FR3136479A1 - Dispositif d’isolement de cellules de sperme et procédé de sélection de cellules de sperme de haute qualité - Google Patents
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Abstract
L’invention concerne un dispositif de sélection de cellules de sperme ayant une plaque de support (2) comprenant une entrée (3) pour recevoir un échantillon de cellules de sperme, une sortie (4) pour collecter au moins certaines des cellules de sperme de l’échantillon, et un système microfluidique entre ladite entrée et ladite sortie, ledit système microfluidique comprenant une cuvette agencée pour recevoir un milieu et ayant une zone d'entrée et une zone de sortie respectivement à proximité de l'entrée et de la sortie, l'entrée (3) et la sortie (4) étant agencées pour fournir une différence de pression hydrostatique entre ladite zone d'entrée et ladite zone de sortie lorsqu'un milieu est ajouté à la cuvette par l'intermédiaire de la sortie, et la zone d'entrée et la zone de sortie étant en communication fluidique par l’intermédiaire d’un canal principal agencé dans la cuvette ayant une zone de largeur réduite entre la zone d'entrée et la zone de sortie formant une zone de rhéotaxie. Figure pour l’abrégé : Fig. 1
Description
La présente invention concerne un dispositif de sélection de cellules de sperme et un procédé utilisant ledit dispositif pour isoler des cellules de sperme de haute qualité.
L'analyse de sperme et la sélection et l'isolement de sperme de qualité sont essentiels pour les pratiques associées aux « techniques de reproduction artificielle (ART) ». De manière à faire face aux problèmes de santé relatifs à la stérilité masculine et au traitement de l’oligospermie, des ART comprenant une « injection de sperme intracytoplasmique (ICSI) », une « insémination intra-utérine (IUI) », et une « fécondation in vitro (IVF) » sont pratiquées.
Le marché des ART s’est développé depuis la dernière décennie. Des taux de stérilité croissants, des progrès technologiques, et des aides financières gouvernementales sont apparus comme moteurs de ce marché. En revanche, le coût plus élevé et les taux d'échec ont émergé comme potentielles contraintes. Selon la Société Européenne de Reproduction (European Society of Reproduction, ESR), la possibilité moyenne de grossesse et d'accouchement par transfert d'embryon est de 37 % et 21 % respectivement (De Geyter et al., ART in Europe, 2014 : Results generated from European registries by ESHRE. Hum Reprod 2018). Des conditions in vitro inférieures aux normes, la qualité des gamètes mâles/femelles, et des lésions aux embryons sont des facteurs potentiels d'échec des ART. Le criblage d'échantillons de sperme et la sélection de sous-populations de spermatozoïdes (ou cellules de sperme) de qualité est une étape importante, à laquelle est largement corrélée l'efficacité des ART (Oseguera-López et al., S. Novel Techniques of Sperm Selection for Improving IVF and ICSI Outcomes. Front Cell Dev Biol 2019 ; Pérez-Cerezales et al., The oviduct : From sperm selection to the epigenetic landscape of the embryo. Biol Reprod 2018 ; Sakkas et al., What can we learn from Mother Nature to improve assisted reproduction outcomes? Hum Reprod Update 2015).
La rhéotaxie, la thermotaxie, et la chimiotaxie sont les trois principaux mécanismes connus pour diriger les cellules de sperme vers les ovocytes (Giojalas and Guidobaldi, Getting to and away from the egg, an interplay between several sperm transport mechanisms and a complex oviduct physiology. Mol Cell Endocrinol 2020. ; Suarez, Mammalian sperm interactions with the female reproductive tract. Cell Tissue Res 2016 ;363 ; Suarez and Pacey, Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update 2006).
La rhéotaxie comprend la nage et la rotation des cellules de sperme à contre-courant d’un écoulement de liquide. La thermotaxie comprend la migration des cellules de sperme induite par un gradient de température. On suppose que la thermotaxie est principalement responsable de l’orientation de la nage des cellules de sperme à travers le tube folliculaire. La chimiotaxie comprend la réorientation des cellules de sperme vers les ovocytes et déclenche l'accumulation des cellules de sperme. On sait que la rhéotaxie, la thermotaxie, et la chimiotaxie sont déclenchées par l’appareil génital féminin. Par conséquent, l'appareil génital féminin facilite le micro-environnement qui permet la sélection qualitative pour la conception in vivo.
En dépit des mécanismes connus de transport des cellules de sperme à travers l'appareil génital féminin, les urologues ou les spécialistes en santé reproductive suivent le protocole de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) pour le criblage et la collection de sous-populations de qualité (Organisation Mondiale de la Santé, Manuel de laboratoire de l’OMS pour l’examen et le traitement du sperme humain, sixième édition, 2021). Le protocole est révisé périodiquement étant donné que l'évaluation du seuil de viabilité minimal ne prend pas en considération des paramètres potentiellement pertinents tels que l'ethnicité, les toxines environnementales, et la capacité de navigation des cellules de sperme dans des conditions optimisées (Douglas et al., A novel approach to improving the reliability of manual semen analysis : A paradigm shift in the workup of infertile men. World J Mens Health 2019 ; Levine et al., emporal trends in sperm count : A systematic review and meta-regression analysis. Hum Reprod Update 2017 ; Wang and Swerdloff, Limitations of semen analysis as a test of male fertility and anticipated needs from newer tests. Fertil Steril 2014). En outre, les protocoles standardisés sont manuels et longs tel que ceci a été mis en évidence par le demandeur (Shukla et al., Automated analysis of rat sperm motility in microchannels. Biomed Phys Eng Express 2018 ;4). Cependant, le manuel de l'OMS implique « l'analyse du sperme assistée par ordinateur (CASA) » qui offre un criblage rapide et automatisé d’échantillons de sperme. La CASA délivre la cinématique des cellules de sperme nageuses, ces paramètres ne prennent toutefois pas en considération le micro-environnement et les conditions physiologiques de l'appareil génital féminin ; l’importance biologique de ces paramètres reste par conséquent inconnue. En outre les cliniciens de la reproduction ont remis en question et critiqué la précision et la reproductibilité de l'essai CASA (Talarczyk-Desole et al., Manual vs. computer-assisted sperm analysis : Can CASA replace manual assessment of human semen in clinical practice? Ginekol Pol 2017 ;88).
Pour la séparation et l'isolement de sperme, le manuel de l'OMS implique des méthodes standard de lavage du sperme, de configuration en gradient de densité (DGC), et de migration ascendante (swim-up) du sperme, ce qui provoque une fragmentation de l'ADN dans les spermatozoïdes (Alvarez et al., Centrifugation of human spermatozoa induces sublethal damage ; separation of human spermatozoa from seminal plasma by a dextran swim-up procedure without centrifugation extends their motile lifetime. Hum Reprod 1993). La technique antérieure décrit les effets secondaires liés à l'utilisation de gamètes mâles endommagés dans un modèle murin où des cellules inférieures aux normes ont été utilisées dans la fécondation d’ovocytes ; cependant ceci a conduit à une modification de l'expression génique et favorise un développement fœtal/placentaire anormal (Fernández-Gonzalez et al., Long-term effects of mouse intracytoplasmic sperm injection with DNA-fragmented sperm on health and behavior of adult offspring. Biol Reprod 2008).
Indépendamment de ces inconvénients technologiques, la CASA, le DGC et la migration ascendante restent les protocoles les plus pratiqués pour le criblage et la sélection de sperme, respectivement. Il existe par conséquent une immense possibilité de modernisation technologique, qui peut largement améliorer le taux de réussite saturé des ART.
Le mécanisme in vivo de nage des spermatozoïdes est un phénomène complexe ; par conséquent, la mise en œuvre de cette suggestion n'est pas simple. Toutefois, les chercheurs développant des laboratoires sur puce ont exploité les avantages de la technologie microfluidique et ont établi une preuve de concept (PoC) associée à la nage du sperme, à l'analyse de sperme, et au tri de sperme.
US 8,535,622, US 2014/0248656 et WO 2020/041303 décrivent des systèmes de sélection de cellules de sperme.
L'ingénierie microfluidique implique la manipulation d’un petit volume, dans la plage des ml aux nl. L'échelle des petits volumes et une dimension de canal inférieure au millimètre comprennent une caractéristique unique : le mouvement de fluide en courants parallèles (écoulement laminaire), où le rapport entre les forces d'inertie et les forces visqueuses est faible. Ce rapport sans dimension est connu comme le nombre de Reynolds (Re), et permet de calculer la prédisposition du mouvement fluidique à développer des turbulences. L’écoulement laminaire à travers le micro-canal favorise une commande de degré élevé, et cette caractéristique offre de nombreux avantages comparés aux pratiques de laboratoire classiques. Le système microfluidique utilise de faibles volumes de d'échantillons et de réactifs, ce qui réduit le coût opérationnel et améliore la sensibilité et la rapidité du protocole biologique associé. La microfluidique offre un traitement parallèle, qui résulte des rendements élevés ; il est en outre possible d’intégrer à la technologie une perturbation externe, y compris acoustique (Clark et al., Acoustic trapping of sperm cells from mock sexual assault samples. Forensic Sci Int Genet 2019 ;41), optique (Schiffer et al., Rotational motion and rheotaxis of human sperm do not require functional CatSper channels and transmembrane Ca2+signaling . EMBO J 2020), magnétique (Xu et al., agnetic Micromotors for Multiple Motile Sperm Cells Capture, Transport, and Enzymatic Release. Angew Chemie - Int Ed 2020 ;59), électrique (Chen, Chen, et al., Direct characterization of motion-dependent parameters of sperm in a microfluidic device : Proof of principle. Clin Chem 2013 ; De Wagenaar et al., Towards microfluidic sperm refinement : Impedance-based analysis and sorting of sperm cells. Lab Chip 2016 ;16 ; De Wagenaar et al., Spermometer : electrical characterization of single boar sperm motility. Fertil Steril 2016 ;106) pour la manipulation ou la séparation de cellules uniques. La microfluidique évolue comme la technique la plus pratiquée dans la réplication et la régulation du micro-environnement et des conditions physiologiques in vivo pour les organes humains.
Les dispositifs de la technique antérieure ne sont cependant pas satisfaisants, notamment en ce qui concerne la récupération de cellules de sperme. Les dispositifs ont en fait généralement de faibles propriétés de récupération.
En outre l'exécution des procédés d’ART tel que l’IUI et la FIV implique une certaine concentration de spermatozoïdes de qualité. Bien que des approches basées sur la microfluidique améliorent généralement la qualité des cellules de sperme, le débit n’est toujours pas satisfaisant. En d'autres termes, un débit élevé reste un besoin existant. Cependant, le multiplexage peut être utilisé pour augmenter la récupération de cellules de qualité, mais il augmente le travail et la complexité du protocole. En outre, aucune technique de la technique antérieure ne combine les mécanismes de navigation actifs et passifs du sperme pour la séparation qualitative du sperme.
La présente invention améliore la situation.
À cette fin, elle concerne un dispositif de sélection de sperme ayant une plaque de support comprenant une entrée pour recevoir un échantillon de cellules de sperme, une sortie pour collecter au moins une partie des cellules de sperme comprises dans ledit échantillon, et un système microfluidique entre lesdites entrée et sortie, dans lequel ledit système microfluidique comprend une cuvette agencée pour recevoir un milieu et ayant une zone d’entrée et une zone de sortie respectivement à proximité de l’entrée et de la sortie, et dans lequel l’entrée et la sortie sont agencées pour fournir une différence de pression hydrostatique entre ladite zone d’entrée et ladite zone de sortie lorsqu’un milieu est ajouté à la cuvette par l’intermédiaire de la sortie, pour provoquer un courant dudit milieu de la zone de sortie en direction de la zone d’entrée pour initier la migration de cellules de sperme des cellules de sperme de l’échantillon de cellules de sperme à partir de la zone d’entrée en direction de la zone de sortie, et dans lequel la zone d’entrée et la zone de sortie sont en communication fluidique l’une avec l’autre par l’intermédiaire d’un canal principal agencé dans la cuvette, le canal ayant une zone de largeur réduite agencée entre la zone d’entrée et la zone de sortie de manière à former une zone de rhéotaxie, moyennant quoi ledit échantillon de cellules de sperme subit une sélection en traversant ladite zone de rhéotaxie durant ladite migration des cellules de sperme permettant ainsi de collecter un échantillon de cellules de sperme de qualité de la zone de sortie au niveau de la sortie.
L’invention est ainsi agencée pour répliquer le processus de sélection naturelle des cellules de sperme en imitant au moins partiellement l’appareil génital féminin. En particulier, le dispositif de l’invention comprend des propriétés de rhéotaxie qui permettent d’isoler du sperme de qualité d’un échantillon de cellules de sperme.
L’invention concerne en outre le dispositif dans différents modes de réalisation :
- l’entrée peut comprendre un tube ayant un premier diamètre, de préférence de 5 mm à 12 mm, et une première hauteur, de préférence de 1,5 mm à 2,5 mm, et la sortie comprend un tube ayant un second diamètre, de préférence de 4 mm à 5 mm, et une seconde hauteur, de préférence de 3,5 mm à 4,5 mm, dans lequel le premier diamètre est supérieur au second diamètre et la première hauteur est inférieure à la seconde hauteur, pour générer ladite différence de pression hydrostatique entre la zone d’entrée et la zone de sortie lorsque le milieu de fluide est chargé. Ceci améliore les propriétés relatives à la différence de pression hydrostatique, conduisant finalement à un écoulement de liquide proche de l’écoulement dans l’appareil génital féminin. Ce mode de réalisation améliore la sélection des cellules de sperme.
- La plaque de support peut être composée d’une couche supérieure et d’une couche inférieure, la couche supérieure comprenant lesdites entrée et sortie, et la couche inférieure comprenant ladite cuvette. Ceci améliore et/ou facilite la production du dispositif, par exemple, le processus de moulage etc.
- Le canal principal peut comprendre des micro-sous-canaux s'étendant à partir de la zone de rhéotaxie en direction de la zone de sortie ; et/ou le canal principal peut comprendre des micro-sous-canaux s'étendant à partir de la zone d'entrée en direction de la zone de rhéotaxie. Les cellules de sperme ont tendance à nager adjacentes aux parois des micro-sous-canaux. En outre, le confinement du microcanal (de 35 µm à 45 µm) élève la progressivité des cellules de sperme. La zone de rhéotaxie avec des sous-micro-canaux convergents permet la manipulation de la progressivité des cellules de sperme.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, le dispositif comprend en outre un châssis ayant moins un réceptacle configuré pour supporter la plaque de support, le châssis comprenant des premier et deuxième moyens de chauffage, dans lequel ledit premier moyen de chauffage est situé à proximité de l'entrée et ledit deuxième moyen de chauffage est situé à proximité de la sortie lorsque la plaque de support est placée dans le réceptacle, les premier et deuxième moyens de chauffage étant respectivement configurés pour chauffer à une première et une seconde température, la première température étant inférieure à la seconde température de manière à installer un gradient de température à l'intérieur du système microfluidique de la plaque de support de manière à imiter la thermotaxie.
Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif de l'invention comprend des moyens à la fois de rhéotaxie et de thermotaxie. La sélection de cellules de sperme de qualité est spectaculairement améliorée.
Un autre objet de l'invention est un procédé de sélection de cellules de sperme comprenant les étapes suivantes :
i. la fourniture d'un dispositif tel que décrit ci-dessus, ayant une plaque de support comprenant une entrée, une sortie et un système microfluidique entre lesdites entrée et sortie, le système microfluidique comprenant une cuvette ayant une zone d'entrée et une zone de sortie respectivement à proximité de l'entrée et de la sortie, l'entrée et la sortie étant agencées pour fournir une différence de pression hydrostatique entre ladite zone d'entrée et ladite zone de sortie lorsqu'un milieu de fluide est ajouté dans la cuvette par l’intermédiaire de la sortie, de manière à provoquer un courant dudit milieu de fluide depuis la zone de sortie en direction de la zone d'entrée, la zone d'entrée et la zone de sortie étant en communication fluidique l'une avec l'autre par l’intermédiaire d’un canal principal agencé dans la cuvette, dans lequel le canal a une zone de largeur réduite agencée entre la zone d'entrée et la zone de sortie de manière à former une zone de rhéotaxie ;
ii. le pré-remplissage de la cuvette avec un milieu de fluide, de préférence un milieu de séparation de sperme ;
iii. la fourniture d'un échantillon de cellules de sperme à l'entrée pour distribuer ledit échantillon à la zone d'entrée de ladite cuvette ;
iv. la fourniture d'un milieu de fluide à la sortie pour provoquer un courant dudit milieu depuis la zone de sortie en direction de la zone d'entrée, provoquant ainsi la migration de cellules de sperme des cellules de sperme de l'échantillon de cellules de sperme depuis la zone d'entrée en direction de la zone de sortie ;
v. la sélection de cellules de sperme de l'échantillon de cellules de sperme alors que lesdites cellules de sperme passent à travers ladite zone de rhéotaxie durant ladite migration des cellules de sperme ; et
vi. la collecte d'un échantillon de cellules de sperme de qualité depuis la zone de sortie au niveau de la sortie.
Le procédé peut en outre comprendre une étape d’instauration d’un gradient de température sur la plaque de support pour imiter la thermotaxie et améliorer ladite migration de cellules de sperme.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention se démarqueront et/ou deviendront clairs à la lecture de la description suivante, qui comprend des exemples spécifiques proposés à titre d'illustration et non de manière restrictive, ainsi qu’à partir des dessins dans lesquels :
la présente une vue en perspective d'un mode de réalisation du dispositif selon l'invention ;
la présente une vue en perspective d'un dispositif selon l'invention ;
la présente une vue latérale d'une couche supérieure d'un dispositif selon l'invention ;
la présente une vue de dessus d'une cuvette de l'invention ;
la présente une vue de dessus d'un mode de réalisation d'une cuvette de l'invention et dévoile en outre des détails de parties/sections particulières de ladite cuvette ;
la présente une vue de dessus d'un autre mode de réalisation d’une cuvette de l'invention et dévoile en outre des détails de parties/sections de ladite cuvette ;
la présente une vue en perspective d’un châssis chauffant selon l'invention ;
la présente un graphique des températures dans le temps dans un châssis chauffant selon l'invention ;
la présente un graphique des températures par rapport à la position dans un châssis chauffant selon l'invention ;
la présente une photographie microscopique de cellules de sperme et leur trajectoire ;
la présente un diagramme de la concentration en cellules de sperme d'une solution mère, et d'échantillons de cellules de sperme traités à travers trois différents modes de réalisation d'un dispositif selon l'invention ;
la présente un diagramme de la motilité des cellules de sperme d'une solution mère, et d'échantillons de cellules de sperme traités à travers trois différents modes de réalisation d'un dispositif selon l'invention ;
la présente un diagramme de la vitesse instantanée de cellules de sperme d'une solution mère, et d’échantillons de cellules de sperme traités à travers trois différents modes de réalisation d'un dispositif selon l'invention ;
la présente un diagramme du taux de vélocité progressif de cellules de sperme d'une solution mère, et d’échantillons de cellules de sperme traités à travers trois différents modes de réalisation d'un dispositif selon l'invention ; et
la présente les résultats d'un test de fragmentation d'ADN.
Les dessins et la description dans le présent document contiennent, pour la plus grande partie, des éléments de nature définie. Par conséquent, la description et les dessins non seulement sont utilisés pour mieux comprendre la présente invention, mais aussi contribuent à sa définition, lorsque ceci est approprié.
Le terme solution mère tel qu'il est utilisé dans le présent document peut désigner un échantillon de cellules de sperme. Plus particulièrement, une solution mère devient un échantillon de cellules de sperme après avoir été appliquée au dispositif selon l'invention. L'échantillon de cellules de sperme est alors traité à travers le dispositif de l'invention de manière à sélectionner et/ou isoler des cellules de sperme de haute qualité relativement, par exemple, à la motilité ou à la vélocité.
Le terme cellules de sperme et le terme spermatozoïdes sont généralement utilisés pour désigner le même type de cellules.
La présente invention réplique le microenvironnement de l'appareil génital féminin. La conception du dispositif selon l'invention utilise les principes fondamentaux des mécanismes de nage du sperme : la rhéotaxie, la thermotaxie et la chimiotaxie. Le dispositif selon l'invention permet de collecter des sous-populations de cellules de sperme intactes à haute teneur en ADN d'un échantillon de cellules de sperme.
La motilité du sperme est déclenchée par l'interaction synergique des protéines motrices et du cytosquelette accompagnant d'autres molécules supplémentaires. Tout défaut dans la structure basique et le fonctionnement de ces protéines amoindrit la motilité des cellules. De manière à faire face aux problèmes de santé relatifs à la stérilité féminine/masculine et au traitement de l’oligospermie, des « techniques de reproduction artificielle » (ART) comprenant une « injection de sperme intracytoplasmique (ICSI) », une « insémination intra-utérine (IUI) », et une « fécondation in vitro (FIV) » ont été introduites. Tel que décrit ci-dessus, les urologues et les spécialistes en santé reproductive adhèrent au protocole standard de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) ou de l'Association Européenne d'Urologie (European Association of Urology, EAU) pour le criblage d'échantillons de sperme et la séparation de sous-population de qualité. Cependant, le protocole de l'OMS qui implique la migration ascendante du sperme et la centrifugation en gradient de densité pour la séparation qualitative des cellules de sperme n'est pas satisfaisant. Par exemple, ces procédés comprennent la centrifugation qui conduit à la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et à la fragmentation de l’ADN des cellules de sperme. La présente invention imite la sélection naturelle de manière à sélectionner des cellules de sperme de haute qualité.
En conséquence, la présente invention est agencée pour mettre en œuvre à la fois la rhéotaxie et thermotaxie. En conséquence, la migration cellulaire des spermatozoïdes est accélérée, résultant en une collection de sous-population à haut rendement (~ 5 x 106/ml) avec ~ 100 % de motilité et avec ~ 100 % d'intégration d'ADN. Aucun dispositif de la technique antérieure ni aucun système basé sur la microfluidique classique ou autre existant ne permettent d’atteindre ce seuil.
Le dispositif de l'invention comprend au moins un canal principal (hauteur : approximativement 80 µm à 100 µm), et de préférence des micro-sous-canaux (hauteur : approximativement 40 µm à 50 µm). Plus particulièrement le canal principal est soumis à un écoulement entraîné par pression hydrostatique et comprend une zone dite de rhéotaxie qui permet un système de filtre de type grille pour les cellules de sperme. La zone de rhéotaxie est comparable à une zone ayant un effet Venturi. Tel que mentionné, le dispositif peut comprendre des micro-sous-canaux. Les micro-sous-canaux sont agencés à l'intérieur du canal principal. Plus particulièrement, les micro-sous-canaux peuvent être fixés à la partie inférieure des canaux principaux. Les micro-sous-canaux aident à la nage des spermatozoïdes. Le demandeur a, de manière surprenante, observé que la structure des sous canaux accélère la nage des spermatozoïdes. Ceci résulte en une collection de sous-population supérieure, en d'autres termes en une sélection améliorée des cellules de sperme tant en matière de concentration qu’en matière de propriétés de qualité.
Le dispositif de l'invention est généralement préparé par conception informatique 3D suivie par des techniques de modélisation. La « Conception Assistée par Ordinateur (CAO) » du circuit microfluidique peut être dessinée dans le logiciel open source FreeCAD puis exportée au format « .STL » pour le moulage par injection. En particulier, la plaque de support peut être préparée à l'aide de cette technique.
Selon un mode de réalisation préférée le dispositif comprend un châssis ayant une poche ou un réceptacle de manière à supporter la plaque de support. Le châssis peut comprendre une plaque à gradient constituée d'alliages d'aluminium (6800, 7075). Deux rubans de polyimide peuvent être collés en mode épaisseur au niveau des deux coins ou de côtés opposés du châssis puis être chauffés de préférence à 37 °C et 39 °C, respectivement. Les températures peuvent être commandées par les pilotes de refroidisseur thermoélectrique (TEC) Meerstetter® 1091 (disponibles auprès de la compagnie Meerstetter Engineering GmbH) raccordés à des capteurs PT-100 (Élément 010010TD 14). Plus généralement, l'invention est améliorée lorsqu'elle est activement maintenue à une température aussi constante que possible (en d'autres termes un gradient constant) à l'aide d'éléments thermiques et indépendamment des fluctuations de température. Pour répondre à ces exigences, le châssis de l'invention peut utiliser des éléments chauffants et/ou refroidissants. Le dispositif de commande TEC commande la température en délivrant un courant et une tension à l'élément thermique, régulé par rétroaction de capteurs de température. Dans la présente invention, un gradient d’approximativement 2 °C est atteint au niveau de la plaque de gradient. Le gradient est diffusé à la plaque de support (également appelée puce) par conduction. Les gradients de température activent les récepteurs thermiques dans les cellules de sperme qui provoquent ensuite la migration des cellules à travers le canal principal et/ou le micro-sous-canal.
Le dispositif va maintenant être décrit par référence aux figures 1 à 7.
La présente une vue en perspective d'un mode de réalisation du dispositif selon l'invention comprenant un châssis 7. Une plaque de support 2 ayant une forme allongée, de préférence une forme rectangulaire, comprend une entrée 3 et une sortie 4. L'entrée 3 et la sortie 4 ont une paroi de section circulaire et sont agencées pour appliquer ou retirer un échantillon liquide tel qu'un échantillon de cellules de sperme. L'entrée 3 et la sortie 4 donnent respectivement accès à une zone d'entrée et à une zone de sortie (non illustrée sur la ) dans l'intérieur de la plaque de support à l'intérieur d'une cuvette (pas non plus illustrée sur la ). La zone d'entrée et la zone de sortie sont en communication fluidique l’une avec l'autre. La forme et/ou la configuration de l'entrée 3 et de la sortie 4 sont choisies pour fournir une différence de pression hydrostatique lorsqu'un liquide tel qu'un échantillon de cellules de sperme est distribué à la plaque de support par l’intermédiaire de l'entrée 3 ou la sortie 4 ou des deux. De préférence, tel qu'illustré sur la , l'entrée 3 et la sortie 4 comprennent des tubes. Plus précisément, l'entrée 3 comprend un tube ayant un premier diamètre, de préférence de 5 mm à 12 mm, et une première hauteur, de préférence de 1,5 mm à 2,5 mm. La sortie 4 comprend un tube ayant un second diamètre, de préférence de 4 mm à 5 mm, et une seconde hauteur, de préférence de 3,5 mm à 4,5 mm. Le premier diamètre est supérieur ou égal au second diamètre et la première hauteur est inférieure à la seconde hauteur, de manière à générer une différence de pression hydrostatique entre la zone d'entrée et la zone de sortie lorsqu’un milieu de fluide est ajouté.
Le châssis 7 est de forme allongée, de préférence rectangulaire. Le châssis 7 comprend au moins une poche ou réceptacle 6 configuré pour supporter la plaque de support 2. Dans le mode de réalisation présenté sur la le châssis 7 présente cinq réceptacles 6. Cela confère au châssis 7 une conception de type échelle. Le châssis 7 comprend en outre un premier moyen de chauffage 8 et un deuxième moyen de chauffage 10. Le premier moyen de chauffage 8 est situé sur un côté du châssis et le deuxième moyen de chauffage 10 est situé sur le côté opposé du châssis. Plus généralement, les moyens de chauffage sont agencés de manière à ce que lorsque la plaque de support 2 est placée dans le réceptacle 6, le premier moyen de chauffage 8 se trouve à proximité de l'entrée et ledit deuxième moyen de chauffage 10 se trouve à proximité de la sortie. Les premier et deuxième moyens de chauffage étant respectivement configurés pour chauffer à une première et à une seconde température, la première température étant inférieure à la seconde température pour définir un gradient de température à l'intérieur du système microfluidique de la plaque de support de manière à imiter la thermotaxie.
La schématise généralement le protocole de sélection de sperme avec un mode de réalisation du dispositif de l'invention. Un échantillon de cellules de sperme est injecté avec une pipette 1 (~ 0,05 ml) au niveau de l'entrée 3 de la plaque de support 2 jetable. La différence de hauteur entre la sortie 4 et l'entrée 3 induit l’écoulement 5 (indiqué par les références 5a, 5b). Les cellules de sperme migrent contre l’écoulement, depuis la zone d'entrée en direction de la zone de sortie, et atteignent finalement la proximité de la sortie 4 où elles peuvent être collectées. La migration du sperme est également provoquée par un gradient de température T. Ici, le gradient de température T est établi à travers une carte TEC fournie par la compagnie Meerstetter®. La plaque de support 2 jetable est conservée à l'étage poche/réceptacle 6, et le chauffage a été commandé le long des rubans de polyamides jetables placés sur les côtés opposés du châssis 7. La carte TEC lit et acquiert les températures par l'intermédiaire des capteurs PT-100, en d'autres termes un premier moyen de chauffage 8 et un deuxième moyen de chauffage 10, et pour validation, un troisième moyen de chauffage 9 a été installé entre les premier et deuxième moyens de chauffage. Le troisième moyen de chauffage est un capteur de coefficient de température négatif (NTC 10K).
Référence est maintenant faite à la , qui présente une vue en perspective d'un dispositif selon l'invention et à la qui présente une vue latérale d'une couche supérieure du dispositif selon l'invention. La présente une plaque de support 2. La plaque de support 2 comprend une plaque de couche de dessus 11 (ou couche supérieure 11) et une plaque de couche de dessous 12 (ou couche inférieure 12). La couche supérieure 11 comprend l'entrée 3 et la sortie 4. La différence de hauteur 14 entre l'entrée 3 et la sortie 4 sont présentes sur la . La couche inférieure 12 comprend une cuvette 13. La cuvette 13 peut être remplie ou partiellement remplie de fluide par l’intermédiaire de l'entrée 3 ou par l’intermédiaire de la sortie 4. Plus généralement, l'entrée et la sortie sont configurées pour recevoir un milieu de fluide tel qu'un échantillon de sperme ou un milieu de sperme. Cependant, le courant (ou écoulement) de fluide selon l’invention (en d'autres termes depuis la zone de sortie en direction de la zone d'entrée) est uniquement provoqué lorsque la sortie est remplie de milieu. Principalement, la couche supérieure 11 assure le fonctionnement de l’écoulement de fluide par l’intermédiaire de la différence de pression hydrostatique entre les terminaux fluidiques, en d'autres termes la différence de hauteur 14. La couche inférieure a une cuvette 13 assurant la conception fluidique. Le couplage des deux couches termine les circuits fluidiques, et la communication fluidique entre l'entrée 3 et la sortie 4.
La présente une vue de dessus d’une cuvette 13 de l'invention. La cuvette 13 est de forme allongée. Ici, elle peut être décrite comme en forme de huit ou comme ayant un aspect général de cuillère. La cuvette 13 comprend un canal principal 13a servant de système microfluidique. La cuvette est généralement agencée pour comprendre un volume d’approximativement 20 µl. La cuvette 13 comprend en outre une zone d'entrée 103 et une zone de sortie 104. La zone d'entrée 103 se trouve à proximité de l'entrée 3. Elle est remplie de fluide lorsque le fluide est distribué à l'entrée 3. La zone de sortie 104 est à proximité de la sortie 4. La zone d'entrée 103 et une zone de sortie 104 sont en communication fluidique l'une avec l'autre par l'intermédiaire du canal principal 13a. En conséquence, lorsqu'un fluide est distribué à l'une ou l'autre de l'entrée 3 ou de la sortie 4, après un temps donné à la fois la zone d'entrée 103 et une zone de sortie 104 comprennent le fluide. À l'intérieur du système microfluidique, la cuvette 13 est de préférence agencée dans les limites d'une largeur 16 de 5 mm et d'une longueur 15 de 5 cm. Dans cet agencement, la cuvette comprend une restriction d’une largeur 17 d'environ 1,5 à 1,8 mm. Plus généralement, le rapport d'aspect longueur/largeur de la cuvette 13 peut se trouver entre 10 et 6, de préférence d'environ 7. Le rapport entre la restriction de largeur 117 et largeur moyenne de cuvette 16 est compris entre 0,3 et 0,36, de préférence d’environ 0,3. La configuration de la cuvette 13 est telle que le canal principal 13a est étranglé. La largeur de la restriction 17 est inférieure à la largeur de la cuvette 13. Plus généralement la zone d'entrée 103 et la zone de sortie 104 sont en communication fluidique l'une avec l'autre par l'intermédiaire d'un canal principal 13a agencé dans la cuvette 13, le canal 13a a une zone de largeur réduite agencée entre la zone d'entrée 103 et la zone de sortie 104 de manière à former une zone de rhéotaxie 117. L'objectif de la zone de rhéotaxie 117 est qu'un échantillon de cellules de sperme subisse une sélection en passant à travers ladite zone de rhéotaxie 117. La zone de rhéotaxie 117 sert ainsi de grille pour la sélection sperme. La structure de l'invention ne permet de passer de l’autre côté (zone de sortie) qu’aux cellules de sperme qui s’écoulent en amont et qui présentent une motilité suffisante pour dépasser la vitesse établie au niveau de la zone de rhéotaxie 117.
La présente une vue de dessus d'un mode de réalisation d'une cuvette de l'invention et présente en outre des détails de parties/sections particulières de la cuvette. La cuvette 13 comprend des circuits fluidiques dans lesquels le canal principal 13a comprend des micro-sous-canaux 13b (également dénommé sous-micro-canaux). Les micro-sous-canaux 13b s'étendent à partir de la zone de rhéotaxie 117 en direction de la zone de sortie 104. Le zoom [A] de la présente la largeur 18a des micro-sous-canaux 13b à proximité de la zone de rhéotaxie 117. Le zoom [C] de la présente la largeur 18b des micro-sous-canaux 13b à proximité de la zone de sortie 104. Dans le mode de réalisation de la , la largeur 18b des micro-sous-canaux à proximité de la zone de sortie est supérieure à la largeur 18a des micro-sous-canaux à proximité de la zone de rhéotaxie. En d'autres termes la largeur des micro-sous-canaux 13b diverge à partir de la zone de rhéotaxie 117 en direction de la zone de sortie 104. Les micro-sous-canaux 13b peuvent être formés par placement d'un premier jeu de tiges 19a le long du canal principal 13. Le zoom [A] de la présente le détail des tiges 19a placées dans le canal principal 13. La hauteur du canal principal est généralement comprise entre 80 µm et 100 µm, et est de préférence d'environ 80 µm. En conséquence, la hauteur des tiges est généralement comprise entre 40 µm et 50 µm, de préférence d'environ 40 µmm (zoom [B]). Les micro-sous-canaux aident la cellule de sperme à naviguer pour atteindre la zone de sortie 104, et finalement la sortie 4.
La présente une vue de dessus d'un autre mode de réalisation d'une cuvette selon l'invention et présente en outre les détails de parties/sections particulières de ladite cuvette. Dans ce mode de réalisation préféré, le canal principal 13a de la cuvette non seulement comprend des micro-sous-canaux 13b sur le côté de la zone de sortie 104 (après la zone de rhéotaxie 117), mais aussi comprend des micro-sous-canaux 13b sur la zone d'entrée sur le côté de la zone d'entrée 103 (avant la zone de rhéotaxie 117). Les micro-sous-canaux 13b sur le côté de la zone d'entrée 103 sont formés par placement d'un second ensemble de tiges 19b dans le canal principal 13. Les tiges 19b s'étendent à partir de la zone d'entrée 103 en direction de la zone de rhéotaxie 117. La met également en évidence qu'à l'intérieur de la zone de rhéotaxie 117 elle-même, aucune tige n'est placée. La longueur 17a de la zone de rhéotaxie 117 est généralement comprise entre 1 mm et 2,75 mm, de préférence est d'environ 2,75 mm. Le zoom [D] de la présente l'agencement du premier ensemble de tiges 19a et du second ensemble de tiges 19b à proximité de la zone de rhéotaxie 117. Le zoom [E] de la présente l'agencement du second ensemble de tiges 19b à proximité de la zone d'entrée 104. Généralement, le second ensemble de tiges 19b converge de la zone d'entrée 103 en direction de la zone de rhéotaxie 117. Cependant, au moins une partie des tiges du second ensemble de tiges 19b peuvent être agencées parallèlement tel que présenté dans le zoom [E] de la . Plus généralement, la décrit les sous-canaux sur les deux côtés de la zone de rhéotaxie. Les sous-canaux du côté entrée aident la propagation des cellules de sperme en direction de la zone de rhéotaxie. Cet agencement facilite la filtration des cellules de sperme immobiles et des ambiguïtés indésirables de l'échantillon de sperme.
La présente une vue en perspective d'un châssis chauffant selon l'invention. Le châssis 7 est similaire à celui présenté sur la . Il est formé à partir d'une plaque d'aluminium d'une épaisseur d’approximativement 1 cm et a une forme rectangulaire. Il comprend des réceptacles 6 qui ont été coupés dans la plaque d'aluminium de manière à supporter au moins une plaque de support 2 de l'invention. Il comprend en outre un premier ruban chauffant de polyamide 25 et un second ruban chauffant de polyamide 26 agencés sur des côtés de longueur opposés du châssis 7. Un circuit imprimé TEC Meerstetter® 36 a été mis en œuvre pour commander et entraîner les deux rubans chauffants de polyamide 25, 26. Les modules chauffants sont raccordés aux premier 25 et second rubans de polyamide. Les rubans 25, 26 sont respectivement alimentés par le circuit imprimé TEC par l’intermédiaire d'un premier raccordement chauffant 31 et d'un second raccordement chauffant 30. Un premier capteur PT 100 8 et un second capteur PT 100 10 ainsi qu’un capteur NTC-10K 9 étaient respectivement raccordés à trois « entrées/sorties universelles (GPIO) » 27, 28, 29. Le couplage de ces 3 capteurs 8, 9, 10 à la carte TEC 36 permet la lecture de la température en temps réel. Le fonctionnement « proportionnelle-intégrale-dérivée (PID) » de la carte permet la commande de la température par l'intermédiaire du flux de courant jusqu’aux rubans résistifs 25, 26. Le fonctionnement de la carte a été géré par l'intermédiaire d'une infrastructure informatique 35. Dans des conditions de travail d'un mode de réalisation préféré, le châssis est agencé pour chauffer les premier 25 et second 26 rubans de polyamide respectivement à 37 °C et 39 °C. En conséquence, le châssis formé par de d'aluminium est chauffé à 37 °C sur un côté de longueur et 39 °C sur l'autre côté de longueur conjointement au réceptacle 6.
La et la présentent respectivement un graphique de températures dans le temps et un graphique de température par rapport à la position dans un châssis chauffant selon l’invention. Les résultats de donnés de température sont présentés sur les deux figures. La représente la stabilité des mesures de température du premier capteur PT-100 8 et d’un second capteur PT-100 10, ainsi que d’un capteur NTC-10K 9. La met en évidence que les températures au niveau des coins (côtés des longueurs du châssis 7) sont respectivement maintenues à 37 °C et 39 °C, et les données du capteur NTC-10K mettent en évidence l'établissement de 38 °C au niveau du point intermédiaire (au milieu) du châssis 7, en d'autres termes, de la plaque d'aluminium. Les figures 8 et 9 mettent en évidence qu'un gradient de température régulier est instauré à l'intérieur du châssis 7. Ce gradient de température régulier est diffusé régulièrement dans la plaque de support 2 lorsque cette dernière est placée dans l'un des réceptacles 6 du châssis 7.
La est une image microscopique des cellules de sperme. Les trajectoires desdites cellules de sperme sont également présentées. La concentration initiale des cellules de sperme a été évaluée avec une chambre Makler (Sefi medical instruments Ltd.). Les dynamiques de motilité et de nage des cellules de sperme ont été évaluées par une infrastructure informatique, ce qui facilite le suivi des trajectoires des cellules de sperme. Un objectif de cette image microscopique peut être de fournir des informations associées aux analyses de données (extraction des paramètres de vélocité et de motilité).
Exemple
Un échantillon collecté de cellules de sperme (ou échantillon de sperme) et un milieu de sperme ont été maintenus à 37 °C dans des incubateurs pour la liquéfaction et le préchauffage. En même temps, le gradient de température est initié à l'intérieur du dispositif de l'invention. La température est définie à 37 °C et 39 °C, respectivement au niveau des premier et deuxième moyens de chauffage du châssis 7. Le gradient de température est instauré régulièrement dans la plaque de support après approximativement 12 minutes. La motilité et la concentration de la solution mère sont évaluées avec une chambre Makler. Des vidéos du sperme en mouvement ont été enregistrées à l'aide d'une caméra pour microscope (SwiftCam SC500), et des procédés de traitement d'image qui impliquent la soustraction du bruit de fond, le débruitage de l'image, et la segmentation de l'intensité et des régions ont été effectués pour l'analyse de la motilité et de la cinématique du sperme. Le dispositif, ou plus précisément la cuvette, est prérempli (80 µl) avec un milieu de séparation de sperme préchauffé (37 °C) (Sperm RinseTM510312Vitrolife). La plaque de support est maintenue à l'étape du gradient. Après 20 minutes, 0,05 ml de l'échantillon de sperme liquéfié est chargé au niveau de l'entrée du dispositif, et immédiatement, 80 µl du milieu de sperme sont ajoutés au niveau de la sortie. La rhéotaxie et la migration du sperme basée sur la thermotaxie surviennent et après environ 45 minutes, approximativement 80 µl de l'échantillon de sperme sont collectés par la sortie. La motilité de la collection de sous-population est également réalisée avec une chambre Makler et un microscope (Amscope T720Q). Un module d’algorithme de suivi d'objets basé sur un filtre Kalman et un algorithme Hunagarian ont été mis en œuvre pour extraire les trajectoires XY des images.
Les figures 11, 12, 13 et 14 présentent des mesures et des résultats de l'exemple ci-dessus réalisé dans trois modes de réalisation différents de l'invention.
Les figures 11, 12, 13 et 14 présentent des mesures et des résultats de l'exemple ci-dessus réalisé dans les dispositifs de l'invention présenté dans les modes de réalisation des figures 4, 5, et 6. RS représente les données de l'échantillon de sperme brut (solution mère). MF représente des données de cellules de sperme sélectionnées et collectées au niveau de la sortie du dispositif de l'invention présentée sur la , en d'autres termes ayant un canal principal sans micro-sous-canaux. MFS représente des données de cellules de sperme sélectionnées et collectées au niveau de la sortie du dispositif de l'invention présenté sur la , en d'autres termes ayant un canal principal et des micro-sous-canaux du côté de la sortie. MFBS représente des données de cellules de sperme sélectionnées et collectées au niveau de la sortie du dispositif de l'invention présenté sur la , en d'autres termes ayant un canal principal et des micro-sous-canaux sur le côté sortie et sur le côté entrée.
La présente l’évolution de la concentration des cellules de sperme. La présente la motilité des cellules de sperme. Presque ~ 100 % des cellules de sperme mobiles ont été séparées et isolées de l'échantillon de sperme initial. La présente la vitesse instantanée des cellules de sperme améliorée dans la sous-population collectée de sperme de qualité isolé de l'échantillon de sperme initial. La met en évidence que la vitesse progressive des cellules de sperme a été améliorée.
La représente les résultats du test de fragmentation d’ADN. [A] et [B] sont les images microscopiques représentatives (1280 × 940 px2avec 2,48 px/µm) pour la solution mère (RS) et le mode de réalisation microfluidique (MF). Le kit de fragmentation « Halosperm® G2 DNA fragmentation kit » et le protocole ont été respectés pour évaluer la fragmentation de l'ADN (fournis par Halotech®). La tête avec un grand halo représente une absence de fragmentation ou de dégradation, en revanche la tête avec un petit halo ou sans halo représente la fragmentation et la dégradation. La figure [C] valide le fait que la sélection de sperme réalisée avec le mode de réalisation 13 fournit la sous-population de sperme présentant une intégrité de l'ADN d'environ 100 %.
D'autres arrangements ont été mis au point. Selon un mode de réalisation, les températures définies par les moyens chauffant du châssis 7 sont comprises entre 36 °C et 40 °C. En particulier, la première température est définie entre 36 °C et 38 °C, de préférence à 37 °C, et la seconde température est définie entre 38 °C et 40 °C, de préférence à 39 °C.
Dans un sens plus général, l'objet de l'invention est un dispositif de sélection de sperme présentant un moyen d’imitation de la rhéotaxie et un moyen d’imitation de la thermotaxie.
Un autre objet de l'invention concerne un kit de sélection de sperme comprenant :
[A]. un dispositif présentant une plaque de support comprenant une entrée pour recevoir un échantillon de cellules de sperme, une sortie pour collecter au moins une partie des cellules de sperme comprises dans ledit échantillon, et un système microfluidique entre ladite entrée et ladite sortie, dans lequel ledit système microfluidique comprend une cuvette agencée pour recevoir un milieu et ayant une zone d'entrée et une zone de sortie respectivement à proximité de l'entrée et de la sortie,
[A]. un dispositif présentant une plaque de support comprenant une entrée pour recevoir un échantillon de cellules de sperme, une sortie pour collecter au moins une partie des cellules de sperme comprises dans ledit échantillon, et un système microfluidique entre ladite entrée et ladite sortie, dans lequel ledit système microfluidique comprend une cuvette agencée pour recevoir un milieu et ayant une zone d'entrée et une zone de sortie respectivement à proximité de l'entrée et de la sortie,
et dans lequel l'entrée et la sortie sont agencées pour fournir une différence de pression hydrostatique entre ladite zone d'entrée et ladite zone de sortie lorsqu'un milieu est ajouté à la cuvette par la sortie, de manière à provoquer un courant du milieu à partir de la zone de sortie en direction de la zone d'entrée pour initier la migration de cellules de sperme des cellules de sperme de l'échantillon de cellules de sperme depuis la zone d'entrée en direction de la zone de sortie,
et dans lequel la zone d'entrée et la zone de sortie sont en communication fluidique l'une avec l'autre par l'intermédiaire d'un canal principal agencé dans la cuvette, le canal ayant une zone de largeur réduite agencée entre la zone d'entrée et la zone de sortie de manière à former une zone de rhéotaxie,
moyennant quoi ledit échantillon de cellules de sperme subit une sélection en passant à travers ladite zone de rhéotaxie pendant ladite migration des cellules de sperme permettant ainsi de collecter un échantillon de cellules de sperme de qualité de la zone de sortie au niveau de la sortie ; et
B. un châssis ayant au moins un réceptacle configuré pour supporter la plaque de support, le châssis comprenant des premier et deuxième moyens chauffants, dans lequel ledit premier moyen chauffant se trouve à proximité de l'entrée et ledit deuxième moyen chauffant se trouve à proximité de la sortie lorsque la plaque de support est placée dans le réceptacle, les premier et deuxième moyens chauffants étant respectivement configurés pour chauffer à une première et une deuxième température, la première température étant inférieure à la deuxième température de manière à définir un gradient de température à l'intérieur du système microfluidique de la plaque de support de manière à imiter la thermotaxie.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention.
Claims (10)
- Dispositif de sélection de cellules de sperme ayant une plaque de support (2) comprenant une entrée (3) pour recevoir un échantillon de cellules de sperme, une sortie (4) pour collecter au moins certaines des cellules de sperme comprises dans ledit échantillon, et un système microfluidique entre ladite entrée et ladite sortie,
dans lequel ledit système microfluidique comprend une cuvette (13) agencée pour recevoir un milieu et ayant une zone d'entrée (103) et une zone de sortie (104) respectivement à proximité de l'entrée et de la sortie,
et dans lequel l'entrée (3) et la sortie (4) sont agencées pour fournir une différence de pression hydrostatique entre ladite zone d'entrée (103) et ladite zone de sortie (104) lorsqu'un milieu est ajouté à la cuvette (13) par l'intermédiaire de la sortie (4), de manière à provoquer un courant dudit milieu depuis la zone de sortie (104) en direction de la zone d'entrée (103) pour initier la migration de cellules de sperme des cellules de sperme de l'échantillon de cellules de sperme depuis la zone d'entrée (103) en direction de la zone de sortie (104),
et dans lequel la zone d'entrée (103) et la zone de sortie (104) sont en communication fluidique l'une avec l'autre par l’intermédiaire d’un canal principal (13a) agencé dans la cuvette (13), le canal ayant une zone de largeur réduite agencée entre la zone d'entrée (103) et la zone de sortie (104) de manière à former une zone de rhéotaxie (117),
moyennant quoi ledit échantillon de cellules de sperme subit une sélection en passant à travers ladite zone de rhéotaxie (117) durant la migration des cellules de sperme permettant ainsi de collecter un échantillon de cellules de sperme de qualité de la zone de sortie (104) au niveau de la sortie (4). - Dispositif selon la revendication 1, dans lequel l'entrée (3) comprend un tube ayant un premier diamètre, de préférence de 5 mm à 12 mm, et une première hauteur, de préférence de 1,5 mm à 2,5 mm, et la sortie (4) comprend un tube ayant un second diamètre, de préférence de 4 mm à 5 mm, et une seconde hauteur, de préférence de 3,5 mm à 4,5 mm, dans lequel le premier diamètre est supérieur au second diamètre et la première hauteur est inférieure à la seconde hauteur, de manière à générer ladite différence de pression hydrostatique entre la zone d’entrée (103) et la zone de sortie (104) lorsque le milieu est ajouté.
- Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la plaque de support (2) est composée d'une couche supérieure (11) et d'une couche inférieure (12), la couche supérieure comprenant lesdites entrée (3) et sortie (4), et la couche inférieure comprenant ladite cuvette (13).
- Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le canal principal (13a) comprend des micro-sous-canaux (13b) s'étendant à partir de la zone de rhéotaxie (117) en direction de la zone de sortie (104).
- Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le canal principal (13a) comprend des micro-sous-canaux (13b) s'étendant à partir de la zone d’entrée (103) en direction de la zone de rhéotaxie (117).
- Dispositif selon l'une des revendications 4 ou 5, dans lequel les micro-sous-canaux (13b) convergent en direction de la zone de rhéotaxie (117).
- Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le dispositif comprend en outre un châssis (7) ayant moins un réceptacle (6) configuré pour recevoir la plaque de support (2), le châssis comprenant des premier et deuxième moyens de chauffage, dans lequel ledit premier moyen de chauffage est situé à proximité de l'entrée (3) et ledit deuxième moyen de chauffage est situé à proximité de la sortie (4) lorsque la plaque de support (2) est placée dans le réceptacle (7), les premier et deuxième moyens de chauffage étant respectivement configurés pour chauffer à une première et une seconde température, la première température étant inférieure à la seconde température de manière à installer un gradient de température à l'intérieur du système microfluidique de la plaque de support (2) de manière à imiter la thermotaxie.
- Procédé de sélection de cellules de sperme comprenant les étapes suivantes :
i. la fourniture d'un dispositif selon l’une des revendications 1 à 7, ayant une plaque de support (2) comprenant une entrée (3), une sortie (4) et un système microfluidique entre lesdites entrée (3) et sortie (4), le système microfluidique comprenant une cuvette (13) ayant une zone d'entrée (103) et une zone de sortie (104) respectivement à proximité de l'entrée (3) et de la sortie (4), l'entrée (3) et la sortie (4) étant agencées pour fournir une différence de pression hydrostatique entre ladite zone d'entrée (103) et ladite zone de sortie (104) lorsqu'un milieu de fluide est ajouté dans la cuvette (13) par l’intermédiaire de la sortie (4), de manière à provoquer un courant dudit milieu de fluide depuis la zone de sortie (104) en direction de la zone d'entrée (103), la zone d'entrée (103) et la zone de sortie (104) étant en communication fluidique l'une avec l'autre par l’intermédiaire d’un canal principal (13a) agencé dans la cuvette (13), dans lequel le canal a une zone de largeur réduite agencée entre la zone d'entrée (103) et la zone de sortie (104) de manière à former une zone de rhéotaxie (117) ;
ii. le pré-remplissage de la cuvette (13) avec un milieu de fluide ;
iii. la fourniture d'un échantillon de cellules de sperme à l'entrée pour distribuer ledit échantillon à la zone d'entrée (103) de ladite cuvette (13) ;
iv. la fourniture d'un milieu de fluide à la sortie (4) pour provoquer un courant dudit milieu depuis la zone de sortie (104) en direction de la zone d'entrée (103), provoquant ainsi la migration de cellules de sperme des cellules de sperme de l'échantillon de cellules de sperme depuis la zone d'entrée (103) en direction de la zone de sortie (104) ;
v. la sélection de cellules de sperme de l'échantillon de cellules de sperme alors que lesdites cellules de sperme passent à travers ladite zone de rhéotaxie (117) durant ladite migration des cellules de sperme ; et
vi. la collecte d'un échantillon de cellules de sperme de qualité depuis la zone de sortie (104) au niveau de la sortie (4). - Procédé selon la revendication 8, comprenant en outre l’étape d’installation d’un gradient de température sur la plaque de support (7) pour imiter la thermotaxie et améliorer ladite migration des cellules de sperme.
- Procédé selon les revendications 8 ou 9, dans lequel le milieu de fluide de l’étape ii. est un milieu de séparation de sperme.
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| US20140248656A1 (en) | 2011-05-20 | 2014-09-04 | The Brigham And Women S Hospital, Inc. | Analysis and sorting of motile cells |
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-
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-
2023
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8535622B2 (en) | 2009-04-22 | 2013-09-17 | Lotus Bio (Nymphaea) Ltd | Sperm separation system |
| WO2012126478A1 (fr) * | 2011-03-21 | 2012-09-27 | Motilitycount Aps | Dispositif d'analyse de la motilité cellulaire |
| US20140248656A1 (en) | 2011-05-20 | 2014-09-04 | The Brigham And Women S Hospital, Inc. | Analysis and sorting of motile cells |
| US20140315281A1 (en) * | 2011-09-14 | 2014-10-23 | Dcb-Usa Llc | Microfluidic chips for acquiring sperms with high motility, productions and applications thereof |
| WO2020041303A1 (fr) | 2018-08-21 | 2020-02-27 | Florida Atlantic University Board Of Trustees | Systèmes et procédés de sélection de sperme |
Non-Patent Citations (16)
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