TW201331364A - 獲得高活動力的精子的微流道晶片，其製造及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於獲取具高速度(velocity)及/或運動力(motility)的精子之微流體晶片及其應用。該微流體晶片包括一入口區，第一流道，一分歧流道，一視需要的具圓角的塊狀結構及一或多個出口區。本發明模擬體內的精子激活過程並設計一種微流體晶片模擬激活過程，以便獲取較高量的具有高運動力及/或活性的精子群及/或次群。

Description

獲得高活動力的精子的微流道晶片，其製造及其應用
本發明係關於分選及/或活化具高速度(velocity)及/或運動力(motility)的精子。特定言之，該微流體晶片包括一入口區，第一流道，一分歧道及一或多個出口區。
已知約40%至50%的不育夫婦中，男性因素是不孕是重要因素。此等不孕和生育力低下的人絕大多數是少精子及/或弱精子性(精子活動力低於50%)。存在於這些不育男性的問題是由於這些人嘗試成為父親多年，但卻不成功。以子宮內置放精子，男性因素不育夫婦的懷孕率每個週期只有約15-20%。這是由於子宮內人工授精治療後有或沒有懷孕的丈夫群組中，在精子濃度及運動力方面沒有可察覺的差異。雖然在體外受精治療的懷孕率是比較高的，但足夠的精子濃度，或精子運動力並不保證懷孕成功。也有男性患有原因不明的男性不育症問題，即雖然精子濃度正常，但精子卻喪失生育能力。
由於各種社會學，經濟，和或許環境的原因，人工授精已成為更為頻繁的程序。全球人工授精的數量一直在增加，並將繼續增加。許多原因已被用來說明此一增加。例如，隨年齡增加通常會降低男性與女性受精的概率。越來越多的女性也在沒有伴侶下，由自己撫養孩子，並選擇人工授精作為懷孕的手段。此外，彼等無法擁有孩子者， 現在有一個負擔的起的醫療選擇。另一個因素可能是，男性的精子數量一直在下降，使懷孕更加困難。最後，環境因素也為男性和女性的生育能力下降的原因。
目前有各種各樣的人工授精方法，如子宮頸內、子宮內(IUI)、輸卵管內及直接的腹腔內(DIPI)受精，配子輸卵管內轉移(GIFT)，體外授精及胚胎移植(IVFET)，接合子輸卵管內移植(如ZIFT，PROST和TET)，腹膜卵母細胞和精子轉移(POST)及性別選擇。然而，隨著技術的進步，特定須遵循其他方法，然而，不論方法為何；高活動精子總是較佳的。大部分執行人工授精的設備，執行授精的設施沒有分離運動性精子，要求與設備(具分離裝置)分開的裝置。例如，子宮內人工授精(IUI)，體外受精(IVF)方法藉由將精子與卵子一起放置在利於懷孕的環境中(無論是在子宮內或子宮外)，而嘗試模擬生殖過程。授精過程中要求精子主動侵入卵並開始受精。具運動力的精子更能夠穿透卵。
人類精液是由不同成熟度的異源細胞群組成，具不同的功能質量和受精能力。射出的精子無法馬上就能使卵子受精。它們必須經過稱為「獲能化」(capacitation)的功能性成熟的過程。「獲能化」被普遍認為是一個獲得超活化的運動力及獲得進行精子頂體胞釋作用(acrosomal exocytosis)的過程。獲能化的結果在兩個精子功能上引起變化。首先，對如透明帶蛋白激素或孕激素等生理配體的反應，精子頭部獲得進行精子頂體胞釋作用的能力。第二，精子的鞭毛獲得」超活化」模式的運動力。
藉密度梯度離心的精子劃分可分離這些亞群，得到的顆粒中回收的精子在品質上有相當大的改良。相較於低密度的劃分區，數個區域指出可自顆粒中回收較高百分比的具運動力且型態正常的精子。精液是由具不同程度的結構與功能的分化與正常度的異質精子族群所組 成。從Percoll梯度，當自normozoospermic的人類精液分離高品質精子時，通常採用三個子集的精子(45%；L45)，(65%；L65)和(L90)90%劃分。L45顯示品質最差的，呈現最小百分比的形態正常且具運動力的精子。L65和L90顯示獲能化相關的酪氨酸磷酸化中的時間相關的增量(M.G.Buffone et al.,Human Reprod Vol.19,No.1 pp 139-146,2004)。
一次射精中精子的總數可衡量生育能力，但是，具運動力的精子的百分比是更重要的，尤其是當考慮替代的生殖方法。根據運動力，精子分類如下表所示：
呈現積極泳動的運動力精子的百分比可衡量精子樣品的生育能力。百分比越高，精子樣品的品質越高，及樣品達成受精的可能性就越大。高品質的精子樣品很重要的原因是多方面的。人工受精的過程，不僅花費昂貴且心理上也代價高昂。不成功的嘗試對患者造成巨大的影響。當樣品進行冷凍或以水稀釋時，更高品質的精子樣品也是重要的考慮因素，因為這些處理會殺死或減弱樣品。因此，只有最高的精子質量可在精子進行的處理程序中存活。
在過去已有各種篩選較具活性的精子被使用，例如向上游泳(swim up)，向下游泳(swim down)和Percoll密度梯度離心技術。向上游泳的方法是在IUI及IVF程序中常用處理新鮮或冷凍樣品。精子被放 置在培養基中，並進行離心過程。較多的具運動力的精子游泳到可提取他們的一定程度。這種方法採用多個試管和離心步驟，其耗時且會導致低回收的具運動力的精子。
已存在許多評估運動力和樣品中的精子數的方法。一種此等方法是顯微鏡分析，這通常是在醫院或商業實驗室進行。然而，最近，已提出許多關於測試套組的建議，這些是為了簡化精子的檢測。這些檢測套組的缺點是，它們不能區分具運動力的不具運動力的精子。而這種區別是男性不育症的最具預測性的指標。
US 5427946揭示一管道設備，有入口區、流道及嵌套室。精子樣品施加在入口區，只有運動力的精子能夠達到腔室。US 7179641提供了一種用於分離和檢測液體樣品中具運動力的精子，包括：一個分離容器，包括(i)入口區，(ii)出口區安排為可被打開，(iii)一個分離介質，在其中樣品中具運動力精子可流動通過入口區，及(iv)致動器可操作以打開出口區，用於使分離介質經出口區流出容器。這些先前技術均非基於微流體技術。
US 6929945提供一種裝置，其包括一具有樣品貯器的微流體結構，下游收集區，及在其間延伸的微通道。微通道被尺寸化以局限樣品精子在通道內單方向移動，使得精子在置於樣品貯器的精液樣品進入並沿著微通道移動朝向和進入收集區。Brenda等人提供一種用於自小樣品中分離具運動力精子的集成微通道系統，其包括兩個樣品入口，兩個出口，區分通道和被動驅動的幫浦系統，其提供穩定流動的液體。US 2010291535 A1揭示一種方法，使用一微流體晶片分選高運動力精子。在該先前技術參考文獻中，精子和介質分別經由數個入口注入微流體晶片的微通道。然而，上述先前技術文獻無法達到區別性的分選以獲得不同亞群的精子。也就是說，界上述先前技術文獻分選的精子會包括高運動力精子、低運動力精子，甚至沒有游動的精子。 此外，由上述先前技術文獻分選出的具運動力的精子量無法達到滿意的程度。
因此，仍然需要開發一種裝置和方法，不僅分選具較高運動力的精子，而且較多量的具目標品質的精子。
本發明係關於一種自精子樣品中獲取具高運動力的精子之微流體晶片，其包括：(a)一在微流體晶片一端的入口區；(b)一第一流道，其與入口區流體連通；(c)一分歧流道，其位於第一流道的下游且與第一流道的流體連通；(d)一或多個出口區，位於該分歧流道的一或兩側。
本發明另關於一種獲取精子樣品中具高運動力的精子之微流體晶片，其包括：(a)一在微流體晶片一端的入口區；(b)一第一流道，其與入口區流體連通；(c)一分歧流道，其位於第一流道的下游且與該第一流道的流體連通；(d)一或多個出口區，位於該分歧流道的一或兩側；(e)一第二流道，位於該分歧流道的下游；及(f)一出口區，位於微流體晶片的入口區相反端且與該第二流道的流體連通。
本發明亦關於使用本發明微流體晶片的方法，套組及系統。
2‧‧‧流道
3‧‧‧分歧流道
7‧‧‧擠壓流道
11‧‧‧入口區
12‧‧‧流道
13‧‧‧分歧流道
14‧‧‧出口區
41‧‧‧入口區
42‧‧‧出口區
43‧‧‧出口
44‧‧‧出口
45‧‧‧分歧流道
51‧‧‧擠壓流道
52‧‧‧擠壓流道
62‧‧‧第二微流體通道
63‧‧‧第三微流體通道
64‧‧‧第四微流體通道
71‧‧‧開口區
72‧‧‧流道
72‧‧‧出口區
73‧‧‧出口區
74‧‧‧出口區
75‧‧‧出口區
81‧‧‧第一層
82‧‧‧第二層
83‧‧‧第三層
84‧‧‧入口區
85‧‧‧出口區
86‧‧‧微流體通道
87‧‧‧出口區
88‧‧‧廢物容器
211‧‧‧入口區
212‧‧‧流道
213‧‧‧分歧流道
214‧‧‧出口區
215‧‧‧第2流道
216‧‧‧出口區
221‧‧‧入口區
222‧‧‧流道
223‧‧‧分歧流道
224‧‧‧出口區
225‧‧‧第2流道
227‧‧‧塊狀結構
226‧‧‧出口區
311‧‧‧塊狀結構之側
611‧‧‧入口區
612‧‧‧出口區
622‧‧‧出口區
632‧‧‧出口區
圖1顯示本發明的微流體晶片的的整體圖，包括一入口區，一第一流道，一分歧流道及一或多個出口區。
圖2A顯示本發明的微流體晶片的的整體圖，包括一入口區、一第一流道、一分歧流道、第二流道及一出口區。圖2B顯示本發明的微流體晶片的的整體圖，包括一入口區、一第一流道、一分歧流道、一第二流道、一具圓角的塊狀結構、及一出口區。
圖3A顯示本發明的微流體晶片的的整體圖，其包括除了如圖1所示的那些以外，包括一安置在該分歧流道之前具有入口區的擠壓流道。圖3B及3C顯示本發明的微流體晶片的的整體圖，其包括除了分別如圖2A及圖2B所示的那些以外，包括一安置在該分歧流道之前具有入口區的擠壓流道。
圖4顯示具有安置在該分歧流道之前之額外出口的本發明的微流體晶片的的整體圖。
圖5顯示本發明的微流體晶片的的整體圖，在分歧流道之前但在擠壓通道之後的可能端口佈置。
圖6顯示本發明的微流體晶片的順序操作組合。
圖7顯示本發明的微流體晶片的平行操作組合。
圖8顯示高吞吐量精子分類。
圖9顯示以濃度60x106精子/ml之精液樣品之獲取結果。
圖10顯示使用本發明的微流體晶片獲取濃度60x106精子/ml之人類精液樣品之結果。
圖11顯示使用本發明的微流體晶片與本發明激活劑之組合，獲取濃度45x106精子/ml之人類精液樣品之結果。
圖12顯示使用本發明的微流體晶片與本發明激活劑之組合，獲取濃度10x106精子/ml之人類精液樣品之結果。
圖13顯示使用本發明的微流體晶片獲取濃度3x108精子/ml之豬精子之結果。
圖14A、14B及14C顯示使用本發明的微流體晶片，透過31.8x106 精子/ml人類精液之回沖操作之獲取結果。
本發明提供一種微流體晶片，用於獲取具有高運動及/或活性的精子群及/或次群。本發明模擬體內的精子激活過程並設計一種微流體晶片模擬激活過程，以便獲取較高量的具有高運動力及/或活性的精子群及/或次群。精液可直接施用於該微流體晶片，不須稀釋。
本說明書中使用的術語一般有其在本領域中的普通含義在本發明上下文中及每個術語在特定的上下文中。特定術語將在下面討論的，或在本說明書中的其它地方，以提供額外的指導，在描述本發明的裝置和方法，以及如何能夠製造和使用它們。為便利起見，某些條款被標示，例如使用斜體和/或引號。使用標示不影響術語的範圍與意義，在同樣內文中，不論它是否被標示，術語的範圍與意義相同。將被理解的是，同樣的事情通常可用一個以上的方式進行說明。因此，替代的語言和同義詞可被用於任一或多個本文中所討論的術語。對某些術語的同義詞亦有提供。然而，一個或多個同義詞的引用不排除其他同義詞的使用，也不是解釋為任何特殊的意義無論一術語是否被闡述或討論。
術語「微流體通道(microfluidic channel)」是指具有寬度及深度尺寸，其便於精子經由通道的移動與在體內情況類似的方式。通常情況下，微流道的寬度和深度尺寸在約10 mm至5 mm。微流體通道可以是任何橫截面的幾何形狀，如圓形或矩形，以及至多達許多公分的長度。
術語「流(flow)」是指任何液體或固體通過裝置或於本發明方法中的移動，並且包括但不限於任何流體流的任何移動，及與液流(stream)、在液流內或抗液流移動的任何材料。例如，精子通過裝置或在本發明的方法中的移動，如通過本發明微流體晶片的通道，包括 一液流。根據本發明的，是否精子被流體流攜帶(也包括一流)，或者是否精子移動是藉其他直接或間接的力或移動，以及是否任何移動力的性質是已知或理解。任何力的應用可用於提供一種液流，包括但不限於壓力、毛細作用和組合，不考慮任何特定的理論或作用機制，只要精子根據本發明檢測、測定、分選或及激活。
術語「運動力」(motility)是指移動的能力，及「精子運動力」具體為精子細胞允許經由流體介質而移動的彼等性質。
術語「激活精子」(active sperm)是指能積極運動及移動的彼等精子細胞。
術語「流道」(flow channel)是本發明晶片的流道，其允許精子流動至分選及/或活化區。流道通常於接收精子樣品的入口區的流體連通，其允許精子進入流道。流道通常與分選及/或活化區流體連通。
術語「入口區」(inlet region)是微流體晶片接收精子的區域。入口區可包含一入口通道、一井或一貯池、一開口或有利於精子進入晶片的其他特徵。如希望，晶片可包含一個以上的入口區。術語「出口區」是收集或分配分選後精子的微流體晶片的區域。術語「出口區」(outlet region)是位於流道下游，且可包含一貯池、分支通道或出口通道。如希望，晶片可包含一個以上的出口區。
術語「精子」(sperm)是指任何動物，如人、豬、馬、狗、綿羊、牛、山羊、貓等等動物，的精子細胞。精子細胞由頭部、中段和尾部組成。頭部含有具密集盤繞染色質纖維的核，前端圍繞頂體，其含有穿透女性卵子的酶。術語」精子樣品」指精液或稀釋的精液。
術語「亞群」(subgroup)和「亞族群」(subpopulation)是可互換使用的。亞群或亞族群的精子包括下列群組：第(0)群、第(1)群、第(2)群及第(3)群。
第0群(G0)：
此亞群顯示VCL的最低值(VCL=0微米/秒)。亞族群1以整體低的速度值，(基於VCL，VSL和VAP值)，低的線性度值(如LIN及STR的值所指示者)，及低的振盪運動值(如WOB，平均ALH和BCF的值所指示者)來定義。
第1群(G1)：
此亞群顯示VCL的第二最低值(VCL=0-120微米/秒)。包括於亞族群2的精子顯示中至高的速度(如VCL，VSL和VAP所指示者)，高的線性度(如LIN及STR的值所指示者)，及高的振盪運動值(如WOB，平均ALH和BCF的值所指示者)。
第2群(G2)：
此亞群具有高的VCL值(VCL=120-180微米/秒)。亞族群3由具高速度及相對高線性度的精子組成(如VCL，VSL，VAP，LIN及STR所指示者)。再者，包括於此次族群的精子也具有高的振盪運動值(如WOB，平均ALH和BCF的值所指示者)。
第3群(G3)：
包括於此亞群的精子具有最高的VCL值(VCL>180微米/秒)。亞族群4由具高速度及線性度特徵(如VCL，VSL，VAP，LIN及STR所指示者)。再者，此等精子的總振盪運動值非常高(如WOB，平均ALH和BCF的值所指示者)。
本發明之微流體晶片
本發明的微流體晶片藉由建構一分歧結構(divergent structure)及一視需要的具圓角的塊狀結構(block structure with rounded corners)而可獲得高運動力及/或高活力的精子。首先，本發明設計具一分歧結構的微流體晶片，且該分歧結構可根據它們的速度分群精子。再者，本發明設計一種具圓角的塊狀結構以激活精子使增加具高速度及活力 的精子的數目。
在一方面，本發明提供一種自精子樣品中獲取具高運動力的精子之微流體晶片，其包括：(a)一在微流體晶片一端的入口區；(b)一第一流道，其與入口區流體連通；(c)一分歧流道，其位於第一流道的下游且與第一流道的流體連通；(d)一或多個出口區，位於該分歧流道的一或兩側。
根據本發明的微流體晶片包括一入口區，一流道，一分歧流道及位於該分歧流道的一或兩側之一或多個出口區。
參照附圖，圖1是本發明的微流體晶片的整體圖。入口區11引入一精子樣品進入流道12。較佳地，入口區是圓形，且具有直徑範圍從約0.5毫米至約4毫米。更佳為，入口區的直徑是大約1毫米。較佳地，精子樣品可藉由注射道其中而被饋送到入口區。
微流體晶片的流道12與入口區11流體連通。較佳地，所述流道的長度範圍為從約5毫米(mm)到約30毫米，或約6毫米至約30毫米，約7毫米到約30毫米，約8毫米至約30毫米，約9毫米至約30毫米，約10毫米至約30毫米，約11毫米至約30毫米，約12毫米至約30毫米，約13毫米至約30毫米，約15毫米到約30毫米，約16毫米至約30毫米，約17毫米至約30毫米，約18毫米至約30毫米，約19毫米到約30毫米或約20毫米至約30毫米；更佳地，約15毫米，約16毫米，約17毫米，約18毫米，約19毫米，約20毫米，約21毫米，約22毫米，約23毫米，約24毫米，約25毫米，約26毫米，約27毫米，約28毫米，約29毫米或約30毫米；更佳地，約25毫米。較佳地，流道的寬度範圍為從約50微米(μm)至約150微米，約60微米至約150微米，約70微米至約150微米，約80微米至約150微米，約90微米至約150微米，約100微米至約150微 米，約50微米至約140微米，約50微米至約130微米，約50微米至約120微米，約50微米至約110微米，約50微米至約100微米，約60微米至約140微米，約60微米至約130微米，約60微米至約120微米，約70微米至約140微米，約70微米至約130微米，約70微米至約120微米，約80微米至約140微米，約80微米至約130微米，約80微米至約120微米，約80微米至約110微米，約90微米至約130微米，約90微米至約120微米，或約90微米至約110微米；更佳地，約90微米，約91微米，約92微米，約93微米，約95微米，約96微米，約97微米，約98微米，約99微米，約100微米，約101微米，約102微米，約103微米，約104微米，約105微米，約106微米，約107微米，約108微米，約109微米，或約110微米。較佳地，流道的深度範圍為從約25微米到約75微米，約25微米至約70微米，約25微米至約65微米，約25微米至約60微米，約25微米至約55微米，約25微米至約50微米，約25微米至約70微米，約25微米至約65微米，約25微米至約60微米，約25微米至約55微米，約25微米至約50微米，約30微米至約70微米，約30微米至約65微米，約30微米至約60微米，約30微米至約55微米，約35微米至約70微米，約35微米至約65微米，約35微米至約60微米，約35微米至約55微米，約40微米至約60微米，約40微米至約55微米，或約45微米至約55微米；更佳為約45微米，約46微米，約47微米，約48微米，約49微米，約50微米，約51微米，約52微米，約53微米，約54微米或約55微米。
分歧流道13被設置在流道12的下游側，且與流道12的流體連通。分歧流道的端部是開放的。分歧流道的寬度從流道2的寬度開始逐漸增大。在一具體實施例，分歧流道3的寬度較流道2的寬度增加1倍至15倍以上；較佳的是，超過1至14倍，超過1至13倍，超過1至12倍，超過1至11倍，超過1至10倍，超過1至9倍，超過1至8倍，超過1 至7倍，超過1至6倍，超過1至5倍，超過1至4倍，超過1至3倍，或超過1至2倍；較佳為超過1至10倍。較佳地，分歧流道3的寬度範圍從約50微米至約1,000微米，約60微米至約1000微米，約70微米至約1000微米，約80微米至約1000微米，約90微米至約1,000微米的，約100微米至約1000微米，約100微米至約900微米，約100微米至約800微米，或約100微米至約700微米。在另一具體實施例中，分歧流道與流道的壁的壁之間的角度是約5至約30度；較佳地，該角度是約5至約25度，約5至約20度，約5至約15度或約5至約12度；更佳地，該角度是約8至約20度，約8至約15度，約8至約12度；更佳地，該角度是約10度。在另一具體實施例中，流速V主要以精子樣品Q的流量及分歧流道橫截面面積來決定。較佳地，流速是根據V=Q/A來決定，其中V是速度，Q是精子樣品的流體體積，及A是分歧流道的橫截面面積。更佳地，橫截面面積對流速的比例是從約1至約1/10。精子樣品從流道2流至分歧流道3。由於分歧流道較流道具有較大的橫截面尺寸，精子樣品的中間流(middle stream)的流速高於精子樣品在分歧流道的側線流的流速。鑑於精子具有逆流永動的事實，具有較高運動力的精子能夠抵抗該液流的流動阻力。據此，分歧流道13包括一或多個出口區14，其位於分歧流道13的一或兩側，而可將具不同運動力等級的精子分級。
在一具體實施例，本發明提供一種獲取精子樣品中具高運動力的精子之微流體晶片，其包括：(a)一在微流體晶片一端的入口區；(b)一第一流道，其與入口區流體連通；(c)一分歧流道，其位於第一流道的下游且與該第一流道的流體連通；(d)一或多個出口區，位於該分歧流道的一或兩側；(e)一第二流道，位於該分歧流道的下游；及 (f)一出口區，位於微流體晶片的入口區相反端且與該第二流道的流體連通。
在一具體實施例，上述為微流體晶片另包括一具圓角的塊狀結構，位於分歧流道或第二流道，其中該塊狀結構的每一邊與流道璧間維持一個距離。
參照到圖2A，除了如上述圖1所述的入口區211，流道212，分歧流道213及出口區214外，另提供第二流道215及出口區216。參照到圖2B，除了如上述圖1所述的入口區221，流道222，分歧流道223及出口區224外，另提供第二流道225，具圓角的塊狀結構227及出口區226。
參照到圖2A及2B，接續分歧流道213(圖2A)或223(圖2B)，提供一第二流道215(圖2A)或225(圖2B)。該第二流道設置於分歧流道3的下游且是與分歧流道流體連通。較佳地，所述的流道長度的範圍從約0.5毫米至約3毫米，或約0.5毫米到約2毫米或約0.5毫米至大約1毫米。
在圖2B所示的具體實施例中，有一具圓角的塊狀結構227設置於分歧流道223或第二流道225。根據本發明的，具圓角的塊狀結構可為具圓角的啞鈴結構，具圓角的圓柱結構，具圓角的長方體結構，具圓角的立方體結構或具圓角的梯形塊結構。較佳地，具圓角的塊狀結構是具圓角的啞鈴結構。較佳地，具圓角的塊狀結構227位於分歧流道的終點。根據本發明，如圖2C所示，具圓角的塊狀結構的每一側與分歧流道的壁225之間有一距離311。較佳地，該距離的範圍為從約100微米至約10微米；更佳地，約90微米至約10微米，約80微米至約10微米，約70微米至約10微米，約60微米至約10微米，約為50微米至約10微米，約40微米至約10微米，或約30微米至約10微米，約100微米至約20微米，約90微米至約20微米，約80微米至約20微米，約70微 米的至約20微米，約100微米至約30微米，約90微米至約30微米，約80微米至約30微米，約80微米至約40微米，約80微米至約50微米，約75微米至約30微米，約75微米至約40微米，約75微米至約50微米，約75微米至約60微米；進一步更佳的是，約59微米，約58微米，約57微米，約56微米，約55微米，約54微米，約53微米，約52微米，約51微米或約50微米。根據本發明，在塊狀結構中最窄的位置的流速係根據(Q/2)及流道的最大寬度來決定。在一具體實施例中，流速是根據公式：V=(Q/2)/(分歧流道的最大寬度(μm)/S)來決定，其中V是流速，Q是精子的流量及S是塊狀結構每側與流道壁間的距離。
如上所述，在流動流的中間的流速高於在分歧通道3兩側流道璧附近的流動流的流速。鑑於精子具有逆流永動的事實，具有較高運動力的精子能夠抵抗該液流的流動阻力且可在較窄流道寬度的位置被收集。據此，分歧流道3包括一或多個出口區4，位於分歧流道3的一側或兩側，以收集高運動力的精子。分歧流道3的中間流中的精子將繼續流經具圓角的塊狀結構31。如圖2C所示，具圓角的塊狀結構227提供了對精子流的阻礙，使得精子流經具圓角的塊狀結構的每一側311與分歧流道璧225間的空間，使得其流速大幅增加。藉由大幅增加精子流的流速，精子藉由精子或能化而被激活，因此可得到較多量的具運動力的精子。
在本發明微流體晶片的終點，提供一出口區216(圖2A)或226(圖2B)，以收及具高運動力的精子且其與第二流道215(圖2A)或225(圖2B)是流體連通的。較佳地，出口區是圓形的，且具有範圍從約0.5mm至約4mm的直徑。更佳地，出口區的直徑是大約1毫米。
在另一個實施例中，參照圖3A，一或兩個擠壓流道7與入口區係安置在如圖1中所示的微流體通道的分歧流道14之前，以提供介質擠壓流的精子樣品流。如圖2A和圖2B圖所示微流體晶片的實施例，可 具有如圖3B和圖3C所示之上述的額外的擠壓流道。擠壓流道和流道的接合位置可在入口和分歧流道之間的任何地方。該晶片係設計為可藉由捏縮力控制流體的方向和速度，並可產生穩定且緩慢的流動速度。在分歧點的流動分佈係藉由該分支流道之液體高度來控制，根據精子的運動力集中精子。該設計的另一個目的是為在分支入口投藥，例如黃體激素等，並在流道中央混合。各擠壓流道7包括一個流道72及開口區71。在該擠壓流道與該第一流道的壁之間的角度範圍為自大約30度至大約120度。較佳地，該角度係約30度，約45度，約90度或大約120度。當該角度係自大約30度至90度時，該介質擠壓流係與該精子樣品流同向流。當該角度係自90度至120度時，該介質擠壓流係與該精子樣品流逆流。藉由提供擠壓流至精子樣品流中，可在分歧流道中增加具有高運動力的精子。
在另一個實施例中，從該開口區收集精子後，可添加緩衝液至如圖2A、圖2B、圖3A、圖3B或圖3C中所示的微流體晶片的出口區中，以將流道內的精子沖洗回來，並在入口區收集。將精子樣品加載至入口區中後，可透過靜水壓力和毛細作用形成流道。由於精子的逆流游泳性質，具有較高運動力的亞群將會留在該流道中，且具有較低運動力的將會與死精子和廢物一起被推向該出口區。當流道變得平衡時，可藉由入口區的蓋子隔絕大氣壓力。從出口區移除廢物後，將緩衝液添加至該出口，以將流道內的精子沖洗回來，並在入口區收集。
在另一個實施例中，除了位於開口區41之相對端處的出口區42以外，如圖4所示，一或二個額外的出口43和44可安置在分歧流道45之前。如圖5所示，對於具有一或二個擠壓流道51和52之微流體晶片，該出口43和44可安置在分歧流道45之前，但在該擠壓流道51和52之後。較佳地，該出口和第一流道的壁之間的角度係約小於90度，較佳為大約90度。在一個實施例中，該晶片也可用於將高運動力精子逆 沖至該垂直分支的出口中，以避免在回沖後原始精液的干擾。參照圖4，在隔絕出口43和出口後，加載精液至入口區41。透過靜水壓力和毛細作用可形成在流道中的流動流。由於精子的逆流游泳性質，具有較高運動力的亞群將會留在該流道中，且死精子和廢物將出現在出口區42中。當流道變得平衡時，流道便保持靜態。從出口區42移除廢物後，將緩衝液添加至出口區42中，以將流道內的精子沖洗回來，並從出口43和44收集。參照圖5，加載精液至入口區41，並加載緩衝液或藥物至擠壓流道51和52中。透過靜水壓力和捏縮力可形成流道。由於精子的逆流游泳性質，具有高運動力精子的亞群將留在流道中，而該死精子和廢物則會出現在出口區中。當流道變得平衡時，可藉由入口41、51、和52的蓋子與大氣壓力隔絕。從出口區42移除廢物後，添加緩衝液至出口區42中，以將流道內的精子沖洗回來，並從擠壓流道51和52收集。
另一方面，本發明提供了一種該微流體晶片之順序操作組件，其包括一個以上的本發明晶片，其中，該晶片係有順序地安置。已設計出收集精子的順序操作。在流動平衡建立之前，一些高運動力精子將被沖洗至出口。在一個實施例中，為保留所有高品質的精子，該晶片亦可藉由四個連續的微流體通道分類精子，以減少高品質精子的損失。參照圖6，加載精液至入口區611後，透過靜水壓力和毛細作用可形成流道。由於精子的逆流游泳性質，具有高運動力精子的亞群將留在流道中，而死精子和廢物則出現在該出口區612中。在出口區612中的樣本係藉由第二62微流體通道、第三63微流體通道、及第四64微流體通道分類。當流道變得平衡時，流道便保持靜態。我們可以根據精子數目的需求，從入口區611，出口區612，出口區622，或出口區632收集樣本。取決於從入口區611收集到的精子數量，從出口區612、622和632分類的精子將被視為保存的精子。
另一方面，本發明提供了一種微流體晶片的平行操作裝置，其包括一個以上的本發明晶片，其中晶片係以平行佈置。已設計出收集精子的平行操作。該晶片係設計為將四個微流體通道之組合至一個晶片中。當檢體超載時，我們可以藉由同時操作四個微流體通道，將分類產量增加至4倍。參照圖7，在加載精液至中央入口區71中後，透過靜水壓力和毛細作用可形成流道。由於精子的逆流游泳性質，高運動力的亞群將留在流道中，而死精子和廢物將出現在四個出口區72、73、74及75中。在一個實施例中，當流道變得平衡時，藉由入口的蓋子可隔絕大氣壓力。從出口移除該廢物後，將緩衝液添加至出口區72、73、74及/或75中，以將流道內的精子沖洗回來，並從入口區71收集。
另一方面，亦已設計出一種高吞吐量的精子分類裝置。該高吞吐量的精子分類裝置包括：第一層、第二層及第三層，其中該第一層上位於該裝置的頂端，並具有在該微流體晶片一端的一入口區及在該微流體晶片之該開口區的相對端的一出口區，該第二層位於第一層和第三層之間並具有本發明的微流體晶片，該晶片的入口區連接至在該第一層的入口區，且該第三層位於該裝置的底部並具有連接至在該第二層之該晶片之該出口區的容器。參照圖8，該晶片被分作81，82和83三層：第一層81包含作為入口區84和出口區85的兩個開口；第二層82係設計為微流體通道86，且該出口區87係連接到第三層83。第三層83具有廢物容器88，其負責從出口收集廢物並保持流道內的流體靜壓力。在一個實施例中，加載精液至入口區84後，透過靜水壓力和毛細作用形成流道，其由於亞群活動的精子之逆向游泳性質，而死精子和廢物將出現在出口區87中。當流道變得均衡，藉由入口區84之蓋子可隔絕大氣壓力。從出口區87移除該廢物後，添加緩衝液至出口區87，以將流道內的精子沖洗回來，並從入口區84收集。
本發明微流體晶片的製造
本發明之微流體晶片係微製造的，例如，藉由使用常規的光刻技術(photolithography techniques)蝕刻矽晶片，或使用稱為「軟光刻技術」(soft lithography)的微機械技術。此等和其它微組裝方法可用於提供不昂貴的小型化設備，且在軟光刻技術的情形下，可以提供具有利性質的設備，如改善的柔韌性，穩定性和機械強度。根據本發明的裝置相對便宜且容易設置。它們也可以是拋棄式。使用此等技術，微製造的流體裝置可以取代先前技術的傳統流體流動室。
本發明的微製造裝置較佳係從矽微晶片或矽彈性體製作。須理解的是，「區/區域」和「通道/流道」是彼此流體連通，因此可能會重疊；即，區域或通道的開始或結束處有可能是沒有明確的邊界。一個微組裝裝置可以是透明的，且可以具有透明性質的材料覆蓋。
在一較佳具體實施方案中，本發明提供通道模塑成光學透明的矽橡膠、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚(乳酸)、聚乳酸(PLA)或聚二甲基矽氧烷(PDMS)；較佳為優選聚二甲基矽氧烷。PDMS過程中已由Samuel K.Sia與George M.Whitesides報導(Electrophoresis 2003,24,pp.3563-3576)。這是鑄造而成的模具，由此等通道的負像蝕刻用於半導體製造中使用的相同類型的晶體矽晶片。如上所述，對於圖案化的半導體的相同技術被用於形成通道的模式。未固化的液體矽橡膠注入到此等置於玻片底部的模具。為了加速固化，將此等注入的模具烘烤。PDMS固化後，將其從模具頂部去除並修整。在使用前，PDMS裝置被放置在HCl的熱浴中，使表面具親水性。接著將該裝置放置到第一號(150微米厚)(25×25毫米)的正方形顯微鏡蓋玻片。蓋玻片形成所有通道和井的底部(或屋頂)。任何或所有此等製造和準備步驟可通過手工完成，或者它們可被自動化的操作和使用該裝置。
藉由使用本發明微流體晶片獲取具有高運動力精子之套組及方法
另一方面，本發明提供了一種獲取具有高運動力精子之方法，其包括視情況將精子樣品與活化劑混合並將所得精子樣品施加到本發明的微流體晶片。根據本發明，該活化劑為本多非林(pentoxifylline)、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、白蛋白或黃體激素。因此，本發明提供了用於獲取具有高運動力精子的套組，其包括一種活化劑及本發明的微流體晶片。
用於獲取高運動力精子的系統
在另一實施例中，本發明提供了一種用於獲取高運動力精子的系統，其包括本發明之微流體晶片、一可選的活化劑、一微流體分配系統、和一用於檢測精子品質的感測器。任何一種本領域中已知的微流體分配系統及感測器皆能與本發明微流體晶片結合，以提供一種用於獲取具有高運動力精子的系統。
該微流體晶片可在一個步驟中達成獲取精子之方法，且在使用本發明晶片之方法前，能忽略原始精液樣本之間的精子運動力或濃度的差別。本發明的微流體晶片能篩選活動精子的亞群，並獲得更高數量的活動精子。此外，該微流體晶片是可拋棄式的，容易生產且成本低，所以它在獲取活動精子中是個有優勢的產品。
實例1 本發明微流體晶片之製備
具有微規格流道、閥及其他元件的微流體晶片可設計並製造成固體基材。矽是一種較佳的基料，由於發展成熟的技術使其可精確且高效的製造，但也可使用其他材料，包括聚合物，如聚四氟乙烯。在本領域中公知的微機械方法包括膜沉積處理，如旋塗法和化學氣相沉積法，激光加工或光刻技術，或蝕刻方法，其可以使用任一的濕化學或電將處理。
本發明的微流體晶片的微製造的起始步驟包括SU-8厚膜光阻製程。使用標準的洗滌過程以丙酮、異丙醇和蒸餾水清洗玻璃基板，然 後乾燥。一層SU8-50的光阻，較佳約50μm的厚度，形成於玻璃基板，通常是藉由加熱玻璃基板至800至1200℃。經光罩照射的經塗覆積壓體，其已經以大小對應的圖案(pattern)壓印，並製成所要的微流道模式。形成具有所要光罩圖案的光罩的方法為已知技術。
微流體精子獲取流道係使用軟光刻方法製得。簡言之，PDMS澆鑄於具所要流到特徵的模型並固化。所得PDMS圖案被氧化以密封在流道上的玻璃蓋玻片，製得本發明之微流體晶片。圖1至圖8顯示本發明微流體晶片的各種類型。
實例2 具運動力精子之獲得與分析 使用本發明微流體晶片獲取人類精子
人類精子根據它們的曲線運動速度(curvilinear velocity；VCL)，可分成下列3群：第0群(G0)：VCL為0微米/秒(精子是活的但VCL可忽略)；第1群(G1)：VCL<120微米/秒；第2群(G2)：VCL為120-180微米/秒；第3群(G3)：VCL>180微米/秒。
具高濃度(60×106精子/毫升)的精子樣品係得自人類。每一樣品晶如下處理及測定。1毫升PureSperm80(Sepal Reproductive Devices,MA,U.S.A.)，1毫升PureSperm40(Sepal Reproductive Devices,MA,U.S.A.)和1.5毫升的樣品分別加入15毫升的離心管中，然後在25℃，300 RCF(相對離心力)下離心30分鐘。離心分離後，除去上清液，然後以5毫升PureSperm WASH清流速洗。將所得溶液於25℃，500 rcf下離心20分鐘。離心分離後，除去上清液而得到沉澱。沉澱用500 μL biggers-Whitten-Whittingham(BWW)培養基溶解沉澱決。然後，精子的濃度被調節至20-25×106精子/毫升。
接著進行精子獲取分析。10毫升的磷酸鹽緩衝液注射至本發明 的微流體晶片，使得晶片的管道中沒有氣泡。精子樣品被引入本發明的微流體晶片的入口區。在分歧流道中，速度可以下列方式獲得：(V)=流量(Q)/分歧通道的橫截面面積(A)。在本例中，Q是0.8米/秒及分歧流道的璧與該流中的流動方向的流道的壁之間的角度是10度，分歧流道不同位置的流速如下表所示：
將樣品溶液自本發明晶片的出口區抽吸出。所得樣品以medeaLAB CASA(MedComputer Aided Sperm Analyzer；Medical Technology Vertriebs-GmbH,Germany)測定。
濃度為60×106精子/毫升的精子樣品，處理前後的各種VCL群中的精子數目列於下表：
上表結果如圖9所示。本發明晶片處理後，G3群的精子從54%增加至65%及G2群的精子自23%減少至7%。
使用本發明微流體晶片組合激活劑獲取人類精子
高濃度(60×106精子/毫升與45×106精子/毫升)及低濃度(10×106精子/毫升)的精液樣品係得自人類。樣品的離心和處理與上述相同。所得樣品以本發明激活劑(即以Hans-F10調整本多非林(pentoxifylline)密度)處理，並接著如前述進行高運動力精子獲取分析。結果示於圖10、圖11與12針對濃度分別為60×106個精子/毫升、45×106精子/毫升 及10×106個精子/毫升的樣品。關於60×106精子/毫升的精液樣品，G3組的精子從51%提高至73%及G2組的精子從15%減少至11%。關於45×106精子/毫升精液樣品，G3組的精子從18%提高至36%及G2組的精子從11%減少到9%。至於10×106精子/毫升的精液樣品，G3組的精子從17%提高到28%，而G2組的精子增加，從11%至14%。結果，G2及G3的精子的濃度從2.7×104精子/微升增加至4.2×104精子/微升。
使用本發明微流體晶片獲取豬精子
豬精子根據它們的曲線運動速度(curvilinear velocity；VCL)，可分成下列3級：第1群(G1)：VCL<120微米/秒；第2群(G2)：VCL為120-180微米/秒；第3群(G3)：VCL>180微米/秒。
具1×106個精子/毫升的低濃度精液樣品係得自豬。離心分離、處理及精子獲取測定的步驟類似於彼等用於人類樣品者，但進行適當修改以適合豬樣品。其結果如圖13所示。所獲取精子的VCL高於250微米/秒，證明本發明的晶片可分離具不同速度的精子亞群。
使用本發明的微流體晶片組合本發明激活劑以獲取豬精子
具低濃度為3×108個精子/毫升的精液樣本係得自豬。1毫升的90%的PercollTM(GE Healthcare)加入微離心管，接著1毫升65%的PercollTM及1毫升40%的PercollTM依次添加到該管中。離心管中加入3毫升的精液樣品管並在900 g下離心20分鐘。取沉澱物並置於微量離心管(eppendorf)中。1毫升的稀釋溶液加入微量離心管，然後以500 g離心8分鐘。除去上清液。1毫升的稀釋溶液中加入微量離心管，然後以500 g離心8分鐘。除去上清液並溶解沉澱物並稀釋至濃度為1×106個精子/毫升。所得樣品以本發明的激活劑(即，以Hans-F10調整本多非林(pentoxifylline)密度)處理，然後如前所述進行精子獲取測定。結 果顯示處理後可達到高於60%的獲取率。
實例3 以回沖操作收集具運動力的精子
使用如圖2B所示的微流體晶片進行回沖操作。將晶片的入口和出口吸乾，並將晶片置於水平操作台。8微升的精液加入到入口，停留10-12分鐘，然後在顯微鏡下觀察精子的分佈。入口蓋上蓋玻片並自出口收集廢物於心的微量離心管。20 μL的Ham's F10培養基加到出口以沖洗流道，並自入口收集樣品於心的微量離心管。原精液的濃度為31.8x106精子/毫升及G2+G3群中的精子數目為1658精子(共4微升)，而G1+G2+G3群中的精子數目為51433的精子(共4微升)(參見圖14A-14C)。以微流體晶片分選後，精子的濃度是54.15×106/ml，相較於原精液，其濃縮了1.7倍。此外，G1+G2+G3群中的精子的數量是97598精子(總4 μL)，其升高約1.89倍。此結果指出以為流體晶片分選精子，不僅增加總濃度，也提高了高運動力的精子的數目。
2‧‧‧流道
3‧‧‧分歧流道
7‧‧‧擠壓流道
11‧‧‧入口區
12‧‧‧流道
13‧‧‧分歧流道
14‧‧‧出口區
41‧‧‧入口區
42‧‧‧出口區
43‧‧‧出口
44‧‧‧出口
45‧‧‧分歧流道
51‧‧‧擠壓流道
52‧‧‧擠壓流道
62‧‧‧第二微流體通道
63‧‧‧第三微流體通道
64‧‧‧第四微流體通道
71‧‧‧開口區
72‧‧‧流道
72‧‧‧出口區
73‧‧‧出口區
74‧‧‧出口區
75‧‧‧出口區
81‧‧‧第一層
82‧‧‧第二層
83‧‧‧第三層
84‧‧‧入口區
85‧‧‧出口區
86‧‧‧微流體通道
87‧‧‧出口區
88‧‧‧廢物容器
211‧‧‧入口區
212‧‧‧流道
213‧‧‧分歧流道
214‧‧‧出口區
215‧‧‧第2流道
216‧‧‧出口區
221‧‧‧入口區
222‧‧‧流道
223‧‧‧分歧流道
224‧‧‧出口區
225‧‧‧第2流道
227‧‧‧塊狀結構
226‧‧‧出口區
311‧‧‧塊狀結構之側
611‧‧‧入口區
612‧‧‧出口區
622‧‧‧出口區
632‧‧‧出口區

Claims (32)

  1. 一種自精子樣品中獲取具高運動力的精子之微流體晶片，其包括：(a)一在微流體晶片一端的入口區；(b)一第一流道，其與入口區流體連通；(c)一分歧流道，其位於第一流道的下游且與第一流道的流體連通；(d)一或多個出口區，位於該分歧流道的一或兩側。
  2. 如請求項1的微流體晶片，其中該精子係得自人類、豬、馬、狗、綿羊、狗、牛、山羊或貓。
  3. 如請求項1之微流體晶片，其中該入口區是圓形，且具有直徑範圍從約0.5毫米至約2毫米。
  4. 如請求項1之微流體晶片，其中該流道的長度範圍為從約5毫米到約15毫米。
  5. 如請求項1之微流體晶片，其中該分歧流道與流道的壁的壁之間的角度是約5至約30度。
  6. 如請求項1之微流體晶片，其中該分歧流道與流道的壁的壁之間的角度是約8至約20度。
  7. 如請求項1之微流體晶片，其中該分歧流道與流道的壁的壁之間的角度是約10度。
  8. 如請求項1之微流體晶片，其中該分歧流道的寬度較該流道的寬度增加1倍至15倍以上。
  9. 一種獲取精子樣品中具高運動力的精子之微流體晶片，其包括：(a)一在微流體晶片一端的入口區； (b)一第一流道，其與入口區流體連通；(c)一分歧流道，其位於第一流道的下游且與該第一流道的流體連通；(d)一或多個出口區，位於該分歧流道的一或兩側；(e)一第二流道，位於該分歧流道的下游；及(f)一出口區，位於微流體晶片的入口區相反端且與該第二流道的流體連通。
  10. 如請求項9的微流體晶片，其中該精子係得自人類、豬、馬、狗、綿羊、狗、牛、山羊或貓。
  11. 如請求項9之微流體晶片，其中該入口區是圓形，且具有直徑範圍從約0.5毫米至約4毫米。
  12. 如請求項9之微流體晶片，其中該流道的長度範圍為從約5毫米到約15毫米。
  13. 如請求項9之微流體晶片，其中該分歧流道與流道的壁的壁之間的角度是約5至約30度。
  14. 如請求項9之微流體晶片，其中該分歧流道與流道的壁的壁之間的角度是約8至約20度。
  15. 如請求項9之微流體晶片，其中該分歧流道與流道的壁的壁之間的角度是約10度。
  16. 如請求項9之微流體晶片，其中該分歧流道的寬度較該流道的寬度增加1倍至15倍以上。
  17. 如請求項9之微流體晶片，其另包括一具圓角的塊狀結構，位於分歧流道或第二流道，其中該塊狀結構的每一邊與流道璧間維持一個距離。
  18. 如請求項17之微流體晶片，其中該距離的範圍為從約100微米至約10微米。
  19. 如請求項17之微流體晶片，其中該具圓角的塊狀結構為具圓角的啞鈴結構，具圓角的圓柱結構，具圓角的長方體結構，具圓角的立方體結構或具圓角的梯形塊結構。
  20. 如請求項17之微流體晶片，其中該具圓角的塊狀結構為具圓角的啞鈴結構。
  21. 如請求項17之微流體晶片，其中該第二流道的長度範圍為從約0.5毫米至約3毫米。
  22. 如請求項17之微流體晶片，其中該出口區具有範圍從約0.5mm至約4mm的直徑。
  23. 如請求項17之微流體晶片，其中具入口區的一或兩個擠壓流道係額外安置於分歧流道14之前。
  24. 如請求項17之微流體晶片，其中額外的出口係安置在分歧流道之前。
  25. 如請求項17之微流體晶片，其中額外的出口係安置在分歧流道之前，但在該擠壓流道之後。
  26. 一種微流體晶片之順序操作組件，其包括一個以上如請求項1至25中任一項之微流體晶片，其中，該晶片係有順序地安置。
  27. 一種微流體晶片的平行操作裝置，其包括如請求項1至25中任一項之微流體晶片，其中晶片係以平行佈置。
  28. 一種獲取具高運動力精子之方法，包括視需要混合精子樣品與激活劑，並施用所得精子樣品至請求項1至25中任一項之微流體晶片。
  29. 如請求項28之方法，其中該激活劑為本多非林(pentoxifylline)、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、白蛋白或黃體激素。
  30. 一種用於獲取高運動力精子的系統，其包括本發明之微流體晶片、一可選的活化劑、一微流體分配系統、和一用於檢測精子 品質的感測器。
  31. 如請求項30之系統，其中該激活劑為本多非林(pentoxifylline)、黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、白蛋白或黃體激素。
  32. 一種高吞吐量的精子分類裝置。該高吞吐量的精子分類裝置包括：第一層、第二層及第三層，其中該第一層上位於該裝置的頂端，並具有在該微流體晶片一端的一入口區及在該微流體晶片之該開口區的相對端的一出口區，該第二層位於第一層和第三層之間並具有本發明的微流體晶片，該晶片的入口區連接至在該第一層的入口區，且該第三層位於該裝置的底部並具有連接至在該第二層之該晶片之該出口區的容器。
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