ミクロン、３，０００〜７，５００平方ミクロン又は３，０００〜６，０００平方ミクロン。上記のものは単なる例であり、近位開口部２５２でのチャネル１２２の断面積はこれ以外の範囲（例えば、上記のいずれかの終点によって定められる範囲）内であってもよい。
[0184] 隔離囲いの種々の実施形態では、接続領域２５４の長さＬｃｏｎは、以下のいずれかの範囲内であり得る：１〜２００ミクロン、５〜１５０ミクロン、１０〜１００ミクロン、１５〜８０ミクロン、２０〜６０ミクロン、２０〜５００ミクロン、４０〜４００ミクロン、６０〜３００ミクロン、８０〜２００ミクロン及び１００〜１５０ミクロン。上記のものは単なる例であり、接続領域２５４の長さＬｃｏｎは上記の例と異なる範囲（例えば、上記のいずれかの終点によって定められる範囲）内であってもよい。
[0185] 隔離囲いの種々の実施形態では、近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは、以下のいずれかの範囲内であり得る：２０〜５００ミクロン、２０〜４００ミクロン、２０〜３００ミクロン、２０〜２００ミクロン、２０〜１５０ミクロン、２０〜１００ミクロン、２０〜８０ミクロン、２０〜６０ミクロン、３０〜４００ミクロン、３０〜３００ミクロン、３０〜２００ミクロン、３０〜１５０ミクロン、３０〜１００ミクロン、３０〜８０ミクロン、３０〜６０ミクロン、４０〜３００ミクロン、４０〜２００ミクロン、４０〜１５０ミクロン、４０〜１００ミクロン、４０〜８０ミクロン、４０〜６０ミクロン、５０〜２５０ミクロン、５０〜２００ミクロン、５０〜１５０ミクロン、５０〜１００ミクロン、５０〜８０ミクロン、６０〜２００ミクロン、６０〜１５０ミクロン、６０〜１００ミクロン、６０〜８０ミクロン、７０〜１５０ミクロン、７０〜１００ミクロン及び８０〜１００ミクロン。上記のものは単なる例であり、近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは上記の例とは異なるもの（例えば、上記のいずれかの終点によって定められる範囲）であってもよい。
[0186] 隔離囲いの種々の実施形態では、近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは、少なくとも隔離囲いが目的とする微小物体（例えば、卵母細胞、卵細胞、胚、精子）の最大寸法と同じ大きさであり得る。例えば、中に卵母細胞、卵細胞又は胚が配置される隔離囲いの近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは、以下のいずれかの範囲内であり得る：約１００ミクロン、約１１０ミクロン、約１２０ミクロン、約１３０ミクロン、約１４０ミクロン、約１５０ミクロン、約１６０ミクロン、約１７０ミクロン、約１８０ミクロン、約１９０ミクロン、約２００ミクロン又は約１００−２００ミクロン、約１２０−２００ミクロンもしくは約１４０−２００ミクロン。上記のものは単なる例であり、近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎは上記の例と異なるもの（例えば、上記のいずれかの終点によって定められる範囲）であってもよい。
[0187] 隔離囲いの種々の実施形態では、近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎに対する接続領域２５４の長さＬｃｏｎの比は、以下のいずれかの比以上であり得る：０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０又はそれ以上。上記のものは単なる例であり、近位開口部２５２での接続領域２５４の幅Ｗｃｏｎに対する接続領域２５４の長さＬｃｏｎの比は、上記の例と異なるものであってもよい。
[0188] マイクロ流体装置１００、２００、２４０、２９０の種々の実施形態では、Ｖｍａｘを０．２μＬ／秒、０．３μＬ／秒、０．４μＬ／秒、０．５μＬ／秒、０．６μＬ／秒、０．７μＬ／秒、０．８μＬ／秒、０．９μＬ／秒、１．０μＬ／秒、１．１μＬ／秒、１．２μＬ／秒、１．３μＬ／秒、１．４μＬ／秒又は１．５μＬ／秒前後に設定し得る。
[0189] 隔離囲いを有するマイクロ流体装置の種々の実施形態では、隔離囲いの隔離領域２５８の容積は、例えば少なくとも５×１０５立方ミクロン、８×１０５立方ミクロン、１×１０６立方ミクロン、２×１０６立方ミクロン、４×１０６立方ミクロン、６×１０６立方ミクロン、８×１０６立方ミクロン、１×１０７立方ミクロン又はそれ以上であり得る。隔離囲いを有するマイクロ流体装置の種々の実施形態では、隔離囲いの容積は、約５×１０５立方ミクロン、６×１０５立方ミクロン、８×１０５立方ミクロン、１×１０６立方ミクロン、２×１０６立方ミクロン、４×１０６立方ミクロン、８×１０６立方ミクロン、１×１０７立方ミクロン、３×１０７立方ミクロン、５×１０７立方ミクロンもしくは約８×１０７立方ミクロン又はそれ以上であり得る。
[0190] 種々の実施形態では、マイクロ流体装置は、本明細書に記載されるいずれかの実施形態と同じように設計された隔離囲いを有し、ここでは、マイクロ流体装置は、隔離囲いを約５〜約１０個、約１０〜約５０個、約１００〜約５００個；約２００〜約１０００個又は約５００〜約１５００個有する。このような隔離囲いは全部が同じ大きさである必要はない。
[0191] 図２Ｆに、一実施形態によるマイクロ流体装置２９０を示す。図２Ｆに示されるマイクロ流体装置２９０はマイクロ流体装置１００の定型略図である。実際には、マイクロ流体装置２９０及びその構成回路要素（例えば、チャネル１２２及び隔離囲い１２８）は本明細書に記載される寸法を有する。図２Ｆに示されるマイクロ流体回路１２０には、２つの出入口１０７、４つの異なるチャネル１２２及び４つの異なる流路１０６がある。マイクロ流体装置２９０はさらに、各チャネル１２２に通じる複数の隔離囲いを含む。図２Ｆに示されるマイクロ流体装置では、隔離囲いは図２Ｅに示される囲いとほぼ同じ幾何学的形状を有し、したがって、接続領域及び隔離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路１２０は、通過領域（例えば、チャネル１２２及び二次流２６２の最大侵入深度Ｄｐ以内の接続領域２５４の部分）及び非通過領域（例えば、隔離領域２５８及び二次流２６２の最大侵入深度Ｄｐ以内の接続領域２５４の部分）の両方を含む。
[0192] 図３Ａ〜図３Ｂに、本発明によるマイクロ流体装置（例えば、１００、２００、２４０、２９０）を稼働及び観察するのに用いることができるシステム１５０の種々の実施形態を示す。図３Ａに示されるように、システム１５０は、マイクロ流体装置１００（不掲載）をはじめとする本明細書に記載の任意のマイクロ流体装置を保持するよう設計された構造物（「ネスト」）３００を含み得る。ネスト３００は、マイクロ流体装置３６０（例えば、光学作動式動電型装置１００）と連動し、電源１９２からマイクロ流体装置３６０に電気的接続をもたらすことが可能なソケット３０２を含み得る。ネスト３００はさらに、組み込まれた電気シグナル発生サブシステム３０４を含み得る。電気シグナル発生サブシステム３０４は、電極対がソケット３０２に保持されている場合、ソケット３０２にバイアス電圧を供給し、マイクロ流体装置３６０内の電極対の間にバイアス電圧をかけるように設計され得る。したがって、電気シグナル発生サブシステム３０４は電源１９２の一部となり得る。マイクロ流体装置３６０にバイアス電圧をかけることができるというのは、マイクロ流体装置３６０がソケット３０２に保持されている場合に常にバイアス電圧がかかるという意味ではない。むしろほとんどの場合、バイアス電圧は間欠的に、例えば、マイクロ流体装置３６０内で誘電泳動又はエレクトロウェッティングなどの動電力の発生を促進する必要があるときに限りかかる。
[0193] 図３Ａに示されるように、ネスト３００はプリント回路基板アセンブリ（ＰＣＢＡ）３２０を含み得る。電気シグナル発生サブシステム３０４は、ＰＣＢＡ３２０内に取り付けられ電気的に組み込まれていてよい。例示的な支持物は、ＰＣＢＡ３２０に取り付けられたソケット３０２も含む。
[0194] 電気シグナル発生サブシステム３０４は通常、波形発生器（不掲載）を含む。電気シグナル発生サブシステム３０４はさらに、波形発生器から受け取った波形を増幅するよう設計されたオシロスコープ（不掲載）及び／又は波形増幅回路（不掲載）を含み得る。オシロスコープが存在する場合、それは、ソケット３０２に保持されているマイクロ流体装置３６０に供給される波形を測定するよう設計されていてよい。ある特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体装置３６０の近位にある（かつ波形発生器の遠位にある）位置の波形を測定し、したがって、実際に装置に加えられた波形の測定の精度をさらに高くする。オシロスコープによる測定から得たデータを、例えば波形発生器にフィートバックすることができ、そのようなフィートバックに基づいて出力を調節するよう波形発生器を設計することができる。波形発生器とオシロスコープとの組み合わせの適切な例にはＲｅｄ Ｐｉｔａｙａ（商標）がある。
[0195] ある特定の実施形態では、ネスト３００はさらに、電気シグナル発生サブシステム３０４の検知及び／又は制御に使用するマイクロプロセッサなどの制御装置３０８を含む。適切なマイクロプロセッサの例としては、Ａｒｄｕｉｎｏ Ｎａｎｏ（商標）などのＡｒｄｕｉｎｏ（商標）マイクロプロセッサが挙げられる。制御装置３０８を用いて、機能及び解析を実行しても、外部の主制御装置１５４（図１に示されるもの）と通信して機能及び解析を実行してもよい。図３Ａに示される実施形態では、制御装置３０８は、インターフェース３１０（例えば、プラグ又はコネクタ）を介して主制御装置１５４と通信する。
[0196] いくつかの実施形態では、ネスト３００は、Ｒｅｄ Ｐｉｔａｙａ（商標）波形発生器／オシロスコープユニット（「Ｒｅｄ Ｐｉｔａｙａユニット」）と、Ｒｅｄ Ｐｉｔａｙａユニットにより発生した波形を増幅し、増幅された電圧をマイクロ流体装置１００に送る波形増幅回路とを含む、電気シグナル発生サブシステム３０４を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｒｅｄ Ｐｉｔａｙａユニットは、増幅された電圧をマイクロ流体装置３６０において測定し、次いで必要に応じて、マイクロ流体装置３６０において測定された電圧が所望の値になるようそれ自体の出力電圧を調節するよう設計されている。いくつかの実施形態では、波形増幅回路は、ＰＣＢＡ３２０に取り付けられた１対のＤＣ−ＤＣコンバータの対により発生する電力供給が＋６．５Ｖ〜−６．５Ｖであり、マイクロ流体装置１００において最大１３Ｖｐｐのシグナルを発生し得る。
[0197] 図３Ａに示されるように、支持構造物３００はさらに、温度制御サブシステム３０６を含み得る。温度制御サブシステム３０６は、支持構造物３００によって保持されるマイクロ流体装置３６０の温度を調節するよう設計することができる。例えば、温度制御サブシステム３０６は、ペルチェ電熱素子（不掲載）と冷却ユニット（不掲載）とを含み得る。ペルチェ電熱素子は、マイクロ流体装置３６０の少なくとも１つの表面と連動するよう設計された第一の表面を有し得る。冷却ユニットは、例えば液体冷却アルミニウムブロックなどの冷却ブロックであり得る。ペルチェ電熱素子の第二の表面（例えば、第一の表面の反対側の表面）をこのような冷却ブロックと連動するよう設計することができる。冷却ブロックは、冷却された流体が冷却ブロックの中を循環するよう設計された流体通路３３０と連結されていてよい。図３Ａに示される実施形態では、支持構造物３００は、外部の貯蔵器（不掲載）から冷却された流体を受け取り、それを流体通路３３０に導入して冷却ブロックの中を通過させた後、それを外部の貯蔵器に戻すための入口３３２と出口３３４とを含む。いくつかの実施形態では、ペルチェ電熱素子、冷却ユニット及び／又は流体通路３３０を支持構造物３００の枠３４０に取り付けることができる。いくつかの実施形態では、ペルチェ電熱素子の温度を調節してマイクロ流体装置３６０を目的の温度するよう温度制御サブシステム３０６を設計する。ペルチェ電熱素子の温度調節は、例えばＰｏｌｏｌｕ（商標）熱電電源（Ｐｏｌｏｌｕ Ｒｏｂｏｔｉｃｓ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社）などの熱電電源によって実施することができる。温度制御サブシステム３０６は、アナログ回路によって得られる温度値などのフィードバック回路を含み得る。あるいは、フィードバック回路は、デジタル回路によって得られるものであってもよい。
[0198] いくつかの実施形態では、ネスト３００は、抵抗器（例えば、抵抗１ｋＯｈｍ＋／−０．１％、温度係数＋／−０．０２ｐｐｍ／Ｃ０のもの）とＮＴＣサーミスタ（例えば、名目抵抗１ｋＯｈｍ＋／−０．０１％のもの）とを含むアナログ分圧回路（不掲載）であるフィードバック回路を有する、温度制御サブシステム３０６を含み得る。いくつかの場合には、温度制御サブシステム３０６は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次いで計算温度値を内蔵ＰＩＤ制御ループアルゴリズムへの入力データとして用いる。ＰＩＤ制御ループアルゴリズムからの出力データは、例えばＰｏｌｏｌｕ（商標）モータードライブ（不掲載）上の方向指示シグナルピン及びパルス幅調節シグナルピンの両方を駆動し、熱電電源を稼働させることにより、ペルチェ電熱素子を制御することができる。
[0199] ネスト３００は、制御装置３０８のマイクロプロセッサがインターフェース３１０を介して外部の主制御装置１５４と通信することを可能にするシリアルポート３５０を含み得る。さらに、制御装置３０８のマイクロプロセッサは、（例えば、Ｐｌｉｎｋツール不掲載）を通じて）電気シグナル発生サブシステム３０４及び温度制御サブシステム３０６と通信することができる。したがって、制御装置３０８とインターフェース３１０とシリアルポート３５０との組合せを介して、電気シグナル発生サブシステム３０８及び温度制御サブシステム３０６は外部の主制御装置１５４と通信することができる。このようにして、主制御装置１５４は、出力電圧を調節するためのスケーリング計算を実行することによって、とりわけ電気シグナル発生サブシステム３０８を補助することができる。外部の主制御装置１５４と接続されたディスプレイ装置１７０を介してもたらされるグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）（不掲載）を、温度制御サブシステム３０６及び電気シグナル発生サブシステム３０８からそれぞれ得られた温度及び波形に関するデータをプロットするよう設計することができる。上記のものに代えて、又はこれに加えて、ＧＵＩにより制御装置３０８、温度制御サブシステム３０６及び電気シグナル発生サブシステム３０４をアップデートすることが可能である。
[0200] 上記のように、システム１５０は撮像装置１９４を含み得る。いくつかの実施形態では、撮像装置１９４は光調節サブシステム４０４を含む。光調節サブシステム４０４はデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）又はマイクロシャッタアレイシステム（ＭＳＡ）を含んでよく、そのいずれかは、光源４０２から光を受け取り、その一部を顕微鏡４００の光学縦列内に送るよう設計されていてよい。あるいは、光調節サブシステム４０４は、それ自体の光を発する（したがって、光源４０２の必要がなくなる）装置、例えば有機発光ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）装置、強誘電性液晶オンシリコン装置（ＦＬＣＯＳ）又は透過型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）などを含み得る。光調節サブシステム４０４は、例えばプロジェクタであり得る。したがって、光調節サブシステム４０４は、構造化された光及び構造化されていない光の両方を放射することが可能なものであり得る。適切な光調節サブシステム４０４の一例には、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標）社のＭｏｓａｉｃ（商標）システムがある。ある特定の実施形態では、システム１５０の撮像モジュール１６４及び／又は動力モジュール１６２は光調節サブシステム４０４を制御することができる。
[0201] ある特定の実施形態では、撮像装置１９４はさらに顕微鏡４００を含む。このような実施形態では、ネスト３００と光調節サブシステム４０４が顕微鏡４００に取り付けられるよう別個に設計されていてよい。顕微鏡４００は、例えば標準的な研究グレードの光顕微鏡又は蛍光顕微鏡であり得る。したがって、ネスト３００を顕微鏡４００のステージ４１０に取り付けられるよう設計し、かつ／又は光調節サブシステム４０４を顕微鏡４００のポートに取り付けられるよう設計することができる。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト３００及び光調節サブシステム４０４は、顕微鏡４００と一体になった構成要素であり得る。
[0202] ある特定の実施形態では、顕微鏡４００はさらに、１つ又は複数の検出器４２２を含み得る。いくつかの実施形態では、検出器４２２は撮像モジュール１６４によって制御される。検出器４２２は、接眼レンズ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ（例えば、デジタルカメラ）又はその任意の組合せを含み得る。少なくとも２つの検出器４２２が存在する場合、一方の検出器が例えば高フレーム率のカメラであり、もう一方の検出器が高感度のカメラであり得る。さらに、顕微鏡４００は、マイクロ流体装置３６０から反射及び／又は放射された光を受け取り、その少なくとも一部を１つ又は複数の検出器４２２に集めるよう設計された光学縦列を含み得る。顕微鏡の光学縦列はほかにも、各検出器上の最終倍率が異なるものになるよう検出器ごとに異なるチューブレンズ（不掲載）を含み得る。
[0203] ある特定の実施形態では、撮像装置１９４は、少なくとも２つの光源を用いるよう設計されている。例えば、第一の光源４０２は、（例えば、光調節サブシステム４０４と通して）構造化された光を発するために使用し、第二の光源４３２は、構造化されていない光を発するよう使用することができる。第一の光源４０２は、光学作動式電動及び／又は蛍光励起のための構造化された光を発し、第二の光源４３２は、明視野照明を得るために使用するものであり得る。これらの実施形態では、動力モジュール１６４を用いて第一の光源４０４を制御し、撮像モジュール１６４を用いて第二の光源４３２を制御し得る。顕微鏡４００の光学縦列は、（１）装置が支持構造物２００によって保持されている場合、光調節サブシステム４０４から構造化された光を受け取り、それを光学作動式動電型装置などのマイクロ流体装置内の少なくとも１つの第一の領域に集め、（２）マイクロ流体装置から反射及び／又は放射された光を受け取り、その少なくとも一部を検出器４２２上に集めるよう設計されていてよい。光学縦列はさらに、装置が支持構造物３００によって保持されている場合、第二の光源から構造化されていない光を受け取り、それをマイクロ流体装置の少なくとも１つの第二の領域に集めるよう設計されていてよい。ある特定の実施形態では、マイクロ流体装置の第一の領域と第二の領域は重なり合う領域であってよい。例えば、第一の領域は第二の領域の一部であってよい。
[0204] 図３Ｂでは、第一の光源４０２は、光調節サブシステム４０４に光を供給し、それにより顕微鏡４００の光学縦列に構造化された光を供給するよう示されている。第二の光源４３２は、ビームスプリッタ４３６を介して光学縦列に構造化されていない光を供給するよう示されている。光調節サブシステム４０４からの構造化された光及び第二の光源４３２からの構造化されていない光はともに、ビームスプリッタ４３６から光学縦列の中を伝わり、第二のビームスプリッタ４３６（又は光調節サブシステム４０４が供給する光に応じてダイクロイックフィルタ４０６）に到達し、そこで下に向かって反射されて対物レンズ４０８を通り試料平面４１２に達する。次いで、試料平面４１２から反射及び／又は放射された光は、対物レンズ４０８の中を上に向かって伝わり、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ４０６を通ってダイクロイックフィルタ４２４まで伝わる。ダイクロイックフィルタ４２４に到達する光のごく一部がこれを通過して検出器４２２に到達する。
[0205] いくつかの実施形態では、第二の光源４３２は青色光を放射する。しかるべきダイクロイックフィルタ４２４を用いれば、試料平面４１２から反射された青色光がダイクロイックフィルタ４２４を通過し、検出器４２２に到達することができる。これに対し、光調節サブシステム４０４から出る構造化された光は試料平面４１２から反射するが、ダイクロイックフィルタ４２４は通過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ４２４は波長が４９５ｎｍを超える可視光を除去する。光調節サブシステムから放射される光が４９５ｎｍよりも短い波長を一切含まなければ、このような光調節サブシステム４０４からの光の除外が（図のように）完全になるだけである。実際には、光調節サブシステム４０４から出る光が４９５ｎｍよりも短い波長（例えば、青色波長）を含む場合、光調節サブシステムからの光の一部がフィルタ４２４を通過し、検出器４２２に到達することになる。このような実施形態では、フィルタ４２４は、第一の光源４０２から検出器４２２に到達する光の量と第二の光源４３２から検出器４２２に到達する光の量と間のバランスを変化させるよう作用する。このことは、第一の光源４０２が第二の光源４３２よりも大幅に強力である場合に有益であり得る。他の実施形態では、第二の光源４３２が赤色光を放射し、ダイクロイックフィルタ４２４が赤色光以外の可視光（例えば、波長が６５０ｎｍよりも短い可視光）を除去し得る。
[0206] 実施例１．高生存能の胚のモニタリング。図４に示されるように、マイクロ流体装置１００、２００、２４０又は２９０のいずれかのように設計され得るマイクロ流体装置の隔離囲い４３０の隔離領域４５８に胚が配置され得る。マイクロ流体装置は流路を有してよく、この例では、流路は流れ２６０の向きが左から右に向かって示されているチャネル１２２である。隔離囲いは流路と流体連絡されており、隔離囲いの近位開口部４５２は、新鮮な培地が隔離囲いの中に流れ込み胚を運び去ることなくチャネルから隔離囲い（及び胚）の周囲一帯に新鮮な培地が供給されるようにチャネルに開口している。チャネル壁４１４は流路の境界となり、マイクロ流体装置の内表面２０８は、ＤＥＰ構造（光電子ピンセット（ＯＥＴ）構造を含む）又はエレクトロウェッティング構造（オプトエレクトウェッティング（ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｏｗｅｔｔｉｎｇ）（ＯＥＷ）構造を含む）のいずれかとして設計され得る基板の上面になっていても、そのような基板を覆っていてもよい。隔離囲い内への胚の配置は、流体流動、重力、ＤＥＰもしくはエレクトロウェッティング力又はその組合せによって実行され得る。隔離領域は、胚の培養を支えるのに十分な大きさ、例えば、胚に有毒となる老廃物が蓄積されない程度に大きく、細胞が分泌する生存シグナル伝達因子が過剰に希釈されない程度に小さい大きさを有するよう設計し得る。培地の流れ２６０は、隔離囲い４３の隔離領域４５８から接続領域４５４まで領域からの拡散により必要な栄養素を供給し、老廃物を除去するのに効果的な速度で間欠的であっても一定であってもよい。培地はＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）であってよく、実験全体を通じてこれを使用することができる。
[0207] 図５Ａでは、特に限定されないが流体流動２６０、重力、ＤＥＰ又はエレクトロウェッティングを含めた任意のしかるべき手段によって、捕捉ビーズ５７４が囲い４３０の近位開口部４５２に隣接するチャネル１２２内に取り込まれ得る。胚分泌物５１０は拡散によって囲い４３０から出る。通常、ビーズ５７４及び分泌物５１０がチャネル１２２を移動して囲い４３０から離れるのを防ぐため、流れ２６０を停止させる。胚分泌物５１０は捕捉ビーズ５７４によって捕捉され、隔離囲い４３０に隣接する位置に移動するか、隔離囲い４３０そのものの中に入り得る（不掲載）。第一の捕捉ビーズ５７４の組を所定の位置（例えば、流路内）で、又はマイクロ流体装置から排出された後にアッセイすることができる。上記のものに代えて、又はこれに加えて、胚２７２の形態の画像を１つ又は複数取得してもよい。このような撮像及び／又は分泌物に関するデータを時間１で収集し得る。時間１は、図５Ａに示されるように単一細胞接合子期であり得る。図５Ａ〜５Ｃのチャネル壁４１４、チャネル１２２、囲い４３０、隔離領域４５８、接続領域４５４、近位開口部４５２及び内表面２０８は、それぞれ図４に記載されているものである。
[0208] 次いで、胚分泌物５１２は第二の捕捉ビーズ５７６の組によって捕捉され、隔離囲い４３０に隣接して位置するか、隔離囲いそのものの中に入り得る（不掲載）。同じく、第二の捕捉ビーズ５７６を所定の位置（例えば、流路内）で、又はマイクロ流体装置から排出された後にアッセイすることができる。上記のものに代えて、又はこれに加えて、胚２７４の形態の画像をさらに１つ又は複数取得してもよい。このような撮像及び分泌物に関するデータを時間２で収集し得る。時間２は、図５Ｂに示されるように二細胞期であり得る。第二の捕捉ビーズ５７６の組で実施する分泌物アッセイは、第一の捕捉ビーズ５７４の組で実施するものと同じアッセイであり得る。
[0209] さらにその後、胚分泌物５１４が第三の捕捉ビーズ５７８の組によって捕捉され、隔離囲いに隣接する位置又は隔離囲いそのものの中に移動し得る（不掲載）。第三の捕捉ビーズ５７８の組を所定の位置（例えば、流路内）又はマイクロ流体装置から排出された後にアッセイすることができる。上記のものに代えて、又はこれに加えて、胚２７６の形態の画像をさらに１つ又は複数取得してもよい。このような撮像及び分泌物に関するデータを時間３で収集し得る。時間３は、図５Ｃに示されるように四細胞期であり得る。第三の捕捉ビーズ５７８の組で実施する分泌物アッセイは、第一（５７４）又は第二（５７６）の捕捉ビーズの組で実施したものと同じアッセイであっても、第一及び第二の捕捉ビーズの組の一方又は両方のものと異なるものであってもよい。例えば、ビーズ５７４は、テイ・サックス病の原因となる単一遺伝子の核酸を捕捉するよう設計されていてよい。チップ外での解析により、胚２７２が標的変異を有するかどうかを明らかにし得る。ビーズ５７６は、ＴＮＦ、ＩＬ−１０、ＭＳＰ−α、ＳＣＦ、ＣＸＣＬ１３、ＴＲＡＩＬＲ３、ＭＩＰ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ及び１種類又は２種類のハウスキーピングタンパク質を含めたタンパク質のパネルに対する抗体を有する複数のビーズを含み得る。ビーズはチップ外でさらに処理しても、あるいはチップ上で多重蛍光標識二次抗体を用いることによって同定を実施してもよい。パネルタンパク質の蛍光シグナルの割合がハウスキーピングタンパク質よりも大きいことが明らかになった場合、さらに異数性を検討し得る。ビーズ５７４、５７４及び５７８のセットのうちの１つは、ＤＮＡ全般を捕捉するよう設計されていてよい。非限定的な一例では、このようなビーズのセットはビーズ５７８であり得、これを用いてｍｔＤＮＡとｇＤＮＡの比を求め得る。この比を４細胞の発生時点の胚の適応度の尺度とし、着床への適応度を判定し得る。
[0210] 任意選択で、胚が着床に適した発生段階（例えば、第３日、第４日又は第５日の胞胚）に達するまで胚の分泌物及び形態を定期的にモニタしてもよい。分泌物及び／又は形態に関して収集したデータに基づき、胚が着床後も生存する可能性があるかどうかを判定することができる。胚が生存する可能性がある（又は１群の胚の中でも最も生存能が高いと予測される（不掲載））場合に限り、胚２７６（又は細胞数がさらに多い次の段階のこの胚）を将来の母親の中に着床させることができる。
[0211] 実施例２．受精前の卵細胞のモニタリング、検査及び調整。実施例１と同じように、卵細胞６７２を隔離囲い４３０の隔離領域４５８に配置することができる。マイクロ流体装置は、実施例１に記載されるように設計することができる。培地（Ｇ−ＧＡＭＥＴＥ（商標）（ＶｉｔｒｏＬｉｆｅ社））を流す。培地の流れ２６０は、拡散によって隔離囲い４３０の隔離領域４５８から接続領域４５４までの中に（から）必要な栄養素を供給する（かつ老廃物を除去する）のに効果的な速度で間欠的であっても一定であってもよい。隔離囲い４３０内の中の卵細胞６７２の配置は、流体流動、重力、ＤＥＰ（ＯＥＴを含む）、エレクトロウェッティング力（ＯＥＷを含む）又はその組合せによって実行され得る。
[0212] 卵細胞６７２（不掲載）の画像を取得し、卵細胞６７２の形態を解析し得る。上記のものに加えて、又はこれに代えて、受精に使用する精子を同じように解析して精子の生存能及び運動能の有無を判定してもよい。その解析の結果に基づき（例えば、卵細胞又は精子の一方に生理又は機能に欠陥がある）、体外受精時に活性化処理を実施する。精子はチャネル１２２に流し込んでよく、隔離囲いに侵入させる。活性化培地（ＢＴＸｐｒｅｓｓ（商標）Ｃｙｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社の一部であるＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を流して最初の培地と入れ換えてもよい。活性化培地はさらに、塩化カルシウムを約０．０５ｍＭの濃度で含有し得る。精子の導入から約３０分以内にイオノマイシン又はカルシマイシンなどの活性化イオノフォアを約１マイクロモル〜約１５マイクロモルの範囲内であり得る有効濃度でマイクロ流体チャネル１２２に流れ込む。イオノフォア物質に一定時間（約３０分であり得る）の間曝露した後、流れ２６０によって第二の培地（例えば、Ｇ−ＦＥＲＴＴＭ（ＶｉｔｒｏＬｉｆｅ社））が流れ込み、活性化培地と入れ替わる。この時点で卵細胞を可視化して受精の有無を判定する。次いで、受精に成功した卵細胞を上の実施例１に記載した通りにモニタし検査することができる。
[0213] 本明細書に本発明の特定の実施形態及び応用を記載してきたが、これらの実施形態及び応用は単に例示的なものであり、多数の変形形態が可能である。

Claims (83)

  1. マイクロ流体装置で胚を作成する工程であって、
    前記マイクロ流体装置の隔離囲い内に卵細胞を導入することと、
    前記マイクロ流体装置内に少なくとも１つの精子を導入することと、
    前記卵細胞の受精を促す条件下で前記少なくとも１つの精子と前記卵細胞とを接触させることと、
    接触させた前記卵細胞と前記少なくとも１つの精子とを前記マイクロ流体装置内で、少なくとも前記卵細胞と前記少なくとも１つの精子とが前記胚を形成するのに十分な長さの時間にわたってインキュベートすることと、を含む工程。
  2. 前記隔離囲い内に前記卵細胞を導入することが誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いることを含む、請求項１に記載の工程。
  3. 前記ＤＥＰ力が光電子ピンセット（ＯＥＴ）構造によって発生する、請求項２に記載の工程。
  4. 前記隔離囲い内に前記少なくとも１つの精子を導入することが誘電泳動（ＤＥＰ）力を用いることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の工程。
  5. 前記隔離囲い内に前記卵細胞を導入することがエレクトロウェッティング力を用いることを含む、請求項１に記載の工程。
  6. 前記エレクトロウェッティング力がＯＥＷ構造によって発生する、請求項５に記載の工程。
  7. 前記隔離囲い内に前記少なくとも１つの精子を導入することがエレクトロウェッティング力を用いることを含む、請求項１〜３又は５〜６に記載の工程。
  8. 前記隔離囲い内に前記卵細胞を導入することが、流体流動及び／又は重力を用いて前記卵細胞を輸送することを含む、請求項１に記載の工程。
  9. 前記マイクロ流体装置内に前記少なくとも１つの精子を導入することが、流体流動及び／又は重力を用いて前記少なくとも１つの精子を輸送することを含む、請求項１又は８に記載の工程。
  10. 前記卵細胞の状態を確認することをさらに含み、
    前記マイクロ流体装置内に前記少なくとも１つの精子を導入する前に前記確認することを実施する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の工程。
  11. 前記卵細胞の状態を確認することをさらに含み、
    前記隔離囲い内に前記卵細胞を導入する前に前記確認することを実施する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の工程。
  12. 前記マイクロ流体装置内に前記少なくとも１つの精子を導入する前に、前記卵細胞に少なくとも１つの調整処理を実施する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の工程。
  13. 前記少なくとも１つの調整処理が電気処理又は化学処理である、請求項１２に記載の工程。
  14. 前記少なくとも１つの調整処理が体細胞への曝露である、請求項１３に記載の工程。
  15. 前記体細胞が卵丘細胞である、請求項１４に記載の工程。
  16. 前記卵細胞を前記隔離囲い内で前記体細胞に曝露する、請求項１４又は１５に記載の工程。
  17. 前記卵細胞の受精を促す条件が、卵細胞を取り囲む培地の組成を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の工程。
  18. 前記マイクロ流体装置内に前記少なくとも１つの精子を導入する前に前記卵細胞を取り囲む培地の組成を変化させることをさらに含む、請求項１７に記載の工程。
  19. 前記マイクロ流体装置内に前記少なくとも１つの精子を導入した後に前記卵細胞に少なくとも１つの調整処理を実施する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の工程。
  20. 前記少なくとも１つの調整処理が電気処理又は化学処理である、請求項１９に記載の工程。
  21. 接触させた前記卵細胞と前記少なくとも１つの精子が前記胚を形成したことを判定することをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の工程。
  22. 前記胚が形成されたことを判定することが目視検査を含む、請求項２１に記載の工程。
  23. 前記胚に少なくとも１つの調整処理を実施することをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の工程。
  24. 前記胚に実施する前記少なくとも１つの調整処理が体細胞への曝露である、請求項２３に記載の工程。
  25. 前記胚を曝露する前記体細胞が、卵丘細胞、子宮内膜細胞、無線毛分泌細胞、ＰＥＧ細胞又はその任意の組合せである、請求項２４に記載の工程。
  26. 前記胚が形成されたことを判定することが、前記卵細胞が導入された前記隔離囲い内にある分泌物又は前記隔離囲いから出る分泌物を検出することを含む、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の工程。
  27. 前記分泌物の検出が、タンパク質又は核酸を検出することを含む、請求項２６に記載の工程。
  28. 前記卵細胞及び前記少なくとも１つの精子が、それぞれ哺乳動物から採取されるものである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の工程。
  29. 前記隔離囲いが単一の卵細胞を収納する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の工程。
  30. 前記マイクロ流体装置が複数の隔離囲いを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の工程。
  31. 前記複数の隔離囲いのうち２つ以上の隔離囲いにそれぞれ少なくとも１つの卵細胞を導入する、請求項３０に記載の工程。
  32. 前記複数の隔離囲いのうち２つ以上の隔離囲いにそれぞれ単一の卵細胞を導入する、請求項３０に記載の工程。
  33. 接触させた前記卵細胞と前記少なくとも１つの精子が前記胚を形成したことを判定することと、
    前記隔離囲い内の前記胚を取り囲む培地の組成を変化させることと、をさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の工程。
  34. 前記胚が単細胞細胞胚から桑実胚又は胞胚に発生するにつれて、前記培地の組成を２回以上変化させる、請求項３３に記載の工程。
  35. 前記培地の組成を変化させることが、前記培地のｐＨを変化させることを含む、請求項３３又は３４に記載の工程。
  36. 前記隔離囲いから前記胚を排出することをさらに含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の工程。
  37. 前記マイクロ流体装置から前記胚を排出することをさらに含む、請求項３６に記載の工程。
  38. 前記マイクロ流体装置が、流体培地を含むよう設計されたチャネルをさらに含み、
    前記隔離囲いが、隔離領域と接続領域とを含み、
    前記接続領域の近位開口部が、前記隔離領域と前記チャネルとを流体連結する、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の工程。
  39. 前記隔離領域が、前記隔離領域内の流体培地の成分と、前記チャネル内の前記流体培地の成分とを交換する、請求項３８に記載の工程。
  40. マイクロ流体装置内の少なくとも１つの生物学的微小物体の状態をモニタする工程であって、
    前記生物学的微小物体が、胚、精子又は卵細胞から選択され、前記工程が、
    前記マイクロ流体装置の隔離囲い内に前記生物学的微小物体を導入することと、
    生存に必要な栄養素を供給するよう構成された培地を前記生物学的微小物体に供給することと、
    前記生物学的微小物体によって産生された分泌物を分析することと、
    前記生物学的微小物体の状態を判定することと、を含む工程。
  41. 前記供給する培地が、次の生物学的変化のために前記生物学的微小物体を活性化するのに必要な成分を含む、請求項４０に記載の工程。
  42. 前記次の生物学的変化が受精又は胚発生の次の段階への進行である、請求項４０又は４１に記載の工程。
  43. 前記分泌物を分析する段階が、前記分泌物を捕捉ビーズで捕捉することを含む、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の工程。
  44. 前記分泌物を分析する段階を前記隔離囲い内で、又は前記隔離囲いのすぐ近くで実施する、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の工程。
  45. 前記分泌物を分析する段階を前記マイクロ流体装置の外部で実施する、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の工程。
  46. 前記分泌物を分析することが、タンパク質、核酸、上記のもののいずれかのフラグメント又はその任意の組合せを検出することを含む、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載の工程。
  47. 前記分泌物を分析することを２回以上実施する、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の工程。
  48. 前記分泌物を分析することを定期的に実施する、請求項４７に記載の工程。
  49. 前記生物学的微小物体を撮像することを含み、
    前記生物学的微小物体の少なくとも１つの画像を少なくとも１回の前記分泌物の分析とともに用いて、前記生物学的微小物体の状態を判定する、請求項４０〜４８のいずれか１項に記載の工程。
  50. 前記隔離囲いから前記生物学的微小物体を排出することをさらに含む、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載の工程。
  51. 前記生物学的微小物体が胚であり、前記胚が生存可能であると判定した後に前記胚を排出する、請求項５０に記載の工程。
  52. 前記生物学的微小物体が胚であり、前記胚が生存可能な胞胚であると判定した後に前記胚を排出する、請求項５０に記載の工程。
  53. マイクロ流体装置内の少なくとも１つの生物学的微小物体の状態をモニタする工程であって、
    前記生物学的微小物体が、胚、精子又は卵細胞から選択され、前記工程が、
    前記マイクロ流体装置の隔離囲い内に前記生物学的微小物体を導入することと、
    生存に必要な栄養素を供給するよう構成された培地を前記生物学的微小物体に供給することと、
    前記生物学的微小物体を撮像することと、
    前記生物学的微小物体の状態を判定することと、を含む工程。
  54. 前記生物学的微小物体を撮像する段階を２回以上実施する、請求項５３に記載の工程。
  55. 前記撮像する段階を定期的に実施する、請求項５３又は５４に記載の工程。
  56. 前記撮像する段階を継続的に実施する、請求項５３又は５４に記載の工程。
  57. 前記状態を判定する段階が、卵細胞の大きさ、形状又はその両方を判定することを含む、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の工程。
  58. 前記卵細胞について判定した前記大きさ及び／又は形状に基づき、前記卵細胞に調整処理を実施するかどうかを判定することをさらに含む、請求項５７に記載の工程。
  59. 前記卵細胞について判定した前記大きさ及び／又は形状に基づき、前記卵細胞の受精を準備するかどうかを判定することをさらに含む、請求項５７に記載の工程。
  60. 前記状態を判定する段階が、精子の大きさ、形状、運動能及び走化性反応のうちの少なくとも１つを判定することを含む、請求項５３〜５９のいずれか１項に記載の工程。
  61. 精子について判定した前記大きさ、形状、運動能及び／又は走化性反応に基づき、前記精子に調整処理を実施するかどうかを判定することをさらに含む、請求項６０に記載の工程。
  62. 前記状態を判定する段階が、胚が形成されたかどうかを判定することを含む、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の工程。
  63. 前記状態を判定する段階が、胚の大きさ、形状及び細胞分裂の時期のうちの少なくとも１つを判定することを含む、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の工程。
  64. 前記細胞分裂の時期を胚の生存能の指標とする、請求項６３に記載の工程。
  65. マイクロ流体装置で単為発生胚を作成する方法であって、
    前記マイクロ流体装置の隔離囲い内に卵母細胞を導入することと、
    刺激作用因子を加えて前記卵母細胞を前記単為発生胚に変換することと、を含む方法。
  66. 前記卵母細胞が哺乳動物卵母細胞である、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記卵母細胞がヒト卵母細胞である、請求項６５又は６６に記載の方法。
  68. 前記刺激作用因子が、電気刺激、化学刺激又はその両方の組合せである、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記刺激作用因子が電気刺激である、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記単為発生胚がヘテロ接合型である、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記単為発生胚がホモ接合型である、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記隔離囲いから前記単為発生胚を排出する段階をさらに含む、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
  73. 前記マイクロ流体装置から前記単為発生胚を排出する段階をさらに含む、請求項６５〜７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記単為発生胚を１つ又は複数の胚性幹細胞（ＥＳＣ）に変換する段階をさらに含む、請求項６５〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記単為発生胚を１つ又は複数の胚性幹細胞に変換する段階が、孵化胚盤胞から内部細胞塊（ＩＣＭ）を分離することさらに含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記単為発生胚を１つ又は複数の胚性幹細胞に変換する段階が、前記マイクロ流体装置の隔離囲い内で前記ＩＣＭを培養することをさらに含む、請求項７５に記載の方法。
  77. 隔離囲い内で前記ＩＣＭを培養する段階が、前記ＩＣＭとフィーダー細胞とを共培養することをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記ＩＣＭとフィーダー細胞とを共培養する段階が、前記ＩＣＭが配置される前記隔離囲いに隣接した隔離囲い内に前記フィーダー細胞を配置することを含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記単為発生胚を１つ又は複数の胚性幹細胞に変換する段階が、前記ＩＣＭを１つ又は複数の胚性幹細胞（ＥＳＣ）に変換することをさらに含む、請求項７６〜７８のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記１つ又は複数のＥＳＣが実質的にホモ接合型である、請求項７４〜７９のいずれか１項に記載の方法。
  81. 前記実質的にホモ接合型のＥＳＣが二倍体であり、変異対立遺伝子に関してホモ接合型である、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記１つ又は複数のＥＳＣが実質的にヘテロ接合型である、請求項７４〜７９のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記１つ又は複数のＥＳＣが、前記卵母細胞のドナーとヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致するものである、請求項８２に記載の方法。
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