DE102020214862B4

DE102020214862B4 - System und Vorrichtung zur Charakterisierung von Veränderungen des Reifungsvorgangs einer Eizelle, sowie deren Verwendung

Info

Publication number: DE102020214862B4
Application number: DE102020214862.7A
Authority: DE
Inventors: Uwe Schnakenberg; Wilhelm Jahnen-Dechent; Carlo Schmitz; Julia Floehr; Akram El Hasni; Tom Kremers; Yuan Cao
Original assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Current assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2022-08-04
Anticipated expiration: 2040-11-27
Also published as: DE102020214862A1; WO2022112460A1

Abstract

Vorrichtung zur Charakterisierung von Veränderungen des Reifungsvorgangs einer Eizelle (Ez) aufweisend:• ein Substrat (S),• wobei auf dem Substrat (S) zumindest eine Vertiefung (V) zur Aufnahme einer Eizelle (Ez) vorgesehen ist,• wobei in den Randbereichen der Vertiefung (V) zumindest zwei Elektroden (E1, E2; E1a, E1b, E2a, E2b) vorgesehen sind,• wobei mittels der Elektroden (E1, E2; E1a, E1b, E2a, E2b) im Betrieb ein komplexer Widerstand (Z) der Eizelle (Ez) gemessen werden kann, wobei ein erster komplexer Widerstand (Z1) zu einem ersten Zeitpunkt (t1) gemessen werden kann und wobei ein zweiter komplexer Widerstand (Z2) zu einem zweiten Zeitpunkt (t2), der nachfolgend zum ersten Zeitpunkt ist, gemessen werden kann,• wobei aus der Abweichung von Real- und/oder Imaginärteil des gemessenen ersten komplexen Widerstands (Z1) und zweiten komplexen Widerstands (Z2) oder des Betrags der Impedanz auf den Reifegrad oder den Fortschritt der Zellteilung der Eizelle (Ez) geschlossen werden kann.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Charakterisierung von Veränderungen des Reifungsvorgangs einer Eizelle. Die Erfindung betrifft weiterhin ein System mit der erfinderischen Vorrichtung, sowie deren Verwendung.
Hintergrund
Die künstliche Befruchtung von Eizellen ist eine etablierte Methode in der Reproduktionsmedizin.
Sie wird routinemäßig angewendet, um Paaren, die nicht auf natürlichem Wege ein Kind bekommen können, den Kinderwunsch zu ermöglichen.
Neben der humanen Reproduktionsmedizin wird die künstliche Befruchtung zum Erhalt und der Generierung von Zucht- und Versuchstieren angewendet.
Der Erfolg der künstlichen Befruchtung hängt entscheidend von der Qualität der Eizellen ab, speziell vom Zustand der Zona pellucida (ZP), die aus einer gelatinösen Schicht extrazellulärer Matrix besteht, die während der Reifung zunächst hart ist, während der Befruchtung weich und nach der Befruchtung wieder verhärtet.
Nach der Befruchtung wird so das Eindringen weiterer Spermien verhindert.
Die Eizell- und Embryonenqualität wird typischerweise durch eine mikroskopische Kontrolle begutachtet.
Die mikroskopische Kontrolle ist jedoch stark von der Erfahrung und dem Können und Wissen der begutachtenden Person abhängig, d.h., die Beurteilung ist stark subjektiv. Insbesondere ist die morphologische Beurteilung der Eizelle unmittelbar vor der Befruchtung stark subjektiv und kann nur von erfahrenen Embryologen durchgeführt werden. Dies schildert z.B. der Artikel „The Istanbul consensus workshop on embryo assessment“, in Human Reproduction, Vol.26, No.6 pp. 1270-1283, 2011.
Um die Entwicklung des Embryos unmittelbar nach der Befruchtung nicht durch Schwankungen in den Umgebungsbedingungen, wie z.B. Belichtung, Temperatur, pH-Wert, etc. zu stören, wird in aller Regel erst ab 18 Stunden nach einer Befruchtung erneut eine Beurteilung der Qualität vorgenommen.
Bei einer Momentaufnahme fehlen allerdings wichtige Informationen über die Entwicklung des Embryos, die für eine fundierte Aussage über die Qualität wichtig sind.
In der Vergangenheit wurden daher verschiedenste Ansätze unternommen, um zu besseren Ergebnissen zu kommen.
Das sogenannte time-lapse-Verfahren beurteilt den Embryo, also die Eizelle erst nach der Befruchtung und ist somit aus ethischen Gründen nach deutscher Gesetzgebung nur begrenzt einsetzbar. Zudem ist dies ein sehr teures Verfahren, sodass es kaum Anwendung findet.
Ebenso ist die Beurteilung mit einem Polarisationsmikroskop zeitaufwendig. Diese Methode wird vor allem eingesetzt um festzustellen, ob die Eizelle die vollständige Reife zur Befruchtung besitzt. Ein Zusammenhang zwischen der Brechkraft der ZP und dem Entwicklungspotenzial der Eizelle ist in verschiedenen Spezies unterschiedlich und sogar widersprüchlich. Daher ist eine Aussage über die Qualität einer Eizelle anhand der Brechkraft der ZP wenig aussagekräftig.
Im Rahmen eines präimplantationsgenetischen Screenings (PGS) werden für die genetischen Untersuchungen dem bereits mehrzelligen Embryo Zellen entnommen. Der mechanische Eingriff ist mit Risiken für den Embryo verbunden und somit ethisch umstritten. Zudem kann diese Art der Untersuchung erst nach der Befruchtung an Embryos, nicht aber an Eizellen durchgeführt werden.
Ebenso gibt es weitere Ansätze, wie z.B. das metabolische Profiling oder das Aminosäuren-Profiling von Embryonen, die aber alle erst nach und nicht vor der Befruchtung durchgeführt werden können.
Allen vorgenannten Verfahren gemein ist somit, dass sie Embryonen untersuchen, was nach dem Deutschen Embryonen-Schutzgesetz nur unter Auflagen geschehen darf, zudem, dass ein Vorteil gegenüber dem am Anfang vorgestellten Verfahren nicht belegt ist.
Es gibt daher derzeit keine objektive Methode, um die Qualität von Eizellen oder frühen Embryonen zuverlässig zu bestimmen.
Wie bereits angedeutet, ist die Beurteilung von Eizellen und Embryonen auch international umstritten und sehr unterschiedlich geregelt.
In einigen Ländern, wie z.B. Deutschland, gelten Embryonenschutzgesetze. Nach konservativer Auslegung dürfen aus ethischen Gründen nur die Eizellen im Vorkernstadium (18 Stunden nach Befruchtung) beurteilt und selektiert werden. Das heißt, zu diesem Zeitpunkt muss bereits entschieden werden, welche Eizellen (in der Regel 2 - 3) bis zu Tag 3 - 5 weiter kultiviert und schließlich wieder in den Uterus (in der Regel 1- 2 Embryos) transferiert werden. Auf diese Weise soll eine Bevorratung von Embryonen vermieden werden. Die anderen Eizellen (durchschnittlich werden pro Frau 5-10 Eizellen nach einer hormonellen Stimulation gewonnen) werden im Vorkernstadium eingefroren.
Allerdings birgt der Vorgang der Vitrifizierung Risiken, die die Qualität der Eizellen mindert (nicht alle Eizellen, die vor der Vitrifizierung noch eine gute Qualität hatten, haben sie auch noch danach). Deshalb wäre eine zuverlässige Qualitätskontrolle der befruchteten Eizelle besonders wichtig.
Neben der konservativen Auslegung des Embryonenschutzgesetzes gibt es auch eine liberale Auslegung: der so genannte deutsche Mittelweg.
Hier wird aufgrund der Anamnese der Patientin entschieden, wie viele der befruchteten Eizellen (maximal 6) weiter kultiviert werden, um eine Schwangerschaft zu erzielen. Dies ist z.B. bei älteren Patientinnen der Fall, da das fortgeschrittene Alter auf Eizellen schlechterer Qualität hindeutet. Die Beurteilung und Handhabung von Eizellen und Embryonen wird aus ethischen, gesundheitlichen und wirtschaftlichen Gründen äußerst unterschiedlich gehandhabt.
Im Ausland (von Deutschland aus betrachtet) wird eine Vielzahl von Embryonen kultiviert und dann nur der „beste“ Embryo ausgewählt (elective single embryo transfer, eSET). Ziel ist es hier, nur einen Embryo zu transferieren, nämlich den mit der besten Chance auf eine erfolgreiche Schwangerschaft, und die Risiken von Mehrlingsschwangerschaften zu vermeiden. Die übrigen Embryonen werden eingefroren oder verworfen. Nach Embryonen-Schutzgesetz ist dies in Deutschland nicht erlaubt.
Die große Divergenz der rechtlichen Randbedingungen zeigt die enorme Bedeutung einer zuverlässigen Eizell- und Embryokontrolle.
Aufgabe
Es wäre daher wünschenswert, eine objektive Charakterisierung von Veränderungen des Reifungsvorgangs einer Eizelle, sowie des Embryos, bereitstellen zu können.
Kurzdarstellung der Erfindung
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche, Abbildungen und der Beschreibung.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand einer Zeichnung und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Die Zeichnung ist eine schematische Darstellung und nicht maßstabsgetreu. Die Zeichnung schränkt die Erfindung in keiner Weise ein.
Es zeigen:

den Zusammenhang zwischen der Härte der Zona pellucida und der Eizelle- bzw. Embryo-Entwicklung über die Zeit
und eine schematische Ansicht einer Vorrichtung gemäß Ausführungsformen der Erfindung,
, & jeweils eine schematische Ansicht einer Vorrichtung gemäß Ausführungsformen der Erfindung mit einer Eizelle,
eine weitere schematische Ansicht mit weiteren Aspekten einer Vorrichtung gemäß Ausführungsformen der Erfindung, und
eine weitere schematische Ansicht mit weiteren Aspekten einer Vorrichtung gemäß Ausführungsformen der Erfindung

Ausführliche Darstellung der Erfindung
Nachfolgend wird die Erfindung, unter Bezugnahme auf die Abbildungen, eingehender dargestellt. Dabei ist anzumerken, dass unterschiedliche Aspekte beschrieben werden, die jeweils einzeln oder in Kombination zum Einsatz kommen können. D.h. jeglicher Aspekt kann mit unterschiedlichen Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden, soweit nicht explizit als reine Alternative dargestellt.
Weiterhin wird nachfolgend der Einfachheit halber in aller Regel immer nur auf eine Entität Bezug genommen. Soweit nicht explizit vermerkt, kann die Erfindung aber auch jeweils mehrere der betroffenen Entitäten aufweisen. Insofern ist die Verwendung der Wörter „ein“, „eine“ und „eines“ nur als Hinweis darauf zu verstehen, dass in einer einfachen Ausführungsform zumindest eine Entität verwendet wird.
Soweit nachfolgend Verfahren beschrieben werden, sind die einzelnen Schritte eines Verfahrens in beliebiger Reihenfolge anordbar und/oder kombinierbar, soweit sich durch den Zusammenhang nicht explizit etwas Abweichendes ergibt. Weiterhin sind die Verfahren - soweit nicht ausdrücklich anderweitig gekennzeichnet - untereinander kombinierbar.
Soweit in dieser Anmeldung Normen, Spezifikationen oder dergleichen benannt werden, werden zumindest immer die am Anmeldetag anwendbaren Normen, Spezifikationen oder dergleichen in Bezug genommen. D.h. wird eine Norm / Spezifikation etc. aktualisiert oder durch einen Nachfolger ersetzt, so ist die Erfindung auch hierauf anwendbar.
In den Abbildungen sind verschiedene Ausführungsformen dargestellt.
zeigt den Zusammenhang zwischen der Härte der Zona pellucida und der Eizelle- bzw. Embryo-Entwicklung über die Zeit. Dabei wird in der Zeitachse Bezug auf den Zustand vor der Befruchtung als auch nach der Befruchtung und erfolgender Zellteilung bis hin zur sogenannten Blastozyste genommen. D.h., im Folgenden wird unter Eizelle nicht nur die Eizelle an sich, sondern auch die Reifung eines Embryos bis hin zum Blastozysten-Stadium, jedoch insbesondere bis zur Morula, und weiter insbesondere bis zum Mehrkern-Stadium verstanden. Wie aus der ersichtlich ist (basierend auf eigenen Messungen und ebenso aus Murayama et al., 2006 „Mouse zona pellucida dynamically changes its elasticity during oocyte maturation, fertilization and early embryo development“ entnehmbar), ändert sich die Härte der Zona pellucida mit der Entwicklung der Eizelle bzw. des Embryos. So nimmt die Härte der Zona pellucida, ausgehend vom Stadium GV der Eizelle stetig ab, bis sie ein Minimum innerhalb der germinal vesicle breakdown Phase (abgek. GVBD) erreicht. Typischerweise findet nachfolgend im Stadium MII ( ) die Befruchtung der Eizelle statt, nach der sich die Zona pellucida zunächst verhärtet. Bei der anschließenden Entwicklung des Embryos wird sie dann wieder weicher.
Die Erfindung beschreibt eine Vorrichtung zur Beurteilung von Eizellen Ez, die zur künstlichen Befruchtung verwendet werden.
Die Vorrichtung zur Charakterisierung von Veränderungen des Reifungsvorgangs einer Eizelle Ez weist ein Substrat S auf. Auf dem Substrat S ist zumindest eine Vertiefung V zur Aufnahme einer Eizelle Ez vorgesehen. Solche Vorrichtungen sind aus den , und schematisch ersichtlich.
In den Randbereichen der Vertiefung V sind mindestens zwei Elektroden vorgesehen. Dabei ist der Randbereich auch als in der Vertiefung V liegend zu verstehen.
Beispielsweise sind in den , , und zwei Elektroden E1, E2 in den und vier Elektroden E1a, E1b, E2a, E2b vorgesehen. Die genaue Anzahl /Anordnung und Verschaltung der Elektroden kann vom Fachmann geeignet ausgewählt werden. Bevorzugt sind die Elektroden paarweise symmetrisch zueinander angeordnet. Weiterhin bevorzugt weisen die Elektroden zumindest in Bezug auf die Vertiefung V eine ähnliche Ausgestaltung im Randbereich der Vertiefung V auf. Die Elektroden können für die elektrische Ansteuerung und Messung geeignet kontaktiert sein. In den Abbildungen wird dies über die nach außen geführten Kontaktfläche bereitgestellt. Auch wenn die Zuführung zu den Kontaktflächen, als auch die Kontaktflächen selbst, als gleichartig dargestellt sind, ist dies keine Notwendigkeit für das Funktionieren der Erfindung.
Mittels der Elektroden E1, E2; E1a, E1b, E2a, E2b kann im Betrieb ein komplexer Widerstand Z der Eizelle gemessen werden, wobei ein erster komplexer Widerstand Z₁ zu einem ersten Zeitpunkt t₁ gemessen werden kann und wobei ein zweiter komplexer Widerstand Z₂ zu einem zweiten Zeitpunkt t₂, der nachfolgend zum ersten Zeitpunkt t₁ ist, gemessen werden kann.
Aus der Abweichung von Real- und/oder Imaginärteil und/oder Betrag des gemessenen ersten komplexen Widerstands Z₁ und zweiten komplexen Widerstands Z₂ kann auf den Reifegrad oder den Fortschritt der Zellteilung der Eizelle Ez geschlossen werden. Dabei kann sich der Realteil unterschiedlich vom Imaginärteil ändern, sodass aus der qualitativen und/oder der quantitativen Änderung von Realteil und/oder Imaginärteil und/oder des Betrages für den jeweiligen Typ Eizelle auf den Reifegrad oder den Fortschritt der Zellteilung der Eizelle Ez geschlossen werden kann. Ohne Beschränkung der Allgemeinheit können dabei auch mehr als zwei Messungen vorgenommen werden. Messungen des komplexen Widerstandes können dabei z.B. periodisch, basierend auf einem zuvor gemessenen komplexen Widerstand oder der Änderung vorhergehender komplexer Widerstände, vorgenommen werden. Dies kann z.B. abhängig von der Verwendung der Vorrichtung sein. Es ist aber auch denkbar, absolute Aussagen auf Basis eines Einzelspektrums zu treffen. Man kann z.B. ein elektrisches Ersatzschaltbild aufstellen, wobei die Verhältnisse der simulierten Bauteilgrößen bereits eine Aussage über die Eizelle bereitstellen. D.h., sobald eine Kalibrierungsmessung vorliegt, kann man ein Ersatzschaltbild bestimmen, das die gemessenen Kurven nachbildet und somit direkt auf den Reifegrad zurückschießen. In diesem Fall ist es nicht mehr notwendig, Differenzmessungen auszuwerten.
Für die Bestimmung des komplexen Widerstandes können die Elektroden z.B. an ein Impedanzspektrometer oder eine LCR-Messbrücke oder einen Vektor-Netzwerkanalysator angeschlossen sein, um den komplexen elektrischen Widerstand in Abhängigkeit der eingeprägten Frequenz - auch als elektrische Impedanz bezeichnet - zu messen.
Mit der Vorrichtung kann die Härtung der ZP einzelner Eizellen während ihrer Reifung mithilfe der elektrischen Impedanzspektroskopie - abgekürzt EIS - detektiert werden. Die elektrische Impedanzspektroskopie wird auch als „dielektrische Spektroskopie (DS)“ bezeichnet. Dabei werden die dielektrischen Eigenschaften eines Materials zwischen Elektroden gemessen.
Durch Messungen über einen großen Frequenzbereich können Impedanzänderungen untersucht werden, die sowohl durch die Veränderung der ZP Glykoproteinmatrix als auch der elektrophysiologischen Änderungen des Zytoplasmas hervorgerufen werden.
Mit der Vorrichtung werden eine einfache Handhabung, Miniaturisierung, Integration und Portabilität kombiniert. EIS erlaubt zudem eine kontinuierliche und zerstörungsfreie Live-Beobachtung und Charakterisierung reifender Zellen und sich entwickelnder Embryonen.
Die künstliche Befruchtung von Eizellen ist ein etabliertes Verfahren der assistierten Reproduktion (ART) bei Mensch und Tier. Unter künstlicher Befruchtung wird die in-vitro Fertilisation (IVF) und die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) verstanden. Sie wird routinemäßig eingesetzt, wenn die natürliche Paarung fehlschlägt, oder wenn Nutztiere und Forschungssäuger geklont und vermehrt werden sollen. Die künstliche Befruchtung hängt entscheidend von der Qualität der Eizellen ab, insbesondere vom Zustand der ZP, einer gelatinösen Außenschicht aus extrazellulärer Matrix, die spontan härtet und für Spermien während der Eizellisolierung und -kultur undurchdringlich wird.
Die proteolytische Spaltung des Zona pellucida Protein 2 (ZP2) wurde als definitiver Schritt in der ZP-Modifikation zur Regulierung der Befruchtung nachgewiesen. Obwohl die ZP2-Spaltung eine Spermienbindung verhindert, blockiert sie nicht die Polyspermie. Daher sind zusätzliche molekulare Veränderungen der Eizelle erforderlich, um eine angemessene Kontrolle der Befruchtung zu gewährleisten. Befruchtungsbedingte molekulare Veränderungen treten an der ZP, dem perivitellinen Raum, der Eizellenzellmembran und im Zytoplasma der Eizelle auf.
Darüber hinaus wird die Elektrophysiologie der Eizellen durch Spermien-PLCzeta induziert. Es werden z.B. zytoplasmatische Ca²⁺-Oszillationen während der Aktivierung der Eizelle hervorgerufen. Um den Befruchtungserfolg zu erhöhen, kann diese physiologische Aktivierung künstlich durch z.B. lonomycin oder PLCzeta-Behandlung ausgelöst werden. So können die durch die PLCzeta-induzierten Ca²⁺-Oszillationen als Qualitätsmaßstab für die Aktivierung der Eizellen angesehen werden.
Die charakteristischen Ca²⁺-Wellen können nunmehr durch die Erfindung ebenfalls mittels elektrischer Impedanzspektroskopie mit den Vorrichtungen der Erfindung erfasst werden.
Ebenso wurden die kürzlich entdeckten so genannten Zn²⁺-Ausschüttungen, die in den Eizellen nach der Befruchtung auftreten, durch Zn²⁺-Bildgebung nachgewiesen. Diese Zn²⁺-Ausschüttungen können ebenfalls mittels elektrischer Impedanzspektroskopie mit den Vorrichtungen der Erfindung erfasst werden.
Werden Zellen mit EIS mit niederfrequenten (typischerweise ^~1 kHz - 100 kHz) Signalen vermessen, können Informationen über die Größe der Zelle erhalten werden. Bei niedrigen Frequenzen dominiert der Leitungsstrom, so dass im Wesentlichen der gesamte Strom im extrazellulären Raum zwischen den Sondierungselektroden verschoben wird. Dies liegt daran, dass der elektrische Widerstand der Eizelle Ez die Zellmembran bzw. auch die ZP einschließt, typischerweise viel größer ist als der des umgebenden Mediums.
Mit zunehmender EIS-Frequenz (typischerweise 100 kHz - 5 MHz) wird der Strom zwischen Verschiebungsstrom in der dielektrischen Grenze und Leitungsstrom im extrazellulären Shuntpfad aufgeteilt. Der über die Membran verlagerte Strom beinhaltet z.B. Kapazitätsbeiträge aus der passiven Permittivität der Lipidmembran, mobile Ladungen, die mit Membranproteinen assoziiert sind, und erregbare Beiträge, die mit der spannungsgesteuerten lonenkanal-Kinetik der Membran verbunden sind. In der ZP werden Ladungen und Dipole detektiert. Messungen in diesem Frequenzbereich können daher zur Abschätzung der effektiven Impedanz (Dielektrikum) der Zellmembran und der ZP herangezogen werden.
Impedanzmessungen, die aus der Vermessung der Zelle mit noch höherfrequenten Signalen (typischerweise ^~5 MHz - 1 GHz) generiert werden, können zur Untersuchung intrazellulärer Effekte verwendet werden. In diesem Frequenzbereich wird die Zellmembran und ZP transparent. Aus den Impedanzspektren können intrazelluläre Ladungsverteilungen wie intrazelluläre Ca²⁺lonenschwingungen nach der Befruchtung von Eizellen gemessen werden.
Die genauen Frequenzen, bei denen maximale Impedanzsignaländerungen und somit Signalempfindlichkeiten festzustellen sind, hängen stark vom verwendeten Zelltyp, dem Aufbau und der Konfiguration des Aufbaus, der Elektrodenfläche und deren Material ab.
EIS ist bisher ein Messverfahren zur Kurzzeitcharakterisierung dielektrischer Eigenschaften und Größen einzelner Zellen in Hochdurchsatzanwendungen, wie z.B. in der Zytometrie oder der Zellsortierung/ Durchflusszytometern.
Die vorliegende Erfindung ist hingegen für Langzeitbeobachtungszeiträume ausgelegt.
Die Elektroden, z.B. vier Mikroelektroden, können sich in der Vertiefung V bzw. an deren Rand befinden. Mit den Elektroden können dielektrische Eigenschaften von Zellen vermessen werden. Die Größe von Elektroden richtet sich nach der Ausgestaltung der Vertiefung V, der Größe der Eizelle Ez und des Füllfaktors, der erzielt werden soll. Der Füllfaktor, d.h. der Quotient aus Volumen der Zelle und Messvolumen, kann mit dem Design der Elektroden und der Vertiefung eingestellt werden. Aus dem Artikel „Electrical impedance spectroscopy of single cells in hydrodynamic traps“ der Autoren Akram El Hasni, Carlo Schmitz, Katrin Bui-Göbbels, Peter Bräunig, Wilhelm Jahnen-Dechent und Uwe Schnakenberg, veröffentlicht in Sensors and Actuators B 248 (2017), Seiten 419 - 429 ist für Maus-Eizellen bekannt, dass ZP-intakte Eizellen einen insgesamt geringeren Anstieg der Impedanz im Vergleich zu den ZP-freien Eizellen aufweisen. Die geringere Impedanzänderung wird durch die hohe Leitfähigkeit der ZP induziert. Die Frequenz der höchsten Empfindlichkeit betrug 100 - 200 kHz. Die Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein der ZP mithilfe der EIS nachgewiesen werden kann.
Wie in den Abbildungen dargestellt, weist die Vorrichtung z.B. eine Art Haltevorrichtung aus einem planaren, vorzugsweise transparenten (Träger-) Substrat S auf. Das Substrat S kann z.B. Glas oder ein transparentes Polymer sein. Auf dem Substrat S ist zumindest eine isolierende Schicht ZS1 bzw. ZS2 aufgebracht. Geeignete Materialien können ebenfalls Kunststoffe, wie z.B. Polymere oder Lacke sein. Die Zwischenschicht ZS1 bzw. ZS2 kann auch aus dem gleichen Material wie das Substrat S gefertigt sein.
Ohne Beschränkung der Allgemeinheit kann die Zwischenschicht ZS1 auch aus einem Fotolack, wie z.B. SU-8 hergestellt sein. In dieser Zwischenschicht ZS1 kann mindestens eine Vertiefung V zur Aufnahme einer einzelnen Eizelle Ez angeordnet sein.
Ohne Beschränkung der Allgemeinheit kann die Vorrichtung oder auch Teile davon auch mittels anderer Techniken hergestellt werden. Beispielsweise können auch Teile in Spritzguss oder mit RADbasierten Verfahren, wie z.B. 3D-Drucker, hergestellt werden. Beispielsweise können so Substrate S und/oder Zwischenschichten ZS1, ZS2 hergestellt werden. Ebenso lassen sich auch metallische Elemente, wie z.B. Elektroden E1, E2; E1a, E2a, E1b, E2b, aufdrucken oder durch andere Verfahren aufbringen. Ganz allgemein kann die Wahl des Herstellungsverfahrens durch die verwendete Anzahl und/oder durch die benötigen Größen bestimmt sein.
Die Größe der Vertiefung kann in einer Ausführung auch größer als die Eizelle sein. Dann liegt die Eizelle in der Vertiefung ein (in Aufsicht gemäß / 3b).
Die Form der Vertiefung V (in Aufsicht gemäß / 3b) ist dabei nicht zwingend rund, sondern kann auch (viel-)eckig sein. Wesentlich ist nur, dass die Eizelle in der Vertiefung V zumindest randständig einliegen kann, sodass eine räumliche Fixierung in Bezug auf die Elektroden gegeben ist. Es ist dabei nicht zwingend notwendig, dass die Eizelle Ez kleiner ist als der Durchmesser der Vertiefung V, sondern die Eizelle Ez kann auch auf dem Rand der Vertiefung V aufliegen - wie in gezeigt - und somit nur mit einem Teilbereich in die Vertiefung V ragen. Bevorzugt ist der Durchmesser der Vertiefung V zur Fixierung der Eizellen ca. 30 - 70 µm groß, z.B. für Eizellen der Maus.
Bei einer nicht-runden Vertiefung V werden Bereiche an der oberen Kante der Vertiefung V freigelegt, in denen die Feldlinien ohne Zellkontakt durch das leitfähige Medium, das die Zelle umgibt, geleitet werden. Das verringert die Messsignalhöhe und damit die Empfindlichkeit.
Es versteht sich von selbst, dass gleichartige Anordnungen auf einem einzelnen Substrat für eine Vielzahl von Eizellen vorgesehen sein können.
Der Durchmesser der Vertiefung V ist vorzugsweise kleiner als der Durchmesser der Eizelle. Die Eizelle liegt dann auf der oberen Kante der Vertiefung V und überdeckt (größtenteils oder vollständig) die Vertiefungen V. Für eine hohe bis maximale Impedanzsignalhöhe ist ein schlüssiger Kontakt der Eizelle Ez zum Rand der Vertiefungen V bevorzugt, sodass alle elektrischen Feldlinien durch die Eizelle gezwungen werden.
In Ausführungsformen, wie in und gezeigt, kann sich im Bodenbereich der Vertiefung eine Austrittsöffnung zu einem Fluidkanal befinden. Der Durchmesser der Öffnung in der Vertiefung ist bevorzugt kleiner als der Durchmesser der Vertiefung V und der Eizelle Ez. Dies kann z.B. als Kontrolle für das Einbringen einer Eizelle Ez genutzt werden, um einen Fluidfluss, z.B. mittels Druckunterschieds, in einem zugehörigen Fluidkanal FK zu steuern. Dies kann z.B. dann von Vorteil sein, wenn die zu beobachtenden Eizelle Ez nicht selbständig in die Vertiefung V absinkt, z.B. in einem Zellmedium schwimmt. Durch Erzeugen von Unterdruck hinter der Öffnung kann Nährmedium in die Vertiefung V und durch den Fluidkanal abgezogen werden. Dadurch kann die Eizelle nach Einbringen in eine Nährlösung einfach in der Vertiefung hydrodynamisch positioniert und fixiert werden (hydrodynamische Falle). Umgekehrt kann durch Umkehrung des Fluidflusses ein Zufluss erzeugt und somit (gezielt) die Eizelle aus der Vertiefung freigesetzt werden.
D.h., ist in der mindestens einen Vertiefung ein steuerbarer Fluidkanal angeordnet, so kann der Fluidkanal einen Abfluss von Fluid aus der Vertiefung (zur Fixierung der Eizelle in der Vertiefung) und / oder einen Zufluss von Fluid (z.B. Freigabe der Eizelle aus der Vertiefung V) erlauben.
In (unmittelbarer) Nähe der oberen Kante ist bei den gezeigten Ausführungsformen mindestens eine Elektrode E1 bzw. E1b, E2b angebracht, die vorzugsweise bei runder Vertiefung V ringförmig ausgestaltet ist, siehe , und .
In der Ausführung in und ist mindestens eine weitere Elektrode E2 auf dem Boden der Vertiefung V, in den Ausführungen in und im Bereich der Öffnung aufgebracht. Zwischen Elektroden(paaren) kann eine Wechselspannung bei verschiedenen Frequenzen angelegt werden, der Stromfluss gemessen und daraus die Impedanz berechnet werden.
Wie in der gegenüber der dargestellt, können auch mehrere Zwischenschichten ZS1, ZS2 mit gleich oder unterschiedlichen Materialien hergestellt sein.
In den , und sind vorteilhafte Ausführungsbeispiele der Elektroden gezeigt. Das genaue Layout und die Platzierung der Elektroden ergibt sich durch den Anwendungsfall. Die einzelnen Elektroden sind mit einer oder vorzugsweise mit zwei Zuleitungen kontaktiert, um 2-Punkt oder vorzugsweise 4-Punktmessungen zu ermöglichen. In den , und sind exemplarisch jeweils eine Zuleitung zu einer Elektrode gezeigt. Die Zuleitungen können mit einem isolierenden Material elektrisch isoliert sein. Vorzugsweise ist das isolierende Material transparent.
Neben Messungen mit 2 Elektroden können auch Messungen mit 3 Elektroden durchgeführt werden, bei denen die dritte Elektrode als Referenzelektrode, z.B. aus Silber/Silberchlorid, ausgestaltet wird. Andere geeignete Materialen können ebenfalls verwendet werden.
Zur Herstellung der Haltevorrichtung können vorteilhafterweise Technologien der Mikrosystemtechnik angewendet werden, wenn die zu untersuchenden Zelltypen so klein sind, dass sie mit mechanischen Feinwerkverfahren oder mechanischen Verfahren nicht hergestellt werden können. Vorzugsweise werden für die isolierenden Schichten Fotolacke verwendet, vorzugsweise eignet sich der SU-8 Fotolack, der auch in dicken Schichten im Normalverfahren (in flüssiger Form durch aufschleudern und dann trocknen) oder als Trockenfilmresist (durch laminieren) auf das Trägersubstrat aufgebracht und mit lithographischen Verfahren belichtet und strukturiert werden kann. Die Elektroden und die Zuleitungen bestehen vorzugsweise aus Edelmetallen, wie Gold oder Platin oder oxidischen Halbleitern, wie Iridiumoxid, und werden durch PVD-Verfahren (Aufdampfen, Kathodenzerstäubung) abgeschieden und durch lithographische Verfahren in Kombination mit Lift-off-Techniken oder Ätztechniken strukturiert. Es können auch transparente Elektroden, z.B. aus einem oxidischen Halbleiter, wie Indiumzinnoxid (ITO)-Elektroden, verwendet werden, um in Kombination mit einem transparenten Trägersubstrat einen optischen Zugang zur Eizelle von der Unterseite zu ermöglichen. Die Zuleitungen bestehen vorzugsweise aus leitendem Material mit geringem ohmschen Widerstand. Andere geeignete Materialen und Herstellungsprozesse, wie Feinwerktechniken oder auch das Herstellen von Zuleitungen und Elektroden durch modifizierten Tintenstrahldruck auf Substraten, können ebenfalls verwendet werden, angepasst an die Größe der zu untersuchenden Zellen.
In einer Ausführungsform können die Elektroden modifiziert werden, um deren kapazitiven Einfluss der elektrischen Doppelschicht im Niederfrequenzbereich zu minimieren. Dieses kapazitive Verhalten (und damit die Grenzfrequenz) kann durch Vergrößerung der effektiven Elektrodenfläche in den unteren Frequenzbereich verschoben werden. Hierzu können die Elektroden vorteilhafterweise durch potentiostatische Abscheidung von leitfähigen Polymeren, z.B. Polypyrrol-polystyrolsulfonat (PPy:PSS), Poly(3,4-ethylendioxythiophen)-polystyrolsulfonat (PEDOT:PSS), Polyanilin oder auch Mischungen daraus erreicht werden (das Verfahren nennt man Elektropolymerisation). Diese Schichten sind porös und vergrößern somit die effektive Elektrodenfläche. Sind Elektroden porös, so haben sie eine höhere effektive Elektrodenfläche gegenüber dem Fußabdruck. Für die Ausführungsformen, in denen ein optischer Zugang zu der Eizelle vom Boden der Vertiefung her (Durchlicht-Mikroskopie) vorgesehen ist, sind transparente Schichten vorteilhaft. Andere adäquate Materialien, die den kapazitiven Effekt im unteren Frequenzbereich minimieren, wie z.B. poröses Platin (Platin black) oder Silber, können ebenfalls verwendet werden.
Um eine Nährlösung für die Eizellen Ez bereitzuhalten, kann vorgesehen sein, dass die eine umgebende Barriere B mindestens eine Vertiefung aufweist. Da die Barriere B optisch intransparent sein kann, kann diese auch aus einem anderen Material als das Substrat S oder die Zwischenschicht ZS1, ZS2 gefertigt sein.
Durch die Ausgestaltung der Erfindung mit optisch transparenten Materialen kann alternativ oder zusätzlich zu einer Impedanzmessung der Reifegrad auch mittels optischer Systeme (im Auflicht oder Durchlichtbetrieb) begutachtet werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auch in einer Ausgestaltung für mehrere Eizellen eine Ansteuerungselektronik zur Auswahl bestimmter Elektrodenpaare für gezielte Messungen an einer bestimmten Eizelle aufweisen. Diese kann z.B. mittels Schalter ein Messgerät mit den jeweiligen Elektroden verbinden. Beispielhafte Schalter sind z.B. elektronischer Schalter (z.B. Transistoren) oder elektrischer Schalter (DIP-Schalter) ohne hierauf limitiert zu sein. Die Ansteuerung kann vorteilhafterweise als Multiplexer ausgestaltet sein.
Die Ansteuerungselektronik kann z.B. auf einer Platine bereitgestellt sein. Über geeignete Anschlüsse und Kabel kann ein Impedanzspektrometer oder eine LCR-Messbrücke oder ein Vektor-Netzwerkanalysator als auch ein PC als Beispiel für eine Messwertaufnahme, Messwertspeicherung und Messwertverarbeitung angeschlossen werden.
Natürlich kann es auch vorgesehen sein, dass ein Impedanzspektrometer oder eine LCR-Messbrücke oder ein Vektor-Netzwerkanalysator auf der Ansteuerungselektronik implementiert sind, so dass ein integriertes und mobiles System zur Verfügung gestellt werden kann.
Mit der Vorrichtung werden eine einfache Handhabung, Miniaturisierung, Integration und Portabilität kombiniert. EIS erlaubt zudem eine kontinuierliche Beobachtung reifender Zellen und sich entwickelnder Embryonen.
Für die Messung wird die Vorrichtung vorzugsweise in einen Inkubator oder in einen Temperaturschrank gestellt, um das Medium und die Eizellen für die Messungen vorzugsweise auf eine konstante Temperatur von vorzugsweise 37 °C zu halten. Um die Verdunstung des Mediums zu minimieren, kann eine Deckelplatte vorgesehen sein, die auf die Barriere gelegt werden kann.
In einer weiteren Ausführung kann die Vorrichtung auch eine Temperiereinheit aufweisen.
Beispielsweise kann die Barriere B einen metallischen Werkstoff, wie z.B. Aluminium, und ein oder mehrere steuerbare Heizelemente aufweisen, die das Medium inklusive der Eizellen auf einer vorbestimmten Temperatur, für menschliche Eizellen vorzugsweise 37 °C, geregelt halten. Ein Temperatursensor kann hierzu die Temperatur in der Nährlösung / dem Medium messen und ermöglicht so die vorbestimmte Temperatur mithilfe eines geeigneten Regelgeräts zu steuern.
In weiteren Ausführungsformen kann ein Heizelement in die Nährlösung eingetaucht werden oder Dünnfilmwiderstände auf den Boden des Trägersubstrats im Bereich der Vertiefung(en) V angeordnet werden.
Weiterhin kann die Vorrichtung eine Einheit zur atmosphärischen Steuerung aufweisen. Beispielsweise kann die Vorrichtung auch mit einem Gas, wie z.B. CO₂-haltige Gasmischungen (z.B. vorzugsweise 5% CO₂) überströmt sein, oder aber in einer geschlossenen Atmosphäre befindlich sein. Dies kann z.B. für bestimmte Langzeituntersuchungen vorteilhaft sein.
Für die Messungen kann der Innenbereich der Barriere B mit Nährlösung gefüllt, auf die gewünschte Betriebstemperatur von vorzugsweise 37 °C gebracht, und Eizellen Ez in die Vertiefungen V gebracht werden. Vorzugsweise befinden sich mehrere Vertiefungen V auf der Haltevorrichtung, um mehrere Eizellen Ez gleichzeitig vermessen zu können.
Zur Kalibrierung wird das elektrische Impedanzspektrum (Real- und Imaginärteil, Phase) einer mit einer Eizelle Ez gefüllten Vertiefung V über den gesamten Frequenzbereich, beispielsweise 1 Hz bis 1 MHz gemessen. Es können auch in einer Ausführungsform die Beträge der Impedanz über der Frequenz bestimmt werden. Dieses Spektrum wird von einem Spektrum, Referenzspektrum genannt, das simultan aus einer weiteren Vertiefung V ohne Eizelle aufgenommen wird, subtrahiert. Durch die Subtraktion der beiden Spektren werden parasitäre Effekte, insbesondere Polarisationseffekte der Elektroden und Einflüsse der Zuleitungen, herausgefiltert. Aus der Differenz der Spektren kann auf zellspezifische Veränderungen geschlossen werden und die Frequenz der höchsten Empfindlichkeit ermittelt werden, die vorteilhaft für die weiteren Messungen verwendet wird.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein Referenzspektrum einer leeren Vertiefung V aufgenommen, anschließend die Eizelle Ez in diese Vertiefung V eingelegt und erneut die Impedanz aufgenommen. Durch die Subtraktion beider Spektren wird die Frequenz mit der höchsten Empfindlichkeit bestimmt. Auch in diesem Fall können in einer Ausführungsform die Beträge der Impedanzsignale beider Spektren voneinander subtrahiert werden. Auch hier kann aus der Differenz der Spektren auf zellspezifische Veränderungen geschlossen werden.
In einer typischen Messroutine wird die Vorrichtung verwendet, Eizellen Ez in die (jeweilige) Vertiefung V der Haltevorrichtung eingelegt, temperiert und die elektrische Impedanz in Abhängigkeit von der Zeit bei der Frequenz der höchsten Empfindlichkeit aufgezeichnet. Mit den Impedanzmessungen werden erfindungsgemäß Veränderungen des Reifungsvorgangs einer Eizelle analysiert.
Im Zeitfenster der optimalen Reife der Eizelle (beispielsweise im Bereich des lokalen Minimums) kann die Befruchtung durch Zugabe der Spermien erfolgen. Nach der Befruchtung ändert sich die Impedanz, z.B. steigt die Impedanz wieder an.
Für die Befruchtung können dem Zellmedium Spermien direkt zugeführt werden. Dabei kann eine Zuführung zu einem gesamten Medium für eine Vielzahl von Eizellen Ez (z.B. bei einer Anordnung für mehrere Eizellen Ez) als auch eine Zuführung zu einzelnen Abteilungen vorgesehen sein. Ebenso wäre es natürlich möglich, eine Eizelle gezielt mittels einer Intrazytoplasmatischen Spermieninjektion zu befruchten.
Nach der Befruchtung ändert sich die Impedanz, z.B. steigt die Impedanz wieder an. Der Messzeitraum kann dabei von wenigen Minuten, z.B. 20 Minuten, über Stunden bis hin zu Tagen umfassen.
Physiologische Phänomene, wie die Ausschüttung von Zn²⁺- und Ca²⁺-Ionen, treten unmittelbar bzw. zeitlich verzögert nach der Befruchtung auf.
Zur Charakterisierung dieser elektrophysiologischen Phänomene kann vorzugsweise die Impedanz bei der Frequenz höchster Empfindlichkeit und hoher Abtastrate, typischerweise einer Messung pro Sekunde, über einen Zeitraum von 60 Minuten nach der Befruchtung in der hier beschriebenen Vorrichtung gemessen werden. Dabei können Schwingungen im ElS-Signal aufgelöst werden, die mit charakteristischen spannungsgesteuerten lonenkanal-Kinetiken in der Membran assoziiert werden können, die durch charakteristische Spermien PLCzeta-induzierte Ca²⁺-Oszillationen im Zytoplasma und die Freisetzung von Zn⁺²-Ionen hervorgerufen werden.
In einer weiteren Ausführungsform zur Charakterisierung der elektrophysiologischen Phänomene wird die Vorrichtung für Hochfrequenzmessungen umgestaltet. Vorzugsweise wird hier ein Vektor-Netzwerkanalysator mit zwischengeschaltetem 50 Ω-Anpassungsnetzwerk angeschlossen.
Die Vorrichtung charakterisiert einzelne Eizellen durch die elektrische Impedanzspektroskopie, um die Qualität der Eizellen und das Potenzial für die Befruchtung und Embryonenentwicklung zu beurteilen. Die Vorrichtung misst zerstörungsfrei und ermöglicht markierungsfreie Langzeitmessungen über den gesamten Zeitraum einer künstlichen Befruchtung. Die Eizellen können einfach und schnell in die Vorrichtung gelegt, entnommen und ausgetauscht werden. Durch die Auflage auf dem Rand der Vertiefung V können Größenveränderungen der Zellen ausgeglichen werden. Zeitaufgelöste EIS-Messungen ermöglichen sowohl die Messung der Änderung der ZP als auch der elektrophysiologischen Vorgänge der Eizelle. Die Inspektion mittels (inverser) Mikroskopie ermöglicht die Messung des Durchmessers der Eizelle sowie der ZP-Schichtdicke während der ZP-Reifung und -Härtung.
Neben den EIS-Messungen an einzelnen Zellen ist die parallele und damit zeitsparende Charakterisierung mehrerer Eizellen ein Mehrwert. So können in dem Screening-Verfahren Eizellen verschiedener Qualitäten beurteilt werden. Nur die Eizellen mit gutem Entwicklungs-, sprich Reifungspotenzial, werden für die Befruchtung selektiert. Dadurch werden die Erfolgsaussichten erheblich erhöht.
Die Vorrichtung kann für alle Arten von Eizellenbewertungen, sowie für Zuchtprogramme mit begrenzter Eizellverfügbarkeit genutzt werden und wird somit die Ergebnisse in der assistierten Reproduktion verbessern.
In den humanen Fertilitätskliniken werden alle Eizellen einer Frau nach der Follikelpunktion mit Hilfe der Vorrichtung beurteilt. Mithilfe der EIS-Messungen werden bevorzugt die Eizellen/Embryonen bester Qualität (optimaler Reifungsprozess) ausgewählt. Somit kann der Befruchtungserfolg durch die Bestimmung der optimalen Befruchtungszeitpunkte, und dadurch das Entwicklungspotenzial des Embryos, erhöht werden. Die Chance auf eine erfolgreiche Schwangerschaft steigt und das Risiko weiterer erforderlicher Eingriffe sinkt.
In der Tierzucht kann die Bestimmung der besten Eizell-/Embryoqualität zu einer Reduktion der zu verwendenden Tiere führen. Durch die Erhöhung der Befruchtungsrate eines einzelnen Tieres müssen insgesamt weniger weibliche Tiere zur Eizellgewinnung eingesetzt werden.
Zum Schutz von bedrohten Tierarten muss die Befruchtung der Eizelle optimiert werden. Eizellen und Spermien stehen hier oft in nur reduzierter Quantität zur Verfügung. Mithilfe der Vorrichtung können die Eizellen/Embryonen bester Qualität bestimmt und damit der Erfolg einer erfolgreichen Schwangerschaft gesteigert werden.
Neben der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem erfindungsgemäßen System zur Vorbereitung einer künstlichen Befruchtung kann die erfindungsgemäße Vorrichtung auch in einem System zur Charakterisierung von Kontrazeptiva Verwendung finden. Kontrazeptiva können dabei z.B. so wirken, dass die ZP durch Einwirkung von Stoffen so verändert wird, dass eine Befruchtung über vorbestimmte Zeiträume unmöglich wird. Um solche Stoffe auf Ihre Eignung überprüfen zu können, kann sowohl eine Eizelle in der Vorrichtung der Einwirkung eines solchen Stoffes ausgesetzt werden als auch die Wirksamkeit durch nachfolgendes Hinzufügen von Samenzellen ins Medium unmittelbar getestet werden.

Claims

Vorrichtung zur Charakterisierung von Veränderungen des Reifungsvorgangs einer Eizelle (Ez) aufweisend: • ein Substrat (S), • wobei auf dem Substrat (S) zumindest eine Vertiefung (V) zur Aufnahme einer Eizelle (Ez) vorgesehen ist, • wobei in den Randbereichen der Vertiefung (V) zumindest zwei Elektroden (E1, E2; E1a, E1b, E2a, E2b) vorgesehen sind, • wobei mittels der Elektroden (E1, E2; E1a, E1b, E2a, E2b) im Betrieb ein komplexer Widerstand (Z) der Eizelle (Ez) gemessen werden kann, wobei ein erster komplexer Widerstand (Z₁) zu einem ersten Zeitpunkt (t₁) gemessen werden kann und wobei ein zweiter komplexer Widerstand (Z₂) zu einem zweiten Zeitpunkt (t₂), der nachfolgend zum ersten Zeitpunkt ist, gemessen werden kann, • wobei aus der Abweichung von Real- und/oder Imaginärteil des gemessenen ersten komplexen Widerstands (Z₁) und zweiten komplexen Widerstands (Z₂) oder des Betrags der Impedanz auf den Reifegrad oder den Fortschritt der Zellteilung der Eizelle (Ez) geschlossen werden kann.
Vorrichtung zur Charakterisierung von Veränderungen des Reifungsvorgangs einer Eizelle (Ez) aufweisend: • ein Substrat (S), • wobei auf dem Substrat (S) zumindest eine Vertiefung (V) zur Aufnahme einer Eizelle (Ez) vorgesehen ist, • wobei in den Randbereichen der Vertiefung (V) zumindest zwei Elektroden (E1, E2; E1a, E1b, E2a, E2b) vorgesehen sind, • wobei mittels der Elektroden (E1, E2; E1a, E1b, E2a, E2b) im Betrieb ein komplexer Widerstand (Z) der Eizelle (Ez) gemessen werden kann, wobei ein erster komplexer Widerstand (Z₁) zu einem ersten Zeitpunkt (t₁) gemessen werden kann und wobei ein zweiter komplexer Widerstand (Z₂) zu einem zweiten Zeitpunkt (t₂), der nachfolgend zum ersten Zeitpunkt ist, gemessen werden kann, • wobei auf Basis der Messungen ein elektrisches Ersatzschaltbild aufgestellt wird, das die gemessene Kurve nachbildet, wobei die Verhältnisse der simulierten Bauteilgrößen eine Aussage über die Eizelle bzw. den Reifegrad der Eizelle (Ez) bereitstellt.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in der zumindest einen Vertiefung (V) ein steuerbarer Fluidkanal (FK) angeordnet ist, wobei der Fluidkanal (FK) zumindest einen Abfluss von Fluid aus der Vertiefung (V) erlaubt.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der zumindest einen Vertiefung (V) ein steuerbarer Fluidkanal (FK) angeordnet ist, wobei der Fluidkanal (FK) einen Zufluss und einen Abfluss von Fluid aus der Vertiefung (V) erlaubt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (S) zumindest im Bereich der Vertiefung (V) im optischen Bereich transparent ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zumindest zwei Elektroden (E1, E2; E1a, E1b, E2a, E2b) ein elektrisch leitfähiges Polymermaterial aufweisen.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung weiterhin eine Temperiereinheit zur Bereitstellung einer vorwählbaren Temperatur aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (V) weiterhin eine Einheit zur atmosphärischen Steuerung aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass drei oder mehr Elektroden (E1a, E1b, E2a, E2b) zur Impedanzmessung bereitgestellt sind.
System zur Charakterisierung von morphologischen und elektrophysiologischen Veränderungen des Reifungsvorgangs einer Eizelle aufweisend: • eine Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, • und ein Impedanzspektrometer oder eine LCR-Messbrücke oder ein Vektor-Netzwerkanalysator.
Verwendung eines Systems gemäß Anspruch 10 zur Vorbereitung einer künstlichen Befruchtung.
Verwendung eines Systems gemäß Anspruch 10 zur Charakterisierung von Kontrazeptiva.