WO2020175264A1 - マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法 - Google Patents

マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法 Download PDF

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圭佑 後藤
牧野　洋一
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    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic device and a sample analysis method using the microfluidic device.
  • microwell arrays having various types of fine flow channel structures formed by using etching techniques and photolithography techniques used in semiconductor circuit manufacturing techniques, or fine plastic molding methods. Is being considered.
  • the wells of these microwell arrays are used as chemical reaction vessels for conducting various biochemical or chemical reactions in a microvolume of fluid.
  • Patent Documents 1 to 3 and Non-Patent Document 1 describe the use of such a microfluidic system as various microchips or biochips.
  • biomolecules are detected by introducing them into micropores and conducting a reaction involving heating.
  • a technique capable of detecting a single molecule of a biomolecule is known. Examples of the technology capable of detecting the single molecule include, for example, digital LI SA (Digital HI nz yme—L inked I mm uno Sorbent As ssay), digital PCR (D igital P ol yme rase R eaction) Digital measurement such as Assay (Digital ICA) ⁇ 2020/175264 2 ⁇ (:171? 2020 /006479
  • the digital PCR technique is to divide a mixture of a reagent and a nucleic acid into a myriad of microdroplets for PCR amplification so that a signal such as fluorescence is detected from a droplet containing a nucleic acid. This is a technique for quantification by counting the detected droplets.
  • a method of forming microdroplets a method of forming microdroplets by dividing a mixture of a reagent and a nucleic acid with a sealing liquid, or a method of forming a mixture of a reagent and a nucleic acid in a hole formed on a substrate
  • a method of forming fine liquid droplets by inserting and then inserting a sealing liquid is being studied.
  • Patent Document 1 Patent No. 6 1 8347 1
  • Patent Document 2 Special Table 201 4-50383 No. 1 Publication
  • Patent Document 3 International Publication No. 201 3— 1 5 1 1 35
  • Patent Document 3 International Publication No. 201 3— 1 5 1 1 35
  • Non-Patent Document 1 Kim S. H., et a 1. ,Large-scale femto liter drop let array for digital counting of single biomolecules., Lab on a Chip, 12 (23), 4986-4991, 2012.
  • bubbles may be generated inside the channel, which may hinder the detection.
  • the present invention is a microfluidic device capable of suppressing the generation of bubbles and improving the detection efficiency when minute droplets are formed and heated for optical detection.
  • the purpose is to provide.
  • the present invention forms a minute droplet, heats it, and optically detects a sample. ⁇ 2020/175264 3 (:171? 2020/006479
  • the present invention employs the following configurations.
  • a microfluidic device comprising: a flow path; and a liquid droplet holding section formed in the flow path, wherein the flow path has a height of more than 0 and not more than 30.
  • the total capacity of the droplet holding unit is 0.2 or more and 2.0 or less
  • microfluidic device according to any one of [1] to [5].
  • the ratio of the total area of the openings of the droplet holding section to the unit area of the region where the droplet holding section is formed on the substrate is 23% or more and 90% or less, [ 2] The microfluidic device according to any one of [8].
  • a sample analysis method comprising: a sealing step of enclosing a liquid; a reaction step of causing a reaction in the droplet holding section to generate a signal for detection; and a detection step of detecting the signal.
  • a microfluidic device comprising: a flow channel; and one or a plurality of droplet holding units connected to the flow channel, wherein the flow channel has a height of more than 0 and less than 30. ..
  • microfluidic device further including a lid member, and the flow path is a space sandwiched between the lid member and the substrate.
  • the ratio of the total area of the openings of the droplet holding unit per unit area of the region where the droplet holding unit is formed on the substrate is 23% or more and 90% or less, [ 1 7] or the microfluidic device according to [18].
  • the droplet holding unit is a plurality of droplet holding units. ⁇ 0 2020/175 264 5 (: 17 2020 /006479
  • microfluidic device according to any one of claims.
  • the volume of one of the droplet holding units is 10!
  • the ratio of the total volume of the droplet holding section to the volume of the flow channel is 5% or more and 40% or less, [16] to [22] Microphone mouth fluid device.
  • a sample analysis method using the microfluidic device using the microfluidic device according to any one of [16] to [24], wherein an aqueous liquid containing a sample is introduced into the channel, Retaining the aqueous liquid in the droplet holding unit, introducing a sealing liquid into the channel to replace the aqueous liquid existing in the channel, and enclosing the aqueous liquid in the droplet holding unit. And a step of causing a reaction in the droplet holding unit to generate a signal for detection, and detecting the signal.
  • Generating the signal for the detection includes heating the microfluidic device to cause the reaction, and the temperature when the microfluidic device is heated is 60° or more.
  • microfluidic device of the present invention it is possible to suppress the generation of bubbles when forming minute droplets and heating the minute droplets.
  • the microscopic droplets when microscopic droplets are formed, the microscopic droplets are heated, and when the sample is optically detected, bubbles when heating the microscopic droplets It is possible to suppress the occurrence of the noise and improve the detection efficiency of the sample.
  • FIG. 1 A perspective view showing a microfluidic device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 A top view of a microchannel device according to an embodiment of the present invention in which a region where a droplet holding portion is formed exists only in a part of a substrate.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view showing a microfluidic device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing a state when the microfluidic device according to one embodiment of the present invention is used.
  • FIG. 7 is a diagram showing a state when the microfluidic device according to one embodiment of the present invention is used.
  • FIG. 8 is a diagram showing a state when the microfluidic device according to the comparative example is used.
  • FIG. 9-8 is a diagram showing a fluorescent image observed using the microfluidic device/chair according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 98 is a view showing a fluorescence image observed using the microfluidic device/chair according to the comparative example.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a microfluidic device 1 according to this embodiment.
  • FIGS. 2 and 3 are cross-sectional views taken along line 13 — 13 in FIG.
  • the microfluidic device 1 is provided with a flow channel 35 and a droplet holding unit 11.
  • the flow path 35 may be formed by disposing the lid member 20 and the substrate 10 so as to face each other at a constant interval. In this case, the flow path 35 is a space sandwiched between the lid member 20 and the base plate 10.
  • a peripheral member 34 is located between the substrate 10 and the lid member 20.
  • a channel 35 is a region sandwiched between the substrate 10 and the lid member 20 and surrounded by the peripheral member 34.
  • the peripheral member 34 may be formed integrally with the lid member 20.
  • the droplet holder 11 is preferably a hole, that is, a well, present in the substrate 10 when the substrate 10 forming the flow path 35 is flat or flat.
  • the holding portion 11 is preferably a microwell 33 having a plurality of holes (wells) on the substrate 10 as shown in FIG. In other words, the substrate 10 preferably has a plurality of microwells 33.
  • the microfluidic device 1 according to the present embodiment will be described by taking as an example the microfluidic device 1 in which the droplet holding section 11 is a microwell 3 3 having a plurality of holes (wells) on the substrate 10. explain.
  • the microwell array 30 may include a bottom layer 31, a wall layer 32 (may be described as a partition 32), and a plurality of microwells 33.
  • the bottom layer 31 is provided on the substrate 10.
  • the wall layer 32 is formed on the bottom layer 31.
  • the plurality of microwells 33 are composed of a bottom layer 31 and a plurality of through holes 323 formed in the thickness direction of the wall layer 32.
  • the plurality of microwells 33 are formed in an array on the wall layer 32.
  • There is a gap In the internal space 3 between the substrate 10 and the lid member 20, between the microwell array 30 and the lid member 20, in other words, between the upper surface of the wall layer 32 and the lid member 20.
  • There is a gap This gap functions as a flow path 35 that communicates with the plurality of microwells 33 and the first hole 21 and the second hole 22. ⁇ 2020/175 264 8
  • the substrate 10 may be capable of transmitting electromagnetic waves.
  • electromagnetic waves include X-rays, ultraviolet rays, visible rays, and infrared rays. Since the substrate 10 is capable of transmitting electromagnetic waves, it is possible to observe from the substrate 10 side fluorescence or phosphorescence generated by the reaction between the sample sealed in the microfluidic device 1 and the reagent.
  • the substrate 10 may be capable of transmitting only electromagnetic waves in a predetermined wavelength range. For example, when the presence of a sample in a microwell is determined by detecting fluorescence having a peak in the wavelength range of 350 to 700, which is the visible light region, at least visible light in the above wavelength range must be detected.
  • a substrate that can transmit light may be used as the substrate 10.
  • Examples of the material forming the substrate 10 include glass and resin.
  • Examples of materials for the resin substrate include: Mitsumi 3 resin, polycarbonate resin, XX (cycloolefin copolymer), XX (cycloolefin polymer), acrylic resin, polyvinyl chloride, polystyrene resin, polyethylene resin, polypropylene resin, polypropylene resin, Examples thereof include polyvinyl acetate, Ming (polyethylene terephthalate), and M (polyethylene naphthalate).
  • These resins may contain various additives. Examples of the additive include an antioxidant, an additive that imparts water repellency, an additive that imparts hydrophilicity, and the like.
  • the resin substrate may contain only one of the above resins, or may be a mixture of a plurality of resins.
  • the sample analysis method described later may utilize fluorescence or phosphorescence, the substrate 1
  • substantially no autofluorescence As 0, it is preferable to use a material having substantially no autofluorescence.
  • substantially free of autofluorescence means that the substrate has no autofluorescence of the wavelength used to detect the experimental results, or even if it has autofluorescence, it detects the experimental results. It means that it is weak enough not to affect.
  • autofluorescence that is less than 1/2, preferably less than 1/10, of the fluorescence to be detected can be said to be weak enough not to affect the detection of experimental results.
  • the thickness of the substrate 10 can be appropriately determined, but it should be determined in the sample analysis. ⁇ 2020/175 264 9 ⁇ (:171? 2020 /006479
  • the lower limit value of the thickness of the substrate 10 can be appropriately determined, but it is preferable that the thickness is such that no distortion occurs even if the pressure inside the microfluidic device 1 rises.
  • 0.11 111 111 or higher is preferable, and 0.201 01 or higher is more preferable, The above is more preferable.
  • the upper limit and the lower limit of the thickness of the substrate 10 can be arbitrarily combined.
  • the thickness of the substrate 10 is 0.111 The following is preferable, and 0.201 or more and 2 01 01 or less is more preferable.
  • the bottom layer 31 constitutes the bottom surface of the microwell 33. Therefore, when it is desired to impart hydrophilicity to the bottom surface, the bottom layer 31 may be formed of a hydrophilic material. It is preferable that the bottom layer 31 is formed so that the bottom layer 31 can transmit an electromagnetic wave and does not interfere with the observation of the sample in the microwell 33 from the substrate 10 side. When it is desired to impart hydrophobicity to the bottom surface, the bottom layer 31 may be formed of a hydrophobic material. It is preferable that the bottom layer 31 does not hinder the observation of the sample in the microwell 33 from the substrate 10 side. Further, it is preferable to use a material that does not substantially have autofluorescence for the bottom layer 31.
  • the one in which the substrate 10 and the bottom layer 31 are integrated can be simply referred to as a substrate.
  • the wall layer 3 2 is formed directly on the substrate 10 without providing the bottom layer 31. May be done. Therefore, in that case, the micro-well 3 3 is composed of the through-hole 3 2 3 of the substrate 1 0 surface and the wall layer 3 2.
  • the wall layer 32 has a plurality of through holes 323 arranged in an array when viewed in the thickness direction.
  • the inner surface of each through hole 3 23 constitutes the inner wall surface of each microwell 3 3.
  • the same resin as the material for forming the substrate 10 can be used, but the resin is colored to absorb electromagnetic waves of a predetermined wavelength. ⁇ 2020/175 264 10 ⁇ (:171? 2020 /006479
  • resin materials include hydrophilic resins in which the constituent molecules of the resin have a hydrophilic group, and hydrophobic resins in which the constituent molecules of the resin have a hydrophobic group. Any of these can be used.
  • hydrophilic group examples include a hydroxyl group, a carboxyl group, a sulfone group, a sulfonyl group, an amino group, an amide group, an ether group, and an ester group.
  • hydrophilic resin examples include siloxane polymer; epoxy resin; polyethylene resin; polyester resin; polyurethane resin; polyacryl amide resin; polyvinyl pyrrolidone resin; acrylic resin such as polyacrylic acid copolymer; cationized polyvinyl alcohol, Polyvinyl alcohol resins such as silanolated polyvinyl alcohol and sulfonated polyvinyl alcohol; polyvinyl acetal resins; polyvinyl butyral resins; polyethylene polyamide resins; polyamide polyamine resins; cellulose derivatives such as hydroxymethyl cellulose and methyl cellulose; polyethylene oxide.
  • Poly(ethylene oxide) polypropylene oxide copolymers and other polyalkylene oxide derivatives include maleic anhydride copolymers; ethylene-vinyl acetate copolymers; styrene-butadiene copolymers; and combinations of the above resins. Therefore, it can be appropriately selected and used.
  • hydrophobic resin examples include, for example, novolac resin; acrylic resin; methacrylic resin; styrene resin; vinyl chloride resin; vinylidene chloride resin; polyolefin resin; polyamide resin; polyimide resin; polyacetal resin; polycarbonate resin.
  • hydrophobic as used in this specification means that the contact angle measured according to the sessile drop method specified in "1 3 [ ⁇ 3 2 5 7-1 999] is 70 degrees or more. Means ⁇ 0 2020/175 264 1 1 ⁇ (: 17 2020 /006479
  • the contact angle is determined by the method based on 8 3 1/ 1 0 5 7 2 5-1 997. It can also be measured.
  • Both the hydrophilic resin and the hydrophobic resin may be a thermoplastic resin or a thermosetting resin. Further, it may be a resin that is cured by an active energy ray such as electron beam or UV light, or may be an elastomer.
  • photoresist as a resin material, a large number of fine through-holes 3 2 3 in the wall layer 3 2 can be accurately formed by photolithography.
  • known means can be appropriately selected for selection of the type of photoresist used, coating, exposure (photosensitization), and removal of unnecessary photoresist.
  • the wall layer 32 can be formed by injection molding or the like.
  • Examples of the colored component include organic or inorganic pigments.
  • black pigments include carbon black, acetylene black, iron black and the like.
  • yellow pigments include chrome yellow, zinc yellow, ocher, Hanseye mouth, permanent yellow, and benzine yellow.
  • Orange pigments include orange lake, molybdenum orange, and benzine orange.
  • Red pigments include red iron oxide, cadmium red, antimon red, permanent red, resored red, lake red, prilian scarlet, and thioindigo red.
  • Blue pigments include ultramarine blue, cobalt blue, phthalocyanine blue, ferrocyan blue, and indigo.
  • green pigments include chrome green, pyridiannaphthol green, and phthalocyanine green.
  • the wall layer 32 is formed by injection molding or the like, not only the pigment dispersed in the resin but also various dyes dissolved in the resin can be used as the colored component.
  • the dye can be exemplified by various dye methods. Specifically, direct dyes, basic dyes ⁇ 2020/175 264 12 boxes (:171? 2020 /006479
  • Dyes cationic dyes, acid dyes, mordant dyes, acid mordant dyes, sulfur dyes, vat dyes, naphthol dyes, disperse dyes, and reactive dyes.
  • a disperse dye is often selected.
  • the lid member 20 (may be simply referred to as the lid 20) is a member formed in a plate shape or a sheet shape.
  • the lid member 20 faces the substrate 10 in a state of being separated from the substrate 10.
  • the lid member 20 covers the plurality of microwells 33.
  • the channel 35 is a region surrounded by the lid member 20, the microwell array 30 and the peripheral member 34.
  • the channel 35 is connected to the openings of the plurality of microwells 33 and is located above the plurality of microwells 33.
  • the lid member 20 has a first hole 21 and a second hole 22 that penetrate in the thickness direction.
  • the first hole 21 and the second hole 22 are located so as to sandwich one or a plurality of the liquid holding portions.
  • the first hole 21 and the second hole 22 communicate with the internal space 3 including the microwell array 30 and the channel 35 in the completed microfluidic device 1.
  • the first hole 21 and the second hole 22 function as an inlet for supplying a fluid to the internal space 3 and an outlet for discharging the fluid, respectively.
  • the material forming the lid member 20 and the thickness of the lid member 20 can be the same as those of the substrate 10.
  • the electromagnetic wave transparency can be appropriately set.
  • the lid member 20 may not be able to transmit electromagnetic waves.
  • the height of the flow channel 35 is the uppermost surface of the substrate 10 on the flow channel 35 side (the flow channel 35 side in the portion where the holes of the substrate 10 are not formed). Surface) to the surface of the lid member 20 on the flow path 35 side.
  • the microfluidic device 1 is provided with the wall layer 32, as shown in FIG. 3, the surface 3 2 of the wall layer 32 on the side of the flow channel 35 to the surface 20 on the side of the flow channel of the lid member 20. Up to 3 heights.
  • the height II of the flow path 35 is more than 0! and less than 500!, and is preferably more than 0 and 30 or less, preferably 2 or more and 30 or less, and 3 or more and 25 or more. ⁇ 2020/175 264 13 ⁇ (:171? 2020 /006479
  • the height of the flow path is more than 0 and less than 5001, the generation of bubbles is suppressed when the droplets formed in the droplet holder 1 1 (microwell 33) are heated. .. Therefore, the sample can be detected by the fluorescence or the like without the air bubbles hindering the detection of the fluorescence or the like.
  • the flow path height II is preferably smaller than 50 from the viewpoint of suppressing the generation of bubbles, but when the flow path height is less than 2, the sample is flowed. It may not be possible to simply fill the inside.
  • the height of the channel is 2 or more, the pressure at the time of filling the channel with the aqueous liquid containing the sample does not rise excessively, and the aqueous liquid can be simply filled.
  • the height II of the flow path is 50 or more, bubbles are likely to be generated when the droplets formed in the droplet holding portion 11 (microwell 33) are heated, and the bubbles are generated. This makes it difficult to detect the sample by fluorescence or the like.
  • the height of the channel 1 * 1 is less than 50, bubbles will not easily be generated even if the droplets formed in the droplet holder 1 1 (microwell 33) are heated, and the sample Can be accurately detected by fluorescence or the like.
  • the flow path height II is less than 50, it will lead to an improvement in the yield rate of microfluidic devices. If the height II of the flow path is less than 50, the detection efficiency of the sample is improved and the success rate of the detection operation is improved.
  • the heights of the flow channels 35 are the heights at a plurality of positions on the uppermost surface of the substrate 10 on the flow channel 35 side (the surface on the flow channel 35 side in the portion where the holes of the substrate 10 are not formed). It may be the average value of the height or the height at a typical place. As the representative position, any position on the substrate 10 can be selected. For example, it may be at the center of the substrate 10 forming the flow path 35, or from the front end side of the line connecting the front end of the substrate 10 forming the flow path 35 and the center. It may be in the range of %-50%.
  • the microfluidic device 1 When the microfluidic device 1 is provided with the wall layer 32, it may be an average value of heights at a plurality of positions of the surface 3 23 of the wall layer 3 2 on the side of the flow path 35, or a typical value. It may be the height at a specific point.
  • the representative location any position on the wall layer 32 can be selected.
  • the representative location may be the center of the wall layer 32.
  • the typical location is a position of 10% to 50% from the tip end side of the line connecting the tip and the tip of the wall layer 32 facing the flow path 35. Good.
  • the position at the point where the virtual orthogonal line at the center of the virtual line connecting the first hole 2 1 and the second hole 2 2 intersects with the peripheral member 3 4 is a typical location. Is preferred.
  • leading edge refers to an end in a direction (called a longitudinal direction) parallel to an imaginary line connecting the first hole 21 and the second hole 22 of the microfluidic device 1.
  • the end means a portion that contacts a peripheral member 34 described later.
  • the flow path side surface of the lid member 20 forming the flow path 35 is smooth. Since the surface of the lid member 20 on the flow path 35 side is smooth, it is possible to further suppress the generation of bubbles when the liquid droplets in the liquid droplet holding portion 11 (microwell 33) are heated. You can In the present specification, “smooth” means that the unevenness when observed with an optical microscope is small, that is, the microscopic unevenness is small. In the present specification, “smooth” does not mean that the lid member 20 is not curved inside the peripheral member 34. In this embodiment, the lid member 20 may be curved inside the peripheral member 34.
  • the lid member 20 may be curved so as to project to the substrate 10 side in the vicinity of the center of the main surface of the lid member 20. That is, the flow path 35 in the portion in contact with the peripheral member 34 may be higher than the flow path 35 in the vicinity of the center of the main surface of the lid member 20.
  • the center of the main surface of the lid member 20 is the geometric center of the main surface of the lid member 20.
  • a microwell means a well having a volume of 10 nanoliter ( ⁇ !_) or less.
  • the reaction carried out inside can be suitably carried out.
  • mutation detection of a gene can be performed.
  • the volume of the droplet holding unit 1 1 is not particularly limited, but it is preferably 10 femtoliters (dry! _) or more and 100 picolitres (!_) or less, and 1 0 dry! More than _ and 5 !_ or less are more preferable, 10 dry! Most preferred is _ or more and 2!_ or less. Setting the volume in this range is suitable for accommodating one to several biomolecules or carriers in one droplet holding unit 11 (microwell 33) during the sample analysis described later. ing.
  • the shape of the microwell 33 is not particularly limited as long as the volume is within the above range.
  • a cylinder a polyhedron composed of multiple faces (for example, a rectangular parallelepiped, a hexagonal prism, and an octagonal prism), an inverted cone, and an inverted pyramid (an inverted triangular pyramid, an inverted quadrangular pyramid, an inverted pentagon). It may be a pyramid, an inverted hexagonal pyramid, an inverted polyhedron of heptagon or more).
  • the shape of the plurality of macrowells 33 may be a shape obtained by combining two or more of the above shapes.
  • a part of the plurality of macrowells 33 may be cylindrical and the rest may be inverted conical.
  • the bottom of the cone or pyramid is the opening that connects the flow path 35 and the microwell 33.
  • the bottom of the microwell 33 may be flattened by using a shape obtained by cutting a part of the top of an inverted cone or an inverted pyramid.
  • the bottom of the microwell 33 may have a curved surface shape protruding toward the opening, and the bottom of the macrowell 33 may have a concave curved surface shape.
  • Ratio of the total area of the openings of the droplet holding part 1 1 (microwell 3 3) per unit area (usually 10! 2 ) of the region of the substrate 10 where the droplet holding part is formed Is preferably 23% or more and 90% or less, more preferably 25% or more and 90% or less, more preferably 30% or more and 90% or less, and more preferably 35% or more and 80% or less, 39% or more and 76% or less are more preferable, and 39% or more and 64% or less are more preferable.
  • the ratio of the total area of the openings of the droplet holding section 11 is within the above-mentioned preferable range, it is possible to effectively suppress the generation of bubbles in the flow channel. This is because the total area of the openings is not too large when the aqueous liquid in the droplet holding unit 11 (microwell 33) is heated, and therefore the pressure applied to the sealing liquid in the flow channel 35. It is considered that this can be suppressed to some extent.
  • the ratio of the total area of the openings of the liquid drop holding portion 11 (microwell 33) per unit area of the region of the substrate 10 where the liquid drop holding portion is formed is defined as "opening area”. Also called “ratio”.
  • the droplet holding section 11 (microwell 33) of the substrate 10 is It may be approximated that the total area of the openings in 3 3) is the same as the area of the region defined by the peripheral member of the substrate 10.
  • the region where the droplet holding portion 11 (microwell 33) is formed may be present only in a part of the substrate 10 as shown in FIG.
  • the area where the droplet holding section 11 (microwell 33) is formed means that when the substrate 10 is viewed from the vertical direction, the droplet holding section 11 ( Microwell 3 3) A region where the distance between each other is constant.
  • the total area of the openings of the droplet holding part 11 (microwell 3 3) of the substrate 10 is located at the outermost part of the area where the droplet holding part 1 1 (microwell 3 3) is formed. It may be approximated to the area of a region surrounded by an imaginary line passing through the centers of the openings of the plurality of droplet holding units 1 1 (microwalls 3 3).
  • the constant interval does not need to be the exact constant interval, and naturally, a manufacturing error is allowed.
  • the thickness of the wall layer 3 2 is ⁇ 2020/175 264 17 ⁇ (:171? 2020/006479
  • the wall layer 32 has a thickness of, for example, 1 O nm or more and 100 or less, preferably The range is more preferably 1 or more and 30 or less, still more preferably 20! or more and 15 or less, and further preferably 3 or more and 10 or less.
  • each part of the microwell 3 3 should be one or several biomolecules in one microwell in consideration of the amount of the aqueous liquid to be contained and the size of the carrier such as beads to which the biomolecule is attached. May be appropriately determined so as to be accommodated.
  • the ratio of the depth of the droplet holding portion 11 (microwall 33) to the height II of the channel 35 is preferably 3% or more and 150% or less, more preferably 10% or more 10 ⁇ % or less, more preferably 12% or more and 75% or less, further preferably 15% or more and 75% or less, more preferably 33% or more and 75% or less, further preferably 33% or more and 50% It is the following. Within this range, it is possible to further satisfy both the suppression of bubble generation and the ease of introduction into the liquid drop holder 11 (microwell 33) to be detected.
  • the number and density of the microwells 33 provided in the microwell array 30 can be set as appropriate, but the total volume of the microwells 33 is, for example, 0.2 or more and 2.0 or less, and preferably 0.5. More than that! It is preferable to set the number and density of the microwells 33 so that it is 5 or less.
  • the total volume of the microwell 33 is preferably 5% or more and 40% or less, more preferably 8% or more and 30% or less, particularly preferably 1% with respect to the volume of the flow channel 35.
  • a volume of 0% or more and 20% or less is preferable.
  • the density of the micro-wells the number of micro-wells 3 3 per ⁇ 01 2 herein.
  • the density of the microwells is within this range, it is easy to fill the predetermined number of wells with the aqueous liquid as the sample.
  • the density of the microwells is within this range, it is easy to observe the wells for analyzing the experimental results. For example, when detecting a cell-free 0 mutation, the mutation to be detected in the wild-type If the existence ratio of eight is about 0.01%, for example,
  • Figure 1 shows an example of a one-dimensional array in which multiple microwells 33 are arranged in a row.
  • a two-dimensional array in which a plurality of microwells are arranged two-dimensionally may be used.
  • a peripheral member 34 having a frame shape in plan view is arranged around the microwell array.
  • the dimension of the peripheral member 34 in the thickness direction of the microfluidic device 1 is larger than that of the wall layer 32.
  • the material of the peripheral member 34 is not particularly limited, and examples thereof include a double-sided adhesive tape in which an acrylic adhesive is laminated on both sides of a core material film formed of silicone rubber or acrylic foam.
  • the peripheral member 34 may be integrally formed with the lid member 20. In that case, the peripheral member 34 serves as a stepped portion of the lid member 20, and the stepped portion ensures a gap between the lid member 20 and the microwell array to maintain the flow path 35.
  • microfluidic device 1 configured as described above can be manufactured by the following procedure, for example.
  • the substrate 10 is prepared, and the resin for the wall portion to be the wall layer 32 is formed on the surface of the substrate 10. ⁇ 2020/175 264 19 ⁇ (:171? 2020/006479
  • the bottom layer 31 is formed before the wall resin layer is formed. Even if the bottom layer 31 is not provided, an anchor layer or the like that enhances the adhesion between the substrate 10 and the wall resin layer may be provided on the surface of the substrate 10 if necessary.
  • the wall resin layer may be formed of a material obtained by mixing a resin material with a colored component.
  • the content rate of the color component with respect to the total weight of the resin material and the color component may be, for example, 0.5 mass% (01 3 3 3%) or more and 6 0 111 3 3 3% or less. it can.
  • the content is preferably 5 01 3 3 3% or more and 5 5 01 8 3 3% or less, more preferably 200 1 0 13 3 3% or more and 5 0 0 1 8 3 3% or less.
  • the content of the colored component with respect to the total mass of the resin material and the colored component can be appropriately set so that a desired pattern can be constructed in consideration of the ratio of the photosensitive component contained in the resist.
  • the colored component is a pigment
  • the particle size of the pigment is set and prepared so that the above-described predetermined conditions are satisfied for the microwell to be formed.
  • a dispersant may be appropriately added to the resin material together with the pigment.
  • the wall resin layer When the formed wall resin layer is made of a material in which a colored component is mixed with a resin material, the wall resin layer has a color based on the colored component contained in the wall resin layer.
  • a through hole 3 2 3 to the forming wall of the resin layer As described above, the use of photolithography, the through-hole 3 2 3 can you to form good easily and accurately.
  • the wall resin layer is formed by injection molding or the like, the wall resin layer and the through hole can be formed in the same process.
  • the through holes 3 23 can be formed also by etching using a pattern mask.
  • peripheral member 34 is arranged around the microwell array 30 and then the lid member 20 is arranged on the peripheral member 34.
  • the microfluidic device/chair 1 is completed by joining the lid members 20 together.
  • the flow path 35 is formed between the lid member 20 and the substrate 10 by the peripheral member 34.
  • the joining method is not particularly limited, and examples thereof include joining with an adhesive, joining with a double-sided tape, joining by laser welding, and joining by heat welding. If the sample analysis method using the microfluidic device 1 includes a heating reaction, it can sufficiently withstand the pressure increase in the internal space 3 due to heating.Therefore, adhesive bonding, double-sided tape bonding, or laser welding bonding preferable.
  • FIG. 5 shows a microfluidic device 2 in which a base plate 10 and a wall layer 32 are integrally formed, and a peripheral member 34 and a lid member 20 are integrally formed.
  • the substrate 10 integrally formed with the wall layer 32 is arranged on the lid member 20 integrally formed with the peripheral member 34, and the peripheral member 34 and the lid member 20 are integrated. It is possible to manufacture by joining the step portion formed by being molded to the substrate 10 integrally molded with the wall layer 32.
  • the flow path 35 is formed between the lid member 20 and the substrate 10 by the step portion formed on the lid member 20.
  • the configuration of the microfluidic device 2 is the same as that of the microphone fluid device 1 described above except that the substrate 10 and the wall layer 32 are integrally molded, and the peripheral member 34 and the lid member 20 are integrally molded. Is.
  • the peripheral member has a substrate 10 and a wall layer 32 as separate elements.
  • microfluidic device in which 34 and lid member 20 are integrally formed. Also in this case, the configuration of the microfluidic device is the same as that of the above-mentioned microfluidic device 1 except that the peripheral member 34 and the lid member 20 are integrally formed.
  • the sample analysis method of this embodiment is the microfluidic device 1 according to this embodiment. ⁇ 2020/175264 21 ⁇ (: 171-1?2020/006479
  • An aqueous liquid containing a sample is introduced into the flow path 35, and the droplet holding unit 11 holds the aqueous liquid,
  • the aqueous liquid may include water, a buffer solution, a detection reaction reagent, and the like, in addition to the sample. Further, the aqueous liquid may contain an enzyme.
  • the sample is a nucleic acid
  • the PCR method ICA method
  • LAMP method (trademark registration, Loop-Medi i t e d I s o t h e r m a l A m p I i f
  • the aqueous liquid may contain additives such as a surfactant.
  • buffer solution for example, examples thereof include I buffer solution, acetate buffer solution, and phosphate buffer solution.
  • enzyme for example, an oral polymerase, Eight polymerases, reverse transcriptase, and flap endonuclease.
  • the microfluidic device of the present embodiment favors the use of the aqueous liquid in the well even when the temperature of the encapsulated aqueous liquid is changed, for example, in the detection of gene mutation. ⁇ 2020/175 264 22 ⁇ (:171? 2020 /006479
  • the range of the temperature to be changed is, for example, ⁇ ° ⁇ to 100 ⁇ , preferably 20 ° ⁇ to 100 ° ⁇ , more preferably 20 ° ⁇ to 90 ° ⁇ , more preferably 20 ° ⁇ to 80 ° ⁇ , further It is preferably 20° to 70°. If the aqueous solution enclosed in the well is within this range, It is possible to preferably carry out a reaction or a reaction carried out in a minute space such as a 0.88 reaction.
  • the flow path height II is less than 50, even when the droplet holding unit 1 1 (microwell 33) is heated in the above temperature range, bubbles are generated. Can be suppressed.
  • Examples of the sample analyzed using the microfluidic device 1 according to the present embodiment include a sample collected from a living body such as blood.
  • the target to be detected by the sample analysis was a hook-shaped mouth included in the sample. It may be a product or the like, or an artificially synthesized compound (for example, an artificially synthesized nucleic acid simulating a sample mouth).
  • the well may have a shape and size such that one mouth contains one molecule.
  • the sample includes a mouthpiece, [3 ⁇ 48, 0 1 ⁇ [3 ⁇ 4, It may include proteins or biomolecules such as lipids.
  • the lipid may include a lipid bilayer membrane structure.
  • the biomolecule may include cells collected from a human for non-therapeutic purpose, cells collected from an animal, microorganisms, bacteria and the like.
  • the detection target is a biomolecule
  • the sample analysis method according to one embodiment of the present invention can be said to be a biomolecule detection method
  • the microfluidic according to one embodiment of the present invention used for the biomolecule detection method It can be said that the device is a biomolecule detection device.
  • Aqueous liquid containing a sample to be sealed in microwells is prepared.
  • Aqueous liquid containing the sample is a liquid water containing detection target is the principal solvent, e.g., a biological sample and ⁇ , as a detection reagent 3 ⁇ [3 ⁇ 4 ⁇ reaction include "6 6 n ⁇ ⁇ 2020/175 264 23 ⁇ (:171? 2020 /006479
  • Examples include a liquid, an allele probe, a 0.8 oligo, a 1 1-1-1, and a reaction solution containing a fluorescent substrate and the like.
  • a surfactant may be added to make it easier for the sample to enter the microwell.
  • beads that specifically recognize the detection target may be added to capture the detection target.
  • the object to be detected may be suspended in an aqueous liquid without directly or indirectly binding to a carrier such as beads.
  • an aqueous liquid 100 containing the prepared sample is introduced from the first hole 21 into the flow path 35, and the sample is contained in the droplet holding section 11. Hold an aqueous liquid (also called the sample supply step).
  • Aqueous liquid 100 containing the supplied sample is filled in each microwell 33 and channel 35 as shown in FIG.
  • the gas in the channel 35 is degassed in advance by a degassing operation before the sample supply step. This degassing operation may be performed by filling the flow path 35 with a buffer.
  • the buffer include water, water containing a buffer solution, water containing a surfactant, and water containing a buffer solution and a surfactant.
  • an encapsulation step of enclosing the aqueous liquid 100 containing the sample in the droplet holding unit 11 (microwell 33) is performed.
  • a detection target in the sample contained in the aqueous liquid may be labeled with fluorescence or the like.
  • the fluorescent label treatment may be performed before the sample supply step, for example, when preparing the sample, or after the sample supply step, the fluorescent label may be introduced into the channel 35.
  • the sealing liquid 110 is supplied from the first hole 21 to the flow path 35 using a syringe or the like.
  • the supplied sealing liquid 110 flows in the flow channel 35, and as shown in FIG. 7, the aqueous liquid 100 containing the sample existing in the flow channel 35 is directed to the second hole 22. And press.
  • the sealing liquid 110 is replaced with the aqueous medium 100 filled in the channel 35, and the channel 35 is filled with the sealing liquid 110.
  • the aqueous liquid 100 containing the sample is placed in each of the microwells 33 independently of each other, and the sealing of the sample is completed.
  • the term "seal liquid 110" means that the aqueous liquids introduced into the respective microwells 33 of the microwell array 30 are separated so that they do not mix with each other. ⁇ 2020/175 264 24
  • oils for example, the trade name “ ⁇ 40” manufactured by Sigma, the trade name “1 to 1 _750_100” manufactured by 3 IV!, and the mineral oil used for reactions etc. It can be used.
  • the sealing liquid 110 preferably has a contact angle with the material of the wall layer 32 of 5 degrees or more and 30 degrees or less. When the contact angle of the sealing liquid 110 is in this range, the sample can be suitably sealed in each microwell 33.
  • the contact angle of the sealing liquid 110 is, for example, ""
  • the measurement may be performed using the sealing liquid 110 instead of water.
  • 3 2 5 7-1 9 9 9 instead of the sessile drop method, 8 3 1/1 0 5 7 2 5-1
  • Examples of the signal for detection include fluorescence, chemiluminescence, color development, change in electric potential, !! change, etc., but fluorescence is preferable.
  • the microfluidic device 1 may be subjected to a thermal cycler to carry out an enzymatic reaction such as an O reaction or an I 0 reaction, if necessary.
  • the reaction may be, for example, a biochemical reaction, more specifically an enzymatic reaction.
  • the reaction may be carried out by heating the microfluidic device 1.
  • the temperature for heating is appropriately determined depending on the reaction, but is, for example, 60° or more and 100° or less.
  • the temperature for heating is preferably 60° ⁇ or more and 90°° or less, more preferably 60°° or more and 80°° or less, and further preferably 60°° or more and 70°° or less.
  • the heating temperature is not the actual temperature of the reagent solution in the droplet holding unit 11 (microwell 33), but the heating temperature of the microfluidic device set by a thermal cycler or an incubator. That is. Further, when the heating temperature is, for example, 60 ° ⁇ or more and 100 ° or less, it means that the maximum temperature reaches 60 ° ⁇ or more and 100 ° or less. ⁇ 2020/175 264 25 ⁇ (: 171? 2020 /006479
  • the temperature of the microfluidic device 1 may change within the range of changing temperature described above.
  • An example of the reaction is a signal amplification reaction.
  • the microfluidic device 1 is set to the desired enzyme activity with a reagent solution containing an enzyme for signal amplification contained in the droplet holding unit 11 (microwell 33).
  • a constant temperature condition under which constant temperature is obtained for example, 60 ° or more and 100 ° or less, and is maintained for a predetermined time, for example, at least 10 minutes, preferably about 15 minutes, and is an isothermal reaction.
  • the signal generated from the droplet holding unit 11 (microwell 33) by the above reaction is detected (also referred to as a detection step).
  • the signal is fluorescence
  • excitation light electromagnetic wave
  • the wavelength of the excitation light is set appropriately according to the fluorescent label used.
  • the electromagnetic wave irradiation may be performed from the substrate 10 side of the microfluidic device 1, the lid member 20 side, that is, the upper side of the microwell 33, or from any other direction. .. Detection of fluorescence or phosphorescence generated as a result of electromagnetic wave irradiation may be performed from the substrate side of the microwell array, the well side, or any other direction. For example, when detecting fluorescence or phosphorescence using a fluorescence microscope, it is convenient to perform it from the substrate 10 side of the microfluidic device 1.
  • microwells 33 among the plurality of microwells 33 forming the microwell array 30 emit fluorescence or phosphorescence are measured.
  • the measurement may be performed by taking a fluorescence image of the microwell array 30 and using the fluorescence image.
  • the expression frequency of 3 can be analyzed by counting the number of fluorescent microwells 33.
  • Another aspect of the present invention includes the following embodiments.
  • [33] has at least one second hole for discharging the at least one first hole and the liquid from the previous SL flow path for introducing liquid to the channel, the first _ hole and the second hole
  • the bottom of the liquid drop holder is on the substrate side, the liquid drop holder has an opening on the lid member side, and the flow path is located on the opening, [3 1] ⁇ The microfluidic device according to [33].
  • the volume of one of the liquid drop holders is 10!
  • the ratio of the total area of the openings of the droplet holding unit per unit area of the region where the droplet holding unit is formed on the substrate is 23% or more and 90% or less, 31.
  • the microfluidic device according to any one of [1] to [38].
  • [4 1] A sample analysis method using the microfluidic device according to any one of [3 1] to [40], wherein an aqueous liquid containing a sample is introduced into the flow channel, Holding the aqueous liquid in the droplet holding part, introducing a sealing liquid into the flow path to replace the sealing liquid with the aqueous liquid present in the flow path,
  • a sample analysis method comprising: enclosing an aqueous liquid; causing a reaction in the droplet holding unit to generate a signal for detection; and detecting the signal.
  • Generating a signal for the detection includes heating the microfluidic device to cause the reaction, and the temperature when the microfluidic device is heated is 60° or more.
  • Two resin members, a substrate made of CO P (Z EONOR 1101 OR, made by Nippon Zeon Co., Ltd.) and a lid member made of CO P (Z EONOR 1001 0 R, made by Nippon Zeon Co., Ltd.) formed by injection molding were used. Got ready.
  • the total volume of micropores (that is, microwells) was adjusted by changing the number of micropores formed on the COP substrate.
  • the height of the flow path was set to 30 Mm by integrally forming the lid member and the step and adjusting the height of the step to 30 Mm.
  • micropores with a diameter of 10 Mm and a depth of 15 Mm were placed in the area of 9000 mm x 30000 mm in the channel surface.
  • the opening area ratio was defined as the ratio of the total area of the openings of the micropores in the area where the micropores were formed, 6.5 mm x 9.0 mm.
  • the substrate used was a substrate having a thickness of 0.6 mm and formed by injection molding, in which micropores were arranged on the entire surface of the substrate.
  • a contact type measuring instrument (TA LYSURF FPG I 1240, manufactured by TaylorHobbson) was used for measuring the height of the channel.
  • the substrate and the stepped portion of the lid member were attached by laser welding to produce a microfluidic device.
  • a fluorescent reagent (Fluorcecei n, manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) having the composition shown in Table 1 was injected into the channel formed between the substrate and the lid member. Furthermore, multiple microwells were individually sealed with fluorocarbon oil (FC40, Sigma). In this example, the fluorescent reaction was not performed, but an enzyme was added to the fluorescent reagent in order to obtain the same state as in the case where the fluorescent reaction was performed.
  • Table 2 shows the generation rate of bubbles in the above microfluidic device.
  • the bubble generation rate was calculated by preparing multiple microfluidic devices of the same design and dividing the number of bubbles in one microfluidic device by the number of all microfluidic devices analyzed. ..
  • the presence/absence of bubbles is determined as the presence of bubbles when a bubble of a size visible to the naked eye is present in the microfluidic device, and the absence of bubbles under the same conditions. did.
  • the maximum size of bubbles visible under the above conditions was about 500 Mm or more.
  • the size of the bubbles is such that when the microfluidic device is observed under a microscope using a 4x objective lens, the distance between the adjacent micropores (that is, microwells) is small. When it is smaller than, it is judged that there is no bubble. The reason why such a judgment may be made is that if there are bubbles of the size or smaller, it does not substantially impede detection and it is considered that the generation of bubbles can be suppressed. Is.
  • the microfluidic device manufactured in Example 1 had a low bubble generation rate.
  • Figure 8 shows the results of observation of typical bubbles in the microfluidic device of the comparative example (channel height: 1 O O ⁇ m).
  • the part indicated by the arrow shows a typical bubble generation part.
  • Figure 8 shows that a few mm of air bubbles are present, and several air bubbles as small as 500 yu, m are also observed.
  • the generation rate of such bubbles was reduced.
  • a microfluidic device was manufactured in the same manner as in Example 1 except that the height of the flow path was set to 20, and the bubble generation rate was measured. The results are shown in Table 2. As shown in Table 2, the microfluidic device produced in Example 2 had a low bubble generation rate.
  • a microfluidic device was manufactured in the same manner as in Example 1 except that the height of the flow path was set to 100, and the bubble generation rate was measured. The results are shown in Table 2. As shown in Table 2, the microfluidic device manufactured in Comparative Example 1 had a high bubble generation rate.
  • Figure 9 shows the results of fluorescence observation. In a microfluidic device with a channel height of 100, multiple bubbles were generated and it was difficult to observe the micropores. In Fig. 9, the part indicated by the arrow shows a typical bubble generation part.
  • a microfluidic device was manufactured in the same manner as in Example 1 except that the well depth was 3.5 and the channel height was 100, and the bubble generation rate was measured. The results are shown in Table 2. As shown in Table 2, the microfluidic device produced in Comparative Example 2 had a high bubble generation rate.
  • a substrate made of ⁇ (2 x ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇ [3 ⁇ 4 1 0 1 ⁇ [3 ⁇ 4, manufactured by ZEON CORPORATION) formed by injection molding was used.
  • the micropores have a diameter of 5 and a depth of 3.5. ⁇ 2020/175 264 31 ⁇ (: 171? 2020/006479
  • the lid member made of injection-molded CO P (Z EONOR 10010 R, manufactured by Nihon Zeon Co., Ltd.) was used as the lid member (with liquid supply and waste liquid ports), and the peripheral member was PET (polyethyleneterephtha) with a thickness of 30 yLtm. late)
  • PET polyethyleneterephtha
  • a double-sided substrate tape (N ⁇ 0.5603 BN, manufactured by Nitto Denko) was used.
  • Example 3 a microfluidic device was manufactured in the same manner as in Example 1, and the bubble generation rate was measured. The results are shown in Table 3.
  • the microfluidic device of Example 3 was formed by connecting four microfluidic devices. We created three device groups, that is, a total of 12 microfluidic devices.
  • the "ratio of the region in which the well is formed” is the ratio of the region surrounded by the peripheral member, that is, the region in which the micropores are formed to the area of the region in which the flow path is formed.
  • a microfluidic device was manufactured in the same manner as in Example 1 except that a PET-based double-sided tape (product number: No. 5603 BN, manufactured by Nitto Denko) with a thickness of 50 m as a peripheral member was used. Then, the bubble generation rate was measured. The results are shown in Table 3.
  • a microfluidic device was used in the same manner as in Example 1 except that PET (polyethyleneterephtha I ate)-based double-sided tape with a thickness of 100 Mm (product number: No. 5603 BN, manufactured by Nitto Denko) was used as the peripheral member. Was manufactured and the bubble generation rate was measured. The results are shown in Table 3.
  • the height of the flow channel of the microfluidic device of Example 4 corresponds to the thickness of the peripheral member, so it can be said to be 3001. No bubbles were generated in the microfluidic device of Example 4. ⁇ 2020/175 264 33 ⁇ (:171? 2020 /006479
  • the bubble generation rate is 5 respectively. High values of 0% and 100%.
  • the present invention it is possible to provide a microfluidic device capable of suppressing the generation of bubbles when forming and heating minute droplets.
  • a microfluidic device capable of suppressing the generation of bubbles when forming and heating minute droplets.
  • microscopic droplets are formed and heated to optically detect a sample, it is possible to suppress the generation of bubbles when microscopic droplets are formed and heated.
  • a sample analysis method capable of improving When a biomolecule is used as a sample, it is necessary to heat it to a high temperature for a certain period of time or longer, and the present invention can effectively suppress the generation of bubbles even in such a case. ..

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Abstract

および流路（３５）と、前記流路（３５と接続している１つまたは複数の液滴保持部（１１）と、を有し、前記流路（３５）の高さが０μｍ超３０μｍ以下である、マイクロ流体デバイス（１）、および、前記マイクロ流体デバイス（１）を用いた試料分析方法であって、試料を含有する水性液体を前記流路に導入し、前記液滴保持部に前記水性液体を保持させることと、前記流路に封止液を導入して前記流路内に存在する前記水性液体と置換し、前記液滴保持部に前記水性液体を封入することと、前記液滴保持部において反応を起こし、検出のためのシグナルを発生させることと、前記シグナルを検出することと、を備える試料分析方法。

Description

\¥02020/175264 1 卩（：17 2020 /006479 明 細 書
発明の名称 ： マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法
技術分野
[0001] 本発明は、 マイクロ流体デバイス、 および前記マイクロ流体デバイスを用 いた試料分析方法に関する。
本願は、 201 9年 2月 27日に日本に出願された特願 201 9— 034 228号について優先権を主張し、 その内容をここに援用する。
背景技術
[0002] 近年、 半導体回路の製造技術に用いられているエッチング技術やフォトリ ソグラフィ技術、 または微細なプラスチックの成型方法を用いて形成される 、 種々の形態の微細な流路構造を有するマイクロウェルアレイが検討されて いる。 これらのマイクロウェルアレイのウェルは、 微小体積の流体中で種々 の生化学的または化学的反応をさせるための化学反応容器として用いられて いる。
[0003] マイクロ流体システムの製作のための材料としては、 シリコン及びガラス 等の硬質の物質、 P DMS (ポリジメチルシロキサン) 等の種々の高分子樹 脂やシリコーンゴム等の軟質の物質等が用いられている。 例えば、 特許文献 1〜 3および非特許文献 1 には、 このようなマイクロ流体システムを、 種々 のマイクロチップ又はバイオチップとして用いることが記載されている。
[0004] 生体分子を流路デバイス内で検出する技術が知られている。 例えば、 DN Aマイクロアレイ技術では、 微小孔に生体分子を導入し、 加熱を伴う反応を 行うことにより、 生体分子を検出する。 また、 生体分子を単分子検出できる 技術が知られている。 前記単分子検出できる技術として、 例えば、 デジタル ヒ L I SA (D i g i t a l ヒ n z yme— L i n k e d I mm u n o S o r b e n t A s s a y) 、 デジタル PCR (D i g i t a l P o l yme r a s e R e a c t i o n) 丁ジタル I n v a s i v e C l e a v a g e d A s s a y (D i g i t a l I C A ) などのデジタル計測 〇 2020/175264 2 卩（：171? 2020 /006479
技術がある。
デジタル P C R技術とは、 試薬と核酸との混合物を無数の微小液滴に分割 して P C R増幅を行い、 核酸を含んだ液滴からは蛍光等のシグナルが検出さ れるようにしておき、 シグナルが検出された液滴を数えることにより定量を 行う技術である。
[0005] 微小液滴の形成方法として、 封止液で試薬と核酸との混合物を分断化する ことにより微小液滴を形成する方法や、 基板上に形成した孔に試薬と核酸と の混合物を入れ、 続いて封止液を入れることにより微小液滴を形成する方法 等が検討されている。
先行技術文献
特許文献
[0006] 特許文献 1 :特許第 6 1 8347 1号公報
特許文献 2 :特表 201 4— 50383 1号公報
特許文献 3 :国際公開第 201 3— 1 5 1 1 35号 非特許文献
[0007] 非特許文献 1 : Kim S. H., et a 1. , Large-scale femto liter drop let array for digital counting of single biomolecules. , Lab on a Chip, 12 (23), 4986-4991, 2012.
発明の概要
発明が解決しようとする課題
[0008] しかしながら、 微小な液滴を形成して加熱し、 蛍光等により光学的に検出 を行う場合には、 流路内部に気泡が発生することがあり、 これが検出の妨げ となり得る。
[0009] そこで、 本発明は、 微小な液滴を形成して加熱し、 光学的に検出を行う場 合に、 気泡の発生を抑制し、 検出効率を向上させることが可能なマイクロ流 体デバイスを提供することを目的とする。
また、 本発明は、 微小な液滴を形成して加熱し、 試料を光学的に検出する 〇 2020/175264 3 卩（：171? 2020 /006479
場合に、 微小な液滴を形成して加熱した場合の気泡の発生を抑制し、 試料の 検出効率を向上させることができる試料分析方法を提供することを目的とす る。
課題を解決するための手段
［0010］ 上記の目的を達成するために、 本発明は以下の構成を採用する。
［1］ 流路と、 前記流路中に形成された液滴保持部と、 を有し、 前記流路の 高さが〇 超 3〇 以下である、 マイクロ流体デバイス。
［2］ 前記流路は、 平面状の基板を有し、 前記液滴保持部が前記基板に存在 する孔である、 ［1］ に記載のマイクロ流体デバイス。
［3］ 前記液滴保持部が複数存在する、 ［1］ または ［2］ に記載のマイク 口流体デバイス。
［4］ 蓋部材を有し、 前記流路が、 前記蓋部材と前記基板とに挟まれた空間 である、 ［1］ 〜 ［3］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［ 5］ 前記液滴保持部の 1つあたりの容量が 1 0チ！_以上 1 0 0 !_以下で ある、 ［1］ 〜 ［4］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［6］ 前記液滴保持部の総容量が、 〇. 2 し以上 2 . 0 し以下である、
［1］ 〜 ［5］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［7］ 前記流路の容積に対する、 前記液滴保持部の総容量の比率が、 5 %以 上 4 0 %以下である、 ［1］ 〜 ［6］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体 デバイス。
［8］ 前記流路の高さに対する、 前記液滴保持部の深さの比率が、 3 %以上 1 5 0 %以下である、 ［2］ 〜 ［7］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体 デバイス。
［9］ 前記基板において前記液滴保持部が形成されている領域の単位面積に 対する、 前記液滴保持部の開口部の総面積の比率が、 2 3 %以上 9 0 %以下で ある、 ［2］ 〜 ［8］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［1 0］ ［1］ 〜 ［9］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスを用 いた試料分析方法であって、 試料を含有する水性液体を前記流路に供給し、 〇 2020/175264 4 卩（：171? 2020 /006479
前記液滴保持部に前記水性液体を保持させる試料供給工程と、 前記流路に封 止液を導入して前記流路内に存在する前記水性液体と置換し、 前記液滴保持 部に前記水性液体を封入する封止工程と、 前記液滴保持部において反応を起 こし、 検出のためのシグナルを発生させる反応工程と、 前記シグナルを検出 する検出工程と、 を備える試料分析方法。
［1 1］ 前記試料が、 生体分子である、 ［1 0］ に記載の試料分析方法。
［1 2］ 前記反応工程において、 前記マイクロ流体デバイスを加熱して前記 反応を起こし、 加熱される際の温度が 6 0 °〇以上である、 ［1 0］ または ［ 1 1］ に記載の試料分析方法。
［1 3］ 前記シグナルを画像撮影により検出する、 ［1 0］ 〜 ［1 2］ のい ずれか _項に記載の試料分析方法。
［1 4］ 前記シグナルが蛍光である、 ［1 0］ 〜 ［1 3］ のいずれか一項に 記載の試料分析方法。
［1 5］ 前記反応が等温反応である、 ［1 0］ 〜 ［1 4］ のいずれか一項に 記載の試料分析方法。
［001 1］ 本発明のもう一つの側面は、 以下の態様を包含する。
［1 6］ 流路と、 前記流路と接続している 1つまたは複数の液滴保持部と、 を有し、 前記流路の高さが〇 超 3 0 以下である、 マイクロ流体デバ イス。
［1 7］ さらに、 平板状の基板を有し、 前記流路は、 前記平板状の基板上に 位置し、 前記液滴保持部が前記基板上に存在する孔である、 ［1 6］ に記載 のマイクロ流体デバイス。
［1 8］ さらに、 蓋部材を有し、 前記流路が、 前記蓋部材と前記基板とに挟 まれた空間である、 ［1 7］ に記載のマイクロ流体デバイス。
［1 9］ 前記基板において前記液滴保持部が形成されている領域の単位面積 あたりの前記液滴保持部の開口部の総面積の比率が、 2 3 %以上 9 0 %以下で ある、 ［1 7］ または ［1 8］ に記載のマイクロ流体デバイス。
［2 0］ 前記液滴保持部が複数の液滴保持部である、 ［1 6］ 〜 ［1 9］ の \¥0 2020/175264 5 卩（：17 2020 /006479
何れか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［2 1］ 前記液滴保持部の 1つあたりの容積が 1 0 ！_以上 1 0 0 9 !_以下 である、 ［1 6］ 〜 ［2 0］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス
［2 2］ 前記液滴保持部の総容積が、 〇. 2 し以上 2 . 〇 し以下である 、 ［1 6］ 〜 ［2 1］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［2 3］ 前記流路の容積に対する、 前記液滴保持部の総容積の比率が、 5 % 以上 4 0 %以下である、 ［1 6］ 〜 ［2 2］ のいずれか一項に記載のマイク 口流体デバイス。
［2 4］ 前記流路の高さに対する、 前記液滴保持部の深さの比率が、 3 %以 上 1 5 0 %以下である、 ［1 6］ 〜 ［2 3］ のいずれか一項に記載のマイク 口流体デバイス。
［2 5］ ［1 6］ 〜 ［2 4］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス を用いた試料分析方法であって、 試料を含有する水性液体を前記流路に導入 し、 前記液滴保持部に前記水性液体を保持させることと、 前記流路に封止液 を導入して前記流路内に存在する前記水性液体と置換し、 前記液滴保持部に 前記水性液体を封入することと、 前記液滴保持部において反応を起こし、 検 出のためのシグナルを発生させることと、 前記シグナルを検出することと、 を備える試料分析方法。
［2 6］ 前記試料が、 生体分子である、 ［2 5］ に記載の試料分析方法。
［2 7］ 前記検出のためのシグナルを発生させることは、 前記マイクロ流体 デバイスを加熱して前記反応を起こすことを含み、 前記マイクロ流体デバイ スが加熱される際の温度が 6 0 °〇以上である、 ［2 5］ または ［2 6］ に記 載の試料分析方法。
［2 8］ 前記シグナルを前記マイクロ流体デバイスの画像撮影により検出す る、 ［2 5］ 〜 ［2 7］ のいずれか一項に記載の試料分析方法。
［2 9］ 前記シグナルが虽光である、 ［2 5］ 〜 ［2 8］ のいずれか _項に 記載の試料分析方法。 〇 2020/175264 6 卩（：171? 2020 /006479
［3 0］ 前記反応が等温反応である、 ［2 6］ 〜 ［2 9］ のいずれか一項に 記載の試料分析方法。
発明の効果
［0012］ 本発明のマイクロ流体デバイスによれば、 微小な液滴を形成し、 前記微小 な液滴を加熱する場合の気泡の発生を抑制することができる。
また、 本発明の試料分析方法によれば、 微小な液滴を形成し、 前記微小な 液滴を加熱し、 試料を光学的に検出する場合に、 前記微小な液滴を加熱する 場合の気泡の発生を抑制し、 試料の検出効率を向上させることができる。 図面の簡単な説明
［0013］ ［図 1］本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。
Figure imgf000008_0001
［図 4］基板の一部にのみ液滴保持部が形成されている領域が存在する、 本発明 の一実施形態に係るマイクロ流路デバイスの上面図である。
［図 5］本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す断面図である。 ［図 6］本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの使用時の状態を示す 図である。
［図 7］本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの使用時の状態を示す 図である。
［図 8］比較例に係るマイクロ流体デバイスの使用時の状態を示す図である。
［図 9八］本発明の一実施形態、 に係るマイクロ流体デ/《イスを用いて観察され た虽光画像を示す図である。
［図 98］比較例に係るマイクロ流体デ/《イスを用いて観察された蛍光画像を示 す図である。
発明を実施するための形態
［0014］ 本発明の一実施形態について、 図 1から図 5を参照して説明する。 本明細 書において、 各図面における寸法比は、 説明のため誇張している部分があり 、 必ずしも実際の寸法比とは一致しない。 〇 2020/175264 7 卩（：171? 2020 /006479
[0015] 図 1は、 本実施形態に係るマイクロ流体デバイス 1 を示す斜視図である。
図 2及び図 3は、 図 1の 13 _ 13線における断面図である。 マイクロ流体デバ イス 1は、 図 2及び図 3に示すように、 流路 3 5と液滴保持部 1 1 を備えて いる。 流路 3 5は、 蓋部材 2 0と、 基板 1 0とを一定の間隔で対向配置する ことにより形成されていてもよい。 この場合、 流路 3 5は、 蓋部材 2 0と基 板 1 0とに挟まれた空間となる。 基板 1 0と蓋部材 2 0の間には、 周縁部材 3 4が位置している。 基板 1 0と蓋部材 2 0に挟まれ、 且つ周縁部材 3 4に 囲まれた領域が流路 3 5である。 周縁部材 3 4は、 蓋部材 2 0と一体に形成 されていてもよい。
[0016] 液滴保持部 1 1は、 前記流路 3 5を形成する基板 1 0が平面状つまり平板 である場合は、 基板 1 0に存在する孔、 つまりウェルであることが好ましい 前記液滴保持部 1 1は、 図 3に示すように、 基板 1 0上に孔 （ウェル） が 複数存在するマイクロウェル 3 3であることが好ましい。 言い換えれば、 基 板 1 〇は、 複数のマイクロウェル 3 3を有することが好ましい。
以下、 本実施形態に係るマイクロ流体デバイス 1 を、 前記液滴保持部 1 1 が、 基板 1 〇上に孔 （ウェル） が複数存在するマイクロウェル 3 3であるマ イクロ流体デバイス 1 を例にして説明する。
[0017] マイクロウェルアレイ 3 0は、 底部層 3 1 と、 壁部層 3 2 （隔壁 3 2と記 載してもよい） と、 複数のマイクロウェル 3 3とを有してもよい。 底部層 3 1は、 基板 1 〇上に設けられている。 壁部層 3 2は、 底部層 3 1上に形成さ れている。 複数のマイクロウェル 3 3は、 底部層 3 1 と壁部層 3 2の厚さ方 向に形成された複数の貫通孔 3 2 3とで構成されている。 複数のマイクロウ ェル 3 3は、 壁部層 3 2においてアレイ状に形成されている。 基板 1 0と蓋 部材 2 0との間の内部空間 3において、 マイクロウェルアレイ 3 0と蓋部材 2 0との間、 言い換えれば壁部層 3 2の上面と蓋部材 2 0との間には隙間が 存在する。 この隙間は、 複数のマイクロウェル 3 3、 並びに第一孔 2 1およ び第二孔 2 2と連通する流路 3 5として機能する。 〇 2020/175264 8 卩（：171? 2020 /006479
[0018] 基板 1 0は、 電磁波を透過可能であってもよい。 ここで、 電磁波としては 、 X線、 紫外線、 可視光線および赤外線等が挙げられる。 基板 1 〇が電磁波 を透過可能であることにより、 マイクロ流体デバイス 1 に封入した試料と試 薬との反応により生じる蛍光又は燐光等を基板 1 0側から観察することがで きる。
基板 1 〇は、 所定の波長範囲の電磁波のみを透過可能であってもよい。 例 えば、 マイクロウェル内の試料の存在を、 可視光領域である 3 5 0〜 7 0 0 01の波長範囲にピークを有する蛍光を検出により判定する場合には、 少な くとも上記波長範囲の可視光を透過可能な基板を基板 1 〇として用いればよ い。
[0019] 基板 1 0を形成する材料としては、 例えば、 ガラス及び樹脂等が挙げられ る。 樹脂基板の材料としては、 例えば、 巳 3樹脂、 ポリカーボネート樹脂 、 〇〇〇 （シクロオレフィンコポリマー） 、 〇〇 （シクロオレフィンポリ マー） 、 アクリル樹脂、 ポリ塩化ビニル、 ポリスチレン樹脂、 ポリエチレン 樹脂、 ポリプロピレン樹脂、 ポリ酢酸ビニル、 巳丁 （ポリエチレンテレフ タレート） 及び 巳 （ポリエチレンナフタレート） 等が挙げられる。 これ らの樹脂は、 各種添加剤を含んでいてもよい。 添加剤の例としては、 酸化防 止剤、 撥水性を付与する添加剤、 親水性を付与する添加剤等が挙げられる。 樹脂基板は、 上記の樹脂のうち一種のみを含んでいてもよいし、 複数の樹脂 が混合されていてもよい。
[0020] 後述する試料分析方法では蛍光や燐光を利用する場合があるため、 基板 1
0としては、 自家蛍光を実質的に有しない材料を用いることが好ましい。 こ こで、 「自家蛍光を実質的に有しない」 とは、 基板が、 実験結果の検出に使 用する波長の自家蛍光を全く有しないか、 自家蛍光を有していても実験結果 の検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。 例えば、 検出対象 の蛍光に比べて 1 / 2以下、 好ましくは 1 / 1 0以下程度の自家蛍光であれ ば、 実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。
[0021 ] 基板 1 0の厚みは、 適宜決定することが出来るが、 試料分析において発せ 〇 2020/175264 9 卩（：171? 2020 /006479
られる蛍光や燐光を透過しやすくするため、 例えば 5ミリメートル （ ） 以下が好ましく、 2
Figure imgf000011_0001
以下がより好ましく、 1 . 6
Figure imgf000011_0002
以下がさらに好ま しい。 基板 1 0の厚みの下限値としては、 適宜決定することが出来るが、 マ イクロ流体デバイス 1の内部の圧力が上昇しても歪みが生じない厚みにする のがよい。 例えば、 0 . 1 111 111以上が好ましく、 〇. 2 01 01以上がより好ま しく、
Figure imgf000011_0003
以上がさらに好ましい。 基板 1 0の厚みの上限および下限 は、 任意に組み合わせることができる。 例えば、 基板 1 0の厚みは、 0 . 1 111
Figure imgf000011_0004
以下が好ましく、 〇. 2 01 01以上 2 01 01以下がより好ましく
、 〇. 4 01 01以上 1 . 6 01以下がさらに好ましい。
[0022] 底部層 3 1は、 マイクロウェル 3 3の底面を構成する。 したがって、 底面 に親水性を付与したい場合は親水性材料で底部層 3 1 を形成すればよい。 底 部層 3 1は、 底部層 3 1が電磁波を透過可能なように形成され、 基板 1 0側 からのマイクロウェル 3 3内の試料観察の妨げにならないようにすることが 好ましい。 また、 底面に疎水性を付与したい場合は疎水性材料で底部層 3 1 を形成すればよい。 底部層 3 1は、 基板 1 0側からのマイクロウェル 3 3内 の試料観察の妨げにならないようにすることが好ましい。 また、 底部層 3 1 には、 自家蛍光を実質的に有しない材料を用いることが好ましい。 ここで、 基板 1 〇と底部層 3 1 とが一体化されたものを単に基板と称することもでき る。
[0023] なお、 マイクロウェル 3 3の底面の特性が基板 1 0の特性と同じで問題な い場合は、 底部層 3 1 を設けずに、 基板 1 0上に直接壁部層 3 2が形成され てもよい。 従って、 その場合、 基板 1 0の表面と壁部層 3 2の貫通孔 3 2 3 とでマイクロウェル 3 3が構成される。
[0024] 壁部層 3 2は、 厚さ方向に見た状態においてアレイ状に設けられた複数の 貫通孔 3 2 3を有する。 各貫通孔 3 2 3の内面は、 各マイクロウェル 3 3の 内壁面を構成する。
[0025] 壁部層 3 2を形成する材料としては、 基板 1 0を形成する材料と同様の樹 脂等を用いることができるが、 樹脂に所定の波長の電磁波を吸収する有色成 〇 2020/175264 10 卩（：171? 2020 /006479
分を混合した材料を用いてもよい。
樹脂材料としては、 マイクロウヱル 3 3に求める特性等を考慮して、 樹脂 の構成成分の分子が親水性基を有する親水性樹脂と、 樹脂の構成成分の分子 が疎水性基を有する疎水性樹脂とのいずれも用いることができる。
[0026] 親水性基としては、 例えば、 ヒドロキシル基、 カルボキシル基、 スルホン 基、 スルホニル基、 アミノ基、 アミ ド基、 エーテル基、 およびエステル基等 が挙げられる。 親水性樹脂としては、 例えば、 シロキサンポリマー；エポキ シ樹脂；ポリエチレン樹脂；ポリエステル樹脂；ポリウレタン樹脂；ポリア クリルアミ ド樹脂；ポリビニルピロリ ドン樹脂；ポリアクリル酸共重合体等 のアクリル樹脂；カチオン化ポリビニルアルコール、 シラノール化ポリビニ ルアルコール、 スルホン化ポリビニルアルコール等のポリビニルアルコール 樹脂；ポリビニルアセタール樹脂；ポリビニルプチラール樹脂；ポリエチレ ンポリアミ ド樹脂；ポリアミ ドポリアミン樹脂； ヒドロキシメチルセルロー ス、 メチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリエチレンオキサイ ド、 ポ リエチレンオキサイ ドーポリプロピレンオキサイ ド共重合体等のポリアルキ レンオキサイ ド誘導体；無水マレイン酸共重合体；エチレンー酢酸ビニル共 重合体；スチレンーブタジエン共重合体；および上記の樹脂の組み合わせ等 の中から、 適宜選択して使用することができる。
疎水性樹脂の例としては、 例えば、 ノボラック樹脂； アクリル樹脂； メタ クリル樹脂；スチレン樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリオ レフィン樹脂；ポリアミ ド樹脂；ポリイミ ド樹脂；ポリアセタール樹脂；ポ リカーボネート樹脂；ポリフエニレンスルフィ ド樹脂；ポリスルフォン樹脂 ; フッ素樹脂；シリコーン樹脂；ユリヤ樹脂； メラミン樹脂； グアナミン樹 月旨； フエノール樹脂；セルロース樹脂；および上記の樹脂の組み合わせ等の 中から、 」 丨 3 [¾ 3 2 5 7 _ 1 9 9 9に規定された静滴法に準じて測定し た接触角が 7 0度以上である材料を適宜選択して使用することができる。 す なわち、 本明細書における疎水性とは、 」 1 3 [^ 3 2 5 7 - 1 9 9 9に規 定された静滴法に準じて測定した接触角が 7 0度以上であることを意味する \¥0 2020/175264 1 1 卩（：17 2020 /006479
。 なお、 」 I 3 3 2 5 7 - 1 9 9 9に規定された静滴法に代えて、 八 3 丁1\/1 0 5 7 2 5 - 1 9 9 7に準拠した方法で接触角を測定することもでき る。
[0027] 親水性樹脂および疎水性樹脂のいずれも、 熱可塑性樹脂であっても熱硬化 性樹脂であってもよい。 さらに、 電子線やリ V光等の活性エネルギー線によ り硬化する樹脂であってもよく、 エラストマーであってもよい。
樹脂材料としてフォトレジストを用いると、 フォトリソグラフィにより壁 部層 3 2に多数の微細な貫通孔 3 2 3を精度良く形成することができる。 フォトリソグラフィを用いる場合、 使用するフォトレジストの種類の選択 、 塗布、 および露光 （感光） 、 および不要なフォトレジストの除去の方法に は公知の手段を適宜選択することができる。
レジストを用いない場合は、 例えば射出成型等により壁部層 3 2を形成す ることができる。
[0028] 有色成分としては、 有機質または無機質の顔料が例示できる。 具体的には 、 黒色顔料としては、 力ーボンブラック、 アセチレンブラック、 および鉄黒 等が挙げられる。 黄色顔料としては、 クロム黄、 亜鉛黄、 黄土、 ハンザイエ 口一、 パーマネントイエロー、 およびベンジンイエローが挙げられる。 橙色 顔料としては、 オレンジレーキ、 モリブデンオレンジ、 およびベンジンオレ ンジが挙げられる。 赤色顔料としては、 べんがら、 カドミウムレッ ド、 アン チモン朱、 パーマネントレッ ド、 リソールレッ ド、 レーキレッ ド、 プリリア ントスカーレッ ト、 およびチオインジゴレッ ドが挙げられる。 青色顔料とし ては、 群青、 コバルトブルー、 フタロシアニンブルー、 フエロシアンブルー 、 およびインジゴが挙げられる。 緑色顔料としては、 クロムグリーン、 ピリ ジアンナフトールグリーン、 およびフタロシアニングリーン等が挙げられる
[0029] また、 壁部層 3 2を射出成型等で形成する場合、 樹脂中に分散する顔料だ けでなく、 樹脂中に溶解する各種染料も有色成分として用いることが可能で ある。 染料は各種染料法より例示できる。 具体的には、 直接染料、 塩基性染 〇 2020/175264 12 卩（：171? 2020 /006479
料、 カチオン染料、 酸性染料、 媒染染料、 酸性媒染染料、 硫化染料、 建染染 料、 ナフトール染料、 分散染料、 および反応染料などが挙げられる。 特に、 樹脂を染色する場合には、 分散染料が選択されることが多い。
[0030] 蓋部材 2 0 （単に蓋 2 0と記載してもよい） は、 板状またはシート状に形 成された部材である。 蓋部材 2 0は、 基板 1 0と離間した状態で対向してい る。 言い換えれば、 蓋部材 2 0は、 複数のマイクロウェル 3 3を覆っている 。 流路 3 5は、 蓋部材 2 0と、 マイクロウェルアレイ 3 0と、 周縁部材 3 4 に囲まれる領域である。 流路 3 5は、 複数のマイクロウェル 3 3の開口と接 続しており、 複数のマイクロウェル 3 3の上方に位置する。
[0031 ] 蓋部材 2 0は、 厚さ方向に貫通する第一孔 2 1および第二孔 2 2を有する 。 蓋部材 2 0の平面視において、 第一孔 2 1および第二孔 2 2は、 1つまた は複数の前記液的保持部を挟むように位置している。 第一孔 2 1および第二 孔 2 2は、 完成したマイクロ流体デバイス 1 において、 マイクロウェルアレ イ 3 0と流路 3 5を含む内部空間 3と連通する。 第一孔 2 1および第二孔 2 2は、 それぞれ内部空間 3に流体を供給する入口および流体が排出される出 口として機能する。
蓋部材 2 0を形成する材料や蓋部材 2 0の厚みについては、 基板 1 0と同 様とすることができる。
蓋部材 2 0が電磁波透過性を有する場合は、 電磁波透過性については適宜 設定できる。 例えば、 後述する電磁波照射工程を蓋部材 2 0側から行わない 場合は、 蓋部材 2 0は電磁波を透過可能でなくてもよい。
[0032] 流路 3 5の高さ は、 図 2に示すように、 基板 1 0の流路 3 5側の最上面 （基板 1 0の孔が形成されていない部分における流路 3 5側の面） から蓋部 材 2 0の流路 3 5側の面までの高さとなる。 マイクロ流体デバイス 1が壁部 層 3 2を備える場合は、 図 3に示すように、 壁部層 3 2の流路 3 5側の面 3 2匕から蓋部材 2 0の流路側の面 2 0 3までの高さとなる。
[0033] 流路 3 5の高さ IIは、 〇 〇!超 5 0 〇!未満であり、 〇 超 3 0 以 下が好ましく、 2 以上 3〇 以下が好ましく、 3 以上2 5 以 〇 2020/175264 13 卩（：171? 2020 /006479
下が好ましく、 5 以上 2 0 以下がより好ましく、 8 以上 1 8 111以下が特に好ましい。 流路の高さが、 0 超 5 0 01未満であることに より、 液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） に形成された液滴を加熱した 際に、 気泡の発生が抑制される。 よって、 気泡により蛍光等の検出が妨げら れることなく、 試料を蛍光等により検出することができる。
[0034] 流路の高さ IIは、 気泡の発生を抑制する観点からは、 5 0 未満であれ ば小さい方が好ましいが、 流路の高さ が 2 よりも小さい場合は、 試料 を流路内に充填することが簡便にはできなくなる可能性がある。 流路の高さ が 2 以上であると、 試料を含む水性液体を流路に充填する際の圧力が上 昇しすぎることがなく、 簡便に前記水性液体を充填することができる。 流路 の高さ IIが 5 0 以上であると、 液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） に形成された液滴を加熱した際に、 気泡が発生しやすくなり、 この気泡の発 生により、 試料を蛍光等により検出することが困難となる。 言い換えれば、 流路の高さ 1*1が 5〇 未満であると、 液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） に形成された液滴を加熱しても、 気泡が発生し難く、 試料を蛍光等によ り正確に検出することができる。 その結果、 流路の高さ IIが 5 0 未満で あると、 マイクロ流体デバイスの良品率向上につながる。 また、 流路の高さ IIが 5〇 未満であると、 試料の検出効率が向上するため、 検出操作の成 功率が向上する。
[0035] 流路 3 5の高さは、 基板 1 0の流路 3 5側の最上面 （基板 1 0の孔が形成 されていない部分における流路 3 5側の面） の複数個所における高さの平均 値であってもよいし、 代表的な個所における高さであってもよい。 前記代表 的な個所は、 基板 1 0の任意の位置を選択することができる。 例えば、 流路 3 5を形成している基板 1 0の中心であってもよいし、 流路 3 5を形成して いる基板 1 〇の最先端と中心を結ぶ線の最先端側から 1 0 %〜 5 0 %の位置 であってもよい。 測定のしやすさも考慮すると、 蓋部材 2 0を上面から見た ときの第一孔 2 1の中心と第二孔 2 2の中心とを結ぶ仮想的な線の中心にお ける仮想的な直交線が周縁部材 3 4と交わる点における位置を、 代表的な個 〇 2020/175264 14 卩（：171? 2020 /006479
所とするのが好ましい。
また、 マイクロ流体デバイス 1が壁部層 3 2を備える場合は、 壁部層 3 2 の流路 3 5側の面 3 2 3の複数個所における高さの平均値であってもよいし 、 代表的な個所における高さであってもよい。 前記代表的な個所は、 壁部層 3 2の任意の位置を選択することができる。 例えば、 前記代表的な個所は、 壁部層 3 2の中心であってもよい。 また、 前記代表的な箇所は、 壁部層 3 2 の流路 3 5に面している側の最先端と中心を結ぶ線の最先端側から 1 0 %〜 5 0 %の位置であってもよい。 測定のしやすさも考慮すると、 第一孔 2 1 と 第二孔 2 2とを結ぶ仮想的な線の中心における仮想的な直交線が周縁部材 3 4と交わる点における位置を、 代表的な個所とするのが好ましい。
ここで、 最先端とは、 マイクロ流体デバイス 1の第一孔 2 1 と第二孔 2 2 とを結ぶ仮想的な線に平行な方向 （長手方向という） における端のことを言 う。 端とは、 後述する周縁部材 3 4と接する部分のことを言う。
[0036] さらに、 流路 3 5を形成する蓋部材 2 0の流路側の面は平滑であることが 好ましい。 前記蓋部材 2 0の流路 3 5側の面が平滑であることにより、 液滴 保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） 中の液滴を加熱した際に、 気泡の発生を より抑制することができる。 本明細書において、 平滑であるとは、 光学顕微 鏡で観察した際の凹凸が小さい、 すなわち微視的な凹凸が小さいことを意味 する。 本明細書において、 平滑であるとは、 蓋部材 2 0が周縁部材 3 4の内 側において湾曲していないことを意味しない。 本実施形態において蓋部材 2 0は周縁部材 3 4の内側において湾曲していてもよい。 例えば、 蓋部材 2 0 は、 蓋部材 2 0の主面の中心近傍において、 基板 1 0側に突出するように湾 曲していてもよい。 つまり、 周縁部材 3 4と接する部分の流路 3 5は、 蓋部 材 2 0の主面の中心近傍における流路 3 5より高くなっていてもよい。 ここ で、 蓋部材 2 0の主面の中心とは、 蓋部材 2 0の主面の幾何中心とする。
[0037] 本明細書において、 マイクロウェルとは、 容積が 1 0ナノリッ トル （门！_ ） 以下のウェルを意味する。 液滴保持部 1 1の容積をマイクロウェルの容積 にすることにより、 デジタル 〇 およびデジタル I 〇八反応等の微小空間 〇 2020/175264 15 卩（：171? 2020 /006479
内で行う反応を好適に行うことができる。 上述した手法により、 例えば遺伝 子の変異検出等を行うことができる。
液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） の容積は、 特に限定されるもので はないが、 1 0フェムトリツ トル （干！_） 以上 1 0 0ピコリツ トル （ ！_） 以下が好ましく、 1 0干！_以上 5 !_以下がより好ましく、 1 0干！_以上 2 !_以下が最も好ましい。 このような範囲に容積を設定すると、 後述する試 料分析の際に、 一つの液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） に、 1から数 個だけ生体分子または担体を収容するのに適している。
[0038] マイクロウェル 3 3の形状は、 容積が上述した範囲内である限り特に制限 はない。 したがって、 例えば、 円筒形、 複数の面により構成される多面体 （ 例えば、 直方体、 六角柱、 および八角柱等） 、 逆円錐形、 および逆角錐形 （ 逆三角錐形、 逆四角錐形、 逆五角錐形、 逆六角錐形および、 七角以上の逆多 角錐形） 等であってもよい。
さらに複数のマクロウェル 3 3の形状は、 上述の形状を二つ以上組み合わ せたような形状であってもよい。 例えば、 複数のマクロウェル 3 3の一部が 円筒形であり、 残りが逆円錐形であってもよい。 また、 マイクロウェル 3 3 が逆円錐形または逆角錐形の場合、 円錐または角錐の底面が流路 3 5とマイ クロウェル 3 3とを連通する開口部となる。 この場合、 逆円錐形または逆角 錐形の頂上から一部を切り取った形状を用いて、 マイクロウェル 3 3の底部 を平坦にしてもよい。 他の例として、 マイクロウェル 3 3の底部が開口部に 向かって突出した曲面形状であってもよく、 マクロウェル 3 3の底部が窪ん だ曲面形状であってもよい。
[0039] 基板 1 0の液滴保持部が形成されている領域の単位面積 （通常は 1 〇! 2） あたりの液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） の開口部の総面積の比率は 、 2 3 %以上 9 0 %以下が好ましく、 2 5 %以上 9 0 %以下がより好ましく 、 3 0 %以上 9 0 %以下がより好ましく、 3 5 %以上 8 0 %以下がより好ま しく、 3 9 %以上 7 6 %以下がより好ましく、 3 9 %以上 6 4 %以下がより 好ましい。 基板 1 〇の液滴保持部が形成されている領域の単位面積あたりの 〇 2020/175264 16 卩（：171? 2020 /006479
液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） の開口部の総面積の比率が、 上述の 好ましい範囲にあると、 流路における気泡の発生を効果的に抑制することが できる。 これは、 液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） 内の水性液体を加 熱した際に、 開口部の総面積が大き過ぎないことで、 流路 3 5内の封止液に 加わる圧力をある程度抑制できるからであると考えられる。
[0040] 以下、 基板 1 0の液滴保持部が形成されている領域の単位面積あたりの液 滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） の開口部の総面積の比率を、 「開口面 積比率」 ともいう。
[0041 ] 液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） が形成されている領域が基板 1 0 の全面に渡って存在する場合には、 基板 1 〇の液滴保持部 1 1 （マイクロウ ェル 3 3） の開口部の総面積は、 基板 1 0の周縁部材で区画された領域の面 積と同じであると近似してよい。 液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） が 形成されている領域は、 図 4に示すように、 基板 1 0の一部のみに存在して いてもよい。 ここで、 液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） が形成されて いる領域とは、 図 4に示すように、 基板 1 0を垂直方向から見たときに、 液 滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） 同士の間隔が一定間隔を保っている領 域を言う。 この場合、 基板 1 〇の液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） の 開口部の総面積は、 液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） が形成されてい る領域の最外部に位置する複数の液滴保持部 1 1 （マイクロウヱル 3 3） の 開口部の中心を通る仮想線で囲まれる領域の面積と近似してよい。 一定間隔 であるとは、 厳密に一定間隔である必要はなく、 当然に、 製造上の誤差が許 容される。
[0042] 基板 1 0の周縁部材で区画された領域の面積に対する液滴保持部 1 1が形 成されている領域の面積が大きいほど、 水性液体が蒸発しやすくなり、 気泡 が発生しやすくなる。 しかし本実施形態のように流路 3 5の高さ IIを 5〇 未満とすると、 流路 3 5における気泡の発生を効果的に抑制することがで きる。
[0043] 壁部層 3 2が存在する場合には、 壁部層 3 2の厚さは、 液滴保持部 1 1 （ 〇 2020/175264 17 卩（：171? 2020 /006479
マイクロウェル 3 3） の深さを規定する。
マイクロウェルが円筒形の場合、 生体分子を含む水性液体 （試料） を封入 する目的のためには、 壁部層 3 2の厚さは、 例えば 1 O n m以上1 〇〇 以下、 好ましくは
Figure imgf000019_0001
より好ましくは 1 以上 3 0 以下、 更に好ましくは 2 〇!以上 1 5 以下、 更に好ましくは 3 以上 1 0 以下の範囲内とすることができる。
マイクロウェル 3 3の各部寸法は、 収容する水性液体の量や、 生体分子を 付着させたビーズ等の担体の大きさ等を考慮して、 1つのマイクロウェルに 1つ、 もしくは数個の生体分子が収容されるように適宜決定すればよい。
[0044] 流路 3 5の高さ IIに対する液滴保持部 1 1 （マイクロウヱル 3 3） の深さ の比率は、 3 %以上 1 5 0 %以下が好ましく、 より好ましくは 1 0 %以上 1 〇〇 %以下、 更に好ましくは 1 2 %以上 7 5 %以下、 更に好ましくは 1 5 % 以上 7 5 %以下、 更に好ましくは 3 3 %以上 7 5 %以下、 更に好ましくは 3 3 %以上 5 0 %以下である。 この範囲にあることにより、 気泡の発生の抑制 と、 検出対象の液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） への導入のしやすさ をより両立させることができる。
[0045] マイクロウェルアレイ 3 0に設けるマイクロウェル 3 3の数や密度は適宜 設定できるが、 マイクロウェル 3 3の総容積が、 例えば〇. 2 し以上 2 . 〇 し以下、 好ましくは〇. 5 し以上·！ . 5 し以下となるように、 マイ クロウェル 3 3の数や密度を設定することが好ましい。
また、 マイクロウェル 3 3の総容積は、 流路 3 5の容積に対して、 好まし くは 5 %以上 4 0 %以下、 より好ましくは 8 %以上 3 0 %以下、 特に好まし くは 1 0 %以上 2 0 %以下となる容積が好ましい。 流路 3 5の容積に対する マイクロウェル 3 3の総容積の割合が、 好ましい範囲にあることで、 マイク ロウェル 3 3中の液滴を加熱した場合の気泡の発生をより抑制することがで きる。
[0046]
Figure imgf000019_0002
の数は、 例えば 1万以上 1 0 0 0万以 下であり、 好ましくは 1 0万以上 5 0 0万以下であり、 更に好ましくは 1 0 〇 2020/175264 18 卩（：171? 2020 /006479
万以上 1 0 0万以下である。 本明細書において 1 〇 01 2あたりのマイクロウェ ル 3 3の数をマイクロウェルの密度と呼ぶことがある。 マイクロウェルの密 度がこの範囲内であると、 所定数のウェルに試料である水性液体を封入させ る操作が容易である。 また、 マイクロウェルの密度がこの範囲内であると、 実験結果を解析するためのウェルの観察も容易である。 例えば、 セルフリー 0 の変異を検出する場合において、 野生型口 に対する検出対象であ る変異
Figure imgf000020_0001
八の存在割合が〇. 0 1 %程度である場合、 例えば、 1 0 0万〜
2 0 0万個程度のマイクロウェルを使用することが好適である。
図 1では、 複数のマイクロウェル 3 3が一列に並んだ一次元アレイの例を 示している。 しかしながら、 上述のように多数のマイクロウェルを設ける場 合、 複数のマイクロウェルを二次元に配列した二次元アレイを用いてもよい
[0047] マイクロウェルアレイの周囲には、 平面視枠状の周縁部材 3 4が配置され ている。 マイクロ流体デバイス 1の厚さ方向における周縁部材 3 4の寸法は 、 壁部層 3 2よりも大きい。 周縁部材 3 4は、 蓋部材 2 0を支持することに より蓋部材 2 0とマイクロウェルアレイとの間に隙間を確保し、 流路 3 5を 維持している。 つまり、 流路 3 5は、 マイクロウェルアレイ 3 0と蓋部材 2 0に挟まれ、 且つ周縁部材 3 4により囲まれた領域である。
周縁部材 3 4の材質等に特に制限はないが、 例えばシリコーンゴム又はア クリル発泡体から形成される芯材フィルムの両面にアクリル系粘着剤が積層 された両面粘着テープ等が挙げられる。
なお、 周縁部材 3 4は蓋部材 2 0と一体成形されていてもよい。 その場合 、 周縁部材 3 4は、 蓋部材 2 0の段差部となり、 前記段差部により蓋部材 2 0とマイクロウェルアレイとの間に隙間を確保し、 流路 3 5を維持している
[0048] 上記のように構成されたマイクロ流体デバイス 1は、 例えば以下の手順で 製造することができる。
まず、 基板 1 0を準備し、 基板 1 0の面上に壁部層 3 2となる壁部用樹脂 〇 2020/175264 19 卩（：171? 2020 /006479
層を形成する。 底部層 3 1 を設ける場合は、 壁部用樹脂層の形成前に底部層 3 1 を形成する。 底部層 3 1 を設けない場合でも、 必要に応じて基板 1 0の 面上に基板 1 0と壁部用樹脂層との密着性を高めるアンカー層等を設けても よい。
[0049] 壁部樹脂層は、 樹脂材料に有色成分を混合した材料により形成されてもよ い。 樹脂材料がレジストである場合、 樹脂材料と有色成分の総質量に対する 有色成分の含有率は、 例えば〇. 5質量％ ( 01 3 3 3 %) 以上 6 0 111 3 3 3 %以下とすることができる。 含有率に関して、 好ましくは 5 01 3 3 3 %以上 5 5 01 8 3 3 %以下であり、 更に 2 0 01 3 3 3 %以上 5 0 01 8 3 3 %以下が さらに好ましい。 樹脂材料と有色成分の総質量に対する有色成分の含有率は 、 レジストに含まれる感光成分等の割合を考慮して所望するパターンが構築 可能となるように、 適宜設定することができる。 また、 有色成分が顔料であ る場合、 形成するマイクロウェルに対して上述した所定の条件を満たすよう に顔料の粒子径を設定し、 準備する。 顔料と共に、 樹脂材料に分散剤が適宜 添加されてもよい。
形成された壁部樹脂層が樹脂材料に有色成分を混合した材料から形成され ている場合、 壁部樹脂層は、 壁部樹脂層に含有される有色成分に基づいた色 彩を有する。
[0050] 次に、 形成された壁部樹脂層に貫通孔 3 2 3を形成する。 上述したように 、 フォトリソグラフィを用いると、 貫通孔 3 2 3を簡便かつ精度よく形成す ることができる。 壁部樹脂層を射出成型等により形成する場合は、 壁部樹脂 層の形成と貫通孔の形成とを同一のプロセスで行うことができる。 この他、 バターンマスクを用いたエッチング等によっても貫通孔 3 2 3の形成が可能 である。
貫通孔 3 2 3が形成されると、 壁部樹脂層が壁部層 3 2となり、 マイクロ ウェルアレイ 3 0が完成する。
[0051 ] その後、 マイクロウェルアレイ 3 0の周囲に周縁部材 3 4を配置してから 蓋部材 2 0を周縁部材 3 4上に配置する。 基板 1 0、 周縁部材 3 4、 および 〇 2020/175264 20 卩（：171? 2020 /006479
蓋部材 2 0を一体に接合すると、 マイクロ流体デ/《イス 1が完成する。 流路 3 5は、 周縁部材 3 4により、 蓋部材 2 0と基板 1 0との間に形成される。 接合方法は、 特に限定されるものではないが、 例えば、 接着剤による接合、 両面テープを用いた接合、 レーザー溶着による接合、 および熱溶着による接 合等が挙げられる。 マイクロ流体デバイス 1 を用いる試料分析方法が加熱反 応を含む場合、 加熱に伴う内部空間 3の圧力上昇に十分耐えられることから 、 接着剤による接合、 両面テープを用いた接合、 レーザ 溶着による接合が 好ましい。
[0052] また、 マイクロ流体デバイス 1は、 基板 1 0と壁部層 3 2とが一体成形さ れ、 周縁部材 3 4と蓋部材 2 0とが一体成形されていてもよい。 図 5に、 基 板 1 0と壁部層 3 2とが一体成形され、 周縁部材 3 4と蓋部材 2 0とが一体 成形されているマイクロ流体デバイス 2を示す。 マイクロ流体デバイス 2は 、 壁部層 3 2と一体成形された基板 1 0を、 周縁部材 3 4と一体成形された 蓋部材 2 0に配置し、 周縁部材 3 4と蓋部材 2 0とが一体成形されることに より形成された段差部を、 壁部層 3 2と一体成形された基板 1 0に接合する ことにより、 製造することができる。 流路 3 5は、 蓋部材 2 0に形成された 段差部により、 蓋部材 2 0と基板 1 0との間に形成される。
基板 1 0と壁部層 3 2とが一体成形され、 周縁部材 3 4と蓋部材 2 0とが 一体成形されている以外のマイクロ流体デバイス 2の構成は、 上述のマイク 口流体デバイス 1 と同じである。
[0053] 他の態様として、 基板 1 0と壁部層 3 2を別の要素として有し、 周縁部材
3 4と蓋部材 2 0が一体形成されているマイクロ流体デバイスであってもよ い。 この場合においても、 周縁部材 3 4と蓋部材 2 0が一体形成されている 以外のマイクロ流体デバイスの構成は、 上述のマイクロ流体デ/《イス 1 と同 じである。
[0054] 次に、 本実施形態に係るマイクロ流体デバイス 1 を用いた、 本実施形態の 試料分析方法について図 6および図 7を参照して説明する。
本実施形態の試料分析方法は、 本実施形態に係るマイクロ流体デバイス 1 〇 2020/175264 21 卩（：171? 2020 /006479
を用いた試料の分析方法であって、
試料を含有する水性液体を流路 35に導入し、 前記液滴保持部 1 1 に前記 水性液体を保持させることと、
前記流路 35に封止液を導入して前記流路 35内に存在する前記水性液体 と置換し、 前記液滴保持部 1 1 に前記水性液体を封入することと、
前記液滴保持部 1 1 において反応を起こし、 検出のためのシグナルを発生 させることと、
前記シグナルを検出することと、
を備える試料分析方法である。
[0055] ここで、 水性液体とは、 試料のほかに、 水、 緩衝液および検出反応試薬等 を含むことができる。 また、 水性液体中には、 酵素を含有させてもよい。 例 えば、 試料が核酸である場合には、 P C R法、 I C A法、 L A M P法 （商標 登録、 L o o p— Me d i a t e d I s o t h e r m a l A m p I i f
1 031 I 〇 11） % 丁 3 1\/13 |·!法 （登録商標） 、 又は蛍光プローブ法等を 用いることができる。 例えば、 試料がタンパク質の場合には、 巳 1_ 丨 3八法 （登録商標） 等を用いることができる。 さらに、 水性液体中には、 界面活性 剤等の添加物を含有させてもよい。
[0056] 緩衝液としては、 例えば丁 「 丨
Figure imgf000023_0001
I緩衝液、 酢酸緩衝液、 及びリン 酸緩衝液等が挙げられる。
酵素としては、 例えば口 八ポリメラーゼ、
Figure imgf000023_0002
八ポリメラーゼ、 逆転写 酵素、 及びフラップエンドヌクレアーゼ等が挙げられる。
界面活性剤としては、 例えば丁 6 6 n 20 （ポリオキシエチレンソル ビタンモノラウラートともいう） 、 丁 「 丨 1: 〇门一X 1 00 （ポリエチレン グリコールモノー 4—オクチルフエニルエーテル （11 =約 1 0） ともいう）
、 グリセロール、 オクチルフエノールエトキシレート、 及びアルキルグリコ シド等が挙げられる。
[0057] 本実施形態のマイクロ流体デバイスは、 例えば遺伝子の変異検出等におい て、 封入した水性液体の温度を変化させる場合も、 ウエル内に水性液体を好 〇 2020/175264 22 卩（：171? 2020 /006479
適に保持することができる。 変化させる温度の範囲即ち温度変化の下限値か ら上限値の範囲は、 例えば〇°〇~ 1 0 0。〇であり、 好ましくは 2 0 °〇~ 1 0 0 °〇であり、 更に好ましくは 2 0 °〇~ 9 0 °〇であり、 更に好ましくは 2 0 °〇 〜 8 0 °〇であり、 更に好ましくは 2 0 °〇~ 7 0 °〇である。 ウェルに封入した 水性溶液がこの範囲内であると、
Figure imgf000024_0001
反応や丨 0八反応等の微小空間内で 行う反応を好適に行うことができる。
本実施形態のマイクロ流体デバイスは、 流路の高さ IIが 5 0 未満であ ることから、 上記温度範囲で液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） を加熱 した場合も、 気泡の発生を抑制することができる。
［0058］ 本実施形態に係るマイクロ流体デバイス 1 を使用して分析する試料として は、 例えば血液等の生体から採取した試料が挙げられる。 また、 試料分析に より検出する検出対象は、 試料に含まれる口 を錶型とした
Figure imgf000024_0002
産物等 であってもよいし、 人工的に合成された化合物 （例えば、 試料である口 八 を摸した人工的に合成された核酸） 等であってもよい。 例えば、 生体分子で ある〇 八を検出対象とする場合、 ウェルは、 口 八が 1分子入るような形 状および大きさを有していてもよい。
［0059］ 前記試料には、 口 八、 ［¾ 八、 〇1 丨 ［¾ 八、
Figure imgf000024_0003
タンパク質、 ま たは脂質等の生体分子等が含まれてよい。 脂質には、 脂質二重膜構造体が含 まれてよい。 また、 生体分子には、 治療目的でなくヒトから採取された細胞 や、 動物から採取された細胞、 微生物、 または細菌等が含まれてもよい。 検 出対象が生体分子である場合には、 本発明の一態様における試料分析方法は 、 生体分子検出方法であるということができ、 生体分子検出方法に用いられ る本発明の一態様におけるマイクロ流体デバイスは、 生体分子検出デバイス であるということができる。
［0060］ 以下、 試料分析方法の詳細について説明する。 準備工程として、 マイクロ ウェルに封入する試料を含有する水性液体を調製する。 試料を含有する水性 液体は、 検出対象を含有する水が主な溶媒である液体であり、 例えば、 生体 試料を錶型とし、 検出試薬として 3丫巳［¾ ◦ 「 6 6 nを含む 反応溶 〇 2020/175264 23 卩（：171? 2020 /006479
液や、 アレルプローブ、 丨 〇八オリゴ、 巳 1\1— 1、 および蛍光基質等を含 む丨 〇 反応溶液等が挙げられる。 調製においては、 界面活性剤を添加して 、 試料をよりマイクロウェル内に入りやすく してもよい。 また、 検出対象を 特異的に認識するビーズを添加して、 検出対象を捕捉させておいてもよい。 検出対象は、 ビーズ等の担体に直接または間接的に結合せず、 水性液体中に 浮遊していてもよい。
[0061 ] 次に、 シリンジ等を用いて、 調製した試料を含有する水性液体 1 0 0を第 一孔 2 1から流路 3 5に導入し、 前記液滴保持部 1 1 に試料を含有する水性 液体を保持させる （試料供給工程ともいう） 。 供給された試料を含有する水 性液体 1 〇〇は、 図 6に示すように、 各マイクロウェル 3 3内および流路 3 5に充填される。 流路 3 5内の気体は、 試料供給工程の前に、 脱気操作によ り予め抜いておく。 この脱気操作は、 流路 3 5内にバッファを満たすことに より行ってもよい。 バッファとしては、 例えば水、 緩衝液を含む水、 界面活 性剤を含む水、 及び、 緩衝液及び界面活性剤を含む水等が挙げられる。
[0062] 次に、 前記試料を含有する水性液体 1 0 0を液滴保持部 1 1 （マイクロウ ェル 3 3） に封入する封入工程を行う。 封入工程の前に、 水性液体に含有さ れる試料内の検出対象に蛍光等の標識を付けておいてもよい。 蛍光標識処理 は、 試料供給工程の前の、 例えば試料の調製時に行ってもよいし、 試料供給 工程後に、 蛍光標識を流路 3 5に導入して行ってもよい。
封入工程では、 シリンジ等を用いて、 封止液 1 1 0を第一孔 2 1から流路 3 5に供給する。 供給された封止液 1 1 0は流路 3 5内を流れ、 図 7に示す ように、 流路 3 5内に存在する試料を含有する水性液体 1 0 0を第二孔 2 2 に向かって押す。 そして、 封止液 1 1 0は、 流路 3 5内に充填されていた水 性媒体 1 0 0と置換され、 流路 3 5は封止液 1 1 0で充填される。 その結果 、 前記試料を含有する水性液体 1 〇〇は、 各マイクロウェル 3 3内のみに、 互いに独立した状態で配置され、 試料の封入が完了する。
[0063] 本明細書において封止液 1 1 0とは、 マイクロウェルアレイ 3 0の各マイ クロウェル 3 3に導入された水性液体同士が互いに混合しない状態に隔離す 〇 2020/175264 24 卩（：171? 2020 /006479
るために用いる液体を意味し、 例えば、 オイル類等が挙げられる。 オイルと しては、 例えばシグマ社製の商品名 「 〇4 0」 や、 3 IV!社製の商品名 「1~1 巳_ 7 5 0 0」 、 〇 反応等に用いられるミネラルオイル等を用いるこ とができる。
封止液 1 1 0は、 壁部層 3 2の材質に対する接触角が 5度以上 3 0度以下 であることが好ましい。 封止液 1 1 0の接触角がこの範囲であると、 各マイ クロウエル 3 3に好適に試料を封入することができる。 封止液 1 1 0の接触 角は、 例えば、 」 丨 3
Figure imgf000026_0001
、 水の代わりに封止液 1 1 0を用いて測定すればよい。 なお、 」 丨 3
Figure imgf000026_0002
2 5 7 - 1 9 9 9に規定された静滴法に代えて、 八3丁1\/1 0 5 7 2 5 - 1
9 9 7に準拠した方法で接触角を測定してもよい。
［0064］ 続いて、 前記マイクロ流体デバイス 1の前記液滴保持部 1 1 （マイクロウ エル 3 3） において反応を起こし、 検出のためのシグナルを発生させる反応 工程を行う。
検出のためのシグナルの例としては、 蛍光、 化学発光、 発色、 電位変化ま たは、 ! !変化等が挙げられるが、 蛍光が好ましい。
反応工程の前に、 マイクロ流体デバイス 1 をサーマルサイクラーにかけて 、 〇［¾反応や I 0 反応等の酵素反応等を必要に応じて行ってもよい。 前記反応は、 例えば生化学反応、 より具体的には酵素反応であってもよい 。 また、 前記反応は、 マイクロ流体デバイス 1 を加熱して反応を起こしても よい。 加熱する際の温度は、 反応に応じて適宜決定されるが、 例えば、 6 0 °〇以上 1 0 0 °〇以下である。 加熱する際の温度は、 6 0 °〇以上 9 0 °〇以下が 好ましく、 6 0 °〇以上 8 0 °〇以下がより好ましく、 6 0 °〇以上 7 0 °〇以下が さらに好ましい。 加熱する際の温度とは、 前記液滴保持部 1 1 （マイクロウ エル 3 3） 内の試薬液の実際の温度ではなく、 サーマルサイクラーまたはイ ンキユベーター等によって設定される、 マイクロ流体デバイスの加熱温度の ことである。 また、 加熱する際の温度が例えば 6 0 °〇以上 1 0 0 °〇以下であ るとは、 温度の最高温度が 6 0 °〇以上 1 0 0 °〇以下に達することをいい、 常 〇 2020/175264 25 卩（：171? 2020 /006479
に 6 0 °〇以上 1 0 0 °〇以下である必要はない。 すなわち、 上述した変化させ る温度の範囲内において、 マイクロ流体デバイス 1の温度が変化しても構わ ない。 反応の一例として、 シグナル増幅反応が挙げられる。 シグナル増幅反 応は、 シグナル増幅のための酵素を含んだ試薬液が前記液滴保持部 1 1 （マ イクロウェル 3 3） 内に収容された状態で、 マイクロ流体デバイス 1 を、 所 望の酵素活性が得られる一定温度条件下、 例えば 6 0 °〇以上 1 0 0 °〇以下で 、 所定時間、 例えば少なくとも 1 〇分間、 好ましくは約 1 5分間、 維持する 等温反応である。
[0065] 次に、 上記の反応によって前記液滴保持部 1 1 （マイクロウェル 3 3） か ら発生するシグナルを検出する （検出工程ともいう） 。 例えば、 シグナルが 蛍光である場合は、 蛍光顕微鏡にマイクロ流体デバイス 1 をセツ トし、 励起 光 （電磁波） を照射する。 励起光の波長は、 使用している蛍光標識に応じて 適宜設定される。
電磁波の照射は、 マイクロ流体デバイス 1の基板 1 〇側から行ってもよく 、 蓋部材 2 0側、 つまりマイクロウェル 3 3の上側から行ってもよく、 その 他の任意の方向から行ってもよい。 また、 電磁波の照射の結果発生する虽光 または燐光の検出は、 マイクロウェルアレイの基板側から行ってもよく、 ウ ェル側から行ってもよく、 その他の任意の方向から行ってもよいが、 例えば 蛍光顕微鏡を用いて蛍光または燐光を検出する場合には、 マイクロ流体デバ イス 1の基板 1 〇側から行うことが簡便である。
[0066] 次に、 マイクロウェルアレイ 3 0を構成する複数のマイクロウェル 3 3の うち、 何個のマイクロウェル 3 3が蛍光または燐光を発しているかを計測す る。 計測は、 マイクロウェルアレイ 3 0の蛍光画像を撮影して蛍光画像を用 いて行ってもよい。
例えば、 マイクロウェルアレイ 3 0内で 〇 反応を行い、
Figure imgf000027_0001
増幅が 見られたマイクロウェル
Figure imgf000027_0002
〇 「㊀ ㊀ の蛍光を検出す ることにより、 全てのマイクロウェル 3 3の数に対する増幅が見られたマイ クロウェル 3 3の割合を算出することができる。 検出対象が例えば一塩基多 〇 2020/175264 26 卩（：171? 2020 /006479
型 （3 ？ ： 3 1 门 9 1 6 1\1リ〇 1 6〇 1: 1 〇16 〇 1 7111〇 「 11 1
3〇1） の場合、 蛍光を発するマイクロウェル 33の数を数えることで、 3 の発現頻度等を分析することができる。
［0067］ 本発明のもう 1つの側面は、 以下の態様を包含する。
［3 1］ 基板と、 前記基板上に位置する蓋部材と、 前記基板と前記蓋部材と を接続している周縁部材と、 前記基板と前記蓋部材との間に位置し、 前記周 縁部材によって区画されている流路と、 前記基板上に位置し、 前記流路と接 続している 1つまたは複数の液滴保持部と、 を有し、 前記流路の高さが 0 超 3〇 以下である、 マイクロ流体デバイス。
［32］ 前記液滴保持部が前記基板表面に設けられている孔である、 ［3 1 ］ に記載のマイクロ流体デバイス。
［33］ 前記流路に液体を導入するための少なくとも 1つの第一孔および前 記流路から液体を排出するための少なくとも 1つの第二孔を有し、 前記第 _ 孔および前記第二孔は、 1つまたは複数の前記液的保持部を挟むように位置 している、 ［3 1］ に記載のマイクロ流体デバイス。
［34］ 前記液滴保持部の底部が基板側であり、 前記液滴保持部が前記蓋部 材側に開口を有しており、 前記開口上に前記流路が位置する、 ［3 1］ 〜 ［ 33］ に記載のマイクロ流体デバイス。
［35］ 前記液滴保持部の 1つあたりの容積が 1 0チ！_以上 1 00 !_以下 である、 ［3 1］ 〜 ［34］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス
［36］ 前記液滴保持部の総容積が、 〇. 2 し以上 2. 0 し以下である 、 ［3 1］ 〜 ［35］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［37］ 前記流路の容積に対する、 前記液滴保持部の総容積の比率が、 5% 以上 40%以下である、 ［3 1］ 〜 ［36］ のいずれか一項に記載のマイク 口流体デバイス。
［38］ 前記流路の高さに対する、 前記液滴保持部の深さの比率が、 3%以 上 1 50%以下である、 ［3 1］ 〜 ［37］ のいずれか一項に記載のマイク 〇 2020/175264 27 卩（：171? 2020 /006479
口流体デバイス。
［3 9］ 前記基板において前記液滴保持部が形成されている領域の単位面積 あたりの前記液滴保持部の開口部の総面積の比率が、 2 3 %以上 9 0 %以下で ある、 ［3 1］ 〜 ［3 8］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［4 0］ 前記周縁部材が前記蓋部材と一体に形成された段差部である、 ［3 1］ 〜 ［3 9］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［4 1］ ［3 1］ 〜 ［4 0］ のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス を用いた試料分析方法であって、 試料を含有する水性液体を前記流路に導入 し、 前記液滴保持部に前記水性液体を保持させることと、 前記流路に封止液 を導入して前記流路内に存在する前記水性液体と前記封止液を置換し、 前記 液滴保持部に前記水性液体を封入することと、 前記液滴保持部において反応 を起こし、 検出のためのシグナルを発生させることと、 前記シグナルを検出 することと、 を備える試料分析方法。
［4 2］ 前記試料が、 生体分子である、 ［4 1］ に記載の試料分析方法。
［4 3］ 前記検出のためのシグナルを発生させることは、 前記マイクロ流体 デバイスを加熱して前記反応を起こすことを含み、 前記マイクロ流体デバイ スが加熱される際の温度が 6 0 °〇以上である、 ［4 1］ または ［4 2］ に記 載の試料分析方法。
［4 4］ 前記シグナルを前記マイクロ流体デバイスの画像撮影により検出す る、 ［4 1］ 〜 ［4 3］ のいずれか一項に記載の試料分析方法。
［4 5］ 前記シグナルが蛍光である、 ［4 1］ 〜 ［4 4］ のいずれか一項に 記載の試料分析方法。
［4 6］ 前記反応が等温反応である、 ［4 1］ 〜 ［4 5］ のいずれか一項に 記載の試料分析方法。
実施例
［0068］ 次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、 本発明は以下の実施 例に限定されるものではない。
［0069］ （実施例 1） 〇 2020/175264 28 卩（：171? 2020 /006479
射出成形で形成した CO P （Z EONOR 1 01 O R、 日本ゼオン社製） 製の基板と CO P （Z EONOR 1 01 0 R、 日本ゼオン社製） 製の蓋部材 の 2つの樹脂製の部材を準備した。 CO P製の基板に成形する微小孔数を変 化させることで、 微小孔 （つまりマイクロウェル） の総容積を調整した。 蓋 部材と段差部を一体に形成し、 段差部の高さを 30 Mmに調整することによ り、 流路の高さを 30 Mmとした。
微小孔は、 径 1 0 M m、 深さ 1 5 M mの微小孔を、 流路面内の 9000m mX 30000 mmの領域に配置した。
開口面積比率は、 微小孔が形成されている領域 6. 5 mmX 9. 0mmあ たりの微小孔の開口部の総面積の比率とした。
基板は、 厚さ 0. 6 mmで、 基板全面に微小孔が配置された、 射出成形に より成形された基板を用いた。 流路の高さの測定には、 接触式測定器 （TA LYS U R F PG I 1 240、 T a y l o r H o b s o n社製） を使用 した。
基板と蓋部材の段差部とを、 レーザー溶着により貼合し、 マイクロ流体デ バイスを作製した。 基板と蓋部材の間に形成された流路に、 表 1 に示す組成 を有する蛍光試薬 （F l u o r e s c e i n、 東京化成工業社製） を注入し た。 さらにフルオロカーボンオイル （FC40、 シグマ社製） によって複数 のマイクロウェルを個別に封止した。 なお、 本実施例においては、 蛍光反応 は行っていないが、 蛍光反応を行った場合と同様の状態とするために、 蛍光 試薬に酵素を加えている。
[0070] [表 1]
Figure imgf000030_0001
[0071] 上記マイクロ流体デバイスを 66°〇で 30分間加熱した。 室温放置後、 上 面から、 つまり蓋部材側から気泡の発生の有無を確認し、 デジタルカメラ （ 〇 2020/175264 29 卩（：171? 2020 /006479
CX-4、 リコー社製） を用いて撮影した。 また、 蛍光顕微鏡 （BZ-7 1 0、 KEYE NCE社製） で 4倍の対物レンズを用いて微小孔蛍光画像を観 察した。 露光時間は、 明視野 2 Om s e cで、 G F P （G r e e n F l u o r e s c e n t P r o t e i n） の虽光フィルターを用いて 3000 m s e cとした。
[0072] 表 2に、 上記マイクロ流体デバイスの気泡の発生率を示した。 気泡発生率 は、 複数の同じ設計のマイクロ流体デバイスを用意し、 1つのマイクロ流体 デバイス内に気泡が有るものの個数を、 解析を行った全てのマイクロ流体デ バイスの個数で除することにより算出した。 気泡の有無は、 肉眼で視認可能 なサイズの気泡がマイクロ流体デバイス内に存在した場合には、 気泡が有る と判断し、 同一の条件で気泡が存在しなかった場合には気泡が無いと判断し た。 上記条件で視認可能な気泡の最大寸法は、 約 500 Mm以上であった。 小さな気泡が存在したとしても、 気泡のサイズが、 4倍の対物レンズを用い て顕微鏡によりマイクロ流体デバイスを観察した際に、 再隣接の微小孔 （つ まり、 マイクロウェル） の端と端の距離よりも小さいときには、 気泡が無い と判断した。 そのように判断して良い理由は、 上記のサイズ以下の気泡が存 在する場合には、 実質的に検出を阻害することにはならず、 気泡の発生を抑 制できていると考えられるからである。
その結果、 表 2に示すように実施例 1で製造したマイクロ流体デバイスは 、 気泡の発生率が低かった。
図 8に、 比較例のマイクロ流体デバイスでの代表的な気泡の観察結果 （流 路高さ ： 1 O O^m） を示す。 図 8において、 矢印で示した部分が、 代表的 な気泡発生部分を示す。 図 8は、 数 m mの気泡が存在すると共に、 500 yu, m程度の小さな気泡も複数観察されたことを示している。 流路高さを 30 M mとした実施例 1のマイクロ流体デ/《イスは、 このような気泡の発生率が低 減されていた。
[0073] 次に、 蛍光観察結果を示す。 図 9 Aのように、 流路高さを 30 Mmとした 実施例 1のマイクロ流体デバイスは、 液滴が崩れることがなく、 微小孔 （つ 〇 2020/175264 30 卩(：171? 2020 /006479
まり、 マイクロウェル） の観察が可能であった。
[0074] （実施例 2）
流路の高さを 2 0 とした以外は実施例 1 と同様にしてマイクロ流体デ バイスを製造し、 気泡発生率を計測した。 その結果を表 2に示す。 表 2に示 すように実施例 2で製造したマイクロ流体デバイスは、 気泡の発生率が低か った。
[0075] （比較例 1）
流路の高さを 1 0 0 とした以外は実施例 1 と同様にしてマイクロ流体 デバイスを製造し、 気泡発生率を計測した。 その結果を表 2に示す。 表 2に 示すように比較例 1で製造したマイクロ流体デバイスは、 気泡の発生率が高 かった。
図 9巳に、 蛍光観察結果を示す。 流路高さを 1 〇〇 としたマイクロ流 体デバイスは、 気泡が複数発生し、 微小孔の観察が困難であった。 図 9巳に おいて、 矢印で示した部分が、 代表的な気泡発生部分を示す。
[0076] （比較例 2）
ウェルの深さを 3 . 5 とし、 流路の高さを 1 0 0 とした以外は実 施例 1 と同様にしてマイクロ流体デバイスを製造し、 気泡発生率を計測した 。 その結果を表 2に示す。 表 2に示すように比較例 2で製造したマイクロ流 体デバイスは、 気泡の発生率が高かった。
[0077] [表 2]
Figure imgf000032_0001
[0078] （実施例 3）
射出成形で形成した〇〇 （2巳〇1\1〇[¾ 1 0 1 〇 [¾、 日本ゼオン社製） 製の基板を用いた。 微小孔は、 径5 、 深さ 3 . 5 の微小孔を、 流路 〇 2020/175264 31 卩（：171? 2020 /006479
面内の 6. 5 m m X 9. Ommの領域に配置した。
蓋部材として、 射出成形で形成した CO P （Z EONOR 1 01 0 R、 日 本ゼオン社製） 製の蓋部材 （送液および廃液ポート付） に、 周縁部材として 厚さ 30yLtmの P ET （p o l y e t h y l e n e t e r e p h t h a l a t e） 基材両面テープ （N〇. 5603 BN、 日東電工製） を用いた。
[0079] これら以外は、 実施例 1 と同様にしてマイクロ流体デバイスを製造し、 気 泡発生率を計測した。 その結果を表 3に示す。
なお実施例 3のマイクロ流体デバイスは、 4個が連結して一組のデバイス 群として形成された。 このデバイス群を 3個、 つまりマイクロ流体デバイス を計 1 2個作成した。
また 「ウエルが形成されている領域の比率」 は、 周縁部材で囲まれる領域 、 即ち流路が形成されている領域の面積に対する微小孔が形成されている領 域の比率とした。
[0080] （比較例 3）
周縁部材として厚さ 50 mの P ET （p o l y e t h y l e n e t e r e p h t h a I a t e） 基材両面テープ （品番： N o. 5603 BN、 日東電工製） を用いた以外は、 実施例 1 と同様にしてマイクロ流体デバイス を製造し、 気泡発生率を計測した。 その結果を表 3に示す。
[0081] （比較例 4）
周縁部材として厚さ 1 00 Mmの P ET （p o l y e t h y l e n e t e r e p h t h a I a t e） 基材両面テープ （品番： N o. 5603 BN 、 日東電工製） を用いた以外は、 実施例 1 と同様にしてマイクロ流体デバイ スを製造し、 気泡発生率を計測した。 その結果を表 3に示す。
[0082] 〇 2020/175264 32 卩（：171? 2020 /006479
[表 3]
Figure imgf000034_0001
[0083] 実施例 4のマイクロ流体デバイスの流路の高さは、 周縁部材の厚さに相当 することから、 3 0 〇1であるといえる。 実施例 4のマイクロ流体デバイス では、 気泡が発生しなかった。 〇 2020/175264 33 卩（：171? 2020 /006479
[0084] —方で、 流路の高さが 5 0 である比較例 3および流路の高さが 1 0 0 である比較例 4のマイクロ流体デ/《イスでは、 気泡発生率がそれぞれ 5 0 %および 1 0 0 %と高い値となった。
以上より、 マイクロ流体デバイスの流路の高さが 5〇 以上であると気 泡発生率が上昇するが、 流路の高さが 3〇 であると、 気泡の発生率を低 減することが確認できた。
産業上の利用可能性
[0085] 本発明によれば、 微小な液滴を形成して加熱する場合の気泡の発生を抑制 することができるマイクロ流体デバイスを提供することができる。 また、 微 小な液滴を形成して加熱し、 試料を光学的に検出する場合に、 微小な液滴を 形成して加熱する場合の気泡の発生を抑制することができ、 試料の検出効率 を向上させることができる試料分析方法を提供することができる。 試料とし て生体分子を用いる場合には、 一定時間以上に渡って高温に加熱する必要が あり、 本発明によれば、 そのような場合においても効果的に気泡の発生を抑 制することができる。
符号の説明
[0086] 1、 2 マイクロ流体デバイス
1 0 基板
1 1 液滴保持部
2 0 蓋部材
3 0 マイクロウェルアレイ
3 2 壁部層
3 3 マイクロウェル
3 5 流路
1 0 0 水性液体
1 1 0 封止液

Claims

〇 2020/175264 34 2020 /006479 請求の範囲
[請求項 1 ] 流路と、 前記流路と接続している 1つまたは複数の液滴保持部と、 を有し、 前記流路の高さが〇 超 3 0 以下である、 マイクロ流 体デバイス。
[請求項 2] さらに、 平板状の基板を有し、 前記流路は、 前記平板状の基板上に 位置し、 前記液滴保持部が前記基板上に存在する孔である、 請求項 1 に記載のマイクロ流体デバイス。
[請求項 3] さらに、 蓋部材を有し、 前記流路が、 前記蓋部材と前記基板とに挟 まれた空間である、 請求項 2に記載のマイクロ流体デバイス。
[請求項 4] 前記基板において前記液滴保持部が形成されている領域の単位面積 あたりの前記液滴保持部の開口部の総面積の比率が、 2 3 %以上 9 0 % 以下である、 請求項 2または 3に記載のマイクロ流体デバイス。
[請求項 5] 前記液滴保持部が複数の液滴保持部である、 請求項 1〜 4の何れか
—項に記載のマイクロ流体デバイス。
[請求項 6] 前記液滴保持部の 1つあたりの容積が 1 0† !_以上 1 0 0 !_以下 である、 請求項 1〜 5のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス
[請求項 7] 前記液滴保持部の総容積が、 〇. 2 し以上 2 . 〇 し以下である
、 請求項 1〜 6のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
[請求項 8] 前記流路の容積に対する、 前記液滴保持部の総容積の比率が、 5 % 以上 4 0 %以下である、 請求項 1〜 7のいずれか一項に記載のマイク 口流体デバイス。
[請求項 9] 前記流路の高さに対する、 前記液滴保持部の深さの比率が、 3 %以 上 1 5 0 %以下である、 請求項 1〜 7のいずれか一項に記載のマイク 口流体デバイス。
[請求項 10] 請求項 1〜 9のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスを用い た試料分析方法であって、
試料を含有する水性液体を前記流路に導入し、 前記液滴保持部に前 〇 2020/175264 35 卩（：171? 2020 /006479
記水性液体を保持させることと、
前記流路に封止液を導入して前記流路内に存在する前記水性液体と 置換し、 前記液滴保持部に前記水性液体を封入することと、
前記液滴保持部において反応を起こし、 検出のためのシグナルを発 生させることと、
前記シグナルを検出することと、
を備える試料分析方法。
[請求項 1 1 ] 前記試料が、 生体分子である、 請求項 1 〇に記載の試料分析方法。
[請求項 12] 前記検出のためのシグナルを発生させることは、 前記マイクロ流体 デバイスを加熱して前記反応を起こすことを含み、 前記マイクロ流体 デバイスが加熱される際の温度が 6 0 °〇以上である、 請求項 1 0また は 1 1 に記載の試料分析方法。
[請求項 13] 前記シグナルを前記マイクロ流体デバイスの画像撮影により検出す る、 請求項 1 〇〜 1 2のいずれか一項に記載の試料分析方法。
[請求項 14] 前記シグナルが蛍光である、 請求項 1 〇〜 1 3のいずれか一項に記 載の試料分析方法。
[請求項 15] 前記反応が等温反応である、 請求項 1 〇〜 1 4のいずれか一項に記 載の試料分析方法。
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