CN113454463A - 微流体设备及试样分析方法 - Google Patents

微流体设备及试样分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113454463A
CN113454463A CN202080015690.1A CN202080015690A CN113454463A CN 113454463 A CN113454463 A CN 113454463A CN 202080015690 A CN202080015690 A CN 202080015690A CN 113454463 A CN113454463 A CN 113454463A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microfluidic device
substrate
flow path
droplet holding
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080015690.1A
Other languages
English (en)
Inventor
后藤圭佑
牧野洋一
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toppan Inc
Original Assignee
Toppan Printing Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toppan Printing Co Ltd filed Critical Toppan Printing Co Ltd
Publication of CN113454463A publication Critical patent/CN113454463A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502707—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the manufacture of the container or its components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/02—Adapting objects or devices to another
    • B01L2200/026—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details
    • B01L2200/027—Fluid interfacing between devices or objects, e.g. connectors, inlet details for microfluidic devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673—Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0684—Venting, avoiding backpressure, avoid gas bubbles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0689—Sealing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B01L2300/0851—Bottom walls
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N2021/0346—Capillary cells; Microcells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N21/03—Cuvette constructions
    • G01N21/05—Flow-through cuvettes
    • G01N2021/054—Bubble trap; Debubbling
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6482—Sample cells, cuvettes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood

Abstract

本发明为具有流路(35)和与所述流路(35)连接的1个或多个液滴保持部(11)、所述流路(35)的高度为超过0μm且30μm以下的微流体设备(1)及使用了所述微流体设备(1)的试样分析方法，所述试样分析方法具备：将含有试样的水性液体导入至所述流路，在所述液滴保持部中保持所述水性液体；向所述流路中导入封闭液，与存在于所述流路内的所述水性液体进行置换，将所述水性液体封入在所述液滴保持部中；在所述液滴保持部中引起反应，产生用于检测的信号；以及对所述信号进行检测。

Description

微流体设备及试样分析方法
技术领域
本发明涉及微流体设备及使用了所述微流体设备的试样分析方法。
本申请基于2019年2月27日在日本申请的日本特愿2019-034228号主张优先权，在此援引其内容。
背景技术
近年来，探讨了使用半导体电路的制造技术中使用的刻蚀技术或光刻技术、或者微细塑料的成型方法所形成的具有各种形态的微细流路结构的微孔阵列。这些微孔阵列的孔室作为用于在微小体积的流体中使各种生物化学反应或者化学反应进行的化学反应容器来使用。
作为用于制作微流体系统的材料，使用硅及玻璃等硬质的物质、PDMS(聚二甲基硅氧烷)等各种高分子树脂或有机硅橡胶等软质的物质等。例如，专利文献1～3及非专利文献1中记载了将这种微流体系统作为各种微芯片或生物芯片进行使用。
已知在流路设备内对生物体分子进行检测的技术。例如，在DNA微阵列技术中，向微小孔导入生物体分子、进行伴随加热的反应，从而检测生物体分子。另外，已知能够对生物体分子进行单分子检测的技术。作为所述能够单分子检测的技术，例如有数字ELISA(Digital Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，数字酶联免疫吸附测定)、数字PCR(Digital Polymerase Reaction，数字聚合酶反应)或数字Invasive Cleavaged Assay(Digital ICA，数字入侵裂解分析)等数字测量技术。
数字PCR技术是指将试剂与核酸的混合物分割成无数的微小液滴、进行PCR扩增，使得由包含核酸的液滴可检测到荧光等信号，通过计数检测到了信号的液滴来进行定量的技术。
作为微小液滴的形成方法，探讨了通过利用封闭液将试剂与核酸的混合物截断来形成微小液滴的方法；通过在形成于基板上的孔中放入试剂与核酸的混合物、接着放入封闭液来形成微小液滴的方法等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第6183471号公报
专利文献2：日本特表2014-503831号公报
专利文献3：国际公开第2013-151135号
非专利文献
非专利文献1：KimS.H.,et al.,Large-scale femtoliter droplet array fordigital counting of single biomolecules.,Lab on a Chip,12(23),4986-4991,2012.
发明内容
发明要解决的技术问题
但是，在形成微小液滴后进行加热、利用荧光等光学地进行检测时，有时会在流路内部产生气泡，这会成为检测的妨碍。
因此，本发明的目的在于提供在形成微小液滴后进行加热、光学地进行检测时可以抑制气泡的产生、提高检测效率的微流体设备。
另外，本发明的目的在于提供在形成微小液滴后进行加热、光学地对试样进行检测时能够抑制形成微小液滴后进行加热时的气泡的产生、提高试样的检测效率的试样分析方法。
用于解决技术问题的手段
为了达成上述目的，本发明采用以下构成。
[1]一种微流体设备，其具有流路和形成于所述流路中的液滴保持部，所述流路的高度为超过0μm且30μm以下。
[2]根据[1]所述的微流体设备，其中，所述流路具有平面状的基板，所述液滴保持部是存在于所述基板的孔。
[3]根据[1]或者[2]所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部存在多个。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的微流体设备，其具有盖构件，所述流路是被所述盖构件与所述基板夹持的空间。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的每1个的容量为10fL以上且100pL以下。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的总容量为0.2μL以上且2.0μL以下。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的总容量相对于所述流路的容积的比率为5％以上且40％以下。
[8]根据[2]～[7]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的深度相对于所述流路的高度的比率为3％以上且150％以下。
[9]根据[2]～[8]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的开口部的总面积相对于所述基板中形成有所述液滴保持部的区域的单位面积的比率为23％以上且90％以下。
[10]一种试样分析方法，其是使用了[1]～[9]中任一项所述的微流体设备的试样分析方法，其具备以下工序：
将含有试样的水性液体供至所述流路，在所述液滴保持部中保持所述水性液体的试样供给工序；
向所述流路中导入封闭液，与存在于所述流路内的所述水性液体进行置换，将所述水性液体封入在所述液滴保持部中的封闭工序；
在所述液滴保持部中引起反应，产生用于检测的信号的反应工序；以及
对所述信号进行检测的检测工序。
[11]根据[10]所述的试样分析方法，其中，所述试样为生物体分子。
[12]根据[10]或[11]所述的试样分析方法，其中，所述反应工序中，加热所述微流体设备来引起所述反应，加热时的温度为60℃以上。
[13]根据[10]～[12]中任一项所述的试样分析方法，其中，通过图像拍摄对所述信号进行检测。
[14]根据[10]～[13]中任一项所述的试样分析方法，其中，所述信号为荧光。
[15]根据[10]～[14]中任一项所述的试样分析方法，其中，所述反应为等温反应。
本发明的另一方面包含以下方式。
[16]一种微流体设备，其具有流路和连接于所述流路的1个或多个液滴保持部，所述流路的高度为超过0μm且30μm以下。
[17]根据[16]所述的微流体设备，其进一步具有平板状的基板，所述流路位于所述平板状的基板上，所述液滴保持部是存在于所述基板上的孔。
[18]根据[17]所述的微流体设备，其进一步具有盖构件，所述流路是被所述盖构件和所述基板夹持的空间。
[19]根据[17]或[18]所述的微流体设备，其中，所述基板中形成有所述液滴保持部的区域的每单位面积的所述液滴保持部的开口部的总面积的比率为23％以上且90％以下。
[20]根据[16]～[19]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部是多个液滴保持部。
[21]根据[16]～[20]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的每1个的容积为10fL以上且100pL以下。
[22]根据[16]～[21]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的总容积为0.2μL以上且2.0μL以下。
[23]根据[16]～[22]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的总容积相对于所述流路的容积的比率为5％以上且40％以下。
[24]根据[16]～[23]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的深度相对于所述流路的高度的比率为3％以上且150％以下。
[25]一种试样分析方法，其是使用了[16]～[24]中任一项所述的微流体设备的试样分析方法，其具备：
将含有试样的水性液体导入到所述流路中，在所述液滴保持部中保持所述水性液体；
向所述流路导入封闭液，与存在于所述流路内的所述水性液体进行置换，将所述水性液体封入在所述液滴保持部中；
在所述液滴保持部中引起反应，产生用于检测的信号；以及
对所述信号进行检测。
[26]根据[25]所述的试样分析方法，其中，所述试样为生物体分子。
[27]根据[25]或[26]所述的试样分析方法，其中，所述产生用于检测的信号包含加热所述微流体设备来引起所述反应，加热所述微流体设备时的温度为60℃以上。
[28]根据[25]～[27]中任一项所述的试样分析方法，其中，通过所述微流体设备的图像拍摄对所述信号进行检测。
[29]根据[25]～[28]中任一项所述的试样分析方法，其中，所述信号为荧光。
[30]根据[26]～[29]中任一项所述的试样分析方法，其中，所述反应为等温反应。
发明效果
根据本发明的微流体设备，可以抑制在形成微小液滴并加热所述微小液滴时的气泡的产生。
另外，根据本发明的试样分析方法，在形成微小液滴并加热所述微小液滴、光学地检测试样时，能够抑制加热所述微小液滴时的气泡的产生、提高试样的检测效率。
附图说明
图1为表示本发明一个实施方式的微流体设备的立体图。
图2为图1的b-b线的截面图。
图3为图1的b-b线的截面图。
图4为存在仅在基板的一部分形成有液滴保持部的区域的本发明一个实施方式的微流路设备的俯视图。
图5为表示本发明一个实施方式的微流体设备的截面图。
图6为表示本发明一个实施方式的微流体设备的使用时状态的图。
图7为表示本发明一个实施方式的微流体设备的使用时状态的图。
图8为表示比较例的微流体设备的使用时状态的图。
图9A为表示使用本发明一个实施方式的微流体设备观察到的荧光图像的图。
图9B为表示使用比较例的微流体设备观察到的荧光图像的图。
具体实施方式
参照图1～图5说明本发明的一个实施方式。本说明书中，各附图中的尺寸比有为了说明而有所夸张的部分，并非必须与实际的尺寸一致。
图1为表示本实施方式的微流体设备1的立体图。图2及图3为图1的b-b线的截面图。微流体设备1如图2及图3所示，具备流路35和液滴保持部11。流路35可以通过以一定间隔相向地配置盖构件20和基板10来形成。此时，流路35成为被盖构件20和基板10夹持的空间。周边构件34位于基板10与盖构件20之间。被夹持在基板10和盖构件20之间、且被周边构件34包围的区域即为流路35。周边构件34还可以与盖构件20一体地形成。
液滴保持部11在形成所述流路35的基板10为平面状、即为平板时，优选是存在于基板10上的孔、即孔室。
所述液滴保持部11如图3所示，优选是在基板10上存在多个孔(孔室)的微孔33。换而言之，基板10优选具有多个微孔33。
以下，以所述液滴保持部11是在基板10上存在多个孔(孔室)的微孔33的微流体设备1为例，说明本实施方式的微流体设备1。
微孔阵列30可以具有底部层31、壁部层32(也记为隔壁32)和多个微孔33。底部层31设置在基板10上。壁部层32形成在底部层31上。多个微孔33由底部层31和形成于壁部层32的厚度方向上的多个贯通孔32a构成。多个微孔33在壁部层32中形成为阵列状。在基板10与盖构件20之间的内部空间S中，在微孔阵列30与盖构件20之间、换而言之在壁部层32的上表面与盖构件20之间存在空隙。该空隙作为与多个微孔33、以及第一孔21及第二孔22连通的流路35发挥功能。
基板10还可以透过电磁波。这里，作为电磁波，可举出X射线、紫外线、可见光线及红外线等。通过基板10能够透过电磁波，可以从基板10侧观察到由封入在微流体设备1中的试样与试剂的反应所生成的荧光或磷光等。
基板10也可以仅透过规定波长范围的电磁波。例如，当通过检测在作为可见光区域的350～700nm的波长范围具有峰的荧光来判定微孔内的试样的存在时，将至少能够透过上述波长范围的可见光的基板作为基板10使用即可。
作为形成基板10的材料，例如可举出玻璃及树脂等。作为树脂基板的材料，例如可举出ABS树脂、聚碳酸酯树脂、COC(环烯烃共聚物)、COP(环烯烃聚合物)、丙烯酸树脂、聚氯乙烯、聚苯乙烯树脂、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、聚乙酸乙烯酯、PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)及PEN(聚萘二甲酸乙二醇酯)等。这些树脂还可以包含各种添加剂。作为添加剂的例子，可举出抗氧化剂、赋予疏水性的添加剂、赋予亲水性的添加剂等。树脂基板可以包含上述树脂中的仅一种，也可以混合有多个树脂。
由于在后述的试样分析方法中有时要利用荧光或磷光，因此作为基板10，优选使用实质上没有自体荧光的材料。这里，“实质上没有自体荧光”是指基板完全没有用于实验结果检测的波长下的自体荧光、或者即便是具有自体荧光也是不会对实验结果的检测造成影响的程度的微弱荧光。例如，若是与检测对象的荧光相比为1/2以下、优选1/10以下左右的自体荧光，则可以说是不会对实验结果的检测造成影响的程度的微弱荧光。
基板10的厚度可以适当决定，为了易于透过在试样分析中发出的荧光或磷光，例如优选为5毫米(mm)以下、更优选为2mm以下、进一步优选为1.6mm以下。作为基板10的厚度下限值，可以适当决定，宜设定为即便是微流体设备1的内部压力上升也不会发生变形的厚度。例如，优选为0.1mm以上、更优选为0.2mm以上、进一步优选为0.4mm以上。基板10的厚度的上限及下限可以任意地组合。例如，基板10的厚度优选为0.1mm以上且5mm以下、更优选为0.2mm以上且2mm以下、进一步优选为0.4mm以上且1.6mm以下。
底部层31构成微孔33的底面。因此，在想要对底面赋予亲水性时，只要用亲水性材料形成底部层31即可。底部层31优选按照底部层31能够透过电磁波的方式形成，从而使得不会妨碍从基板10侧对微孔33内的试样进行观察。另外，在想要对底面赋予疏水性时，只要用疏水性材料形成底部层31即可。底部层31优选不会妨碍从基板10侧对微孔33内的试样进行观察。另外，优选底部层31使用实质上没有自体荧光的材料。这里，还可以将基板10和底部层31经一体化而成的构件仅称作基板。
此外，微孔33的底面的特性与基板10的特性相同、没有问题时，也可不设置底部层31而在基板10上直接形成壁部层32。因此，此时，由基板10的表面和壁部层32的贯通孔32a构成微孔33。
壁部层32具有在厚度方向上进行观察的状态下设置为阵列状的多个贯通孔32a。各贯通孔32a的内表面构成各微孔33的内壁面。
作为形成壁部层32的材料，可以使用与形成基板10的材料相同的树脂等，但也可以使用在树脂中混合有吸收规定波长的电磁波的有色成分而成的材料。
作为树脂材料，可以考虑微孔33所要求的特性等来使用树脂的构成成分的分子具有亲水性基团的亲水性树脂和树脂的构成成分的分子具有疏水性基团的疏水性树脂中的任一者。
作为亲水性基团，例如可举出羟基、羧基、磺基、磺酰基、氨基、酰胺基、醚基及酯基等。作为亲水性树脂，例如可以从硅氧烷聚合物；环氧树脂；聚乙烯树脂；聚酯树脂；聚氨酯树脂；聚丙烯酰胺树脂；聚乙烯吡咯烷酮树脂；聚丙烯酸共聚物等丙烯酸树脂；阳离子化聚乙烯醇、硅醇化聚乙烯醇、磺化聚乙烯醇等聚乙烯醇树脂；聚乙烯醇缩醛树脂；聚乙烯醇缩丁醛树脂；聚乙烯聚酰胺树脂；聚酰胺聚胺树脂；羟甲基纤维素、甲基纤维素等纤维素衍生物；聚环氧乙烷、聚环氧乙烷-环氧丙烷共聚物等聚氧化烯衍生物；马来酸酐共聚物；乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；苯乙烯-丁二烯共聚物；以及上述树脂的组合等中适当选择使用。
作为疏水性树脂的例子，例如可以从酚醛清漆树脂；丙烯酸树脂；甲基丙烯酸树脂；苯乙烯树脂；氯乙烯树脂；偏氯乙烯树脂；聚烯烃树脂；聚酰胺树脂；聚酰亚胺树脂；聚缩醛树脂；聚碳酸酯树脂；聚苯硫醚树脂；聚砜树脂；氟树脂；有机硅树脂；脲醛树脂；三聚氰胺树脂；胍胺树脂；酚醛树脂；纤维素树脂；以及上述树脂的组合等中适当选择根据JISR3257-1999规定的静滴法测得的接触角为70度以上的材料来使用。即，本说明书中的疏水性是指根据JIS R3257-1999规定的静滴法测得的接触角为70度以上。此外，还可以代替JISR3257-1999规定的静滴法，利用基于ASTM D5725-1997的方法来测定接触角。
亲水性树脂及疏水性树脂中的任一者可以是热塑性树脂也可以是热固化性树脂。进而，还可以是通过电子束或UV光等活性能量射线而固化的树脂，也可以是弹性体。
作为树脂材料使用光致抗蚀剂时，可以利用光刻法在壁部层32上精度良好地形成大量的微细的贯通孔32a。
使用光刻法时，对于所用光致抗蚀剂的种类的选择、涂布及曝光(感光)、以及不需要的光致抗蚀剂的除去方法，可以适当选择公知的手段。
不使用抗蚀剂时，例如可以通过注塑成型等形成壁部层32。
作为有色成分，可以示例有机质或者无机质的颜料。具体地说，作为黑色颜料，可举出炭黑、乙炔黑及铁黑等。作为黄色颜料，可举出铬黄、锌黄、黄土、耐晒黄、永固黄及汽油黄。作为橙色颜料，可举出橙色色淀、钼橙及汽油橙。作为红色颜料，可举出氧化铁红、镉红、锑朱、永固红、立索尔红、色淀红、亮猩红及硫靛红。作为蓝色颜料，可举出群青、钴蓝、酞菁蓝、滕氏蓝及靛蓝。作为绿色颜料，可举出铬绿、萘酚铬绿及酞菁绿等。
另外，利用注塑成型等形成壁部层32时，不仅分散在树脂中的颜料、溶解于树脂中的各种染料也可作为有色成分进行使用。染料可根据各种染料法进行示例。具体地说，可举出直接染料、碱性染料、阳离子染料、酸性染料、媒介染料、酸性媒介染料、硫化染料、还原染料、萘酚染料、分散染料及反应染料等。特别是对树脂进行染色时，多选择分散染料。
盖构件20(也可仅记为盖20)是形成为板状或者薄片状的构件。盖构件20以离开的状态与基板10相向。换而言之，盖构件20将多个微孔33覆盖。流路35是被盖构件20、微孔阵列30和周边构件34包围的区域。流路35与多个微孔33的开口连接、位于多个微孔33的上方。
盖构件20具有在厚度方向上贯通的第一孔21及第二孔22。在盖构件20的俯视下，第一孔21及第二孔22按照夹持1个或者多个所述液滴保持部的方式存在。第一孔21及第二孔22在完成的微流体设备1中，与包含微孔阵列30和流路35的内部空间S相连通。第一孔21及第二孔22分别作为向内部空间S供给流体的入口及排出流体的出口发挥功能。
对于形成盖构件20的材料或盖构件20的厚度而言，可以与基板10相同。
盖构件20具有电磁波透过性时，可以对电磁波透过性适当地设定。例如，未从盖构件20侧进行后述的电磁波照射工序时，盖构件20也可以是不能透过电磁波。
流路35的高度h如图2所示，成为从基板10的流路35侧的最上表面(基板10中未形成有孔的部分中流路35侧的那一面)至盖构件20的流路35侧的那一面的高度。微流体设备1具备壁部层32时，如图3所示，成为从壁部层32的流路35侧的面32b至盖构件20的流路侧的面20a的高度。
流路35的高度h为超过0μm且小于50μm、优选为超过0μm且30μm以下、优选为2μm以上且30μm以下、优选为3μm以上且25μm以下、更优选为5μm以上且20μm以下、特别优选为8μm以上且18μm以下。通过流路的高度为超过0μm且小于50μm，在对形成于液滴保持部11(微孔33)中的液滴进行加热时，可抑制气泡的产生。因此，荧光等的检测不会被气泡妨碍，可以利用荧光等对试样进行检测。
流路的高度h从抑制气泡的产生的观点出发，只要小于50μm则越小越优选，但当流路的高度h比2μm还小时，有可能变得难以将试样填充到流路内。当流路的高度为2μm以上时，将包含试样的水性液体填充到流路中时的压力不会过于上升，可以简便地填充所述水性液体。流路的高度h为50μm以上时，在对形成于液滴保持部11(微孔33)的液滴进行加热时，容易产生气泡，由于该气泡的产生，变得难以利用荧光等对试样进行检测。换而言之，当流路的高度h小于50μm时，即便是对形成于液滴保持部11(微孔33)的液滴进行加热，也难以产生气泡，能够更为准确地利用荧光等对试样进行检测。结果，当流路的高度h小于50μm时，会使得微流体设备的良品率提高。另外，当流路的高度h小于50μm时，由于试样的检测效率提高，因此检测操作的成功率提高。
流路35的高度可以是基板10的流路35侧的最上表面(基板10中未形成有孔的部分中流路35侧的那一面)的多个位置上的高度的平均值，也可以是代表性位置上的高度。所述代表性位置可以选择基板10的任意位置。例如，可以是形成流路35的基板10的中心，还可以是将形成流路35的基板10的最前端和中心连接的线上距离最前端侧为10％～50％的位置。如果考虑测定的容易性，优选将从上面观察盖构件20时连接第一孔21的中心和第二孔22的中心的假想线的中心处的假想垂直线与周边构件34相交的点所处的位置作为代表性位置。
另外，当微流体设备1具备壁部层32时，可以是壁部层32的流路35侧的面32a的多个位置上的高度的平均值，也可以是代表性位置上的高度。所述代表性位置可以选择壁部层32的任意位置。例如，所述代表性位置可以是壁部层32的中心。另外，所述代表性位置还可以是将壁部层32的面向流路35的那一侧的最前端和中心连接的线上距离最前端侧为10％～50％的位置。如果考虑到测定的容易性，优选将连接第一孔21和第二孔22的假想线的中心处的假想垂直线与周边构件34相交的点所处的位置作为代表性位置。
这里，最前端是指与连接微流体设备1的第一孔21和第二孔22的假想线平行的方向(称作长度方向)上的端部。端部是指与后述的周边构件34相接触的部分。
进而，优选形成流路35的盖构件20的流路侧的面是平滑的。通过所述盖构件20的流路35侧的面是平滑的，对液滴保持部11(微孔33)中的液滴进行加热时，可以进一步抑制气泡的产生。本说明书中，平滑是指利用光学显微镜观察时的凹凸小、即微观上的凹凸小。本说明书中，平滑并非是指盖构件20在周边构件34的内侧不弯曲。本实施方式中，盖构件20在周边构件34的内侧也可以弯曲。例如，盖构件20可以在盖构件20的主面的中心附近，按照向基板10侧突出的方式进行弯曲。即，与周边构件34接触的部分的流路35可以高于盖构件20的主面的中心附近处的流路35。这里，盖构件20的主面的中心是指盖构件20的主面的几何中心。
本说明书中，微孔是指容积为10纳升(nL)以下的孔室。通过使液滴保持部11的容积为微孔的容积，可以优选地进行数字PCR及数字ICA反应等在微小空间内进行的反应。通过上述手法，例如可以进行基因的突变检测等。
液滴保持部11(微孔33)的容积并无特别限定，优选为10飞升(fL)以上且100皮升(pL)以下、更优选为10fL以上且5pL以下、最优选为10fL以上且2pL以下。当将容积设定在这种范围内，则在后述的试样分析时，适于在1个液滴保持部11(微孔33)中收容仅1个～数个的生物体分子或者载体。
微孔33的形状只要容积在上述范围内则无特别限定。因此，例如可以是圆筒形、由多个面构成的多面体(例如长方体、六角柱及八角柱等)、倒圆锥形及倒角锥形(倒三角锥形、倒四角锥形、倒五角锥形、倒六角锥形及七角以上的倒多角锥形)等。
进而，多个微孔33的形状还可以是将2个以上的上述形状组合而成的形状。例如，可以是多个微孔33中的一部分是圆筒形、其余为倒圆锥形。另外，当微孔33为倒圆锥形或者倒角锥形时，圆锥或者角锥的底面成为连通流路35和微孔33的开口部。此时，还可以使用从倒圆锥形或者倒角锥形的顶上切去一部分后而成的形状，使微孔33的底部变得平坦。作为其它例子，还可以是微孔33的底部向开口部突出的曲面形状、也可以是微孔33的底部凹陷的曲面形状。
基板10的形成有液滴保持部的区域的每单位面积(通常为1mm2)的液滴保持部11(微孔33)的开口部总面积的比率优选为23％以上且90％以下、更优选为25％以上且90％以下、更优选为30％以上且90％以下、更优选为35％以上且80％以下、更优选为39％以上且76％以下、更优选为39％以上且64％以下。基板10的形成有液滴保持部的区域的每单位面积的液滴保持部11(微孔33)的开口部总面积的比率为上述优选范围内时，可以有效地抑制流路中气泡的产生。认为这是由于，对液滴保持部11(微孔33)内的水性液体进行加热时，由于开口部的总面积没有过大，因此可以某种程度上抑制施加于流路35内的封闭液的压力。
以下，也将基板10的形成有液滴保持部的区域的每单位面积的液滴保持部11(微孔33)的开口部总面积的比率称作“开口面积比率”。
形成有液滴保持部11(微孔33)的区域在基板10的整个面上存在时，基板10的液滴保持部11(微孔33)的开口部总面积可以近似为与基板10的被周边构件划分出的区域的面积相等。形成有液滴保持部11(微孔33)的区域也可以如图4所示，仅存在于基板10的一部分上。这里，形成有液滴保持部11(微孔33)的区域是指，如图4所示，在从垂直方向观察基板10时，液滴保持部11(微孔33)之间的间隔保持恒定间隔的区域。此时，基板10的液滴保持部11(微孔33)的开口部总面积可以近似为被通过位于形成有液滴保持部11(微孔33)的区域最外部的多个液滴保持部11(微孔33)的开口部中心的假想线所包围的区域的面积。恒定间隔并非严格地必须是恒定间隔，制造上的误差当然是允许的。
相对于基板10的被周边构件划分出的区域的面积、形成有液滴保持部11的区域的面积越大，则水性液体变得越易蒸发、气泡越易发生。但是，如本实施方式那样，当使流路35的高度h小于50μm时，可以有效地抑制流路35中的气泡的产生。
存在壁部层32时，壁部层32的厚度决定液滴保持部11(微孔33)的深度。
微孔为圆筒形时，为了封入包含生物体分子的水性液体(试样)，壁部层32的厚度例如可以为10nm以上且100μm以下、优选为100nm以上且50μm以下、更优选为1μm以上且30μm以下、进一步优选为2μm以上且15μm以下、进一步优选为3μm以上且10μm以下的范围内。
微孔33的各部尺寸只要考虑到所收容的水性液体的量、使生物体分子附着的微珠等载体的大小等，按照在1个微孔中收容1个或多个生物体分子的方式适当决定即可。
液滴保持部11(微孔33)的深度相对于流路35的高度h的比率优选为3％以上且150％以下、更优选为10％以上且100％以下、进一步优选为12％以上且75％以下、进一步优选为15％以上且75％以下、进一步优选为33％以上且75％以下、进一步优选为33％以上且50％以下。通过为该范围，可以进一步兼顾气泡的产生抑制和检测对象向液滴保持部11(微孔33)导入的容易性。
设置于微孔阵列30的微孔33的数量或密度可以适当设定，优选按照微孔33的总容积例如达到0.2μL以上且2.0μL以下、优选达到0.5μL以上且1.5μL以下的方式来设定微孔33的数量或密度。
另外，微孔33的总容积相对于流路35的容积，优选是成为5％以上且40％以下、更优选成为8％以上且30％以下、特别优选成为10％以上且20％以下的容积。通过微孔33的总容积相对于流路35的容积的比例为优选范围内，可以进一步抑制加热微孔33中的液滴时的气泡的产生。
每1cm2的微孔33的数量例如为1万以上且1000万以下、优选为10万以上且500万以下、进一步优选为10万以上且100万以下。本说明书中，有时将每1cm2的微孔33的数量称作微孔的密度。微孔的密度为该范围内时，将作为试样的水性液体封入在规定数量的孔室中的操作是容易的。另外，当微孔的密度为该范围内时，用于分析实验结果的孔室的观察也是容易的。例如，在对无细胞DNA的突变进行检测时，当相对于野生型DNA、作为检测对象的突变DNA的存在比例为0.01％左右时，例如优选使用100万～200万个左右的微孔。
图1中示出了多个微孔33排成一列而成的一维阵列的例子。但是，如上所述设置多个微孔时，还可以使用将多个微孔二维地排列而成的二维阵列。
在微孔阵列的周围配置有俯视下为框状的周边构件34。微流体设备1的厚度方向上的周边构件34的尺寸大于壁部层32。周边构件34通过支撑盖构件20，在盖构件20与微孔阵列之间确保空隙，维持流路35。即，流路35是被微孔阵列30和盖构件20夹持、且被周边构件34包围的区域。
周边构件34的材质等并无特别限定，例如可举出在由有机硅橡胶或丙烯酸发泡体形成的芯材薄膜的两面层叠有丙烯酸系粘合剂而成的双面胶等。
此外，周边构件34还可以与盖构件20一体成形。此时，周边构件34成为盖构件20的台阶部，通过所述台阶部，在盖构件20与微孔阵列之间确保空隙、维持流路35。
如上构成的微流体设备1例如可以按以下顺序制造。
首先，准备基板10，在基板10的面上形成成为壁部层32的壁部用树脂层。设置底部层31时，在壁部用树脂层的形成前形成底部层31。即便是不设置底部层31时，也可根据需要在基板10的面上设置提高基板10与壁部用树脂层的密合性的锚固层等。
壁部树脂层可以由在树脂材料中混合有色成分而成的材料形成。树脂材料为抗蚀剂时，相对于树脂材料和有色成分的总质量、有色成分的含有率例如可以为0.5质量％(mass％)以上且60mass％以下。就含有率而言，优选为5mass％以上且55mass％以下、进一步优选为20mass％以上且50mass％以下。相对于树脂材料和有色成分的总质量的有色成分的含有率可以考虑抗蚀剂所含的感光成分等的比例、按照能够构筑所希望图案的方式来适当进行设定。另外，当有色成分为颜料时，按照对于待形成的微孔、满足上述规定条件的方式来对颜料的粒径进行设定、准备。还可以和颜料一起、在树脂材料中适当添加分散剂。
当所形成的壁部树脂层由在树脂材料中混合有有色成分的材料形成时，壁部树脂层具有基于壁部树脂层中含有的有色成分的色彩。
接着，在所形成的壁部树脂层上形成贯通孔32a。如上所述，当使用光刻法时，可以简便且精度良好地形成贯通孔32a。利用注塑成型等形成壁部树脂层时，可以以同一工艺进行壁部树脂层的形成和贯通孔的形成。除此以外，还可以通过使用图案掩模的刻蚀等来形成贯通孔32a。
形成贯通孔32a时，壁部树脂层变成壁部层32，微孔阵列30完成。
之后，在微孔阵列30的周围配置周边构件34后、将盖构件20配置在周边构件34上。将基板10、周边构件34及盖构件20一体地接合时，微流体设备1完成。流路35通过周边构件34形成在盖构件20与基板10之间。接合方法并无特别限定，例如可举出利用粘接剂的接合、使用双面胶的接合、利用激光焊接的接合及利用熔焊的接合等。使用微流体设备1的试样分析方法包含加热反应时，由于可充分耐受伴随加热的内部空间S的压力上升，因此优选利用粘接剂的接合、使用双面胶的接合、利用激光焊接的接合。
另外，微流体设备1还可以将基板10和壁部层32一体成形、将周边构件34和盖构件20一体成形。图5表示将基板10和壁部层32一体成形、将周边构件34和盖构件20一体成形的微流体设备2。微流体设备2可如下制造：将与壁部层32一体成形的基板10配置在与周边构件34一体成形的盖构件20上，将通过周边构件34和盖构件20一体成形所形成的台阶部接合在与壁部层32一体成形的基板10上，从而制造。流路35通过形成于盖构件20上的台阶部而形成于盖构件20与基板10之间。
除将基板10和壁部层32一体成形、将周边构件34和盖构件20一体成形以外的微流体设备2的构成与上述微流体设备1相同。
作为其它方式，还可以是基板10和壁部层32作为分开的要素而具有、将周边构件34和盖构件20一体形成的微流体设备。此时也是，除将周边构件34和盖构件20一体形成以外的微流体设备的构成与上述微流体设备1相同。
接着，参照图6及图7对使用了本实施方式的微流体设备1的本实施方式的试样分析方法进行说明。
本实施方式的试样分析方法是使用了本实施方式的微流体设备1的试样的分析方法，其具备：
将含有试样的水性液体导入至流路35中，使所述水性液体保持在所述液滴保持部11中；
向所述流路35导入封闭液，与存在于所述流路35内的所述水性液体置换，将所述水性液体封入在所述液滴保持部11中；
在所述液滴保持部11中引起反应，产生用于检测的信号；以及
对所述信号进行检测。
这里，水性液体除了试样之外，还可以包含水、缓冲液及检测反应试剂等。另外，水性液体中还可以含有酶。例如，在试样为核酸时，可以使用PCR法、ICA法、LAMP法(注册商标、Loop-Mediated Isothermal Amplification，环介导等温扩增)、TaqMan法(注册商标)或荧光探针法等。例如，在试样为蛋白质时，可以使用ELISA法(注册商标)等。进而，还可以在水性液体中含有表面活性剂等添加物。
作为缓冲液，例如可举出Tris-HCl缓冲液、醋酸缓冲液及磷酸缓冲液等。
作为酶，例如可举出DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶及侧翼核酸内切酶等。
作为表面活性剂，例如可举出Tween 20(也称作聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯)、Triton-X100(也称作聚乙二醇单-4-辛基苯基醚(n＝约10))、甘油、辛基苯酚乙氧基酯及烷基糖苷等。
本实施方式的微流体设备例如在基因的突变检测等中要改变所封入的水性液体的温度时，也可以优选地将水性液体保持在孔室内。所改变的温度的范围，即温度变化的下限值至上限值的范围例如为0℃～100℃、优选为20℃～100℃、进一步优选为20℃～90℃、进一步优选为20℃～80℃、进一步优选为20℃～70℃。封入在孔室中的水性溶液为该范围内时，可以优选地进行PCR反应或ICA反应等在微小空间内进行的反应。
本实施方式的微流体设备由于流路的高度h小于50μm，因此在上述温度范围内加热液滴保持部11(微孔33)时，也可抑制气泡的产生。
作为使用本实施方式的微流体设备1进行分析的试样，例如可举出从血液等生物体中采集的试样。另外，利用试样分析进行检测的检测对象可以是以试样所含DNA为模板而得到的PCR产物等，还可以是人工合成的化合物(例如模拟作为试样的DNA而得到的人工合成的核酸)等。例如，以作为生物体分子的DNA作为检测对象时，孔室可以具有1分子的DNA进入的形状及大小。
所述试样中可以包含DNA、RNA、miRNA、mRNA、蛋白质或者脂质等生物体分子等。脂质还可以包含脂质双分子层膜结构体。另外，生物体分子中还可以包含从非治疗目的的人采集的细胞、或从动物采集的细胞、微生物或者细菌等。检测对象为生物体分子时，本发明一方式的试样分析方法可以称作生物体分子检测方法，生物体分子检测方法中使用的本发明一方式的微流体设备可以称作生物体分子检测设备。
以下，对试样分析方法的详细情况进行说明。作为准备工序，制备含有要封入在微孔中的试样的水性液体。含有试样的水性液体是含有检测对象的水为主要溶剂的液体，例如可举出以生物体试样为模板、作为检测试剂包含SYBR Green的PCR反应溶液，包含等位基因探针、ICA寡核苷酸、FEN-1及荧光底物等的ICA反应溶液等。在制备中还可以添加表面活性剂，使试样更容易地进入微孔内。另外，还可以添加特异性识别检测对象的微珠，预先将检测对象捕获。检测对象也可以不直接或间接地与微珠等载体结合、而是浮游在水性液体中。
接着，使用注射器等将所制备的含有试样的水性液体100从第一孔21导入到流路35中，在所述液滴保持部11中保持含有试样的水性液体(也称作试样供给工序)。所供给的含有试样的水性液体100如图6所示填充到各微孔33内及流路35中。流路35内的气体在试样供给工序之前，预先通过脱气操作而除去。该脱气操作可以通过在流路35内充满缓冲液来进行。作为缓冲液，例如可举出水、包含缓冲液的水、包含表面活性剂的水、以及包含缓冲液及表面活性剂的水等。
接着，进行将所述含有试样的水性液体100封入在液滴保持部11(微孔33)中的封入工序。封入工序之前，还可以预先对水性液体中含有的试样内的检测对象附加荧光等标记。荧光标记处理可以在试样供给工序之前、例如试样的制备时进行，还可以在试样供给工序后、将荧光标记导入流路35中。
封入工序中，使用注射器等将封闭液110从第一孔21供给至流路35。所供给的封闭液110流过流路35内，如图7所示，将存在于流路35内的含有试样的水性液体100挤向第二孔22。进而，封闭液110与填充在流路35内的水性介质100相置换，流路35被封闭液110填充。结果，所述含有试样的水性液体100仅在各微孔33内以相互间独立的状态配置，试样的封入结束。
本说明书中，封闭液110是指为了使导入至微孔阵列30的各微孔33中的水性液体彼此以相互间不混合的状态隔离而使用的液体，例如可举出油类等。作为油，例如可以使用Sigma公司制的商品名“FC40”或3M公司制的商品名“HFE-7500”、PCR反应等中使用的矿物油等。
封闭液110优选相对于壁部层32的材质的接触角为5度以上且30度以下。封闭液110的接触角为该范围时，可以优选地将试样封入在各微孔33中。封闭液110的接触角例如根据基于JIS R3257-1999所规定的静滴法、代替水而使用封闭液110进行测定即可。此外，还可以代替JIS R3257-1999所规定的静滴法，利用基于ASTM D5725-1997的方法来测定接触角。
接着，进行在所述微流体设备1的所述液滴保持部11(微孔33)中引起反应、产生用于检测的信号的反应工序。
作为用于检测的信号的例子，可举出荧光、化学发光、显色、电位变化或者pH变化等，优选荧光。
在反应工序之前，还可将微流体设备1置于热循环仪，根据需要进行PCR反应或ICA反应等酶反应等。
所述反应例如可以是生物化学反应、更具体地说是酶反应。另外，所述反应还可以加热微流体设备1来引起反应。加热时的温度根据反应来适当决定，例如为60℃以上且100℃以下。进行加热时的温度优选为60℃以上且90℃以下、更优选为60℃以上且80℃以下、进一步优选为60℃以上且70℃以下。进行加热时的温度并非是所述液滴保持部11(微孔33)内的试剂液的实际温度，而是通过热循环仪或者孵育箱等设定的微流体设备的加热温度。另外，进行加热时的温度例如为60℃以上且100℃以下是指温度的最高温度达到60℃以上且100℃以下，并无必要一直保持60℃以上且100℃以下。即，在上述变化的温度范围内，微流体设备1的温度发生变化也是没关系的。作为反应的一例，可举出信号扩增反应。信号扩增反应是在将包含用于信号扩增的酶的试剂液收容在所述液滴保持部11(微孔33)内的状态下、将微流体设备1在可获得所希望的酶活性的一定温度条件下、例如60℃以上且100℃以下维持规定时间、例如至少10分钟、优选约15分钟的等温反应。
接着，检测通过上述反应由所述液滴保持部11(微孔33)产生的信号(也称作检测工序)。例如，当信号为荧光时，在荧光显微镜中安装微流体设备1，照射激发光(电磁波)。激发光的波长根据所使用的荧光标记来适当设定。
电磁波的照射可以从微流体设备1的基板10侧进行，也可以从盖构件20侧、即微孔33的上侧进行，还可以从其它任意的方向进行。另外，电磁波照射的结果产生的荧光或者磷光的检测可以从微孔阵列的基板侧进行，也可以从孔室侧进行，还可以从其它任意的方向进行，例如使用荧光显微镜检测荧光或者磷光时，从微流体设备1的基板10侧进行是简便的。
接着，对在构成微孔阵列30的多个微孔33中有几个微孔33发出了荧光或者磷光进行测量。测量可以拍摄微孔阵列30的荧光图像、使用荧光图像来进行。
例如，在微孔阵列30内进行PCR反应，通过检测可观察到PCR扩增的微孔33中的SYBR Green的荧光，可以算出可观察到扩增的微孔33相对于全部微孔33数量的比例。检测对象例如为单核苷酸多态性(SNP：Single Nucleotide Polymorphism)时，通过计数发出荧光的微孔33的数量，可以分析SNP的出现频率等。
本发明的另一方面包含以下方式。
[31]一种微流体设备，其具有：
基板；
位于所述基板上的盖构件；
连接所述基板与所述盖构件的周边构件；
位于所述基板与所述盖构件之间、被所述周边构件划分的流路；以及
位于所述基板上、连接于所述流路的1个或多个液滴保持部，
所述流路的高度为超过0μm且30μm以下。
[32]根据[31]所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部是设置于所述基板表面上的孔。
[33]根据[31]所述的微流体设备，其具有用于向所述流路导入液体的至少1个第一孔及用于将液体从所述流路排出的至少1个第二孔，所述第一孔及所述第二孔位于夹持1个或多个所述液滴保持部的位置。
[34]根据[31]～[33]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的底部为基板侧，所述液滴保持部在所述盖构件侧具有开口，所述流路位于所述开口上。
[35]根据[31]～[34]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的每1个的容积为10fL以上且100pL以下。
[36]根据[31]～[35]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的总容积为0.2μL以上且2.0μL以下。
[37]根据[31]～[36]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的总容积相对于所述流路的容积的比率为5％以上且40％以下。
[38]根据[31]～[37]中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的深度相对于所述流路的高度的比率为3％以上且150％以下。
[39]根据[31]～[38]中任一项所述的微流体设备，其中，所述基板中形成有所述液滴保持部的区域的每单位面积的所述液滴保持部的开口部总面积的比率为23％以上且90％以下。
[40]根据[31]～[39]中任一项所述的微流体设备，其中，所述周边构件是与所述盖构件一体地形成的台阶部。
[41]一种试样分析方法，其为使用了[31]～[40]中任一项所述的微流体设备的试样分析方法，其具备：
将含有试样的水性液体导入到所述流路，使所述水性液体保持在所述液滴保持部中；
向所述流路中导入封闭液，将存在于所述流路内的所述水性液体与所述封闭液置换，将所述水性液体封入在所述液滴保持部中；
在所述液滴保持部中引起反应，产生用于检测的信号；以及
对所述信号进行检测。
[42]根据[41]所述的试样分析方法，其中，所述试样为生物体分子。
[43]根据[41]或者[42]所记载的试样分析方法，其中，所述产生用于检测的信号包含对所述微流体设备进行加热来引起所述反应，加热所述微流体设备时的温度为60℃以上。
[44]根据[41]～[43]中任一项所述的试样分析方法，其中，通过所述微流体设备的图像拍摄对所述信号进行检测。
[45]根据[41]～[44]中任一项所述的试样分析方法，其中，所述信号为荧光。
[46]根据[41]～[45]中任一项所述的试样分析方法，其中，所述反应为等温反应。
实施例
接着，示出实施例更为详细地说明本发明，但本发明并不限定于以下的实施例。
(实施例1)
准备通过注塑成型形成的COP(ZEONOR1010R、日本Zeon公司制)制基板和COP(ZEONOR1010R、日本Zeon公司制)制盖构件的2个树脂制构件。通过改变成形于COP制基板上的微小孔数，调整微小孔(即微孔)的总容积。将盖构件和台阶部一体地形成，将台阶部的高度调整为30μm，从而使流路的高度为30μm。
微小孔是将直径为10μm、深度为15μm的微小孔配置于流路面内的9000mm×30000mm的区域中。
开口面积比率是形成有微小孔的每6.5mm×9.0mm区域的微小孔的开口部总面积的比率。
基板使用厚度为0.6mm、在基板整个面上配置有微小孔、通过注塑成型而成形的基板。流路的高度的测定使用接触式测定器(TALYSURF PGI1240、Taylor Hobson公司制)。
通过激光焊接将基板与盖构件的台阶部粘贴，制作微流体设备。向形成于基板与盖构件之间的流路中注入具有表1所示组成的荧光试剂(Fluorescein、东京化成工业公司制)。进而，通过氟碳油(FC40、Sigma公司制)将多个微孔分别地封闭。此外，本实施例中未进行荧光反应，但为了成为与进行荧光反应时相同的状态，在荧光试剂中添加有酶。
表1
荧光试剂组成 最终浓度
荧光试剂 2μM
MgCl<sub>2</sub> 20mM
Tris(pH 8.5) 50mM
侧翼核酸内切酶1 0.1mg/ml
Tween20 0.05％
在66℃下加热上述微流体设备30分钟。在室温放置后，从上面、即盖构件侧确认有无气泡的产生，使用数字相机(CX-4、Ricoh公司制)进行拍摄。并且，利用荧光显微镜(BZ-710、KEYENCE公司制)、使用4倍物镜观察微小孔荧光图像。曝光时间设定为明视野20msec、使用GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)的荧光滤波器为3000msec。
表2示出了上述微流体设备的气泡的产生率。气泡产生率如下算出：准备多个相同设计的微流体设备，将1个微流体设备内具有气泡的设备个数除以进行了解析的全部微流体设备的个数，从而算出。气泡的有无判断如下：当能够以肉眼识别的尺寸的气泡存在于微流体设备内时，判断具有气泡；在相同条件下气泡不存在时，判断为没有气泡。通过上述条件能够识别的气泡的最大尺寸约为500μm以上。即便是存在小的气泡，气泡的尺寸在使用4倍物镜、利用显微镜观察微流体设备时，如果比最邻近的微小孔(即微孔)的端部与端部的距离还小，则判断为没有气泡。可以如此判断的理由是因为，当存在上述尺寸以下的气泡时，实质上不会阻碍检测，可以认为抑制了气泡的产生。
结果，如表2所示，实施例1中制造的微流体设备的气泡的产生率低。
图8示出了比较例的微流体设备中代表性气泡的观察结果(流路高度：100μm)。图8中，箭头所示的部分表示代表性的气泡产生部分。图8示出了存在数mm的气泡、并且还观察到了多个500μm左右的小气泡。使流路高度为30μm的实施例1的微流体设备减少了这种气泡的产生率。
接着，示出荧光观察结果。如图9A所示，使流路高度为30μm的实施例1的微流体设备的液滴没有溃散、能够观察微小孔(即微孔)。
(实施例2)
除了使流路的高度为20μm以外，与实施例1同样地制造微流体设备，测量气泡产生率。将其结果示于表2中。如表2所示，实施例2制造的微流体设备的气泡产生率低。
(比较例1)
除了使流路的高度为100μm以外，与实施例1同样地制造微流体设备，测量气泡产生率。将其结果示于表2中。如表2所示，比较例1制造的微流体设备的气泡产生率高。
图9B示出荧光观察结果。使流路高度为100μm的微流体设备产生多个气泡、难以观察微小孔。图9B中，箭头所示的部分表示代表性的气泡产生部分。
(比较例2)
除了使孔室的深度为3.5μm、流路的高度为100μm以外，与实施例1同样地制造微流体设备，测量气泡产生率。将其结果示于表2中。如表2所示，比较例2制造的微流体设备的气泡产生率高。
表2
Figure BDA0003221304640000231
(实施例3)
使用通过注塑成型形成的COP(ZEONOR1010R、日本Zeon公司制)制基板。微小孔是将直径为5μm、深度为3.5μm的微小孔配置于流路面内的6.5mm×9.0mm的区域中。
作为盖构件，在通过注塑成型形成的COP(ZEONOR1010R、日本Zeon公司制)制盖构件(带有送液及废液口)上，作为周边构件使用厚度为30μm的PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)基材双面胶(No.5603BN、日东电工制)。
除这些之外，与实施例1同样地制造微流体设备，测量气泡产生率。将其结果示于表3中。
此外，实施例3的微流体设备4个相连、作为一组的设备群而形成，制作3个该设备群，即共计12个微流体设备。
另外，“形成有孔的区域的比率”是形成有微小孔的区域相对于被周边构件包围的区域、即形成有流路的区域的面积的比率。
(比较例3)
除了作为周边构件使用厚度为50μm的PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)基材双面胶(型号：No.5603BN、日东电工制)以外，与实施例1同样地制造微流体设备，测量气泡产生率。将其结果示于表3中。
(比较例4)
除了作为周边构件使用厚度为100μm的PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)基材双面胶(型号：No.5603BN、日东电工制)以外，与实施例1同样地制造微流体设备，测量气泡产生率。将其结果示于表3中。
Figure BDA0003221304640000251
实施例4的微流体设备的流路的高度相当于周边构件的厚度，因此可以说为30μm。实施例4的微流体设备中，未产生气泡。
另一方面，流路高度为50μm的比较例3及流路高度为100μm的比较例4的微流体设备中，气泡产生率分别是高达50％及100％的值。
由以上确认到，当微流体设备的流路高度为50μm以上时，气泡产生率上升，而流路的高度为30μm时，会减少气泡的产生率。
产业上的可利用性
根据本发明，可以提供能够抑制形成微小液滴后进行加热时的气泡的产生的微流体设备。另外，可以提供在形成微小液滴后进行加热、光学地检测试样时能够抑制形成微小液滴后进行加热时的气泡的产生、能够提高试样的检测效率的试样分析方法。作为试样使用生物体分子时，需要用一定时间以上加热到高温，而根据本发明，即便是这种情况下也可有效地抑制气泡的产生。
符号说明
1、2 微流体设备
10 基板
11 液滴保持部
20 盖构件
30 微孔阵列
32 壁部层
33 微孔
35 流路
100 水性液体
110 封闭液

Claims (15)

1.一种微流体设备，其具有流路和与所述流路连接的1个或多个液滴保持部，所述流路的高度为超过0μm且30μm以下。
2.根据权利要求1所述的微流体设备，其进一步具有平板状的基板，所述流路位于所述平板状的基板上，所述液滴保持部是存在于所述基板上的孔。
3.根据权利要求2所述的微流体设备，其进一步具有盖构件，所述流路是被所述盖构件与所述基板夹持的空间。
4.根据权利要求2或3所述的微流体设备，其中，所述基板中形成有所述液滴保持部的区域的每单位面积的所述液滴保持部的开口部的总面积的比率为23％以上且90％以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部为多个液滴保持部。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的每1个的容积为10fL以上且100pL以下。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的总容积为0.2μL以上且2.0μL以下。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的总容积相对于所述流路的容积的比率为5％以上且40％以下。
9.根据权利要求1～7中任一项所述的微流体设备，其中，所述液滴保持部的深度相对于所述流路的高度的比率为3％以上且150％以下。
10.一种试样分析方法，其为使用了权利要求1～9中任一项所述的微流体设备的试样分析方法，其具备：
将含有试样的水性液体导入至所述流路，在所述液滴保持部中保持所述水性液体；
向所述流路中导入封闭液，与存在于所述流路内的所述水性液体进行置换，将所述水性液体封入在所述液滴保持部中；
在所述液滴保持部中引起反应，产生用于检测的信号；以及
对所述信号进行检测。
11.根据权利要求10所述的试样分析方法，其中，所述试样为生物体分子。
12.根据权利要求10或11所述的试样分析方法，其中，所述产生用于检测的信号包含加热所述微流体设备来引起所述反应，加热所述微流体设备时的温度为60℃以上。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的试样分析方法，其中，通过所述微流体设备的图像拍摄对所述信号进行检测。
14.根据权利要求10～13中任一项所述的试样分析方法，其中，所述信号为荧光。
15.根据权利要求10～14中任一项所述的试样分析方法，其中，所述反应为等温反应。
CN202080015690.1A 2019-02-27 2020-02-19 微流体设备及试样分析方法 Pending CN113454463A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-034228 2019-02-27
JP2019034228 2019-02-27
PCT/JP2020/006479 WO2020175264A1 (ja) 2019-02-27 2020-02-19 マイクロ流体デバイスおよび試料分析方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113454463A true CN113454463A (zh) 2021-09-28

Family

ID=72239508

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080015690.1A Pending CN113454463A (zh) 2019-02-27 2020-02-19 微流体设备及试样分析方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210387194A1 (zh)
EP (1) EP3933411A4 (zh)
JP (1) JPWO2020175264A1 (zh)
CN (1) CN113454463A (zh)
WO (1) WO2020175264A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023107663A1 (en) * 2021-12-09 2023-06-15 Forward Biotech, Inc. Liquid evaluation device

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005031070A (ja) * 2003-06-17 2005-02-03 Institute Of Physical & Chemical Research マイクロ流体制御機構およびマイクロチップ
JP2009090248A (ja) * 2007-10-11 2009-04-30 Fuji Xerox Co Ltd マイクロ流路構造体、マイクロ流路構造体の製造方法及びマイクロリアクター
US20130204076A1 (en) * 2010-06-25 2013-08-08 Tsinghua University Integrated microfluidic device for single oocyte trapping
CN104225964A (zh) * 2014-09-17 2014-12-24 清华大学 微流体气泡排除装置及其制备方法以及微流体器件
JP2017121728A (ja) * 2016-01-06 2017-07-13 住友ベークライト株式会社 構造体および構造体の製造方法
WO2018168819A1 (ja) * 2017-03-14 2018-09-20 凸版印刷株式会社 解析デバイス、解析キット、及び解析システム
JP2018151184A (ja) * 2017-03-10 2018-09-27 住友ベークライト株式会社 構造体および構造体の製造方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017217617A (ja) * 2016-06-08 2017-12-14 住友ベークライト株式会社 流路デバイス
WO2019131592A1 (ja) * 2017-12-26 2019-07-04 凸版印刷株式会社 標的分子の検出における偽陰性判定の発生を抑制する方法および検出デバイス
JP2019034228A (ja) 2018-12-05 2019-03-07 株式会社三洋物産 遊技機

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005031070A (ja) * 2003-06-17 2005-02-03 Institute Of Physical & Chemical Research マイクロ流体制御機構およびマイクロチップ
JP2009090248A (ja) * 2007-10-11 2009-04-30 Fuji Xerox Co Ltd マイクロ流路構造体、マイクロ流路構造体の製造方法及びマイクロリアクター
US20130204076A1 (en) * 2010-06-25 2013-08-08 Tsinghua University Integrated microfluidic device for single oocyte trapping
CN104225964A (zh) * 2014-09-17 2014-12-24 清华大学 微流体气泡排除装置及其制备方法以及微流体器件
JP2017121728A (ja) * 2016-01-06 2017-07-13 住友ベークライト株式会社 構造体および構造体の製造方法
JP2018151184A (ja) * 2017-03-10 2018-09-27 住友ベークライト株式会社 構造体および構造体の製造方法
WO2018168819A1 (ja) * 2017-03-14 2018-09-20 凸版印刷株式会社 解析デバイス、解析キット、及び解析システム

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李松晶等: "液滴微流控系统的研究现状及其应用", 液压与气动, no. 06, pages 13 - 23 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2020175264A1 (zh) 2020-09-03
US20210387194A1 (en) 2021-12-16
EP3933411A4 (en) 2022-03-23
EP3933411A1 (en) 2022-01-05
WO2020175264A1 (ja) 2020-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11097269B2 (en) Microfluidic device and sample analysis method
US11662313B2 (en) Microfluidic devices and observation methods
US10408736B1 (en) Cell capture system and method of use
CN107107058B (zh) 高清晰度微液滴打印机
US10718776B2 (en) Method for detecting biological substance
US20100252128A1 (en) Microfluidic device
US20030194716A1 (en) Device and method for performing syntheses, analylses or transport processes
EP2227690B1 (en) The micro-chamber plate, manufacturing method thereof
US11061043B2 (en) Loading station
WO2016159068A1 (ja) マイクロウェルアレイ及びその製造方法、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及び水性液体の分析方法
US20210394185A1 (en) Microfluidic device and sample analysis method
CN110312923A (zh) 解析设备、解析试剂盒及解析系统
JP2017072476A (ja) マイクロウェルアレイ、マイクロ流体デバイス、マイクロウェルアレイのウェル内に水性液体を封入する方法及びマイクロウェルアレイの製造方法
US20210387194A1 (en) Microfluidic device and sample analysis method
US7022157B2 (en) Devices and methods for performing array based assays
US9975125B2 (en) Microsieve diagnostic device in the isolation and analysis of single cells
US20200224253A1 (en) Method of detecting nucleic acid and detection reagent
JP2021004884A (ja) 生体分子の分析方法
JP7485004B2 (ja) 核酸検出方法および検出用試薬
JP2017134005A (ja) アレイデバイス及び生体分子解析用キット
WO2023214516A1 (ja) 検出キット、封止液、封止液の保存方法及び試料検出方法
CN116057386A (zh) 流体设备及其用途
CN111019805A (zh) 用于单细胞固定并原位进行医学分析的微流控芯片装置及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination