CN104254596A - 自动化胞浆内精子注射辅助授精系统 - Google Patents
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Abstract
一种包括微流体盒的集成自动化系统和其使用方法，其用于胞浆内精子注射辅助授精。所述微流体盒和所述集成自动化系统提供人类配子用于辅助体外授精的完整设置，包括适当细胞阶段识别、经由微流体流进行的配子推进、将精虫显微注射进入卵母细胞以及后续胚胎培养和监视，因此因促进可承受性而使得体外授精广泛分布。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年4月16日提交的美国临时申请序列号61/624,490的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文中。
发明领域
本发明涉及一种使用微流体平台来辅助生殖的装置和系统。更具体地说，本发明涉及一种包括微流体装置盒的集成自动化授精系统和其使用方法，其用于体外卵母细胞卵丘去除、卵母细胞成熟、精子选择和胞浆内注射以及体外授精和胚胎培养和发育。
发明背景
在20世纪70年代，体外程序的引入使得旨在治疗输卵管性不孕症夫妻的在体外形成人类胚胎成为可能。以辅助生殖技术(ART)所实现的早期成功尽管很小但激励了人们一方面提高效率另一方面将治疗扩展到其它不孕迹象的雄心。在1992年，这种为解决困扰早期辅助授精周期的授精失败而作出的巨大努力引起胞浆内精子注射(ICSI)的发展。此体外程序已允许医生准确确定涉及亲本配子相互作用的初始步骤。
就高且一致的授精率而言，精子注射操作的可靠性已使得此配子授精方法在全世界广泛应用。ICSI现已在至少53个国家中执行且目前已产生约2百万个婴儿。不幸的是，在此普遍使用的同时可承受性尚未增加，通过健康保险也未提高使用率。此外，由不同国家所报导的数据的结果不一致将要求以增强的质量控制提高标准化。然而，尽管ICSI是被开发作为男性不育症的治疗手段，但其已成为优选授精方法，以超过70％的比率在大型中心执行。因此，需要开发执行ICSI的自动化系统，其将成为唯一体外授精方法。
Cho等人已描述一种用以分选精子样品的重力驱动泵送系统(Cho等人.2003,Passively driven integrated microfluidic system forseparation of motile sperm,Anal Chem.75(7):1671–1675)。所述装置(称为微米级集成精子分选器(MISS))含有入口/出口、流体储集器、重力驱动电源以及具有层流的汇聚微通道，所有集成组件一起工作以促进精子分选。此装置被设计成使得在微通道内精液和培养基的汇聚流将以层流形式平行流动。两个平行流仅在液流之间的界面处通过扩散混合，但活动精子能够游过接触流线并且进入培养基以供收集。非活动精子、细胞碎屑以及精浆不穿过此屏障而穿梭进入废物储集器。
Suh等人已描述为形成一些微流体组件(即用于精子选择、卵母细胞处理、显微授精(而非ICSI)以及胚胎操纵和培养的组件)而作出的最初努力，以及对集成系统的需要和集成系统的益处(Suh等人.2003,Rethinking gamete/embryo isolation and culture with microfluidics,HumReprod Update.9(5):451-61；Suh等人.2005,Microfluidic Applicationsfor Andrology,J Androl.26(6):664-70)。
Smith等人已于2011年提供一篇综述，其论述了精子选择并且推测了小鼠卵母细胞的显微授精和胚胎培养(Smith等人.2011,Microfluidics for gametes,embryos,and embryonic stem cells,SeminReprod Med.29(1):5-14)。Smith是医疗装置公司Incept BioSystemsTM,的共同创始人，该公司使用其“辅助生殖技术系统(System forMicrofluidic Assisted Reproductive Technology；SMART)”来形成微流体IVF系统。其首个产品是一种用于胚胎培养的装置。
Unisense FertiliTech A/S出售一种自动化胚胎培养箱，其合并了完全稳定的培养环境与集成的呼吸和延时图像采集；后述者允许进行胚胎评估(Raty等人.2004,Lab on a Chip,4:186-190)。
Lu等人已描述一种置于显微镜上的一次性芯片，其中精子和卵母细胞置于2个单独的腔室中；选择精虫并且由操作人员实行对所有卵母细胞执行机器人化ICSI(Lu等人.2011,Robotic ICSI,IEEE TransBiomed Eng,58:2102-2108)。Adamo和Jensen也展示了对向单个细胞中显微注射荧光染料的想法的证明(Adamo和Jensen 2008,Lab on aChip,8:1258-1261)。
现有技术中所描述的装置执行体外授精从精子和卵母细胞制备变化到实际授精随后胚胎培养的不同方面。虽然上文提到的现有技术描述了为产生完整自动化系统的组件所作的努力，但此类系统尚未形成。
发明概述
本发明提供一种用于使用ICSI执行辅助授精的集成自动化系统，其开始于卵母细胞卵丘去除，精子选择和固定化，ICSI注射以及胚胎培养和选择。此自动化系统因促进可承受性而使得体外授精广泛分布。
在某些实施方案中，本发明提供一种用于胞浆内精子注射辅助授精的一次性封闭式微流体盒装置，其包括：a)卵母细胞储集器，其包括卵母细胞室、入口以及出口；b)与卵母细胞储集器出口选择性流体连通的卵母细胞卵丘去除通道；c)与卵母细胞卵丘去除通道选择性流体连通的卵母细胞固定化站；d)精子储集器，其包括精子室、入口以及出口；e)与精子储集器出口选择性流体连通的活动精子分离通道；f)与活动精子分离通道选择性流体连通并且与卵母细胞固定化站选择性流体连通的活动精子固定化站；以及g)与卵母细胞固定化站选择性流体连通的胚胎培养室。
在某些实施方案中，封闭式微流体盒装置的卵母细胞卵丘去除通道的下游部分的宽度可比卵母细胞室窄，从而允许卵母细胞独立行进。在某些实施方案中，卵母细胞卵丘去除通道的一部分的宽度为约200μm。在其它实施方案中，卵母细胞卵丘去除通道具有一个或多个90°弯曲，从而使得卵母细胞旋转以去除卵丘细胞。在某些实施方案中，封闭式微流体盒装置的卵母细胞卵丘去除通道具有与其选择性流体连通的带阀卵丘废物出口。
在某些实施方案中，本发明的封闭式微流体盒装置中的活动精子分离通道具有与其选择性流体连通的非活动精子出口或容纳室。在其它实施方案中，活动精子固定化站包括胞浆内精子注射系统。
在其它实施方案中，封闭式微流体盒装置还包括多个上游卵母细胞储集器，其与多个卵母细胞卵丘去除通道下游选择性流体连通，所述多个卵母细胞卵丘去除通道又与卵母细胞固定化站下游选择性流体连通。在某些实施方案中，封闭式微流体盒装置进一步包括多个与卵母细胞固定化站选择性流体连通的下游胚胎培养室。
在某些实施方案中，在封闭式微流体盒装置的各组件中的选择性流体连通可由一个或多个包括纳米电极模块的压电闸门控制。在某些实施方案中，在封闭式微流体盒装置中的各通道、储集器、腔室、入口、出口、站或组件中涵盖一个或多个观察站，用于监视和评估卵母细胞、精子以及胚胎。
本发明进一步提供一种用于自动化胞浆内精子注射(ICSI)辅助授精的系统，其包括本发明的封闭式微流体盒装置和用于功能啮合微流体盒装置的机器，所述机器包括中央处理单元(CPU)和软件，所述软件用于自动化监视和控制ICSI过程，包括用于微流体行进的相连接的通道、腔室、储集器、入口、出口之间的选择性连通；卵母细胞、卵母细胞卵丘去除、卵母细胞选择和固定化、活动精子分离、活动精子固定化、胞浆内精子注射以及胚胎培养。
在某些实施方案中，具有用于胞浆内精子注射辅助授精的本发明自动化系统的机器进一步包括连接到CPU的多个数码摄像机和相关联的远程视频监视器。在某些实施方案中，CPU和相关软件自动控制装置的温度和内部压力以及细胞培养基诸如经由卵母细胞储集器入口、精子储集器入口或胚胎发育室的添加。
在一些实施方案中，具有用于胞浆内精子注射辅助授精的本发明自动化系统的机器通过在卵母细胞固定化站中的微通道中形成负压来控制卵母细胞固定化站。在一些实施方案中，具有用于胞浆内精子注射辅助授精的本发明自动化系统的机器如下控制胞浆内精子注射：通过由压电吸管施加电场以穿透卵母细胞并且接着在压电吸管内部施加微流体压力以使精子定位到卵母细胞中。
本发明还提供一种用于自动化胞浆内精子注射辅助授精的方法，其包括：使精子与卵母细胞在与用于其在封闭系统内的操作的机器啮合的连续路径微流体盒装置中组合。
附图简述
图1示出了本发明的一个实施方案在俯视图中的示意图，包括精子和卵母细胞室、压电装置、使卵丘-卵母细胞复合物去冠化(decoronized)并且去除卵丘细胞的区域、使卵母细胞去活动化(具有用于所述去活动化的真空通道的配置)并且注射精子的区域以及胚胎监视和发育室。进一步描绘用于注射精子的吸管；激光精子固定化装置；以及激光精子捕获和定位装置。
图2示出了在正交视图中的图1系统。
图3示出了本发明的一个实施方案在俯视图中的示意图，包括精子和卵母细胞室、压电装置、具有进入废物室的出口并且使卵丘-卵母细胞复合物去冠化并且去除卵丘细胞的腔室、使卵母细胞去活动化并且注射精子的配置和区域以及胚胎监视和发育室。进一步描绘用于允许受精卵母细胞移动到胚胎监视和发育室的配置和阀门系统。进一步描绘用于注射精子的吸管；激光精子固定化装置；以及激光精子捕获和定位装置。
图4示出了系统的一个实施方案的正交视图，包括精子和卵丘卵母细胞复合物室、压电装置、具有到达废物室的出口并且使卵丘-卵母细胞复合物去冠化并且去除卵丘细胞的腔室、废物室、使卵母细胞去活动化并且注射精子的配置和区域、用于固定化卵母细胞的抽吸装置以及胚胎监视和发育室。还描绘了激光精子固定化装置和激光精子捕获和定位装置。进一步描绘用于注射精子的吸管；激光精子固定化装置；以及激光精子捕获和定位装置。
图5是系统的一个实施方案的顶视图，包括精子和卵丘卵母细胞复合物室、具有废物通道和用于添加和除去培养基的通道的三阀门剥蚀室、压电装置、使卵母细胞去活动化并且注射精子的配置和区域、用于固定化卵母细胞的抽吸装置以及胚胎监视和发育室。还描绘了用于注射精子的吸管和激光精子固定化装置以及激光精子捕获和定位装置。还描绘了两个电极(含有X的圆圈)。
图6是图5中所示的系统的一个实施方案的正交视图。从这个视角来看，更显而易见的是激光-辅助精子固定化和对准组件，经由光发射装置促进其在注射之前沿注射吸管的长度对准。
图7说明卵丘去除。在此腔室中，倾倒透明质酸酶以起始从卵细胞中去除卵丘细胞。宽度为约200μm的出口腔室的漏斗形状将允许卵细胞独立行进。通过通道行进是借助微流体流来执行。
图8说明第二卵丘细胞去除腔室。在此部分中，使用压电闸门来形成分离的腔室，其中通过抽吸来完成卵丘细胞的去除。嵌入PDMS的纳米电极模块引起通道变窄/封闭。通过通道行进是借助微流体流来维持。
图9说明卵细胞成熟评估。在此部分中，通过视频来评估卵母细胞成熟度。连接到计算机处理器和软件的摄像机装有形态识别系统，其辨别细胞是否带有极体。此系统随后发送信号给控制选择的软件。卵细胞保持在适当的位置和取向是通过一对电极来实现，所述电极置于通道壁内的相对位置并且将允许传递AC电流。分配到未成熟室或行进到注射部分是通过流体运动来调节。
图10说明精子选择。精子选择是通过重力驱动泵送系统来获得。将样品加载到A腔室中，并且将新鲜培养基放置于腔室B中。仅活动精子能够穿过层流液流的界面，离开进入腔室C。非活动精子、碎片以及一些非活动精子被收集于腔室D中。
图11说明ICSI注射。通过由侧边微通道产生的真空将借助微流体流移动的MII卵母细胞固定化。单个精子细胞的注射是使用压电吸管首先施加电场以穿透卵母细胞并且随后在微工具内部施加流体压力以使精子定位到卵母细胞中来实现。自始至终使用摄像机系统监视注射。通过机械抽吸压力来取回卵母细胞。所注射的卵母细胞通过微通道行进是借助微流体流来进行。
图12说明胚胎培养。在注射之后，卵母细胞借助微流体流移动到微通道末端并且分配到通道部分。使用摄像机系统来分析其发育，直到其被拾取并且用于传输的时刻为止。
图13说明整个微流体盒芯片系统，其包括用于卵母细胞卵丘去除室的下部隔室、用于卵母细胞成熟评估的中心隔室、用于精子选择、ICSI注射的左隔室以及用于胚胎培养的上部隔室。
图14说明用于卵母细胞卵丘去除室的隔室和闸门。
图15说明用于精子选择、固定化、ICSI注射以及胚胎培养的隔室。
图16说明个别卵母细胞经由多个微通道或具有闸门的微腔室进行分配用于第二卵丘去除。
图17说明经由多个微通道或腔室监视和评估个别胚胎。
本发明的详细描述
在以下描述中，参照了构成其一部分的附图，并且在附图中通过说明可能实施的具体实施方案的方式示出。这些实施方案进行了详细描述，以使得本领域技术人员能够实施本发明，并且应了解，可使用其它实施方案并且可作出逻辑变化而不背离本发明的范围。因此，以下对示例性实施例的描述不以限制意义呈现，并且本发明的范围由随附权利要求书限定。
本文提供摘要遵照37C.F.R.§1.72(b)以允许读者快速确定技术性公开的本质和要领。提交摘要时应具有以下理解：其将不会用以解释或限制权利要求书的范围或含义。
本发明提供一种微流体ICSI自动化系统，其提供从精子制备开始一直到胚胎培养的完整辅助授精设置。此自动化系统因促进可承受性而提供体外授精的广泛分布。本发明的某些实施方案包括但不限于以下特征：用于促进去冠化和卵丘细胞去除的COC-MII卵母细胞洗涤室；激光辅助配子固定化和对准结合自动化注射系统以及电流促进的细胞对准。
在某些实施方案中，本发明提供一种用于胞浆内精子注射辅助授精的封闭式微流体盒装置，其包括：a)卵母细胞储集器，其包括卵母细胞室、入口以及出口；b)与卵母细胞储集器出口选择性流体连通的卵母细胞卵丘去除通道；c)与卵母细胞卵丘去除通道选择性流体连通的卵母细胞固定化站；d)精子储集器，其包括精子室、入口以及出口；e)与精子储集器出口选择性流体连通的活动精子分离通道；f)与活动精子分离通道选择性流体连通并且与卵母细胞固定化站选择性流体连通的活动精子固定化站；以及g)与卵母细胞固定化站选择性流体连通的胚胎培养室。
为促进对本发明的理解，以下定义多个术语和短语。如本文所用，“一个(或一种)(a/an)”意思是一个或多个(一种或多种)，这取决于其使用的上下文。
如本文所用，微流体阐述微升和纳升体积的流体的特性、具体控制以及操纵。微流体系统被设计成用于在ICSI过程的各种离散阶段中卵母细胞、胚胎、精子、培养基组分的单向流动。微流体装置和用于构建微流体装置的组件的材料和技术的示例性非限制性实例描述于例如Smith等人,2011,Microfluidic for Gametes,Embryos,andEmbryonic Stem Cells,Semin Reprod Med 29(1):5-14；以及Smith等人的US 2013/0034906(其各自以全文引用的方式并入本文中)中。
如本文所用，术语“卵母细胞”是指雌性配子细胞、雌性配子、参与生殖的生殖细胞、未成熟卵母细胞或母细胞。用于本发明的优选精子是哺乳动物精子，包括但不限于人类、家畜(包括但不限于牛、猪和绵羊)和伴侣动物(包括但不限于犬和猫)精子精子。
如本文所用，术语“卵丘细胞”是指在发育中的卵泡中的在卵母细胞处或靠近卵母细胞的细胞。卵丘细胞是在卵泡中以及排卵之后包围卵母细胞的颗粒细胞。如本文所用，术语“卵丘-卵母细胞复合物”是指彼此物理结合在一起的至少一个卵母细胞和至少一个卵丘细胞。
如本文所用，术语“卵母细胞成熟”是指制备卵母细胞用于授精的生物化学事件。此类过程可包括但不限于减数分裂II的完成。术语“卵母细胞核成熟”具体地说是指此类减数分裂II的完成。术语“卵母细胞胞浆成熟”具体地说是指胞浆事件，其发生以逐渐赋予卵母细胞完成核成熟、授精和/或早期胚胎形成的能力。卵母细胞胞浆成熟事件可包括但不限于mRNA、蛋白质、底物以及营养物的累积，其为实现促进胚胎发育能力的卵母细胞发育能力所需要的。
如本文所用，术语“精子(sperm/spermatozoa)”是指雄性生殖配子或雄性配子细胞。活动的单鞭毛精子细胞也称为精虫，而非活动精子细胞也称为不动精子。用于本发明的优选精子是哺乳动物精子，包括但不限于人类、家畜(包括但不限于牛、猪和绵羊)和伴侣动物(包括但不限于犬和猫)精子精子。
如本文所用，术语“胚胎”是指用精子授精的卵母细胞。胚胎是从第一次细胞分裂直到出生或发芽为止处于最早发育阶段的多细胞二倍体真核细胞。在有性繁殖的生物体中，一旦精子使卵细胞或卵母细胞受精，所得细胞就称为受精卵，其具有其亲本各一半的DNA。受精卵将开始通过有丝分裂进行分裂，以产生称为胚胎的多细胞生物体。
如本文所用，术语“细胞”是指位于体外或体内的任何真核细胞，包括哺乳动物细胞、鸟类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞以及昆虫细胞。如本文所用，术语“细胞培养物”是指任何体外细胞群体。此术语内包括连续细胞系(例如具有永生化表型)、原代细胞培养物、转化细胞系、有限细胞系(例如非转化细胞)以及在体外维持的任何其它细胞群体。
如本文所用，术语“体外”是指人工环境以及人工环境内发生的过程或反应。体外环境可以由试管和细胞培养物组成但不限于此。术语“体内”是指天然环境(例如动物或细胞)以及天然环境中发生的过程或反应。
如本文所用，术语“介质”或“流体介质”是指系统内的任何流体。在一些实施方案中，介质或流体介质与细胞培养物相容(例如支持细胞生存；支持细胞生长；支持细胞发育；不对细胞造成毒性或死亡)。
如本文所用，术语“通道”、“微通道”、“腔室”、“微腔室”以及“储集器”可互换使用，并且指结构性微流体通路或容器。在一些实施方案中，通道可包括进入材料表面的三维突出物。在一些实施方案中，通道形状是细长的(例如矩形棱柱体)。通道能够容纳或传输含细胞或其它生物组分的流体。如本文所用，术语“动态流动”是指流体系统的状态，其中流体通过系统经历动态运动。
如本文所用，术语“选择性流体连通”意思是流体通路存在于两个所提到的用于传送材料(即流体介质中的细胞)的结构之间，通过其传送可由操作者选择性地打开、变窄、加宽或关闭或通过CPU和软件自动化算法控制。微流体通道(或通道、储集器、腔室、站等之间)的选择性流体连通可通过已知的和以后开发的系统(包括压电闸门、物理夹具、电场以及流体压力产生)来实现。
如本文所用，“封闭式”意思是微流体系统是可密封地包含并且连续的，不过如本文所描述可沿通路布置各种可密封入口和出口，并且诸如由压电闸门形成的暂时阻塞可选择性阻止各阶段之间的流体流。
本发明提供一种用于胞浆内精子注射辅助授精的封闭式微流体盒装置，其包括一个或多个卵母细胞室和卵丘去除通道。在某些实施方案中，封闭式微流体盒装置的卵母细胞卵丘去除通道的一部分的宽度比卵母细胞室窄，从而允许卵母细胞独立行进。在某些实施方案中，卵母细胞卵丘去除通道的所述部分的宽度为约200μm。在其它实施方案中，卵母细胞卵丘去除通道具有至少一个90°弯曲，从而使得卵母细胞旋转以去除卵丘细胞。在某些实施方案中，封闭式微流体盒装置的卵母细胞卵丘去除通道具有与其选择性流体连通的废物出口。在某些实施方案中，封闭式微流体盒装置还包括与多个卵母细胞卵丘去除通道选择性流体连通的多个卵母细胞储集器，所述多个卵母细胞卵丘去除通道与卵母细胞固定化站选择性流体连通。在某些实施方案中，封闭式微流体盒装置进一步包括多个与卵母细胞固定化站选择性流体连通的胚胎培养室。
本发明提供一种用于胞浆内精子注射辅助授精的封闭式微流体盒装置，其包括精子储集器，所述精子储集器包括精子室、入口以及出口；与精子储集器出口选择性流体连通的活动精子分离通道；以及与活动精子分离通道选择性流体连通并且与卵母细胞固定化站选择性流体连通的活动精子固定化站。在某些实施方案中，本发明的封闭式微流体盒装置中的活动精子分离通道具有与其选择性流体连通的非活动(immotile/non-motile)精子出口。在其它实施方案中，活动精子固定化站包括胞浆内精子注射系统。
本发明的微流体装置可设计成一次性生物盒，并且可由本领域中目前已知的或以后开发的任何适合的材料构成。在某些实施方案中，本发明的微流体装置可用惰性聚合有机硅聚合物(如聚(二甲基硅氧烷)(PDMS))制造，其中组分成层/纺丝技术可铸造细胞通道和腔室。软光刻技术可用于直接在芯片上对所需腔室进行打印。流体处理材料可以是无毒、绝缘、透气的。PDMS允许在模制情况下的亚微米精度，在低温下固化，并且本身可轻易密封。形成腔室分隔所需的阀系统可以是通过气动特征操纵的膜，并且使空气通道穿入PDMS基质中。
在某些实施方案中，通过任何合适的方法向装置中供应或从装置中去除流体。可例如通过注射器或附接或结合至入口通道的微管等来供应或去除流体。举例来说，可经由入口通道或其它可再密封端口开口将精子和卵母细胞供应到装置中。
流体流可通过任何合适的方法来形成。举例来说，适合用于泵送少量液体的外部微型泵是可用的。微型泵还可以设置在装置本身中，由温度梯度、磁场和/或电场、所施加的压力等驱动。所有这些装置均为熟练技工已知的。Weigl等人,Proceedings of MicroTAS 2000,Enshede,Netherlands,第299-302页(2000)(其以全文引用的方式并入本文中)描述了被动驱动泵送系统与微流体通道的整合。
在其它实施方案中，通过重力流泵、通过毛细作用或通过这些方法的组合形成流体流。一个简单的重力流泵由装置外部或内部的流体储集器组成，所述流体储集器以高于(就重力而言)各别装置出口的水平含有流体。此类重力泵具有以下缺陷：静水压头并且因此流速随着储集器中流体的高度下降而变化。对于许多装置来说，相对恒定且非脉动流为理想的。
可使用如已公布的PCT公布号WO 03/008102(以引用的方式并入本文中)中所公开的重力驱动泵。在此类装置中，使用水平储集器，其中流体水平移动，从而防止储集器中因表面张力和液体和储集器壁之间的毛细管力造成的垂直崩溃。由于液体的高度保持恒定，所以静水压头没有变化。
流体还可通过毛细管作用来诱导。在这种情况下，各别出口通道或储集器中的流体将相对于其通道或储集器壁展现与相关联装置中的毛细管力相比较高毛细管力。毛细管力的这种差异可通过若干方法来产生。举例来说，出口和入口通道或储集器的壁可具有不同疏水性或亲水性。或者，使得出口通道或储集器的横截面积较小，从而展现较大毛细管力。
在一些实施方案中，通过在加压时在独立通道中泵送流体的嵌入型电容器阀门来促进流动。这是如下来实现的：使底部具有一系列阀门，其引导加压气体或液体，从而引起膜变形并且在顶部通道中向前挤出液体。其它控制是通过使顶层中具有可依序打开的阀门来提供。
在某些实施方案中，封闭式微流体盒装置的各组件中的选择性流体连通可由微流体通道中的一个或多个压电闸门控制，所述一个或多个压电闸门包括连接到整个系统的CPU和软件控制器的纳米电极模块，其将在下文中更详细描述。在某些实施方案中，用于视频监视和评估卵母细胞、精子以及胚胎的一个或多个观察站涵盖于封闭式微流体盒装置的一个或多个组件或站中。
本发明进一步提供一种用于自动化胞浆内精子注射辅助授精的系统，其包括本发明的封闭式微流体盒装置和用于功能啮合微流体盒装置的机器，所述机器包括中央处理单元(CPU)和软件，所述软件用于自动化监视和控制用于微流体行进的选择性连通、卵母细胞卵丘去除、卵母细胞选择和固定化、活动精子分离、活动精子固定化、胞浆内精子注射以及胚胎监视。
在某些实施方案中，具有用于胞浆内精子注射辅助授精的本发明自动化系统的机器含有插孔或对接站，用于整合一次性微流体盒装置。所述机器可进一步包括连接到CPU和软件的多个数码摄像机和远程视频监视器，用于观察和记录在盒内各种相应站处的细胞。在某些实施方案中，CPU和软件自动控制装置的温度、pH值和压力以及向卵母细胞储集器和精子储集器中或在任何沿通路所选的点处添加细胞培养基。
在一些实施方案中，具有用于胞浆内精子注射辅助授精的本发明自动化系统的机器通过在微流体盒的卵母细胞固定化站中的微通道中形成负压(真空)来控制卵母细胞固定化站。在一些实施方案中，具有用于胞浆内精子注射辅助授精的本发明自动化系统的机器如下控制胞浆内精子注射：通过由压电吸管施加电场以穿透卵母细胞并且接着在压电吸管内部施加微流体压力以使精子定位到卵母细胞中。
本发明进一步提供用于自动化胞浆内精子注射辅助授精的方法，其包括使用本文所描述的系统将精子与卵母细胞在连续路径微流体盒装置中组合。本发明还提供用于制造如本文所描述用于ICSI的盒装置、机器以及系统的方法。
装置的各种非限制性实施方案描绘于本文所参考的图1-17中。本发明的用于胞浆内精子注射辅助授精的封闭式微流体盒装置包括：a)卵母细胞储集器(100)，其包括卵母细胞室(101)、入口(102)以及出口(103)；b)与卵母细胞储集器出口选择性流体连通的卵母细胞卵丘去除通道(104)；c)与卵母细胞卵丘去除通道选择性流体连通的卵母细胞固定化站(120)；d)精子储集器(200)，其包括精子室(201)、入口(202)以及出口(203)；e)与精子储集器出口选择性流体连通的活动精子分离通道(204)；f)与活动精子分离通道选择性流体连通并且与卵母细胞固定化站选择性流体连通的活动精子固定化站(220)；以及g)与卵母细胞固定化站选择性流体连通的胚胎培养室(300)。
一旦卵母细胞和精子被置于装置中其各自的腔室(101，201)中，系统就可密封并且激活，并且可通过自动化系统执行以下步骤，借此还可监视个别步骤以便进行手动超控。当然，方法的某些改进预期将在本领域技术人员的技术范围内，并且因此在本发明的范围内。
培养并监视卵丘-卵母细胞复合物(COC)(106)直到其达到中期II，此时其必定是去冠化的并且去除了卵丘细胞。剥蚀或振动模块室(109)可暂时借助于如图3、4以及5中的不同实施方案中所描绘的一个或多个阀门(112)或如图1中所描绘的装置区域来形成。可将透明质酸酶(110)添加到剥蚀室中，以去冠化卵母细胞。用透明质酸酶溶液培养的时间可以是例如介于2分钟与15分钟之间；介于5分钟与12分钟之间，以及介于7分钟与11分钟之间。透明质酸酶可以是重组的。每个卵母细胞的透明质酸酶浓度可介于10IU/ml与40IUs/ml之间。接着，可振动剥蚀室或区以进一步清除卵母细胞，并且可施加真空(113)(如图1、3以及5中所示)以去除碎片，所述碎片可沉积到如图4中所示的废物室(105)中，或穿过如图3、5、8、13以及14中所示的卵丘通道出口(115)。
可进一步如图8、13以及14中所示通过穿过经由一个或多个压电闸门(400)通过压力梯度控制的狭窄通道(104)来帮助去冠化。在倾倒透明质酸酶溶液后，使剥裸的卵母细胞(107)在新鲜培养基中静置约2小时。还可以将剥裸的卵母细胞引入模块室(109)，其中遍布低温保护剂梯度将允许内部具有样品的模块室玻璃化。
细胞可以借助于蠕动泵、通过压力门控或通过控制电磁场通过流体流被驱动穿过芯片。如果装置由包括但不限于PDMS的弹性化合物制成，那么其选定部分可机械压缩或释放到控制阀，促进传送，并且促进蠕动行进。
在剥裸的中期II卵母细胞到达卵母细胞固定化站(其可如图1、2、3、5以及6中所示由腔室壁中的凹入部或由腔室壁的至少一个凸出部形成)以便注射之后，其可经由电流、诸如直流(DC)对准(111)沿注射路径对准。完全剥裸的中期II卵母细胞(108)可如图1、4、5以及11中所示借助于抽吸装置(113)或如图3中所示凭借流体流固定化。完全剥裸的中期II卵母细胞(108)的极体可对准以便通过如图5中所示在电极(121)两端施加交流电以便进行适当注射。这些电极还可以位于卵母细胞的正交对角线的两端或呈任何其它取向以便允许卵母细胞适当取向。
就精子而言，在沉积到精子室(200)中之后，分选精子细胞并且使所选精子汇集到具有入口(202)和出口(203)的注射室(201)中。精子注射室(201)可以是深约5微米的有斑点的腔室，其中精子驻留在单个层中。接着，可通过使用摄像机(407)观察精子和识别具有最佳形态(形状)和运动性的精子的计算机辅助分析软件来对个别精子进行选择。可用激光器捕集所选精子并且将其引入吸管。或者，可在精子室中形成层流并且接着仅将能够穿过所述层的精子引导进入诸如图10中所示的吸管。
在吸管中，精子可被捕获并且诸如本领域已知使用激光捕集和移动控制系统(425)对准；所述系统可沿吸管的长度对准。可通过使用激光来破坏所捕获的精子的鞭毛或膜来固定化精子。
用图11中所示的钝吸管注射已固定化并且对准的卵母细胞，所述钝吸管是在压电装置(430)的控制下起作用，图1-6、11以及15中所示的压电装置促进卵母细胞穿透。压电装置和吸管又安装在滑动平台(未示出)上，所述滑动平台在CPU和软件的控制下可将移液管推进到卵母细胞表面，并且接着进入人类卵母细胞约75微米(对小鼠来说为30微米)。成功穿透卵膜是通过已知膜片钳技术(未示出)来确认。
腔室壁中吸管进入微流体室的区域可由不同于腔室壁其余部分的材料制成，以允许穿透腔室壁并且在抽出吸管之后再密封腔室壁。或者，腔室壁可由自密封材料构成。
一旦所有受精卵母细胞已行进到胚胎培养室(300)中，就将受精胚胎培养一段时间，所述时间可为约16到18小时。所述时间结束时，检查胚胎以确定其是否已发育成由两个不同的极体和两个前核构成的受精卵。未受精的卵母细胞可被自动选择并且例如通过激光捕获和移动系统经由废物端口(未示出)从胚胎培养系统中去除。
剩余的胚胎(301)在其各种阶段中在同一腔室内培养，因为不同类型培养基的更新可通过其它微流体端口来完成。条件培养基胚后培养可使用谢物组学分析来评估。如果分离个别胚胎并且使用类似于显微注射的工具在腔室中以手术方式进行活检，那么可以对活检胚胎进行遗传筛检。胚胎还可以分离到不同腔室中，用于成熟和低温保存。
应对微流体盒装置进行温度控制并且必须监测流入其中的培养基的pH值和渗透压变化。所述系统包括针对温度、pH值、渗透压以及离子转运的传感器。传感器经由导线或以无线方式可操作地连接到CPU和软件控制系统，其监测各参数以确保其在人类生理范围内，并且如果在任一方向上超出所述范围，那么控制系统相应地发挥作用以增加或降低温度、pH值、渗透压以及离子转运，从而使系统保持在人类生理参数以内。
所述系统包括用于至少三种流体的储集器。用于卵丘去除的透明质酸酶溶液；碱性溶液，诸如购自Vitrolife的G1；以及胚胎培养溶液，诸如购自Vitrolife的G2。
在注射步骤之前，在系统中装入G1溶液或其等效物。所有注射完成之后，在系统中装入G2或等效溶液。用第二溶液替换第一溶液可逐渐进行，例如历经一小时的过程来进行。
以下进一步提供对如在图13中一起显示的整个本发明微流体盒的各隔室的更详细描述，包括用于卵母细胞卵丘去除室的下部隔室；用于卵母细胞成熟评估的中心隔室；以及用于精子选择和ICSI的左隔室和图顶部所示的用于胚胎培养的隔室。
卵母细胞卵丘去除室和闸门显示于图7、8以及14中。图7和8更详细地说明卵丘去除，包括第一和第二卵丘去除室和闸门。以下提供卵丘去除的示例性非限制性实例。在图7中所示的用于第一/初始卵丘去除的腔室中，倾倒透明质酸酶(110)以起始从卵细胞中去除卵丘细胞。在某些实施方案中，宽度为约200μm的出口腔室(103)的漏斗形状将允许卵细胞独立行进。通过卵丘去除通道(104)行进是借助微流体流来执行。图8说明第二卵丘细胞去除腔室，其中使用压电闸门(400)来形成分离的腔室，在所述分离的腔室中通过抽吸来完成卵丘细胞的去除。嵌入PDMS的纳米电极模块引起通道变窄/封闭。通过通道行进是借助微流体流来维持。如所论述，微流体流可通过任何合适的方法经由被动或主动手段来实现，包括但不限于以单向或反向交换模式蠕动泵送。微流体流可以是脉冲型或连续型，并且不受动态流速率限制。
在某些实施方案中，对于初始和/或第二卵丘去除来说，各个别卵母细胞可如图16中所示分配于各微流体通道或具有闸门的腔室中。在某些实施方案中，卵丘去除过程可使用计算机辅助程序经由视频(405)监测。关于用于从卵母细胞中去除卵丘的示例性微流体装置，参见Beebe的美国专利号6,695,765、Dodgson的美国公布号2007/0264705以及Craig的美国公布号2011/0250690，其各自以全文引用的方式并入本文中。
图9说明卵细胞成熟评价，其中卵母细胞成熟度是通过视频(405)来评估。连接到计算机软件的摄像机(406)装有形态识别系统，其辨别细胞是否带有极体。此系统随后发送信号给控制选择的软件。卵细胞保持在适当的位置和取向是通过电极(121)来实现，所述电极置于通道壁内的相对位置并且将允许传递AC电流。经由卵母细胞舍弃出口(118)分配到未成熟室(119)或行进到注射部分是通过流体运动来调节。关于用于体外哺乳动物卵母细胞培养和成熟的微流体装置和方法的更详细描述参见美国公布号2013/0034906，其以全文引用的方式并入本文中。
精子选择、固定化、ICSI注射以及胚胎培养显示于图10、11、12以及15中。图10说明精子选择。在此实施方案中，精子选择是通过重力驱动泵送系统来获得。将样品加载到精子注射室(201)中，所述精子注射室具有入口(202)，用于接收新鲜培养基；和出口(203)，用以允许活动精子穿过层流液流的界面通道(204)，从而离开进入活动精子室(210)。非活动精子、碎片以及一些非活动精子被收集于非活动室(215)中。关于精子分离、分选以及选择的更详细描述参见Takayama等人的美国公布号2006/0270021，其以全文引用的方式并入本文中。
图11说明精子固定化和ICSI注射。在此实施方案中，之前借助微流体流移动的MII卵母细胞(108)接着通过由侧边微通道产生的真空(410)在固定化站(120)中固定化。精子可捕获于固定化站(220)中并且使用激光捕集和移动控制系统(诸如本领域中已知的激光辅助精子固定化(LASI)(425)和激光辅助精子定位(LASP)(420))进行对准。单个精子细胞的注射是使用压电吸管首先施加电场以穿透卵母细胞并且随后在微工具内部施加流体压力以使精子定位到卵母细胞中来实现。自始至终使用摄像机系统(405，407)来监视注射。通过机械抽吸压力来取回卵母细胞。所注射的卵母细胞通过微通道行进是借助微流体流来进行。关于胞浆内精子注射(ICSI)的更详细描述参见Lu等人.2011,Robotic ICSI(Intracytoplasmic Sperm Injection),IEEETransactions of Biomedical Engineering,58:2102-2108。
图12说明胚胎培养。在此实施方案中，在注射之后，卵母细胞借助微流体流移动到微通道末端并且分配到通道部分。使用摄像机系统(405，408)来分析其发育，直到其将被拾取并且用于传输的时刻为止。经由多个微通道或腔室对个别胚胎的监测和评估展示于图17中。培养基和胚胎发育的方法是本领域中熟知的。
Claims (20)
1.一种用于胞浆内精子注射辅助授精的封闭式微流体盒装置，其包括：
a)卵母细胞储集器，其包括卵母细胞室、入口以及出口；
b)与所述卵母细胞储集器出口选择性流体连通的卵母细胞卵丘去除通道；
c)与所述卵母细胞卵丘去除通道选择性流体连通的卵母细胞固定化站；
d)精子储集器，其包括精子室、入口以及出口；
e)与所述精子储集器出口选择性流体连通的活动精子分离通道；
f)与所述活动精子分离通道选择性流体连通并且与所述卵母细胞固定化站选择性流体连通的活动精子固定化站；以及
g)与所述卵母细胞固定化站选择性流体连通的胚胎培养室。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述卵母细胞卵丘去除通道的一部分的宽度比所述卵母细胞室窄，从而允许卵母细胞独立行进。
3.如权利要求2所述的装置，其中所述卵母细胞卵丘去除通道的一部分的宽度为约200mm。
4.如权利要求1所述的装置，其中所述卵母细胞卵丘去除通道具有90°弯曲，从而使得卵母细胞旋转以去除卵丘细胞。
5.如权利要求1所述的装置，其中选择性流体连通是由一个或多个包括纳米电极模块的压电闸门来控制。
6.如权利要求1所述的装置，其中所述卵母细胞卵丘去除通道具有与其选择性流体连通的废物出口。
7.如权利要求1所述的装置，其中所述活动精子分离通道具有与其选择性流体连通的非活动精子出口。
8.如权利要求1所述的装置，其进一步包括多个与所述卵母细胞固定化站选择性流体连通的胚胎培养室。
9.如权利要求1所述的装置，其进一步包括一个或多个与胚胎培养和发育站选择性流体连通的胚胎观察站。
10.如权利要求1所述的装置，其进一步包括一个或多个与所述精子固定化站选择性流体连通的精子观察站。
11.如权利要求1所述的装置，其进一步包括一个或多个与所述卵母细胞固定化站选择性流体连通的卵母细胞观察站。
12.如权利要求1所述的装置，其进一步包括与多个卵母细胞卵丘去除通道选择性流体连通的多个卵母细胞储集器，所述多个卵母细胞卵丘去除通道与所述卵母细胞固定化站选择性流体连通。
13.如权利要求1所述的装置，其中所述活动精子固定化站包括胞浆内精子注射系统。
14.如权利要求1所述的装置，其适合于插入用于自动化监视和控制卵母细胞卵丘去除、卵母细胞选择和固定化、活动精子分离、活动精子固定化、胞浆内精子注射以及胚胎监视的机器中。
15.一种用于自动化胞浆内精子注射辅助授精的系统，其包括：
用于胞浆内精子注射辅助授精的封闭式微流体盒装置，其包括：
a)卵母细胞储集器，其包括卵母细胞室、入口以及出口；
b)与所述卵母细胞储集器出口选择性流体连通的卵母细胞卵丘去除通道；
c)与所述卵母细胞卵丘去除通道选择性流体连通的卵母细胞固定化站；
d)精子储集器，其包括精子室、入口以及出口；
e)与所述精子储集器出口选择性流体连通的活动精子分离通道；
f)与所述活动精子分离通道选择性流体连通并且与所述卵母细胞固定化站选择性流体连通的活动精子固定化站；以及
g)与所述卵母细胞固定化站选择性流体连通的胚胎培养室；以及
用于功能啮合所述微流体盒装置的机器，其包括中央处理单元(CPU)和软件，所述软件用于自动化监视和控制用于微流体行进的选择性连通、卵母细胞卵丘去除、卵母细胞选择和固定化、活动精子分离、活动精子固定化、胞浆内精子注射以及胚胎监视。
16.如权利要求15所述的系统，其中所述机器进一步包括多个连接到所述CPU的摄像机和远程视频监视器。
17.如权利要求15所述的系统，其中所述CPU自动控制所述装置的温度和细胞培养基添加到所述卵母细胞储集器入口和精子储集器入口。
18.如权利要求15所述的系统，其中所述机器通过在所述卵母细胞固定化站中的微通道中形成负压来控制所述卵母细胞固定化站。
19.如权利要求15所述的系统，其中所述机器如下控制所述胞浆内精子注射：通过由压电吸管施加电场以穿透所述卵母细胞并且接着在所述压电吸管内部施加微流体压力以使所述精子定位于所述卵母细胞中。
20.一种用于自动化胞浆内精子注射辅助授精的方法，其包括：使用权利要求15所述的系统将精子与卵母细胞在权利要求1所述的连续路径微流体盒装置中组合。
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