CN104024405B - 获得高活动力的精子的微流道芯片，其制造及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明系关于获取具高速度(velocity)及／或运动力(motility)的精子的微流体芯片、制造及其应用。该微流体芯片包括一入口区，第一流道，一分歧流道，一视需要的具圆角的块状结构及一或多个出口区。本发明模拟体内的精子激活过程并设计一种微流体芯片仿真激活过程，以便获取较高量的具有高运动力及／或活性的精子群及／或次群。

Description

获得高活动力的精子的微流道芯片，其制造及其应用
技术领域
本发明系关于分选及/或活化具高速度(velocity)及/或运动力(motility)的精子。具体而言，该微流体芯片包括一入口区，第一流道，一分歧道及一或多个出口区。
背景技术
已知约40％至50％的不育夫妇中，男性因素是不孕是重要原因。此等不孕和生育力低下的人绝大多数是少精子及/或弱精子性(精子活动力低于50％)。存在于这些不育男性的问题是由于这些人尝试成为父亲多年，但却不成功。以子宫内置放精子，男性原因不育夫妇的怀孕率每个周期只有约15-20％。这是由于子宫内人工授精治疗后有或没有怀孕的丈夫群组中，在精子浓度及运动力方面没有可察觉的差异。虽然在体外受精治疗的怀孕率是比较高的，但足够的精子浓度，或精子运动力并不保证怀孕成功。也有男性患有原因不明的男性不育症问题，即虽然精子浓度正常，但精子却丧失生育能力。
由于各种社会学，经济，和或许环境的原因，人工授精已成为更为频繁的程序。全球人工授精的数量一直在增加，并将继续增加。许多原因已被用来说明此一增加。例如，随年龄增加通常会降低男性与女性受精的概率。越来越多的女性也在没有伴侣下，由自己抚养孩子，并选择人工授精作为怀孕的手段。此外，彼等无法拥有孩子者，现在有一个负担的起的医疗选择。另一个因素可能是，男性的精子数量一直在下降，使怀孕更加困难。最后，环境因素也为男性和女性的生育能力下降的原因。
目前有各种各样的人工授精方法，如子宫颈内、子宫内(IUI)、输卵管内及直接的腹腔内(DIPI)受精，配子输卵管内转移(GIFT)，体外授精及胚胎移植(IVFET)，接合子输卵管内移植(如ZIFT，PROST和TET)，腹膜卵母细胞和精子转移(POST)及性别选择。然而，随着技术的进步，其它方法被采用，然而，不论方法为何；高活动精子总是较佳的。大部分执行人工授精的设备，不具有分离运动性精子的资源，因而需要求分开使用具分离装置的设备。例如，子宫内人工授精(IUI)，体外受精(IVF)方法藉由将精子与卵子一起放置在利于怀孕的环境中(无论是在子宫内或子宫外)，而尝试模拟生殖过程。授精过程中要求精子主动侵入卵并开始受精。具运动力的精子更能够穿透卵。
人类精液是由不同成熟度的异源细胞群组成，具不同的功能质量和受精能力。射出的精子无法马上就能使卵子受精。它们必须经过称为「获能化」(capacitation)的功能性成熟的过程。「获能化」被普遍认为是一个获得超活化的运动力及获得进行精子顶体胞释作用(acrosomal exocytosis)的过程。获能化的结果在两个精子功能上引起变化。首先，对如透明带蛋白激素或孕激素等生理配体的反应，精子头部获得进行精子顶体胞释作用的能力。第二，精子的鞭毛获得「超活化」模式的运动力。
藉密度梯度离心的精子划分可分离这些亚群，得到的颗粒中回收的精子在质量上有相当大的改良。相较于低密度的划分区，数个区域指出可自颗粒中回收较高百分比的具运动力且型态正常的精子。精液是由具不同程度的结构与功能的分化与正常度的异质精子族群所组成。从Percoll梯度，当自normozoospermic的人类精液分离高质量精子时，通常采用三个子集的精子(45％；L45)，(65％；L65)和(L90)90％划分。L45显示质量最差的，呈现最小百分比的形态正常且具运动力的精子。L65和L90显示获能化相关的酪氨酸磷酸化中的时间相关的增量(M.G.Buffone et al.,Human Reprod Vol.19,No.1pp 139-146,2004)。
一次射精中精子的总数可衡量生育能力，但是，具运动力的精子的百分比是更重要的，尤其是当考虑替代的生殖方法。根据运动力，精子分类如下表所示：
呈现积极泳动的运动力精子的百分比可衡量精子样品的生育能力。百分比越高，精子样品的质量越高，及样品达成受精的可能性就越大。高质量的精子样品很重要的原因是多方面的。人工受精的过程，不仅花费昂贵且心理上也代价高昂。不成功的尝试对患者造成巨大的影响。当样品进行冷冻或以水稀释时，更高质量的精子样品也是重要的考虑因素，因为这些处理会杀死或减弱样品。因此，只有最高的精子质量可在精子进行的处理程序中存活。
在过去已有各种筛选较具活性的精子被使用，例如向上游泳(swim up)，向下游泳(swim down)和Percoll密度梯度离心技术。向上游泳的方法是在IUI及IVF程序中常用处理新鲜或冷冻样品。精子被放置在培养基中，并进行离心过程。较多的具运动力的精子游泳到可提取他们的一定程度。这种方法采用多个试管和离心步骤，其耗时且会导致回收的具运动力的精子相当低。
已存在许多评估运动力和样品中的精子数的方法。一种此等方法是显微镜分析，这通常是在医院或商业实验室进行。然而，最近，已提出许多关于测试套组的建议，这些是为了简化精子的检测。这些检测套组的缺点是，它们不能区分具运动力与不具运动力的精子。而这种区别是男性不育症的最具预测性的指标。
US 5427946揭示一管道设备，有入口区、流道及嵌套室。精子样品施加在入口区，只有运动力的精子能够达到腔室。US 7179641提供了一种用于分离和检测液体样品中具运动力的精子，包括：一个分离容器，包括(i)入口区，(ii)出口区安排为可被打开，(iii)一个分离介质，在其中样品中具运动力精子可流动通过入口区，及(iv)致动器可操作以打开出口区，用于使分离介质经出口区流出容器。这些先前技术均非基于微流体技术。
US 6929945提供一种装置，其包括一具有样品贮器的微流体结构，下游收集区，及在其间延伸的微通道。微通道被尺寸化以局限样品精子在通道内单方向移动，使得精子在置于样品贮器的精液样品进入并沿着微通道移动朝向和进入收集区。Brenda等人提供一种用于自小样品中分离具运动力精子的集成微信道系统，其包括两个样品入口，两个出口，区分信道和被动驱动的帮浦系统，其提供稳定流动的液体。US 2010291535A1揭示一种方法，使用一微流体芯片分选高运动力精子。在该先前技术参考文献中，精子和介质分别经由数个入口注入微流体芯片的微信道。然而，上述先前技术文献无法达到区别性的分选以获得不同亚群的精子。也就是说，藉由上述先前技术文献分选的精子会包括高运动力精子、低运动力精子，甚至没有游动的精子。此外，由上述先前技术文献分选出的具运动力的精子量无法达到满意的程度。
因此，仍然需要开发一种装置和方法，不仅分选具较高运动力的精子，而且较多量的具目标质量的精子。
发明内容
本发明系关于一种自精子样品中获取具高运动力的精子的微流体芯片，其包括：
(a)一在微流体芯片一端的入口区；
(b)一第一流道，其与入口区流体连通；
(c)一分歧流道，其位于第一流道的下游且与第一流道的流体连通；
(d)一或多个出口区，位于该分歧流道的一或两侧。
本发明另关于一种获取精子样品中具高运动力的精子的微流体芯片，其包括：
(a)一在微流体芯片一端的入口区；
(b)一第一流道，其与入口区流体连通；
(c)一分歧流道，其位于第一流道的下游且与该第一流道的流体连通；
(d)一或多个出口区，位于该分歧流道的一或两侧；
(e)一第二流道，位于该分歧流道的下游；及
(f)一出口区，位于微流体芯片的入口区相反端且与该第二流道的流体连通。
本发明亦关于使用本发明微流体芯片的方法，套组(kit)及系统。
附图说明
图1显示本发明的微流体芯片的整体图，包括一入口区，一第一流道，一分歧流道及一或多个出口区。
图2A显示本发明的微流体芯片的整体图，包括一入口区、一第一流道、一分歧流道、第二流道及一出口区。图2B显示本发明的微流体芯片的整体图，包括一入口区、一第一流道、一分歧流道、一第二流道、一具圆角的块状结构、及一出口区。
图3A显示本发明的微流体芯片的整体图，其包括除了如图1所示的那些以外，包括一安置在该分歧流道的前具有入口区的挤压流道。图3B及3C显示本发明的微流体芯片的整体图，其包括除了分别如图2A及图2B所示的那些以外，包括一安置在该分歧流道的前具有入口区的挤压流道。
图4显示具有安置在该分歧流道的前的额外出口的本发明的微流体芯片的整体图。
图5显示本发明的微流体芯片的整体图，配置于分歧流道前但在挤压通道后的可能端口。
图6显示本发明的微流体芯片的顺序操作组合。
图7显示本发明的微流体芯片的平行操作组合。
图8显示高通量精子分类。
图9显示以浓度60x106精子/毫升的精液样品的获取结果。
图10显示使用本发明的微流体芯片获取浓度60x106精子/毫升的人类精液样品的结果。
图11显示使用本发明的微流体芯片与本发明激活剂的组合，获取浓度45x106精子/ml的人类精液样品的结果。
图12显示使用本发明的微流体芯片与本发明激活剂的组合，获取浓度10x106精子/ml的人类精液样品的结果。
图13显示使用本发明的微流体芯片获取浓度3x108精子/毫升的猪精子的结果。
图14A、14B及14C显示使用本发明的微流体芯片，透过31.8x106精子/毫升人类精液的回冲操作的获取结果。
具体实施方式
本发明提供一种微流体芯片，用于获取具有高运动及/或活性的精子群及/或次群。本发明模拟体内的精子激活过程并设计一种微流体芯片仿真激活过程，以便获取较高量的具有高运动力及/或活性的精子群及/或次群。精液可直接施用于该微流体芯片，不须稀释。
本说明书中使用的术语一般有其在本领域中的普通含义在本发明上下文中及每个术语在特定的上下文中。特定术语将在下面讨论的，或在本说明书中的其它地方，以提供额外的指导，在描述本发明的装置和方法，以及如何能够制造和使用它们。为便利起见，某些条款被标示，例如使用斜体和/或引号。使用标示不影响术语的范围与意义，在同样内文中，不论它是否被标示，术语的范围与意义相同。将被理解的是，同样的事情通常可用一个以上的方式进行说明。因此，替代的语言和同义词可被用于任一或多个本文中所讨论的术语。对某些术语的同义词亦有提供。然而，一个或多个同义词的引用不排除其它同义词的使用，也不是解释为任何特殊的意义无论一术语是否被阐述或讨论。
术语「微流体通道(microfluidic channel)」是指具有宽度及深度尺寸，其便于精子经由信道的移动与在体内情况类似的方式。通常情况下，微流道的宽度和深度尺寸在约10mm至5mm。微流体通道可以是任何横截面的几何形状，如圆形或矩形，以及至多达许多公分的长度。
术语「流(flow)」是指任何液体或固体通过装置或于本发明方法中的移动，并且包括但不限于任何流体流的任何移动，及与液流(stream)、在液流内或抗液流移动的任何材料。例如，精子通过装置或在本发明的方法中的移动，如通过本发明微流体芯片的信道，包括一液流。根据本发明的，是否精子被流体流携带(也包括一流)，或者是否精子移动是藉其它直接或间接的力或移动，以及是否任何移动力的性质是已知或理解。任何力的应用可用于提供一种液流，包括但不限于压力、毛细作用和组合，不考虑任何特定的理论或作用机制，只要精子根据本发明检测、测定、分选或及激活。
术语「运动力」(motility)是指移动的能力，及「精子运动力」具体为精子细胞允许经由流体介质而移动的彼等性质。
术语「激活精子」(active sperm)是指能积极运动及移动的彼等精子细胞。
术语「流道」(flow channel)是本发明芯片的流道，其允许精子流动至分选及/或活化区。流道通常于接收精子样品的入口区的流体连通，其允许精子进入流道。流道通常与分选及/或活化区流体连通。
术语「入口区」(inlet region)是微流体芯片接收精子的区域。入口区可包含一入口通道、一井或一贮池、一开口或有利于精子进入芯片的其它特征。如希望，芯片可包含一个以上的入口区。术语「出口区」是收集或分配分选后精子的微流体芯片的区域。术语「出口区」(outlet region)是位于流道下游，且可包含一贮池、分支信道或出口信道。如希望，芯片可包含一个以上的出口区。
术语「精子」(sperm)是指任何动物，如人、猪、马、狗、绵羊、牛、山羊、猫等等动物，的精子细胞。精子细胞由头部、中段和尾部组成。头部含有具密集盘绕染色质纤维的核，前端围绕顶体，其含有穿透女性卵子的酶。术语「精子样品」指精液或稀释的精液。
术语「亚群」(subgroup)和「亚族群」(subpopulation)是可互换使用的。亚群或亚族群的精子包括下列群组：第(0)群、第(1)群、第(2)群及第(3)群。
第0群(G0)：
此亚群显示VCL的最低值(VCL＝0微米/秒)。亚族群1以整体低的速度值，(基于VCL，VSL和VAP值)，低的线性度值(如LIN及STR的值所指示者)，及低的振荡运动值(如WOB，平均ALH和BCF的值所指示者)来定义。
第1群(G1)：
此亚群显示VCL的第二最低值(VCL＝0-120微米/秒)。包括于亚族群2的精子显示中至高的速度(如VCL，VSL和VAP所指示者)，高的线性度(如LIN及STR的值所指示者)，及高的振荡运动值(如WOB，平均ALH和BCF的值所指示者)。
第2群(G2)：
此亚群具有高的VCL值(VCL＝120-180微米/秒)。亚族群3由具高速度及相对高线性度的精子组成(如VCL，VSL，VAP，LIN及STR所指示者)。再者，包括于此次族群的精子也具有高的振荡运动值(如WOB，平均ALH和BCF的值所指示者)。
第3群(G3)：
包括于此亚群的精子具有最高的VCL值(VCL﹥180微米/秒)。亚族群4由具高速度及线性度特征(如VCL，VSL，VAP，LIN及STR所指示者)。再者，此等精子的总振荡运动值非常高(如WOB，平均ALH和BCF的值所指示者)。
本发明的微流体芯片
本发明的微流体芯片藉由建构一分歧结构(divergent structure)及一视需要的具圆角的块状结构(block structure with rounded corners)而可获得高运动力及/或高活力的精子。首先，本发明设计具一分歧结构的微流体芯片，且该分歧结构可根据它们的速度分群精子。再者，本发明设计一种具圆角的块状结构以激活精子使增加具高速度及活力的精子的数目。
在一方面，本发明提供一种自精子样品中获取具高运动力的精子的微流体芯片，其包括：
(a)一在微流体芯片一端的入口区；
(b)一第一流道，其与入口区流体连通；
(c)一分歧流道，其位于第一流道的下游且与第一流道的流体连通；
(d)一或多个出口区，位于该分歧流道的一或两侧。
根据本发明的微流体芯片包括一入口区，一流道，一分歧流道及位于该分歧流道的一或两侧的一或多个出口区。
参照附图，图1是本发明的微流体芯片的整体图。入口区11引入一精子样品进入流道12。较佳地，入口区是圆形，且具有直径范围从约0.5毫米至约4毫米。更佳为，入口区的直径是大约1毫米。较佳地，精子样品可藉由注射到其中而被馈送到入口区。
微流体芯片的流道12与入口区11流体连通。较佳地，所述流道的长度范围为从约5毫米(mm)到约30毫米，或约6毫米至约30毫米，约7毫米到约30毫米，约8毫米至约30毫米，约9毫米至约30毫米，约10毫米至约30毫米，约11毫米至约30毫米，约12毫米至约30毫米，约13毫米至约30毫米，约15毫米到约30毫米，约16毫米至约30毫米，约17毫米至约30毫米，约18毫米至约30毫米，约19毫米到约30毫米或约20毫米至约30毫米；更佳地，约15毫米，约16毫米，约17毫米，约18毫米，约19毫米，约20毫米，约21毫米，约22毫米，约23毫米，约24毫米，约25毫米，约26毫米，约27毫米，约28毫米，约29毫米或约30毫米；更佳地，约25毫米。较佳地，流道的宽度范围为从约50微米(μm)至约150微米，约60微米至约150微米，约70微米至约150微米，约80微米至约150微米，约90微米至约150微米，约100微米至约150微米，约50微米至约140微米，约50微米至约130微米，约50微米至约120微米，约50微米至约110微米，约50微米至约100微米，约60微米至约140微米，约60微米至约130微米，约60微米至约120微米，约70微米至约140微米，约70微米至约130微米，约70微米至约120微米，约80微米至约140微米，约80微米至约130微米，约80微米至约120微米，约80微米至约110微米，约90微米至约130微米，约90微米至约120微米，或约90微米至约110微米；更佳地，约90微米，约91微米，约92微米，约93微米，约95微米，约96微米，约97微米，约98微米，约99微米，约100微米，约101微米，约102微米，约103微米，约104微米，约105微米，约106微米，约107微米，约108微米，约109微米，或约110微米。较佳地，流道的深度范围为从约25微米到约75微米，约25微米至约70微米，约25微米至约65微米，约25微米至约60微米，约25微米至约55微米，约25微米至约50微米，约25微米至约70微米，约25微米至约65微米，约25微米至约60微米，约25微米至约55微米，约25微米至约50微米，约30微米至约70微米，约30微米至约65微米，约30微米至约60微米，约30微米至约55微米，约35微米至约70微米，约35微米至约65微米，约35微米至约60微米，约35微米至约55微米，约40微米至约60微米，约40微米至约55微米，或约45微米至约55微米；更佳为约45微米，约46微米，约47微米，约48微米，约49微米，约50微米，约51微米，约52微米，约53微米，约54微米或约55微米。
分歧流道13被设置在流道12的下游侧，且与流道12的流体连通。分歧流道的端部是开放的。分歧流道的宽度从流道2的宽度开始逐渐增大。在一具体实施例，分歧流道3的宽度较流道2的宽度增加1倍至15倍以上；较佳的是，超过1至14倍，超过1至13倍，超过1至12倍，超过1至11倍，超过1至10倍，超过1至9倍，超过1至8倍，超过1至7倍，超过1至6倍，超过1至5倍，超过1至4倍，超过1至3倍，或超过1至2倍；较佳为超过1至10倍。较佳地，分歧流道3的宽度范围从约50微米至约1,000微米，约60微米至约1000微米，约70微米至约1000微米，约80微米至约1000微米，约90微米至约1,000微米的，约100微米至约1000微米，约100微米至约900微米，约100微米至约800微米，或约100微米至约700微米。在另一具体实施例中，分歧流道与流道的壁的壁的间的角度是约5至约30度；较佳地，该角度是约5至约25度，约5至约20度，约5至约15度或约5至约12度；更佳地，该角度是约8至约20度，约8至约15度，约8至约12度；更佳地，该角度是约10度。在另一具体实施例中，流速V主要以精子样品Q的流量及分歧流道横截面面积来决定。较佳地，流速是根据V＝Q/A来决定，其中V是速度，Q是精子样品的流体体积，及A是分歧流道的横截面面积。更佳地，横截面面积对流速的比例是从约1至约1/10。精子样品从流道2流至分歧流道3。由于分歧流道较流道具有较大的横截面尺寸，精子样品的中间流(middle stream)的流速高于精子样品在分歧流道的侧线流的流速。鉴于精子具有逆流永动的事实，具有较高运动力的精子能够抵抗该液流的流动阻力。据此，分歧流道13包括一或多个出口区14，其位于分歧流道13的一或两侧，而可将具不同运动力等级的精子分级。
在一具体实施例，本发明提供一种获取精子样品中具高运动力的精子的微流体芯片，其包括：
(a)一在微流体芯片一端的入口区；
(b)一第一流道，其与入口区流体连通；
(c)一分歧流道，其位于第一流道的下游且与该第一流道的流体连通；
(d)一或多个出口区，位于该分歧流道的一或两侧；
(e)一第二流道，位于该分歧流道的下游；及
(f)一出口区，位于微流体芯片的入口区相反端且与该第二流道的流体连通。
在一具体实施例，上述为微流体芯片另包括一具圆角的块状结构，位于分歧流道或第二流道，其中该块状结构的每一边与流道壁之间维持一个距离。
参照到图2A，除了如上述图1所述的入口区211，流道212，分歧流道213及出口区214外，另提供第二流道215及出口区216。参照到图2B，除了如上述图1所述的入口区221，流道222，分歧流道223及出口区224外，另提供第二流道225，具圆角的块状结构227及出口区226。
参照到图2A及2B，接续分歧流道213(图2A)或223(图2B)，提供一第二流道215(图2A)或225(图2B)。该第二流道设置于分歧流道3的下游且是与分歧流道流体连通。较佳地，所述的流道长度的范围从约0.5毫米至约3毫米，或约0.5毫米到约2毫米或约0.5毫米至大约1毫米。
在图2B所示的具体实施例中，有一具圆角的块状结构227设置于分歧流道223或第二流道225。根据本发明的，具圆角的块状结构可为具圆角的哑铃结构，具圆角的圆柱结构，具圆角的长方体结构，具圆角的立方体结构或具圆角的梯形块结构。较佳地，具圆角的块状结构是具圆角的哑铃结构。较佳地，具圆角的块状结构227位于分歧流道的终点。根据本发明，如图2C所示，具圆角的块状结构的每一侧与分歧流道的壁225之间有一距离311。较佳地，该距离的范围为从约100微米至约10微米；更佳地，约90微米至约10微米，约80微米至约10微米，约70微米至约10微米，约60微米至约10微米，约为50微米至约10微米，约40微米至约10微米，或约30微米至约10微米，约100微米至约20微米，约90微米至约20微米，约80微米至约20微米，约70微米的至约20微米，约100微米至约30微米，约90微米至约30微米，约80微米至约30微米，约80微米至约40微米，约80微米至约50微米，约75微米至约30微米，约75微米至约40微米，约75微米至约50微米，约75微米至约60微米；进一步更佳的是，约59微米，约58微米，约57微米，约56微米，约55微米，约54微米，约53微米，约52微米，约51微米或约50微米。根据本发明，在块状结构中最窄的位置的流速系根据(Q/2)及流道的最大宽度来决定。在一具体实施例中，流速是根据公式：V＝(Q/2)/(分歧流道的最大宽度(μm)/S)来决定，其中V是流速，Q是精子的流量及S是块状结构每侧与流道壁间的距离。
如上所述，在流动流的中间的流速高于在分歧通道3两侧流道璧附近的流动流的流速。鉴于精子具有逆流泳动的事实，具有较高运动力的精子能够抵抗该液流的流动阻力且可在较窄流道宽度的位置被收集。据此，分歧流道3包括一或多个出口区4，位于分歧流道3的一侧或两侧，以收集高运动力的精子。分歧流道3的中间流中的精子将继续流经具圆角的块状结构31。如图2C所示，具圆角的块状结构227提供了对精子流的阻碍，使得精子流经具圆角的块状结构的每一侧311与分歧流道的壁225之间的空间，使得其流速大幅增加。藉由大幅增加精子流的流速，精子藉由精子获能化而被激活，因此可得到较多量的具运动力的精子。
在本发明微流体芯片的终点，提供一出口区216(图2A)或226(图2B)，以收集具高运动力的精子且其与第二流道215(图2A)或225(图2B)是流体连通的。较佳地，出口区是圆形的，且具有范围从约0.5毫米至约4毫米的直径。更佳地，出口区的直径是大约1毫米。
在另一个实施例中，参照图3A，一或两个挤压流道7与入口区安置在如图1中所示的微流体通道的分歧流道14的前方，以提供介质挤压流的精子样品流。如图2A和图2B图所示微流体芯片的实施例，可具有如图3B和图3C所示的上述的额外的挤压流道。挤压流道和流道的接合位置可在入口和分歧流道之间的任何地方。该芯片系设计为可藉由捏缩力(pinching force)控制流体的方向和速度，并可产生稳定且缓慢的流动速度。在分歧点的流动分布系藉由该分支流道的液体高度来控制，根据精子的运动力集中精子。该设计的另一个目的是为在分支入口投药，例如黄体激素等，并在流道中央混合。各挤压流道7包括一个流道72及开口区71。在该挤压流道与该第一流道的壁的间的角度范围为自大约30度至大约120度。较佳地，该角度是约30度，约45度，约90度或大约120度。当该角度系自大约30度至90度时，该介质挤压流系与该精子样品流同方向流动。当该角度是90度至120度时，该介质挤压流系与该精子样品流为逆流方向。藉由提供挤压流至精子样品流中，可在分歧流道中增加具有高运动力的精子。
在另一个实施例中，从该开口区收集精子后，可添加缓冲液至如图2A、图2B、图3A、图3B或图3C中所示的微流体芯片的出口区中，以将流道内的精子冲洗回来，并在入口区收集。将精子样品加载至入口区中后，可透过静水压力和毛细作用形成流道。由于精子的逆流游泳性质，具有较高运动力的亚群将会留在该流道中，且具有较低运动力的将会与死精子和废物一起被推向该出口区。当流道变得平衡时，可藉由入口区的盖子隔绝大气压力。从出口区移除废物后，将缓冲液添加至该出口，以将流道内的精子冲洗回来，并在入口区收集。
在另一个实施例中，除了位于开口区41的相对端处的出口区42以外，如图4所示，一或二个额外的出口43和44可安置在分歧流道45的前方。如图5所示，对于具有一或二个挤压流道51和52的微流体芯片，该出口43和44可安置在分歧流道45的前方，但在该挤压流道51和52的后方。较佳地，该出口和第一流道的壁之间的角度系约小于90度，较佳为大约90度。在一个实施例中，该芯片也可用于将高运动力精子逆冲至该垂直分支的出口，以避免在回冲后原始精液的干扰。参照图4，在隔绝出口43和出口后，加入精液至入口区41。透过静水压力和毛细作用可形成在流道中的流动流。由于精子的逆流游泳性质，具有较高运动力的亚群将会留在该流道中，且死精子和废物将出现在出口区42中。当流道变得平衡时，流道便保持静态。从出口区42移除废物后，将缓冲液添加至出口区42中，以将流道内的精子冲洗回来，并从出口43和44收集。参照图5，加载精液至入口区41，并加载缓冲液或药物至挤压流道51和52中。透过静水压力和捏缩力可形成流道。由于精子的逆流游泳性质，具有高运动力精子的亚群将留在流道中，而该死精子和废物则会出现在出口区中。当流道变得平衡时，可藉由入口41、51、和52的盖子与大气压力隔绝。从出口区42移除废物后，添加缓冲液至出口区42中，以将流道内的精子冲洗回来，并从挤压流道51和52收集。
另一方面，本发明提供了一种该微流体芯片的顺序操作组件，其包括一个以上的本发明芯片，其中，该芯片系有顺序地安置。已设计出收集精子的顺序操作。在流动平衡建立之前，一些高运动力精子将被冲洗至出口。在一个实施例中，为保留所有高质量的精子，该芯片亦可藉由四个连续的微流体通道分类精子，以减少高质量精子的损失。参照图6，加载精液至入口区611后，透过静水压力和毛细作用可形成流道。由于精子的逆流游泳性质，具有高运动力精子的亚群将留在流道中，而死精子和废物则出现在该出口区612中。在出口区612中的样本系藉由第二微流体通道62、第三微流体通道63、及第四微流体通道64分类。当流道变得平衡时，流道便保持静态。我们可以根据精子数目的需求，从入口区611，出口区612，出口区622，或出口区632收集样本。取决于从入口区611收集到的精子数量，从出口区612、622和632分类的精子将被视为保存的精子。
另一方面，本发明提供了一种微流体芯片的平行操作装置，其包括一个以上的本发明芯片，其中芯片系以平行布置。已设计出收集精子的平行操作。该芯片系设计为将四个微流体信道的组合至一个芯片中。当检体超载时，我们可以藉由同时操作四个微流体通道，将分类产量增加至4倍。参照图7，在加载精液至中央入口区71中后，透过静水压力和毛细作用可形成流道。由于精子的逆流游泳性质，高运动力的亚群将留在流道中，而死精子和废物将出现在四个出口区72、73、74及75中。在一个实施例中，当流道变得平衡时，藉由入口的盖子可隔绝大气压力。从出口移除该废物后，将缓冲液添加至出口区72、73、74及/或75中，以将流道内的精子冲洗回来，并从入口区71收集。
另一方面，亦已设计出一种高通量的精子分类装置。该高通量的精子分类装置包括：第一层、第二层及第三层，其中该第一层上位于该装置的顶端，并具有在该微流体芯片一端的一入口区及在该微流体芯片的该开口区的相对端的一出口区，该第二层位于第一层和第三层的间并具有本发明的微流体芯片，该芯片的入口区连接至在该第一层的入口区，且该第三层位于该装置的底部并具有连接至在该第二层的该芯片的该出口区的容器。参照图8，该芯片被分作三层(81，82和83)：第一层81包含作为入口区84和出口区85的两个开口；第二层82系设计为微流体通道86，且该出口区87系连接到第三层83。第三层83具有废物容器88，其负责从出口收集废物并保持流道内的流体静压力。在一个实施例中，加载精液至入口区84后，透过静水压力和毛细作用形成流道，其由于亚群活动的精子的逆向游泳性质，而死精子和废物将出现在出口区87中。当流道变得均衡，藉由入口区84的盖子可隔绝大气压力。从出口区87移除该废物后，添加缓冲液至出口区87，以将流道内的精子冲洗回来，并从入口区84收集。
本发明微流体芯片的制造
本发明的微流体芯片是微型制造，例如，藉由使用常规的光刻技术(photolithography techniques)蚀刻硅芯片，或使用称为「软光刻技术」(softlithography)的微机械技术。这些和其它微组装方法可用于提供不昂贵的小型化设备，且在软光刻技术的情形下，可以提供具有利性质的设备，如改善的柔韧性，稳定性和机械强度。根据本发明的装置相对便宜且容易设置。它们也可以是抛弃式。使用这些技术，微制造的流体装置可以取代先前技术的传统流体流动室。
本发明的微制造装置较佳是从硅微芯片或硅弹性体制作。须理解的是，「区/区域」和「信道/流道」是彼此流体连通，因此可能会重叠；即，区域或信道的开始或结束处有可能是没有明确的边界。一个微组装装置可以是透明的，且可以具有透明性质的材料覆盖。
在一较佳具体实施方案中，本发明提供信道模塑成光学透明的硅橡胶、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚(乳酸)、聚乳酸(PLA)或聚二甲基硅氧烷(PDMS)；较佳为优选聚二甲基硅氧烷。PDMS过程中已由Samuel K.Sia与George M.Whitesides报导(Electrophoresis2003,24,pp.3563-3576)。这是铸造而成的模具，由这些通道的负像蚀刻用于半导体制造中使用的相同类型的晶体硅芯片。如上所述，对于图案化的半导体的相同技术被用于形成信道的模式。未固化的液体硅橡胶注入到此等置于玻片底部的模具。为了加速固化，将这些注入的模具烘烤。PDMS固化后，将其从模具顶部去除并修整。在使用前，PDMS装置被放置在HCl的热浴中，使表面具亲水性。接着将该装置放置到第一号(150微米厚)(25×25毫米)的正方形显微镜盖玻片。盖玻片形成所有通道和井的底部(或屋顶)。任何或所有这些制造和准备步骤可通过手工完成，或者它们可被自动化的操作和使用该装置。
藉由使用本发明微流体芯片获取具有高运动力精子的套组及方法
另一方面，本发明提供了一种获取具有高运动力精子的方法，其包括视情况将精子样品与活化剂混合并将所得精子样品施加到本发明的微流体芯片。根据本发明，该活化剂为己酮可可碱(pentoxifylline)、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、白蛋白或黄体激素。因此，本发明提供了用于获取具有高运动力精子的套组，其包括一种活化剂及本发明的微流体芯片。
用于获取高运动力精子的系统
在另一实施例中，本发明提供了一种用于获取高运动力精子的系统，其包括本发明的微流体芯片、一可选的活化剂、一微流体分配系统、和一用于检测精子质量的传感器。任何一种本领域中已知的微流体分配系统及传感器皆能与本发明微流体芯片结合，以提供一种用于获取具有高运动力精子的系统。
该微流体芯片可在一个步骤中实现获取精子的方法，且在使用本发明芯片的方法前，能忽略原始精液样本的间的精子运动力或浓度的差别。本发明的微流体芯片能筛选活动精子的亚群，并获得更高数量的活动精子。此外，该微流体芯片是可抛弃式的，容易生产且成本低，所以它在获取活动精子中是个有优势的产品。
实例1本发明微流体芯片的制备
具有微规格流道、阀及其它组件的微流体芯片可设计并制造成固体基材。硅是一种较佳的基料，由于发展成熟的技术使其可精确且高效的制造，但也可使用其它材料，包括聚合物，如聚四氟乙烯。在本领域中公知的微机械方法包括膜沉积处理，如旋涂法和化学气相沉积法，激光加工或光刻技术，或蚀刻方法，其可以使用任一的湿化学或电将处理。
本发明的微流体芯片的微制造的起始步骤包括SU-8厚膜光阻制程。使用标准的洗涤过程以丙酮、异丙醇和蒸馏水清洗玻璃基板，然后干燥。一层SU8-50的光阻，较佳约50μm的厚度，形成于玻璃基板，通常是藉由加热玻璃基板至800至1200℃。经光罩照射的经涂覆积压体，其已经以大小对应的图案(pattern)压印，并制成所要的微流道模式。形成具有所要光罩图案的光罩的方法为已知技术。
微流体精子获取流道系使用软光刻方法制得。简言之，PDMS浇铸于具所要流道特征的模型并固化。所得PDMS图案被氧化以密封在流道上的玻璃盖玻片，制得本发明的微流体芯片。图1至图8显示本发明微流体芯片的各种类型。
实例2具运动力精子的获得与分析
使用本发明微流体芯片获取人类精子
人类精子根据它们的曲线运动速度(curvilinear velocity；VCL)，可分成下列3群：
第0群(G0)：VCL为0微米/秒(精子是活的但VCL可忽略)；
第1群(G1)：VCL﹤120微米/秒；
第2群(G2)：VCL为120-180微米/秒；
第3群(G3)：VCL﹥180微米/秒。
具高浓度(60×106精子/毫升)的精子样品系得自人类。每一样品经如下处理及测定。1毫升PureSperm80(Sepal Reproductive Devices,MA,U.S.A.)，1毫升PureSperm40(Sepal Reproductive Devices,MA,U.S.A.)和1.5毫升的样品分别加入15毫升的离心管中，然后在25℃，300RCF(相对离心力)下离心30分钟。离心分离后，除去上清液，然后以5毫升PureSperm WASH清流速洗。将所得溶液于25℃，500rcf下离心20分钟。离心分离后，除去上清液而得到沉淀。沉淀用500μL biggers-Whitten-Whittingham(BWW)培养基溶解沉淀决。然后，精子的浓度被调节至20-25×106精子/毫升。
接着进行精子获取分析。10毫升的磷酸盐缓冲液注射至本发明的微流体芯片，使得芯片的管道中没有气泡。精子样品被引入本发明的微流体芯片的入口区。在分歧流道中，速度可以下列方式获得：(V)＝流量(Q)/分歧通道的横截面面积(A)。在本例中，Q是0.8米/秒及分歧流道的璧与该流中的流动方向的流道的壁之间的角度是10度，分歧流道不同位置的流速如下表所示：
将样品溶液自本发明芯片的出口区抽吸出。所得样品以medeaLAB CASA(MedComputer Aided Sperm Analyzer；Medical Technology Vertriebs-GmbH,Germany)测定。
浓度为60×106精子/毫升的精子样品，处理前后的各种VCL群中的精子数目列于下表：
群 以芯片处理前的精子数目(10μL) 以芯片处理后的精子数目(6μL)
G 0 88,247(15％) 46,887(20％)
G 1 49,174(8％) 20,489(9％)
G 2 139,898(23％) 16,868(7％)
G 3 322,681(54％) 153,240(65％)
总计 600,000(100％) 237,484(100％)
上表结果如图9所示。本发明芯片处理后，G3群的精子从54％增加至65％及G2群的精子自23％减少至7％。
使用本发明微流体芯片组合激活剂获取人类精子
高浓度(60×106精子/毫升与45×106精子/毫升)及低浓度(10×106精子/毫升)的精液样品系得自人类。样品的离心和处理与上述相同。所得样品以本发明激活剂(即以Hans-F10调整己酮可可碱(pentoxifylline)密度)处理，并接着如前述进行高运动力精子获取分析。结果示于图10、图11与12针对浓度分别为60×106个精子/毫升、45×106精子/毫升及10×106个精子/毫升的样品。关于60×106精子/毫升的精液样品，G3组的精子从51％提高至73％及G2组的精子从15％减少至11％。关于45×106精子/毫升精液样品，G3组的精子从18％提高至36％及G2组的精子从11％减少到9％。至于10×106精子/毫升的精液样品，G3组的精子从17％提高到28％，而G2组的精子增加，从11％至14％。结果，G2及G3的精子的浓度从2.7×104精子/微升增加至4.2×104精子/微升。
使用本发明微流体芯片获取猪精子
猪精子根据它们的曲线运动速度(curvilinear velocity；VCL)，可分成下列3级：
第1群(G1)：VCL﹤120微米/秒；
第2群(G2)：VCL为120-180微米/秒；
第3群(G3)：VCL﹥180微米/秒。
具1×106个精子/毫升的低浓度精液样品获自猪。离心分离、处理及精子获取测定的步骤类似于用于人类样品者的那些，但进行适当修改以适合猪样品。其结果如图13所示。所获取精子的VCL高于250微米/秒，证明本发明的芯片可分离具不同速度的精子亚群。
使用本发明的微流体芯片组合本发明激活剂以获取猪精子
具低浓度为3×108个精子/毫升的精液样本获自猪。1毫升的90％的PercollTM(GEHealthcare)加入微离心管，接着1毫升65％的PercollTM及1毫升40％的PercollTM依次添加到该管中。离心管中加入3毫升的精液样品管并在900g下离心20分钟。取沉淀物并置于微量离心管(eppendorf)中。1毫升的稀释溶液加入微量离心管，然后以500g离心8分钟。除去上清液。1毫升的稀释溶液中加入微量离心管，然后以500g离心8分钟。除去上清液并溶解沉淀物并稀释至浓度为1×106个精子/毫升。所得样品以本发明的激活剂(即，以Hans-F10调整己酮可可碱(pentoxifylline)密度)处理，然后如前所述进行精子获取测定。结果显示处理后可达到高于60％的获取率。
实例3以回冲操作收集具运动力的精子
使用如图2B所示的微流体芯片进行回冲操作。将芯片的入口和出口吸干，并将芯片置于水平操作台。8微升的精液加入到入口，停留10-12分钟，然后在显微镜下观察精子的分布。入口盖上盖玻片并自出口收集废物于心的微量离心管。20μL的Ham's F10培养基加到出口以冲洗流道，并自入口收集样品于心的微量离心管。原精液的浓度为31.8x106精子/毫升及G2+G3群中的精子数目为1658精子(共4微升)，而G1+G2+G3群中的精子数目为51433的精子(共4微升)(参见图14A-14C)。以微流体芯片分选后，精子的浓度是54.15×106/ml，相较于原精液，其浓缩了1.7倍。此外，G1+G2+G3群中的精子的数量是97598精子(总4μL)，其升高约1.89倍。此结果指出以为流体芯片分选精子，不仅增加总浓度，也提高了高运动力的精子的数目。

Claims (20)

1.一种获取精子样品中具高运动力的精子的微流体芯片，其包括：
(a)一在微流体芯片一端的入口区；
(b)一第一流道，其与入口区流体连通；
(c)一分歧流道，其位于第一流道的下游且与该第一流道的流体连通，并且所述分歧流道的宽度从所述第一流道的宽度开始逐渐增大；
(d)位于该分歧流道的一或两侧的多个出口区；
(e)一第二流道，位于该分歧流道的下游；及
(f)位于微流体芯片的入口区相反端且与该第二流道的流体连通的出口区；
其中该芯片另包含一具圆角的块状结构，位于分歧流道或第二流道，其中该块状结构的每一边与流道的壁之间维持一个距离，其中该距离的范围为从100微米至10微米。
2.根据权利要求1的微流体芯片，其中该精子获自人类、猪、马、狗、绵羊、狗、牛、山羊或猫。
3.根据权利要求1的微流体芯片，其中该入口区是圆形，且具有直径范围从0.5毫米至4毫米。
4.根据权利要求1的微流体芯片，其中该第一流道的长度范围为从5毫米到15毫米。
5.根据权利要求1的微流体芯片，其中该分歧流道的壁与流道的壁之间的角度是5至30度。
6.根据权利要求1的微流体芯片，其中该分歧流道的壁与流道的壁之间的角度是8至20度。
7.根据权利要求1的微流体芯片，其中该分歧流道的壁与流道的壁之间的角度是10度。
8.根据权利要求1的微流体芯片，其中该分歧流道的宽度较该流道的宽度增加1倍至15倍以上。
9.根据权利要求1的微流体芯片，其中该具圆角的块状结构为具圆角的哑铃结构，具圆角的圆柱结构，具圆角的长方体结构，具圆角的立方体结构或具圆角的梯形块结构。
10.根据权利要求1的微流体芯片，其中该具圆角的块状结构为具圆角的哑铃结构。
11.根据权利要求1的微流体芯片，其中该第二流道的长度范围为从0.5毫米至3毫米。
12.根据权利要求1的微流体芯片，其中该位于微流体芯片的入口区相反端且与该第二流道的流体连通的出口区具有范围从0.5mm至4mm的直径。
13.根据权利要求1的微流体芯片，其中具入口区的一或两个挤压流道额外安置于分歧流道的前方。
14.根据权利要求1的微流体芯片，其中额外的出口安置在分歧流道的前方。
15.根据权利要求13的微流体芯片，其中额外的出口安置在分歧流道的前方，但在该挤压流道之后。
16.一种微流体芯片的顺序操作组件，其包括一个以上如权利要求1至15中任一项的微流体芯片，其中，该芯片系有顺序地安置。
17.一种微流体芯片的平行操作装置，其包括如权利要求1至15中任一项的微流体芯片，其中芯片系以平行布置。
18.一种获取具高运动力精子的方法，包括混合精子样品与激活剂，并施用所得精子样品至权利要求1至15中任一项的微流体芯片。
19.如权利要求18的方法，其中该激活剂为己酮可可碱(pentoxifylline)、黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、白蛋白或黄体激素。
20.一种高通量的精子分类装置，其包括：第一层、第二层及第三层，其中该第二层位于第一层和第三层之间并具有根据权利要求1至15中任一项的微流体芯片，该第一层位于该装置的顶端，并具有在该微流体芯片一端的一入口区及一出口区，该出口区位于该微流体芯片中与该第二流道的流体连通的该出口区的相对端，该微流体芯片的入口区连接至在该第一层的入口区，且该第三层位于该装置的底部并具有连接至在该第二层的该芯片的该出口区的容器。
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