PT1917974E

PT1917974E - Sistema de inseminação artificial não cirúrgica em equinos

Info

Publication number: PT1917974E
Application number: PT07023690T
Authority: PT
Inventors: Edward L Squires; Patrick M Mccue; George E Seidel
Original assignee: Xy Llc
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1999-07-29
Publication date: 2011-02-22
Also published as: BR9912539A; NZ509434A; PT1100534E; JP2002521043A; DE69938000D1; EP1917974B1; EP2283848A1; HUP0103126A3; AR018234A1; CA2338194C; ATE488247T1; EP1100534B1; CA2338194A1; DE69942959D1; EP1100534A1; US7772005B1; EP1917974A1; ES2296398T3; ATE383869T1; HUP0103126A2

Description

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DESCRIÇÃO

"SISTEMA DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL NÃO CIRÚRGICA EM EQUINOS"

I. CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se em termos gerais ao campo da inseminação artificial de equídeos. Envolve também a inseminação artificial de equídeos em casos onde tenha havido selecção do sexo dos espermatozóides para produzir descendência equina do sexo desejado. É especialmente relevante para situações em que se deseja a inseminação artificial de equídeos não cirúrgica e ainda quando se reveste de importância prática uma inseminação artificial equina em baixas doses.

II. ANTECEDENTES A inseminação artificial de éguas tem sido importante desde há muitos anos. Com frequência esta operação é efectuada por meios cirúrgicos. Em casos de rotina, em que não são necessárias doses mais baixas de esperma, esta operação é efectuada sem recorrer à cirurgia, por inseminação artificial, no entanto esta emprega números de espermatozóides relativamente elevados. No caso de inseminação artificial de rotina da égua é normalmente recomendada a inseminação de 250 a 500 x 10ê espermatozóides progressivamente móveis (epm) inseminados dia sim, dia não, numa égua no estro para atingir a fertilidade máxima. Infelizmente, no momento da inseminação de éguas com o sémen de garanhões muito férteis, a fertilidade diminui dado que se reduziu o número de 2 espermatozóides móveis. Em condições ideais, insemina-se com êxito uma égua apenas com 100 x 106 epm, sem reduzir a fertilidade, no entanto mesmo este número apresenta desafios. A inseminação com um baixo número de espermatozóides é necessária no caso da utilização de sémen sexado seleccionado e sémen descongelado em quantidade limitada. A pré-selecção do sexo da prole num equídeo reveste-se, naturalmente, de interesse. A pré-selecção do sexo na sequência da inseminação artificial (IA) com baixos números de populações separadas, enriquecidas, de espermatozóides com cromossomas X e Y, separados com base no conteúdo de ADN, é actualmente possível noutras espécies, no entanto, as espécies equinas têm-se revelado mais difíceis nalguns aspectos. Enquanto o nascimento de progenia do sexo desejado na sequência de inseminação intra-uterina de gado bovino e ovino validou a tecnologia de selecção dos sexos até à presente invenção, não se revelou prática na aplicação em equídeos.

Uma pré-selecção do sexo envolve a separação entre os espermatozóides com cromossomas X e os com cromossomas Y, seguida da utilização da inseminação artificial (IA) ou fertilização in vitro (FIV) e posterior transferência do embrião. Actualmente, a citometria de fluxo de alta velocidade permite aos investigadores separar >1000 espermatozóides sexados vivos/segundo. Contudo, a separação só por si não basta. A fim de tornar a sexagem do sémen uma técnica praticável para um programa de IA em equinos comercial, é necessário um número menor de espermatozóides móveis numa dose de inseminação. Numa égua, com utilização de sémen fresco para ia, uma dose de inseminação típica conteria entre 250 e 500 x 106 espermatozóides móveis. À 3 velocidade actual de separação de -1000 espermatozóides vivos/segundo seriam necessários quase seis dias para separar uma dose para inseminação! Por conseguinte, é necessário um número menor de espermatozóides móveis para alcançar em termos práticos uma fertilidade razoável. Uma vez conseguido este objectivo, uma maior fertilidade com inseminação não cirúrgica das éguas com sémen sexado é também considerado como necessário em termos práticos.

Como mencionado, a pré-selecção do sexo envolve a utilização do conteúdo de ADN e separação dos espermatozóide em populações com cromossoma X e Y. Recorrendo a citometria de fluxo de alta velocidade, os investigadores podem separar até 1000 espermatozóides vivos/seg. do sexo desejado com uma precisão de 90 %, o que proporciona números adequados de espermatozóides em muitas espécies que não os equídeos numa porção de tempo razoável. Por exemplo, esta nova tecnologia de sexagem dos espermatozóides tornou-se uma técnica prática de inseminação artificial em gado. Uma vez que é prático separar não só um pequeno número de espermatozóides e manter ainda a viabilidade do esperma, um aspecto da presente invenção remete para maiores taxas de gravidez na sequência da inseminação de 25 x 106 espermatozóides não separados, progressivamente móveis (epm). Este número equivale a cerca de um décimo do que era anteriormente considerado ideal para operações de rotina. Outro aspecto refere-se a números ainda menores. Estes aspectos podem ter consequências económicas significativas quando se considera a sua aplicação no caso de animais premiados célebres, tais como cavalos e outros semelhantes.

Como mencionado, um dos desafios fundamentais que os esforços no sentido da separação dos espermatozóides 4 equinos com X e Y se defrontaram reside no elevado número de espermatozóides envolvido. No caso da inseminação natural, os espermatozóides equinos são produzidos quase ao nivel dos milhares de milhão, no caso da inseminação artificial este número é menor, mas ainda são utilizados números de espermatozóides equinos significativamente elevados. Por exemplo, as técnicas de inseminação artificial de equídeos utilizam por rotina duzentos e cinquenta milhões a cinco milhões de espermatozóides. Assim, presume-se que é necessário um número significativo de espermatozóides num contexto de inseminação artificial equina.

Dado que a invenção se refere a inseminação artificial com selecção do sexo, têm sido tentados muitos métodos para conseguir a separação entre os espermatozóides com cromossomas X e Y noutros animais. No entanto, nenhum destes tratou dos aspectos peculiares dos espermatozóides equinos ou separação especifica destes. Os métodos gerais de separação têm variado entre técnicas magnéticas, tais como se encontram na patente norte-americana n° 4276139, até técnicas colunares, como descrito na patente norte-americana n° 5514537 até técnicas gravimétricas como discutido na patente norte-americana n° 3894529, reemissão da patente n° 32350, patentes norte-americanas n°s 4092229, 4067965 e 4155831. Têm sido tentadas também propriedades eléctricas como se demonstra na patente norte-americana 4083957, bem como uma combinação de propriedades eléctricas e gravimétricas como discutido nas patentes norte-americanas n° 4225405, 4698142 e 4749458. Têm sido também desenvolvidos esforços de motilidade como se revela nas patentes norte-americanas n° 4009260 e 4339434. Técnicas químicas, tais como as apresentadas nas patentes norte- 5 americanas n° 4511661 e 4999283 (envolvendo anticorpos monoclonais) e patentes norte-americanas no 5021244, 5346990, 5439362 e 5660997 (envolvendo proteínas de membrana) e as patentes norte-americanas n° 3687803, 4191749, 4448767 e 4680258 (envolvendo anticorpos) bem como a adição de componentes séricos como demonstrado na patente norte-americana no 4085205. Enquanto cada uma destas técnicas foi apresentada como se fosse extremamente eficaz, na realidade até ao presente nenhuma das técnicas produziu o nivel desejado de pré-selecção de sexo e nenhuma revelou sucesso ao nivel da inseminação artificial com esperma equino. Independentemente da técnica de separação eventualmente empregue, contudo, as combinações em jogo dos elevados números de espermatozóides equinos naturalmente presentes e a abordagem da separação entre espermatozóides com cromossoma X e com cromossoma Y tornou desejável desenvolver uma capacidade para alcançar a inseminação de equídeos com números inferiores de espermatozóides. A técnica quantitativa utilizada para alcançar a separação entre os espermatozóides com cromossomas X e Y destinados a inseminação artificial (de qualquer espécie) tem sido aquela que envolve a técnica de citometria de fluxo. Esta técnica revelou-se possível em resultado dos avanços e descobertas envolvendo a absorção diferencial de pigmento dos espermatozóides com cromossomas X e Y. Este aspecto foi discutido anteriormente na patente norte-americana n° 4362246 e significativamente expandida através das técnicas reveladas por Lawrence Johnson na patente norte-americana n° 5135759. A técnica Johnson de utilização da citometria de fluxo para separar espermatozóides com cromossomas X e Y foi um progresso tão significativo que tornou, pela primeira vez, praticável a separação comercial 6 destes espermatozóides. Além disso, a separação foi significativamente melhorada por meio da utilização de citómetros de fluxo, tais como o citómetro de fluxo MoFlo®, produzido pela Cytomation, inc. e discutido numa variedade de outras patentes, incluindo as patentes norte-americanas n°s 5150313, 5602039, 5602349 e 5643796, bem como a publicação de patente internacional PCT WO 96/12171. Enquanto a utilização dos citómetros Cytomation's MoFlo® permitiu maiores aumentos da velocidade e enquanto esses aumentos da velocidade são particularmente relevantes dado o elevado número de esperma equino utilizado, permanecem alguns problemas. Apesar do aumento de quase dez vezes da velocidade possivel pelo citómetro de fluxo MoFlo®, têm sido desejados tempos de separação mais curtos por várias razões. Em primeiro lugar, descobriu-se que, em termos práticos, o esperma equino é constituído por células para as quais o tempo constitui um factor crítico. Estas perdem a sua eficácia quanto maior o tempo que ficam por utilizar. Em segundo lugar, os tempos de recolha, separação e inseminação tornaram a velocidade um aspecto de elevada importância comercial. Deste modo, a natureza crítica em termos de tempo dos espermatozóides equinos e do processo tornou a velocidade um elemento essencial para atingir uma maior eficácia e taxa de sucesso em inseminação artificial.

Muito embora se tenham alcançado alguns sucessos na separação e posterior inseminação artificial de animais de outras espécies, foram obtidos poucos progressos ao nível dos esforços com equídeos. Com relevância para a presente invenção, as aplicações equinas podem constituir um desafio particular tanto porque o processo de concepção equino e/ou os próprios espermatozóides equinos são mais delicados do que os de outras espécies, especialmente bovinos. Por esta 7 razão, poderá mesmo dar-se a situação de os peritos na técnica não tenham ainda encarado técnicas ou sistemas desenvolvidas para outras espécies como aplicáveis em equídeos. Nalguns casos, procedimentos quase idênticos de espécies não-equinas não apresentem o mesmo tipo de resultados para equídeos. Este facto poderá ter fomentado uma separação nos esforços de pesquisa e nas técnicas e substâncias desenvolvidas.

Existem ainda outros problemas que vão desde o prático ao teórico. Do lado prático, tem-se desejado alcançar uma inseminação artificial de equídeos de um modo que pode ser feito em campo e não num ambiente laboratorial. Deste modo, para a produção comercial e êxito no campo, aperfeiçoamentos que podem apenas representar um aumento da eficácia ou da praticabilidade podem ainda ser significativos. Relacionado com o aspecto prático, existe o aspecto da delicadeza e sensibilidade de todo o processo. Neste contexto, tem sido desejado simplificar o processo e torná-lo tão robusto do ponto de vista do procedimento quanto possível, de forma que os erros ou nível de competência do operador desempenhem um papel cada vez menor. Este objectivo combinou-se também para tornar a inseminação com doses menores ainda mais desejável.

Para além da delicadeza do processo, tem sido conhecido desde sempre que em geral os espermatozóides são células extremamente delicadas. Embora, à primeira vista, este factor seja aparentemente de compreensão fácil, na realidade, a totalidade das sensibilidades das células não foi ainda completamente explorada. Além disso, aparentemente os espermatozóides equinos são particularmente sensíveis. Em contraste com os espermatozóides de bovino, são mais delicados em muitos 8 aspectos da perspectiva de uma inseminação artificial com êxito. Existem diferentes sensibilidades e, deste modo, tem de existir uma percepção, em certa escala, de que estes sistemas, técnicas e substâncias utilizados noutros animais (tais como bovinos) nem sempre pode ser adaptável aos equídeos. Este facto revelou ser verdade.

No contexto da citometria de fluxo, em geral, a maioria das células ou partículas separadas tem com frequência sido fisicamente capazes de resistir a uma variedade de abusos. Não foi este o caso dos espermatozóides equinos. De facto, como é revelado pela presente invenção, o processamento através de técnicas de citometria de fluxo pode, na realidade, ser inaceitável para a separação por citometria de espermatozóides equinos em determinadas aplicações. As sensibilidades vão desde problemas de diluição e necessidade inerente ao citómetro de fluxo para isolar e distinguir cada célula individualmente, bem como a pressão e outros esforços a citometria de fluxo típica impôs (antes da presente invenção) às células de equino que separava. Este dado pode também representar um único factor para espermatozóides equinos porque, aparentemente, muito embora os espermatozóides equinos possam parecer passar através do citómetro de fluxo e ser separadas sem efeitos secundários visualmente discerníveis, na realidade, as próprias células podem ter sofrido stress ao ponto de terem um desempenho abaixo de óptimo no processo de inseminação. Assim, uma interacção de factores parece estar envolvida e levantou problemas invulgares da perspectiva da separação dos espermatozóides e aplicação final para inseminação artificial de equinos.

Outro problema por resolver, apesar dos grandes progressos alcançados com a patente de Johnson e tecnologia 9 associada, reside no facto de ter sido extremamente difícil, antes da presente invenção, alcançar uma inseminação com doses menores com esperma sexado de equídeo, independentemente da tecnologia de separação utilizada. Embora, historicamente, tenha havido algum êxito com inseminação em baixas doses, parece ter sido mais num ambiente teórico ou laboratorial do que nos ambientes nos quais será provável ser vivido ou aplicado em termos comerciais. Ocorreu igualmente por meio de técnicas cirúrgicas. Assim, o desejo não tem sido apenas atingir baixa dose de inseminação mas até alcançar inseminação não-cirúrgica em campo. Alcançar uma inseminação com baixas dose, com taxas de gravidez com êxito equiparáveis aos esforços de inseminação artificial de altas doses, não sexada existente é, assim, bastante significativo. As vantagens alcançadas pelos autores da presente invenção em inseminação artificial tanto sexada como não sexada e a baixas doses representam progressos significativos que podem, pela primeira vez tornar as aplicações comerciais praticáveis com equídeos.

Outro problema enfrentado pelos envolvidos nesta indústria, novamente apesar dos grandes progressos da patente de Johnson e tecnologia relacionada, reside no facto de o próprio problema, nomeadamente a inseminação artificial de equídeos com uma elevada taxa de sucesso, ser de natureza estatística, em que parecem interagir múltiplos factores. Deste modo, as soluções propostas podem envolver, em certo grau, uma combinação de factores que, quando minuciosamente estudados de uma perspectiva estatística, se demonstrará serem necessários seja isoladamente seja em combinação com outros factores. Esta determinação inclui ainda o facto de estes resultados em si variarem de espécie 10 para espécie e pode ser difícil de averiguar devido ao facto de a análise e amostragem estatística de uma base de dados suficientemente grande muito provavelmente não compensar o esforço nas fases iniciais. Por estas razões, a invenção pode ainda envolver uma combinação de factores que podem, individualmente, representar soluções apropriadas para uma dada aplicação. Esta divulgação deve, assim, ser considerada suficientemente lata para que várias combinações e associações da técnica revelada sejam acançadas. As sinergias podem existir com outros factores. Estes factores podem ir desde factores relacionados com as fases de separação ou talvez com o citómetro de fluxo, até à fase de recolha bem como de inseminação. Assim, embora se tenha sentido desde há muito uma falta de inseminação de equídeos sexada de alta velocidade e baixa dose e embora certas técnicas e elementos para implementação estejam disponíveis desde há muito, antes da presente invenção estes progressos ou talvez combinações de progressos foram aparentemente esquecidos pelos peritos na técnica. Pode ainda dar-se o caso de apenas não ter sido realizada uma combinação adequada dos elementos conhecidos. É possível que, até certo ponto, os peritos nesta área não tenham conseguido avaliar que o problema envolvia uma interacção de factores, bem como necessidades peculiares dos espermatozóides equinos neste domínio. Curiosamente, como revela a lista de esforços mais adiante nesta discussão, têm sido feitas tentativas suficientes mas, aparentemente, foram incapazes de compreender o problema inerente neste domínio da inseminação em baixa dose, sexada de equinos e partiu-se talvez do princípio que, porque o acontecimento natural envolve talvez um milhar de milhão de espermatozóides, poderá haver limitações físicas à inseminação artificial com números menores em 11 aproximadamente três ordens de grandeza. Assim, poderá não ser surpreendente verificar que havia em certa medida um ensinamento real a retirar da orientação técnica que os autores da presente invenção perseguiram. É possível que os resultados posam até ser considerados inesperados em certa medida, porque provaram que é possível conseguir inseminação artificial de equídeos sexada, em baixa dose, quando correctamente realizada, com taxas de sucesso equiparáveis às da inseminação artificial de equídeos não sexada, em alta dose. Poderá até ser surpreendente para alguns a combinação das técnicas e dos progressos da presente invenção para atingir os grandes resultados apresentados. Embora cada técnica possa, isoladamente, ser encarada por alguns como pouco notáveis, na realidade, as discretas modificações ou combinações com outras técnicas parecem proporcionar progressoss significativos no resultado final.

Deste modo, de uma perspectiva, até à presente invenção, não era encarada como possível a inseminação artificial de equídeos prática, não cirúrgica, inseminação artificial em baixa dose sexada de equídeos com níveis de desempenho necessários ou procedimentos simplificados com probabilidade de serem necessários para alcançar a implementação comercial. Para além da inseminação em baixa dose, sexada a um nível comercial, seja como for alcançada, a presente invenção também apresenta técnicas que permitem alcançar melhores desempenhos e facilitar assim o resultado final desejado, nomeadamente a inseminação artificial em baixa dose, sexada e não sexada não-cirúrgica de equídeos numa base comercial. 12

III. DESCRIÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

Assim, a invenção apresenta a realização de sistemas para a inseminação artificial não cirúrgica em éguas. Estas técnicas são aplicáveis para a utilização de baixas doses de esperma equino e estão concebidas de forma a poderem ser aplicadas em campo a um nível comercial e prático. Além disso, os sistemas são utilizáveis, e tem uma aplicabilidade especialmente valiosa, em conjunto com a inseminação artificial com esperma equino sexado. Os sistemas proporcionam ainda uma melhor capacidade para separar espermatozóides equinos para determinar o respectivo sexo através de técnicas de separação por citometria de fluxo. São apresentadas várias técnicas e substâncias, mas um perito na técnica rapidamente se aperceberá da possibilidade de utilizar várias combinações e permutações do modo a optimizar o desempenho com base nas necessidades, técnicas de separação, objectivos e outros parâmetros envolvidos numa aplicação para processamento de equídeos específica.

Uma vez que está relacionada com a aplicação equina sexada, os objectivos da invenção eram 1) comparar taxas de gravidez em éguas inseminadas numa única ocasião, próximo da ovulação, com 500, 25 ou 5 x 106 espermatozóides progressivamente móveis (epm), 2) alcançar taxas de gravidez razoáveis na sequência da inseminação com 25 106 espermatozóides sexados, separados em vivo e 3) desenvolvimento de técnicas de separação de sémen.

Numa das experiências iniciais, sessenta e uma éguas foram atribuídas aleatoriamente a 1 de 3 tratamentos: Grupo 1 (n=20) foram inseminadas no corpo do útero com 500 x 106 espermatozóides (controlos). Grupo 2 (n=21) e grupo 3 (n=20) foram inseminadas na ponta do corno uterino 13 ipsilateral relativamente ao folículo pré-ovulatório com 25 e 5 x 106 espermatozóides. Administrou-se às éguas cloprostenol (250 pg i.m.) para induzir a luteólise e monitorizou-se por ultrassonografia dia sim, dia não até ser detectado um folículo >30 mm e depois diariamente até se detectar a ovulação Administrou-se GnRH (deslorelina 2,2 mg, Ovuplant®, Fort Dodge) quando o folículo dominante tinha > 35 mm. As éguas foram inseminadas 34 (n=29) ou 40 horas (n=32) depois de GnRH. Os dados dos ciclos de 22 éguas foram excluídos porque ou ovularam antes da inseminação planeada (n=ll), não ovularam (n=3) ou ovularam >4 dias depois da administração de GnRH (n=8). O sémen foi colhido e imediatamente diluído com um diluente à base de leite desnatado EZ-Mixin, OF, Animal Reproduction Systems, Chino, CA) até 25 x 106 ou 5 x 106 espermatozóides móveis/ml. As éguas que receberam 1 ml foram inseminadas com uma pipeta de inseminação artificial de plástico flexível (IMV, França) enquanto as éguas que receberam 0,2 ml foram inseminadas com uma pistola descartável (Veterinary Concepts, Green Valley, Wl) com uma bainha de 0,5 ml. Foram utilizadas pipetas de inseminação diferentes para optimizar a aplicação dos dois volumes diferentes. A localização das pipetas no interior do útero foi confirmada por ultrassonografia transrectal antes da aplicação do sémen. A gravidez foi determinada por ultrassonografia 16 dias depois da ovulação. As taxas de gravidez não divergiram entre garanhões (P>0,05), portanto foram combinados os resultados de dois garanhões. Verificou-se uma diferença entre as taxas de gravidez de éguas cruzadas com tratamentos de 500 x 106 (18/20 = 90%) em comparação com 25 x 106 (12/21 = 57%) (P<0,05). Não se verificou qualquer 14 diferença entre as éguas cruzadas com tratamentos de 25 x 106 em comparação com 5xl06 (7/20 = 35%) (P>0,05). Não se verificou qualquer diferença entre as taxas de gravidez de éguas cruzadas 34 horas em comparação com 40 horas depois da administração de GnRH 19/29 (65%) e 18/32 (56%) respectivamente (P>0,1). Também não se verificou qualquer diferença entre as taxas de gravidez entre as éguas cruzadas com 5 x 106 espermatozóides num volume de 1 ml, 3/10 (30%) ou um volume de 0,2 ml, 4/10 (40%) (P>0,05). Em resumo, as taxas de gravidez diminuíram com a diminuição de espermatozóides móveis inseminados neste esforço inicial. No entanto, alcançou-se uma taxa de gravidez a fim de 16 dias de 57% com uma única inseminação, próxima da ovulação, com 25 x 106 epm quando depositados na ponta do corno uterino.

Noutra experiência, dezassete éguas forma atribuídas aleatoriamente a 1 de 2 grupos de tratamento: Grupo A (n=ll), as éguas foram inseminadas com aproximadamente 25 x 106 espermatozóides separados em vivo num volume de 1 ml. Os espermatozóides foram separados num diluente seminal à base de leite desnatado comercial (EZ-Mixin, OF, Animal Reproduction Systems, Chino, CA). Uma égua não ovolou e foi excluída do estudo. Grupo B (n=10), as éguas foram inseminadas com aproximadamente 25 x 106 espermatozóides separados em vivo num volume de 1 ml. Os espermatozóides foram separados em EZ-Mixin + 4% gema de ovo (EY) . Duas éguas (uma de cada grupo) foram inseminadas com 20 x 106 espermatozóides devido às limitações de tempo dos citómetros de fluxo. Em ambos os grupos, foram realizadas as inseminações 34 horas depois da administração de GnRH e os espermatozóides foram depositados na ponta do corno uterino, ipsilateralmente em relação ao folículo pré- 15 ovulatório, utilizando uma pipeta de IA em plástico flexível. A localização das pipetas no interior do útero foi confirmada por ultrassonografia transrectal antes da aplicação do sémen. Administrou-se às éguas cloprostenol (250 pg i.m.) para induzir a luteólise e monitorizou-se por ultrassonograf ia dia sim, dia não até ser detectado um foliculo >30 mm e depois diariamente até se detectar a ovulação Administrou-se GnRH (deslorelina 2,2 mg, Ovuplant®, Fort Dodge) quando o foliculo dominante tinha > 35 mm. Nesta experiência foram utilizados dois garanhões, um destes (garanhão A) foi utilizado na experiência 1. Sémen recolhido de fresco foi diluído 1:1 em HBGM-3 e centrifugado durante 10 minutos a 400 x g a 22° C. O sobrenadante foi aspirado e o esperma foi incubado em 25 μΐ 33342 Hoechst e 400 x 106 espermatozóides em HBGM-3 durante lha 35° C e depois foi diluído até 100 x 106 espermatozóide/ml para separação. Os espermatozóides foram separados por cromossomas sexuais com base no conteúdo de ADN. Foram utilizados para a separação dois separadores de fluxo/separadores de células MoFlo®, equipados com um laser de árgon emissor de 150 mW de potência a 352 e 364 nm, a 50 psi com HBGM-3 como fluido de bainha. As aliquotas de populações X e Y separadas foram reanalisadas quanto ao ADN e produziram graus de pureza de 90 e 84% para X e Y respectivamente. Os espermatozóides foram recolhidos a aproximadamente 900 espermatozóides/seg em tubos de ensaio de 14 ml contendo 4 ml de EZ-Mixin (grupo A) ou 4 ml de EZ-Mixin + 4% de gema de ovo (grupo B) . Os espermatozóides recolhidos foram centrifugados e suspensos em 25 x 106 espermatozóides/ml e foram imediatamente inseminados. A gravidez foi determinada por ultrassonografia aos dias 12, 14, 16 e 30 após a ovulação e determinou-se o sexo dos fetos 60 a 70 dias após a ovulação sem conhecimento do sexo 16 dos espermatozóides separados que foram inseminados. As taxas de gravidez não diferiram entre garanhões (garanhão A = 3/10, 30%; garanhão B = 5/10, 50%) (P>0,1) , portanto os conjuntos de dados foram combinados. Embora não se tenha verificado diferença nas taxas de gravidez entre os tratamentos com espermatozóides (EZ-Mixin = 3/10, 30% comparativamente com 4% EY+ EZ-Mixin = 5/10, 50%) (P>0,1) pode-se vir a comprovar que este dado não é verdadeiro. Ao dia 60, 5/20 (25%) das éguas encontravam-se grávidas, determinou-se o sexo dos fetos e a proporção de sexo fenotipico foi prevista com precisão, cinco em cinco.

Esta experiência demonstrou pela primeira vez que a gravidez de uma égua pode ser alcançada e podem ser obtidos potros de sexo pré-determinado na sequência de inseminação não-cirúrgica com sémen sexado. Este aspecto é explicado na discussão seguinte.

Além disso, as divulgações originais da presente invenção encontram-se apresentadas nos pedidos de patente norte-americana com os números de série 60/094,720 e 60/113,143.

Assim, um objecto da invenção consiste em alcançar a inseminação artificial de equídeos em ambiente de campo sem necessidade de recorrer a uma intervenção cirúrgica. Além disso, um objectivo consiste em apresentar a capacidade de utilizar doses menores de um modo que funciona em circunstâncias comerciais realistas e que produz probabilidade de êxito em termos de gravidez equiparáveis às taxas de sucesso com doses tradicionais em equídeos. Um objecto consiste ainda em alcançar uma melhor separação dos espermatozóides equinos. Um objectivo paralelo consiste em proporcionar substâncias e técnicas que sejam especialmente adequadas aos espermatozóides equinos quando separados nos 17 componentes com cromossoma X e com cromossoma Y. Este objectivo consiste em atingir um resultado separado que seja consistente com as expectativas das doses elevadas, sem separação.

Um objectivo consiste também em apresentar um sistema global de inseminação artificial equina que pode alcançar os respectivos objectivos de um modo prático do ponto de vista comercial. A separação de um modo que proporcione elevada velocidade e separação equina de baixo stress e que esteja especialmente adaptado à separação dos espermatozóide equinos num contexto de baixa dose é igualmente um objectivo importante.

Naturalmente serão apresentados outros objectos da invenção ao longo de outras áreas da especificação e reivindicações.

IV. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 é um diagrama de um sistema separador de acordo com a técnica de separação com citómetro de fluxo para a presente invenção. A figura 2 é um diagrama das células arrastadas no bocal imediatamente antes da área de queda livre do citómetro de fluxo típico.

V. MELHOR FORMA DE EXECUÇÃO DA PRESENTE INVENÇÃO

Como se vai observar, os conceitos básicos da presente invenção podem ser combinados e concretizados de várias formas. A invenção envolve uma dose prática em termos comerciais, inseminação artificial equina sexada e os resultados. Para as técnicas de separação por citometria de fluxo, a invenção envolve também sistemas de citometria de fluxo bem como sistemas para a criação de amostras de esperma equino com um sexo específico que possam ser 18 aplicadas na inseminação artificial de equídeos e os equídeos produzidos por estas técnicas. Apresenta processos gerais por meio dos quais são possíveis elevadas taxas de sucesso mesmo em ambientes equinos comerciais. Além disso, as técnicas são apresentadas de um modo geral, de forma que possam ser aplicadas em sistemas específicos e aplicações assim que os princípios gerais estão compreendidos. Enquanto são apresentados aperfeiçoamentos de dispositivos, subentende-se que estes aperfeiçoamentos não só alcançam determinados métodos mas podem ainda variar e ser combinados de numerosas formas. No que respeita ao exposto, é importante reter que cada uma destas facetas deve ser encarada como estando abrangida por esta divulgação.

Quando se tem em consideração o aspecto de selecção do sexo da invenção, o objectivo básico consiste em separar os espermatozóides com X dos espermatozóides equinos com Y de uma forma a poderem ser utilizados na inseminação artificial de éguas com elevadas taxas de êxito. De preferência, esta inseminação não implicaria cirurgia. A fase de separação é efectuada preferencialmente de um modo que isola os dois tipos de espermatozóides equinos de forma que podem ser embalados e manuseados separadamente. De momento, o isolamento é efectuado preferencialmente através da utilização de citometria de fluxo. A citometria de fluxo, em geral, é uma técnica que é bem compreendida. Por exemplo, os aspectos básicos desta técnica encontram-se apresentados e discutidos numa variedade de patentes da Cytomation, Inc. tais como as patentes norte-americanas e outras publicações enumeradas anteriormente.

Em geral, subentende-se que durante a meiose nos testículos, os cromossomas sexuais segregam-se nos espermatídeos individuais e espermatozóides haplóides 19 transportam cromossomas X ou Y. Existe uma proporção de 50:50 de espermatozóides com X ou Y no sémen e a fertilização de um oócito haplóide com X por um espermatozóide X ou Y determina o sexo do embrião. Existe uma proporção de 50:50 porque os espermatozóides X e Y são produzidos em igual número e são idênticos em termos fenotipicos. O desejo de alterar esta proporção 50:50 e pré-determinar o sexo do descendente mamifero tem-se revestido de grande interesse para o público desde há muitos anos. Existem numerosas vantagens na pré-selecção dos sexos nos equídeos. A pré-selecção do sexo tem também sido utilizada para produzir fêmeas no caso de doenças hereditárias associadas ao cromossoma X. Ao contrário dos seres humanos e da maioria dos animais de criação, a vantagem da pré-selecção do sexo no cavalo pode também ser puramente uma questão de preferência do criador/dono e tem havido um interesse considerável da parte dos membros de alguns registos da raça. Há vários anos que se tenta separar os espermatozóides com cromossoma X dos com cromossoma Y com base nas propriedades físicas e químicas dos espermatozóides. Johnson (referido anteriormente) testou estes métodos e constatou que o único método com eficácia comprovada se baseia numa diferença do conteúdo do ADN do espermatozóide. Não existe qualquer outro método baseado na diferença física e química nos espermatozóides ou propriedades da superfície que tenha provado a sua eficácia na separação dos espermatozóide com X ou Y. Entre os equídeos, o conteúdo do ADN dos espermatozóides com cromossomas X e Y mamíferos difere em 4,1 %. Esta diferença no conteúdo do ADN pode ser utilizada para separar os espermatozóides com cromossoma X e Y após coloração dos espermatozóides com um 20 pigmento fluorescente, que se liga ao ADN seguido de citometria de fluxo. A tecnologia de citometria de fluxo/separação celular moderna foi desenvolvida em 1965. A citometria de fluxo foi utilizada principalmente em pequisa médica e diagnóstico relativamente a sangue e células tumorais, mas pode também ser utilizada para avaliar muitos tipos de suspensões de células, incluindo espermatozóides. Essencialmente, a citometria de fluxo tal como presentemente aplicada envolve a separação de espermatozóides equinos que são aplicados no instrumento de citometria de fluxo por meio de algum tipo de fonte de células. Na figura 1 é apresentado um instrumento conceptual. O instrumento de citometria de fluxo inclui uma entrada da amostra, neste caso uma fonte de espermatozóides equinos (1), que actua de forma a estabelecer ou fornecer espermatozóides equinos ou outro tipo de artigo para análise pelo citómetro de fluxo. As células são depositadas num bocal (2) de modo a que as células fiquem cercada por um fluido de envolvimento (3). O fluido de envolvimento (3) é normalmente fornecido por uma fonte de fluido de envolvimento (4) de forma que quando a fonte de espermatozóides equinos (1) fornece as células, o fluido de envolvimento (3) é alimentado simultaneamente através do bocal (2) . Deste modo facilmente se compreende como o fluido de envolvimento (3) forma um ambiente do fluido de envolvimento para os espermatozóides equinos. Uma vez que os vários fluidos são aplicados no citómetro de fluxo a uma certa pressão, estes fluem para fora do bocal (2) e saem pelo orifício do bocal (5) . Recorrendo a um oscilador (6), que pode ser controlado com muita precisão através de um controlo oscilador, podem ser estabelecidas ondas de pressão no interior do bocal (2) e transmitidas 21 aos fluidos que saem do bocal (2) no orifício do bocal (5). Uma vez que o oscilador (6) actua assim no fluido de envolvimento (3), o fluxo (7) que sai do orifício do bocal (5) forma por fim e com regularidade gotas (8) . Porque as células se encontram cercadas pelo ambiente do fluido de envolvimento, as gotas (8) podem conter no seu interior células isoladas individualmente ou outros artigos.

Uma vez que as gotas (8) contêm geralmente espermatozóides equinos isolados, o citómetro de fluxo pode distinguir e separar gotículas com base na existência ou não de célula ou células apropriadas no interior da gota. Este resultado é atingido por meio de um sistemas sensor de células (9). 0 sistema sensor de células envolve pelo menos um tipo de detector (10) (que pode incluir dois detectores a 90° entre si) que responde às células contidas em cada gota (8), como discutido mas extensamente no trabalho seminal (sem intenção de fazer um trocadilho) de Larry Johnson, nomeadamente a patente norte-americana n°. 5135759. Como se explica na patente de Johnson sobre os espermatozóides, o sistema sensor das células (9) pode causar uma acção conforme a presença relativa ou ausência relativa de um pigmento específico que pode ser excitado por um estimulante, tal como o excitador laser (11). Enquanto cada tipo de espermatozóide é corado pelo pigmento, o comprimento diferente do cromossoma X e do cromossoma Y provoca níveis diferentes de coloração. Assim, mediante a detecção do grau de pigmento presente nos espermatozóides é possível discriminar entre os espermatozóides com X e os espermatozóides com Y devido aos níveis de emissão diferentes.

Para atingir a separação e isolamento máximos das células apropriadas numa técnica de separação por 22 citometria de fluxo, os sinais recebidos pelo detector (10) são introduzidos num sistema separador por discriminação (12) que muito rapidamente decide e pode carregar de modo diferencial cada gota (8) com base na sua decisão da presença ou não do espermatozóide equino desejado nessa gota (8). Deste modo, o sistema separador por discriminação (12) actua para permitir que as placas de deflexão electrostáticas (13) deflictam (8) gotas com base na presença ou não da célula ou outro artigo apropriado. Em resultado, o citómetro de fluxo separa as células dirigindo-as para um ou vários colectores. (14) . Assim, ao detectar alguma propriedade das células ou outro artigo, o citómetro de fluxo pode discriminar entre os espermatozóides equinos baseados numa caracteristica particular e colocá-los no colector apropriado (14) . No sistema actualmente utilizado para separar esperma equino, as goticulas de espermatozóides com X são carregadas positivamente e deflectem, assim, numa direcção, as goticulas de espermatozóides com Y recebem carga negativa e deflectem, assim, na outra direcção, e o fluxo desprezado (de células não separáveis) não recebe carga e é recolhido num fluxo que não é deflectido para ou tubo de sucção ou semelhantes.

Relativamente à figura 2, o processo pode ser compreendido mais detalhadamente. Como se mostra na figura, o bocal (2) emite um fluxo (7) que forma gotas (8) (não representadas na figura 2) devido a um oscilador (6) (não representado na figura 2). Uma vez que a fonte de espermatozóides equinos (1) (não representada na figura 2) pode fornecer espermatozóides euquinos (15) que foram coloridos de acordo com a técnica de Johnson, a ligeira estimulação pelo excitador laser (11) e o estado 23 determinado diferencialmente conforme detectado pelo detector (10) pode ser utilizado para criar a existência ou não-existência de uma carga em cada gota (8) à medida que se separa do fluxo (7) . Este processo é integralmente controlado pelo citómetro de fluxo. Este controlo resulta em gotas (8) com carga positiva, com carga negativa e sem carga, com base no respectivo conteúdo. Como se mostra na figura 1, algumas gotas são apresentadas como gotas deflectidas (16). Estas gotas deflectidas (16) são as que contêm espermatozóides (15) de um ou de outro sexo. São depois depositados no colector apropriado (14) para uso posterior.

Como se mostra na figura 2, os espermatozóides equinos (15) podem ser injectados no fluido de envolvimento (3) com uma agulha ou tubo de injecção (18). Os peritos na técnica da técnica da citometria de fluxo compreendem que este tubo de injecção (18) pode ser moldado de forma a atingir uma focalização hidrodinâmica e orientação de forma que tanto o lado do flagelo e/ou lado da cabeça dos espermatozóides equinos (15) fiquem adequadamente orientados. Pode ainda produzir um fluxo do núcleo de amostra em forma de fita como se mostra. Este facto pode ser importante uma vez que uma intensidade de fluorescência a noventa graus pode ser encarada como sendo proporcional à orientação da cabeça do espermatozóide e uma intensidade de fluorescência de zero graus pode ser encarada como proporcional ao conteúdo do ADN do espermatozóide.

Uma análise de ADN em citometria de fluxo de alta resolução do esperma equino é difícil em comparação com outras células devido à cromatina extremamente compacta na cabeça morfologicamente achatada, em forma de pá do espermatozóide que provoca um elevado índice de refracção. 24 A diferença do índice refractivo entre a cabeça do espermatozóide e o meio envolvente, em combinação com a forma achatada da cabeça do espermatozóide tem como resultado uma emissão maior da fluorescência através do plano da célula (da borda da cabeça do espermatozóide) do que num ângulo de 90° relativamente ao plano. Uma adequada orientação da cabeça é crítica para uma separação de elevada resolução. Outros têm investigado métodos de controlo da orientação das cabeças dos espermatozóides qeu fluem numa corrente e constataram que um tubo de injecção em bisel (18) foi eficaz na submissão de células a forças hidrofóbicas planares à medida que as células saiam da ponta da agulha. A corrente da amostra pode ser impulsionada num fluxo em forma de fita que pode orientar a cabeça achatada do espermatozóide da mesma forma. Outros princípios físicos mais complexos são frequentemente aplicados para orientar igualmente o espermatozóide.

Como anteriormente mencionado, os espermatozóides que são submetidos ao processo de separação são coloridos com o fluorocromo da 33342 Hoechst, conhecido quimicamente como bisbenzimida. O pigmento é adicionado à amostra a aproximadamente 9 μΜ num volume de 1 ml contendo 400 x 106 espermatozóides e pode ser incubado entre 32 e 35° C. O 33342 Hoechst não é tóxico para os espermatozóides e não altera significativamente a mobilidade dos espermatozóides. O 33342 Hoechst liga-se às regiões A-T da hélice do ADN. Uma vez que o processo de separação é mais produtivo se não forem recolhidos espermatozóides mortos, pode ser adicionada à amostra colorida uma molécula que atenua a fluorescência do 33342 Hoechst e marca os espermatozóides mortos. Corante alimentar é um exemplo de uma molécula não-tóxica que pode ser utilizada. O processo consiste então na 25 introdução dos espermatozóides marcados com fluorescência sob pressão (por exemplo 50 psi) em suspensão liquida no citómetro de fluxo. Os espermatozóides entram no tubo de inserção da amostra e são orientados num sentido ou noutro, eventualmente à medida que saem da ponta em bisel do tubo para o fluido de envolvimento. A corrente que contém os espermatozóides intersecta um feixe de laser em iões de árgon, a comprimentos de onda ultravioleta (351 e 364 nm) e até 200 mW de potência. Aproximadamente 7% das gotas contêm um espermatozóide quando a amostra se situa a 100 x 106 espermatozóides/ml. Os núcleos com marcação fluorescente são excitados pelo fixe laser, produzindo sinais fluorescentes proporcionais à quantidade de ADN ligado ao pigmento.

Um sistema de separação de fluxo comercial modificado foi utilizado para analisar e separar espermatozóides com

base nas diferenças de ADN. Como mencionado, 0 sinal fluorescente da borda do espermatozóide (ângulo de O O a partir da emissão de laser) é mais brilhante do que a emitida do lado achatado (0o no sentido do detector) . A emissão da borda é utilizada para caracterizar a orientação das cabeças dos espermatozóides à medida que passam o feixe de laser. A luz emissora é colhida pelo detector 90° e os espermatozóides adequadamente orientados são identificados. Os espermatozóides que não estão adequadamente orientados reflectem menos luz e são electronicamente desviados das análises, frequentemente, devido à falta de orientação adequada, a maioria dos espermatozóides não são separados em populações enriquecidas X ou Y. Igualmente, muitos espermatozóides que têm a orientação adequada, não são separados devido à distribuição da sobreposição da fluorescência. Um detector óptico e tubo fotomultimetro 26 (PMT) podem ser utilizados para a detecção 0 o da fluorescência, o que é proporcional ao conteúdo de ADN do espermatozóide correctamente orientado. O PMT recolhe a fluorescência emitida pelo espermatozóide e converte o sinal óptico num sinal electrónico proporcional, que é amplificado pelo PMT para prosseguir o processamento de sinal e apresentação gráfica. Um gating electrónico permite a selecção de sinais a partir do detector frontal 0o apenas para espermatozóide correctamente orientados, esta operação tem como resultado a capacidade de diferenciar entre o ADN de um espermatozóide X e de um espermatozóide Y. Definindo as janelas de separação electrónicas em torno das populações distinguidas, os espermatozóides com X ou com Y são separados para dois tubos. Dois detectores ópticos colhem a luz emitida e são activados os circuitos que adicionam um impulso de carga (+ ou -) à gotas contendo os espermatozóides com X ou com Y. À medida que as goticulas de espermatozóides individuais caem, passam por um campo electrostático que puxa as goticulas carregadas contendo o espermatozóide para tubos separados contendo o diluente "fluido de recolha" como meio de suporte temporário até que os espermatozóides prossigam o processamento.

As amostras de espermatozóides que foram separados em amostras enriquecidas com cromossoma X ou Y podem ser reavaliadas no que toca à pureza utilizando análise por citometria de fluxo do conteúdo do ADN do espermatozóide individual. No passado, o único método válido de verificação da separação disponível consistia na determinação da proporção de sexos da descendência, o que é extemporâneo e caro. A repetição das análises por citometria de fluxo não só reduz o tempo e o custo como aumenta a precisão. 27

Com os avanços prevê-se que a percentagem de espermatozóides com orientação correcta à medida que as goticulas passam pelo laser pode aumentar, resultando em maiores taxas de separação, passando de 100 espermatozóide (s) vivo(s) de cada sexo para taxas entre 1000 e 1500 espermatozóide(s) vivo(s) de cada sexo a -90%. Esta aumento da taxa de separação dos espermatozóides seria útil para tornar mais prática a utilização de sémen sexado num programa de inseminação artificial equino.

Outros têm descrito a utilização da quantidade de adn no esperma como um marcador da pré-selecção do sexo e subsequente nascimento em coelhos com o sexo previsto, na sequência de inseminação cirúrgica. Os espermatozóides foram separados por populações com os cromossomas x e Y com um citómetro de fluxo/separador celular. Os espermatozóides separados foram inseminados cirurgicamente no útero. Dos inseminados com fracções enriquecidas por espermatozóides com o cromossoma Y, 81 % dos descendentes nascidos eram machos; as fracções enriquecidas com espermatozóide possuidores do cromossoma X resultaram em 94 % de fêmeas. Deste modo, a proporção de sexo foi significativamente alterada em relação aos 50:50. Esta proporção fenotipica (e genotipica) foi prevista com precisão com base na repetição da análise do ADN das populações separadas, o que revelou graus de pureza de 81 % para os espermatozóides com Y e 86% para aqueles com X. Estes dados foram seguidos pela publicação de experiências em suinos e gado. A fertilização in vitro tem sido utilizada para obter gravidezes em gado utilizando sémen sexado. Por exemplo, um investigador transferiu embriões gémeos para cada uma de 9 novilhas. Quatro novilhas engravidaram e nasceram 6 vitelos, todos do sexo previsto. Estes resultados revelam que é possível 28 separar esperma viável em populações com o cromossoma X e Y e reter a sua capacidade de fertilização e produzir uma progenia normal. Foram igualmente alcançadas gravidezes em suínos e coelhos na sequência da fertilização in vitro (FIV) com espermatozóides com X ou Y. Recentemente, foram produzidos embriões bovinos por FIV com esperma separado por citometria de fluxo de alta velocidade, porém não foram realizadas transferências de embriões.

Utilizando espermatozóide equino separado por sexos em laboratório, um investigador efectuou duas experiências para determinar a taxa de gravidezes com injecção intracitoplasmática de espermatozóides (intracytoplasmic sperm injection - ICSI) em oócitos equinos ou inseminação directamente no oviducto. Treze oócitos injectados desenvolveram-se até à fase de 2 a 3 células, 8 até à fase de 4 a 6 células e 2 oócitos desenvolveram-se até à fase de 7 a 8 células . Um embrião foi transferido : na fase de 7 a 8 células mas não resultou qualquer gravidez. Na experiência de inseminação oviductal, duas éguas foram inseminadas por canulação da extremidade fimbriada do oviducto com 50 μΐ contendo 1,5 x 105 espermatozóides com X. Foi detectada uma gravidez e a égua produziu um potro fêmea.

Um dos aspectos da citometria de fluxo que é particularmente importante para a respectiva aplicação na separação do esperma equino reside na elevada velocidade de funcionamento de um citómetro de fluxo. Têm sido realizados progressos com os citómetros de fluxo da Cytomation, Inc. com a marca comercial MoFlo®. Estes citómetros de fluxo aumentaram extraordinariamente as velocidades de separação e tornaram a citometria de fluxo uma técnica que muito provavelmente tornará praticável a aplicação comercial da 29 separação de esperma equino (entre outras aplicações comerciais). Procuram alcançar uma separação de alta velocidade, que dizer a uma velocidade que é destacadamente maior do que outras. Especificamente, os citómetros de fluxo MoFlo® da Cytomation actua a frequências do oscilador superiores a cerca de cinco quilohertz e mais especificamente podem ser accionados entre 10 a 30 ou mesmo 50 quilohertz. São formadas duas goticulas a frequências muito altas e as células contidas no ambiente do fluido de envolvimento podem ser emitidas muito rapidamente a partir do bocal (2) . Em resultado, cada um dos componentes tais como o bocal (2), o oscilador (6) e outros constituintes integrantes de um sistema citómetro de fluxo podem ser configurados ou seleccionados para resultar num separador de células de alta velocidade. No caso da aplicação de um separador de células de alta velocidade para a separação de espermatozóides, foi atingida a separação a velocidades superiores a 900 separações por segundo. É importante constatas que o termo "alta velocidade" é um termo relativo, de forma que à medida que se alcançam outros progressos em citometria de fluxo e aplicações especificas, o aspecto que é considerado "alto" pode variar ou pode permanecer em absoluto. Em qualquer definição, o principio geral consiste na ideia que a separação pode ocorrer a velocidades às quais os parâmetros e caracteristicas físicas do citómetro de fluxo são significativas para as próprias células durante a separação de células específicas, tais como espermatozóide equinos.

Um aspecto da separação de alta velocidade que surge em jogo durante a separação de espermatozóides equinos por meio da técnica de separação com citómetro de fluxo consiste nas pressões e outras tensões a que os 30 espermatozóides equinos são sujeitos no citómetro de fluxo. Por exemplo, durante o funcionamento a altas velocidades (e definição alternativa de "alta velocidade") os citómetro de fluxo podem funcionar a uma pressão de 50 libras por polegada quadrada ou mesmo superior. Estas pressões podem ser consideradas elevadas porque podem afectar os espermatozóides equinos que estão a ser separados. A chave, tal como divulgado na presente invenção, para esta faceta reside no facto de os limiares de tensão das células especificas constituem um factor determinante. Além disso, à medida que se adquire mais conhecimentos, poderá ser demonstrado que os limiares de tensão são uma função de efeitos combinados, tais como a espécie especifica ou o manuseamento particular, antes ou depois, dos espermatozóide equinos. Neste contexto, a chave reside no facto de a tensão imposta aos espermatozóides equinos pode, de facto, alterar a viabilidade e a capacidade destes para atingir o resultado desejado. Este facto poderá ser invulgarmente verdade para a espécie equina. No caso da pressão, poderá acontecer que basta a sujeição dos espermatozóides a uma pressão mais elevada, em resultado do funcionamento do citómetro de fluxo a essa pressão, para diminuir o desempenho dos espermatozóides equinos. Por um lado, a presente invenção procura minimizar as tensões e ter assim como resultado maiores eficácias, bem como menores doses tal como discutido posteriormente.

Ao considerar o aspecto da tensão das Os equinas, a presente invenção procura minimizar as tensões. Estas tensões podem ser minimizadas em qualquer ponto do ciclo geral ou processo de recolha, separação ou mesmo inseminação do animal. É importante notar, a tensão imposta pelo manuseamento das células no citómetro de fluxo parece 31 ser significativo para as espécies equinas. Numa forma de realização da invenção, o fluido de envolvimento é especificamente seleccionado de forma a poder servir de forma coordenada com ambos (ou qualquer um) os ambientes de fluido celular pré-separação ou o ambiente de fluido celular pós-separação. Deste modo, a presente invenção actua de forma a minimizar as modificações através do tipo de operação ou selecção das substâncias que podem actuar como um meio de minimização das modificações sentidas pelos espermatozóide equinos- Para o fluido de envolvimento, é seleccionada uma substância de acordo com uma realização da invenção, de forma que pode ser quimicamente coordenada para apresentar modificações minimas. Deste modo, ao seleccionar o fluido de envolvimento apropriado, não só no contexto dos parâmetros da citometria de fluxo mas mesmo no contexto dos espermatozóides equinos e os próprios parâmetros de inseminação artificial de equídeos, as modificações sentidas pelas célula e o resultado global da separação podem ser melhorados. Curiosamente, no caso dos espermatozóides equinos, descobriu-se que funciona bem um meio tamponado com hepes, tal como meio de gametas hepes bovino, particularmente HBGM-3, como anteriormente criado por J. J. Parrish para uma aplicação em bovinos. Este meio é discutido no artigo "Capacitation of Bovine Sperm by Heparin", 38 Biology of Reproduction 1171 (1988). Não só é surpreendente porque não se trata do mesmo tipo de utilização que com o esperma de bovino, mas o próprio tampão foi originalmente desenvolvido para aplicação em bovinos. Deste modo, na aplicação em equídeos, é seleccionado o fluido de envolvimento que contém o tampão hepes. 32

Um aspecto separado do processamento com citometria de fluxo que pode também ser importante reside no tratamento adequado das células, tanto do ponto de vista químico como físico, depois da separação. Como se vê na figura 2, as células dentro das gotas (8) caem no colector (14). 0 fluido colector (17) pode também servir para minimizar as tensões a que as células são submetidas. Por um lado, dado que pode ser importante providenciar um nutriente às células tanto antes como depois da separação, o fluido colector (17) pode ser seleccionado de forma a proporcionar igualmente uma recepção mais fácil. Para espermatozóides equinos, as células podem ser recolhidas num diluente de leite desnatado comercial, tal como o da EZ-Mixin, Animal Reproduction Systems, Chino, CA. Muito embora tenha sido concebido para um fim diferente, este diluente pode ser utilizado como fluido de recolha para espermatozóides de equino. Além disso, este fluido de recolha pode incluir igualmente 4% de gema de ovo.

Outro aspecto que pode interagir com os vários factores da presente invenção consiste na utilização de baixas doses de esperma para inseminação artificial ou semelhante. É possível encontrar uma contextualização adicional relativamente ao aspecto da inseminação artificial sexada em "Prospects for Sorting Mammalian Sperm" de Rupert P. Amman e George E. Seidel, Jr., Colorado Associated University Press (1982) e na publicação PCT anteriormente mencionada. Como anteriormente mencionado, a inseminação artificial em equinos envolve números de espermatozóides da ordem dos milhares de milhão de espermatozóides. A inseminação artificial de rotina é actualmente realizada com duzentos e cinquenta milhões de espermatozóides ou mais no caso da espécie equina. 0 termo "baixa dose" designa que 33 a dose de esperma utilizada na inseminação é inferior a um quarto ou preferencialmente ainda menor que cerca de 10% a 5% do número tipico de espermatozóides fornecidos para uma inseminação artificial equina típica. Assim, o termo "baixa dose" deve ser encarado no contexto da dose de inseminação artificial típica ou ainda como número absoluto. Evidentemente, os números absolutos podem depender da espécie. Para equídeos, apenas cerca de vinte e cinco, dez, cinco ou mesmo um milhão pode ser considerado um processo com baixa dose.

Ainda outro aspecto que pode ser importante reside no facto de o esperma sexado por meio das técnicas da presente invenção (ou de outra forma) é utilizado num sistema de inseminação artificial de equídeos. Assim, quanto à técnica de citometria de fluxo, quando o colector (14) é utilizado para proporcionar esperma para a inseminação artificial, as técnicas da presente invenção podem ser particularmente relevantes. Além disso, é possível que a combinação da utilização em inseminação artificial de equídeos e a utilização num ambiente de baixa dose podem criar conjuntamente sinergias que tornam as várias técnicas da presente invenção particularmente apropriadas. Naturalmente, o esperma sexado pode ser utilizado não apenas num modo de inseminação artificial mas noutras técnicas tais como fertilização in vitro e semelhantes. O processo de recolha, separação e eventualmente de inseminação de um animal por meio da utilização de uma separação por citometria de fluxo ou outra técnica de separação envolve uma variedade de fases. No contexto da inseminação de equídeos, primeiro o sémen é recolhido do garanhão. O sémen pode ser recolhido de garanhões de reconhecida fertilidade imediatamente antes da inseminação 34 planeada. Esta operação pode ocorrer com uma vagina artificial modelo Colorado (Animal Reproduction Systems, Chino, CA), equipada com um filtro de gel em linha. Os ejaculados podem ser avaliados no que toca ao volume isento de gel, mobilidade e concentração de espermatozóides. 0 sémen pode ser diluído com um diluente comercial à base de leite desnatado (EZ-Mixin, OF, Animal Reproduction Systems, Chino, CA) até 25 x 106 epm/ml (n=51) ou 5 x 106 pms/ml (n=10). 0 sémen pode ser mantido à temperatura ambiente até serem efectuadas as inseminações, pouco depois da recolha. A coloração pode ser conseguida conforme um protocolo coloração múltipla ou coloração simples, esta última objecto da patente Johnson e tecnologia relacionada.

Depois de adicionar a coloração, pode ser concretizada a diluição até à concentração desejada. A separação segundo as várias técnicas discutidas anteriormente pode então ser concretizada, sendo os espermatozóides recuperados na fase de recolha.

Um número óptimo de espermatozóides móveis por dose de inseminação ficou. Talvez, bem definido em espécies tais como suínos, ovinos e bovinos. Com a presente invenção, o número mínimo de espermatozóides móveis parece ser muito inferior aos 250 a 500 x 106 espermatozóides progressivamente móveis (epm) normalmente recomendados. Nas condições ideiais, as éguas foram até inseminadas com apenas 100 x 106 epm sem reduzir a fertilidade. (Os investigadores não constaram qualquer diferença entre as éguas inseminadas ao longo de três ciclos com 100 or 500 x 106 epm e atingiram taxas de gravidez de 63,9 e 75% respectivamente). A presente invenção revela que é possível mesmo números menores e que esses números menores podem ser alcançados em campo. 35

Embora a diferença não seja significativa, numa experiência as taxas de gravidez dos tratamentos com 100 e 500 x 106 dos ciclos 1, 2 e 3 foram 25 contra 39, 33 contra 45 e 28 contra 25% respectivamente. Notavelmente, foram têm descrito um aumento da taxa de parição quando o número de espermatozóide móveis por inseminação foi aumentado de 40 para 80 x 106 mas não se observaram melhoramentos adicionais quando o número de espermatozóides aumentou para 160 x 106. Numa experiência com dois grupos de 14 éguas subférteis, um investigador constatou não haver diferença entre os tratamentos utilizando 100 ou 500 x 106 espermatozóides móveis por inseminação (35,7 contra 42,9%, respectivamente). Posteriormente, o mesmo pesquisador descreveu taxas de gravidez após reprodução ao longo de três ciclos com éguas inseminadas com 50, 100 e 500 x 106 epm de 41,7, 65,6 e 81,3% respectivamente, de médias calculadas a partir de várias experiências. Ainda outras éguas inseminadas na técnica (ao longo de três ciclos) com 50 e 500 x 10ê epm e constataram uma diferença significativa atingiram taxas de gravidez de 37,5 e 75% respectivamente. Num estudo mais recente, um dos autores da presente invenção promoveu a super-ovulação em águas com extracto de pituitária de equídeo (EPE) e inseminou éguas uma vez com 50 x 106 spm. As taxas de gravidez não divergiram entre as éguas tratadas com EPE e os controlos com soro fisiológico (65 e 55% respectivamente).

Na actual rotina de inseminação artificial de equídeos, embora exista aparentemente pouca diferença em termos de fertilidade entre uma dose de 100 e 500 x 106 espermatozóides por inseminação, é geralmente recomendado 500 x 106 epm para proporcionar uma fertilidade máxima. No entanto, quando se aplicam técnicas de inseminação 36 artificial adequadas, acredita-se também que 100 x 106 epm de um garanhão muito fértil seja o minimo adequado com as técnicas anteriores. Nas circunstâncias mais aceites, quando se executa uma inseminação artificial (IA) de rotina com garanhões e éguas férteis, 500 x 106 espermatozóides progressivamente móveis/dose, inseminados dia sim, dia não durante o estro das éguas tem sido apontado como resultando em fertilidade máxima. Tal como anteriormente aludido, o problema deste caso é simples, a inseminação de éguas com um baixo número de espermatozóides pode ser necessário quando o sémen é limitado ou quando se utiliza sémen sexado.

Como anteriormente mencionado, actualmente é possível obter aproximadamente 1000 espermatozóides equinos vivos/segundo (3,6 x 106/h) de cada composição cromossómica sexual durante a separação dos espermatozóide por cromossomas sexuais por citometria de fluxo com 90% de precisão. Deste modo não seria prático obter 500 x 106 espermatozóide separados por cromossomas sexuais para uma inseminação a 3,6 x 106 espermatozóides por hora. O objectivo, por conseguinte, será atingir números menores de espermatozóide por dose de inseminação mantendo uma fertilidade razoável. O objecto consiste em atingir taxas de gravidez em éguas inseminadas numa única ocasião, próximo da ovulação, com apenas 25 ou 5 x 10ê ou menos espermatozóides progressivamente móveis (epm). O ejaculado de um garanhão normal contém um volume médio de 50 ml. O garanhão deposita este elevado volume de sémen directamente no útero da fêmea. Noutras espécies (javali) que ejaculam várias centenas de ml de sémen, apenas 0,5 a 0,1 ml penetram em cada trompa de falópio no início do estro para permitir a fertilização. Este grande 37 volume seminal preenche a região da união entre o útero e as trompas até o reservatório de espermatozóides estar estabelecido no istmo. Por conseguinte, é estabelecido um volume específico de sémen no istmo e os conteúdo restante é rapidamente eliminado.

Para inseminação artificial, o número de espermatozóides numa dose de inseminação pode ser crítico. Os diluentes seminais são frequentemente utilizados para diluir sémen em bruto a fim de proporcionar um volume de inseminação mais fácil de manusear. Na técnica anterior, é geralmente recomendado um volume entre 10 e 25 ml de sémen embora, actualmente, talvez dependendo da concentração de espermatozóides, pequenos volumes de inseminação revelaram-se tão eficazes quanto volumes maiores. Embora a concentração não tenha sido especificada, volumes de inseminação entre 0,6 e 26,8 ml de sémen não afectaram negativamente a fertilidade quando foram estudados os efeitos de inseminação de volumes de 10 ou 50 ml de sémen diluído em taxas de recuperação de embriões em éguas. Mas com base nesta experiência, verificou-se uma redução das taxas de recuperação de embriões de éguas inseminadas com um volume de 50 ml de sémen diluído em comparação com um volume de 10 ml quando continham ambos um número igual de epm. A fertilidade reduzida pode ter ficado a dever-se ao maior volume inseminado ou pode ter ficado a dever-se à menor concentração de espermatozóides uma vez que era 1/5 da do volume de 10 ml (5 contra 25 x 106) .

Foram conduzidas mais experiências para determinar: 1) taxa de recuperação do embrião quando as éguas foram inseminadas com 100 x 106 epm diluídos em 10, 100 ou 200 ml de diluente de leite desnatado seco e 2) taxa de recuperação do embrião quando as éguas foram inseminadas 38 com 250 x 106 epm diluído em 10 ou 100 ml do mesmo diluente da experiência 1. Os resultados da experiência 1 revelaram uma diferença dos embriões recuperados apenas entre éguas inseminadas com 10 (40%) e 200 ml (0%). Numa dessas experiências houve uma diferença significativa entre as éguas inseminadas com 10 ml (70,6%) em comparação com 100 ml (13%). Deste modo, com volumes de inseminação de 100 ou 200 ml foram associados a taxas de recuperação do embrião inferiores às com volume de 10 ml, provavelmente devido a uma concentração menor de espermatozóides ou perda retrógrada de espermatozóides na vagina.

Conduziram um estudo para testar se apenas o volume afecta a fertilidade quando se encontram presentes concentrações e números de espermatozóides suficientes. Concluíram que não havia diferença entre as éguas inseminadas com 30 ou 120 ml de sémen refrigerado a uma concentração de 50 x 106 epm/ml. Contudo, esta abordagem não é seguida pela presente invenção até certo ponto. A temporização e frequência da inseminação podem desempenhar um papel muito importante na maioria das operações de reprodução, especialmente quando está envolvido sémen congelado ou refrigerado. O número e programação das inseminações pode afectar a fertilidade. Uma égua média ovula a cada 21 dias durante a época de reprodução fisiológica e a duração média do estro durante esse período é de 5 a 7 dias. Durante o estro, as éguas urinam passivamente, erguem a cauda e apresentam os quartos traseiros ao garanhão. Em condições naturais, quando um garanhão é introduzido numa manada de 20 éguas, o número de acasalamentos por hora de observação foi de 2,4 ± 0,2. Os garanhões acasalam frequentemente a mesma égua várias vezes por dia (em condições naturais). Num estudo, 20 éguas foram 39 sincronizadas e colocadas num pasto com um garanhão e foram observadas durante 9 dias. 0 garanhão cobriu 9,12 vezes por dia e emprenhou 17 ou 18 éguas.

Os investigadores compilaram também dados ao longo de várias épocas de acasalamento e compararam com o efeito do número de inseminações nas taxas de gravidez. Mais éguas engravidam quando inseminadas mais cinco vezes (68%) do que as éguas que são inseminadas três vezes (35,9%) durante o ciclo 1. Não foram detectadas outras diferenças no que respeita ao número de inseminações nas taxas de gravidez durante o ciclo 1. Não se verificou qualquer diferença nas taxas de gravidez durante os ciclos 2 e 3, quando as éguas foram inseminadas uma a sete vezes. Nenhuma égua engravidou quando inseminada mais 5 vezes (60%) do que as éguas inseminadas 1 vez (23,5%), 2 (35%) ou 3 vezes (35,5%) durante 3 ciclos. Quando se avaliam todos os 3 ciclo, as éguas que engravidaram foram inseminadas numa média de 3,3 vezes, o que é mais do que a média de 2,8 vezes do que as éguas que não engravidaram.

Determinou-se também que múltiplas inseminações por ciclo não afectaram negativamente a fertilidade. Num estudo, forma recolhidos os dados de 257 éguas ao longo de um período de 10 anos para estabelecer a relação entre o número de inseminações por ciclo, duração do estro e taxas de gravidez. As éguas foram inseminadas com 100 x 106 espermatozóides. Foram atingidas taxas de gravidez no primeiro ciclo de 22,0, 23,0, 38,6, 52,5, 58,3 e 52,2% quando as éguas foram inseminadas 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 vezes mais por ciclo respectivamente. Menos éguas engravidaram ao fim de três ciclos quando inseminadas 1 a 4 vezes por ciclo do que as éguas inseminadas > 12 vezes por ciclo. Outro estudo inseminou 62 éguas ao longo de três ciclos a cada 48 40 horas, durante o estro, com 200 x 106 epm num máximo de três inseminações. As inseminações começaram quando se detectou um foliculo > 30mm e prosseguiram até à ovulação. A fertilidade por ciclo foi de 45% e não foi diferente no caso de duas ou mais inseminações por ciclo em comparação com uma inseminação por ciclo. Determinaram também que as taxas de gravidez mais elevadas foram alcançadas com inseminações efectuadas entre 48 e 72 (8/23) ou 72 e 96 horas (8/23) antes da ovulação e que a última inseminação não foi a que fertilizou em pelo menos 51 % das vezes. Globalmente quando se executa uma IA de rotina com garanhões e éguas férteis, 500 x 106 epm/dose, inseminados dia sim, dia não durante o estro das éguas resulta em fertilidade máxima. Com a presente invenção, é agora possível números muito inferiores. A indução da ovulação num momento específico na égua pode ser vantajoso pelas seguintes razões: Para garantir que a ovulação ocorra no espaço de 36-48 horas do acasalamento, eliminando a necessidade de repetição, (b) com a utilização de sémen refrigerado, congelado ou sexado quando o tempo é um factor crítico a fim de maximizar a fertilidade, (c) para assegurar que basta uma única inseminação próxima da ovulação quando se utiliza garanhões ou éguas subférteis, (d) para minimizar o transporte de éguas ou garanhões e (e) para desfasar as ovulações quando existem simultaneamente várias éguas no estro.

A gonadotropina coriónica humana (human chorionic gonadotropin - hCG) é produzida pelos citotrofoblastos das vilosidades coriónicas da placenta humana. É uma hormona produtora de glicoproteínas, constituída por duas subunidades (a e β) que estão unidas entre si de modo não-covalente. Tem uma semi-vida de 8-12 horas no sangue. A 41 utilização de hCG para a indução da ovulação durante o ciclo do estro da égua foi descrito em primeiro lugar em 1937 por Mirskaja e Petropavlovski. Estes investigadores constataram a ocorrência de ovulação no espaço de 24 a 48 horas após a injecção de extracto bruto de urina de grávida humana (Prolan®), injectada no primeiro dia do estro. Constatou-se em estudos posteriores que a injecção de hCG (1500-3300 IU) numa égua durante o estro inicial simula a actividade da hormona luteinizante (LH) e induz a ovulação, geralmente nas 24-48 horas seguintes. A utilização de hCG a uma dose de 2000-3000 IU não diminuiu a fertilidade. No entanto, alguns investigadores constataram que doses mais elevadas (4500-6000 IU) resultaram em transtornos da reprodução e uma diminuição da taxa de gravidez. Embora a utilização de hCG possa ser muito eficaz na indução da ovulação, vários pesquisadores demonstraram que a administração de hCG ao longo de vários ciclos de estro consecutivos podem resultar na formação de anticorpos, sendo a duração do estro e da ovulação igual ou dois dias maior que as éguas de controlo. A hormona libertadora da gonadotropina nativa (GnHR) é um decapeptideo sintetizado no hipotálamo e guardado em grânulos secretores da eminência média. Com a libertação, a GnRH penetra no sistema porta e é transportado para a pituitária anterior e liga aos receptores das células gonadotrópicas onde estimula a síntese e secreção da hormona luteinizante (LH) e hormona estimulante do folículo (FSH). A pesquisa foi também conduzida com base na utilização de GnRH nativo e análogos de GnRH, em que 1 ou 2 aminoácidos foram modificados para induzir a ovulação durante o estro nas éguas. 42 A administração por impulsos ou continua de GnRH nativo provoca uma ovulação previsível. Num estudo, perfundiu-se em 11 éguas no ciclo soro fisiológico ou 20 pg de GnRH por impulsos (um impulso de 5 seg./h, 2h ou 4h) com inicio no dia 16 do ciclo do estro. O número de dias a contar do inicio do tratamento até à ovulação foi inferior em éguas perfundidas com 20 pg de GnRH/h em comparação com as éguas com controlo com as éguas de controlo a soro fisiológico ou 20 pg GnRH durante 4 h. Concluiu-se que a perfusão por impulsos de GnRH é eficaz na antecipação da ovulação, mas a frequência dos impulsos constitui uma variável critica. GnRH nativo foi também utilizado para induzir o desenvolvimento folicular e a ovulação em éguas anestras periodicamente. Um implante de curto prazo, que liberta 1,5 ou 2,2 mg do análogo da GnRH deslorelina provoca a ovulação no espaço de 36-48 horas quando administrado em éguas no estro com um foliculo >30 mm de diâmetro.

Um dos autores da invenção comparou o efeito de várias doses de um implante de um análogo da GnRH (acetato de deslorelina) na indução da ovulação em águas no ciclo e constatou que a ovulação foi induzida na maioria das éguas no espaço de 48 horas depois da injecção e que não há vantagem em doses superiores a 2,2 mg/égua. Outros compararam a utilização de hCG, buserelina (um análogo da GnRH) e luprostiol (um análogo de PGF2a) para a indução da ovulação em éguas no ciclo. Tanto a buslerelina como a hCG encurtaram o intervalo entre o tratamento e a ovulação, enquanto o luprostiol foi incapaz de acelerar a ovulação.

Extracto da pituitária quina (EPE) é derivado das glândulas da pituitária anterior equina. A preparação de EPE para experimentação enquanto uma gonadotropina em bruto foi descrita por Braselton e McShan (1970) e mais 43 recentemente por Guillou e Combarnous (1983), ambos incorporados por referência. EPE tem sido utilizado na égua antes de induzir o desenvolvimento de múltiplo foliculos em éguas no ciclo ou anestras e para superovulação de ovelhas. A utilização do extracto de pituitária equino como agente ovulatório na égua é conhecida. Em estudos, preparou-se a hormona luteinizante equina (eLH) e a hormona estimulante do folículo (eFSH) mediante interacção cromatrográfica hidrofóbica (HIC) e realizaram-se experiências. Numa experiência, comparou-se a actividade LH em gonadotropina equina (CEG) bruta e a actividade LH na fracção HIC com a sua capacidade para induzir a ovulação. Das 25 éguas de controlo, 7 ovularam no espaço de 4 8 h em comparação com 24/25 éguas testadas com CEG e 19/26 éguas tratadas com LH. Outra experiência foi concebida para testar a capacidade da fracção enriquecida com eFSH de extracto da pituitária para induzir o desenvolvimento de múltiplos foliculos em comparação com CEG. 0 número de foliculos que atingiu os 30 mm foi igual nos grupos tratados com CEG vs. FSH e ambos os grupos foram diferentes quando comparados com o grupo de controlo. As taxas de ovulação não foram diferentes entre os dois grupos de tratamento, mas foram diferentes do grupo de controlo.

Historicamente, o método mais comum utilizado para induzir a ovulação consiste numa única injecção de hCG. Este permanece o método mais comum. No entanto, não existe diferença nas taxas de gravidez ou temporização da ovulação quando administrado GnRH ou hCG a éguas no ciclo, sendo qualquer tratamento um método aceitável para induzir a ovulação. No entanto, EPE não está disponível comercialmente para os clinicos e, por conseguinte, não é uma técnica prática de indução da ovulação. 44

Em condições de acasalamento naturais, o ejaculado do equídeo é depositado directamente no útero da égua. Spallanzani foi o primeiro a descrever a inseminação artificial (IA) em cães e depois em cavalos nos finais de 1700. A utilização de IA foi documentada em gado bovino, ovino e suíno e cavalos. Cavalos, gado e porcos são artificialmente inseminados na cavidade uterina, ovelhas, cabras e cães no cérvix e gatos na vagina anterior. No que se refere a equídeos, outros têm descrito a recolha seminal por rotina e procedimentos de manuseamento nos cavalos. Nos procedimentos IA de rotina, o sémen é depositado no interior da cavidade uterina com uma pipeta e seringa de inseminação estéril. No entanto, existem várias razões para a utilização de locais e técnicas alternativos para a inseminação artificial. a) inseminação de sémen descongelado de baixa qualidade ou quantidade limitada, b) inseminação de sémen de um macho subfértil ou c) inseminação com sémen sexado em quantidade limitada. Algumas técnicas de IA alternativas incluem: inseminação intra-uterina (por laparoscopia ou técnicas não cirúrgicas) em espécies em que as inseminações cervicais ou vaginais são executadas por rotina, inseminação oviductal (por laparoscopia ou laparotomia no flanco) ou inseminação não-cirúrgica intra-uterina. A inseminação intra-uterina laparoscopica tem evoluído como a técnica menos invasiva para depósito do sémen directamente no útero de ovelhas ou cabras desde os inícios dos anos 70, altura em que foi desenvolvido equipamento adequado. A inseminação por laparoscopia é executada por rotina em ovelhas e cabras com elevada fertilidade em comparação com a IA tradicional. A inseminação laparoscopica intra-uterina tem sido também descrita com 45 êxito no furão, gato doméstico, tigre, chita e leopardo e mais recentemente na serigueia e wallaby. Algumas vantagens da inseminação laparoscópica incluem: Melhoria genética utilizando sémen congelado, maior número de inseminações por colheita com números menores de espermatozóides e maior fertilidade. A principal desvantagem da inseminação laparoscópica reside no elevado custo do equipamento e procedimento (mão de obra especializada, fármacos, processamento do sémen). Este procedimento é também relativamente invasivo para o doente. A inseminação intra-uterina não-cirúrgica com ovelhas é utilizada numa tentativa de aumentar as taxas de fertilidade em espécies que são vulgarmente inseminadas no cérvix. Um investigador obteve uma taxa 75% de borregos na sequência de inseminação intra-uterina em comparação com 17% após inseminação cervical profunda e 30% após inseminação caudocervical dupla. Noutro estudo, um investigador depositou espermatozóides de carneiro descongelados em três regiões do tracto genital de ovelhas. No grupo 1, foi executada uma única inseminação intra-uterina, enquanto no grupo 2 as ovelhas foram inseminadas uma vez na zona profunda do cérvix e no grupo 3 as ovelhas foram inseminadas duas vezes, com intervalo de 12 horas, na região caudocervical. As taxas de concepção foram 89,45 e 57% respectivamente. Outros descreveram resultados similares com inseminação intra-uterina. A inseminação endoscópica não-cirúrgica foi também executada em cadelas, resultando em elevadas taxas de gravidez.

Com inseminação no oviducto (01) foi inseminado cirurgicamente um pequeno volume (normalmente 0,05 a 0,5 ml) no lúmen oviductal. Um estudo inseminou nove marrãs por 46 inseminação laparoscópica. Duas em nove (22%) marras engravidaram com uma única insmeinação. Um estudo mais recente em ovelhas determinou os efeitos do número de espermatozóides, tempo e local da inseminação na fertilidade. Na experiência 1, as ovelhas foram inseminadas com ΙΟ4, ΙΟ5, 106 ou 107 espermatozóides. Os ovos recuperados 48 horas depois foram classificados como fertilizados caso tivessem clivado. Os resultados revelaram que mais ovelhas estavam férteis após inseminação oviductal do que as que receberam inseminação intra-uterina (61 contra 39%) e com doses elevadas (106 e 107) de espermatozóide em vez de doses inferiores (104 e 105) no caso da inseminação intra-uterina mas não para a inseminação oviductal. Os investigadores nas nossas instalações conseguiram pela primeira vez a utilizar 01 para obter gravidezes na égua. Catorze éguas foram inseminadas a 01 com 50 x 103 epm e 15 foram inseminadas por IA intra-uterina com 500 x 106 epm. As taxas de gravidez não divergiram entre os grupos 3/14 (21,4%) e 6/15 (40%) respectivamente. A inseminação oviductal tem também sido utilizada com bastante êxito para obter gravidezes em mulheres e coelhas.

Em vacas, o sitio da deposição seminal durante a inseminação artificial nas últimas quatro décadas tem sido o corpo uterino. Esta tem sido uma técnica aceitável quando existem elevados números de espermatozóides férteis para inseminação, mas no caso de equídeos, em especial quando existem números limitados de espermatozóides, foi desenvolvida uma abordagem alternativa. A inseminação intra-uterina profunda é uma técnica que foi frequentemente utilizada para obter gravidezes em gado. Um estudo comparou as taxas de gravidez para IA quando o sémen foi depositado 47 no corpo uterino ou nos dois cornos uterinos (inseminação cornual). As taxas de gravidez quando o sémen foi depositado no corpo uterino foram 44,7% em comparação com 64,6% com inseminação cornual. No entanto, nem todos os estudos revelam vantagens com esta técnica de inseminação.

Como mostra a presente invenção, pode existir uma congruência de métodos de separar os espermatozóides por sexos com base no conteúdo do ADN, citómetro de fluxo de alta velocidade/separador celular e procedimentos de inseminação de equídeos com menos de vinte e cinco milhões de espermatozóides no total sem comprometer a fertilidade, podendo resultar na possibilidade de uma indústria de sémen não cirúrgica ou mesmo sexado viável em equídeos. Curiosamente, em vez de inseminar no interior do corpo uterino, onde normalmente se aplica este tipo de inseminação, ao inseminar profundamente no interior do corno uterino da égua são alcançados melhores resultados. Por "profundamente" deve subentender-se que a inserção é aplicada bem no interior do corno uterino. Assim, poderá não ser efectuado sem utilizar equipamento de transferência de embriões.

Em resultado da inseminação, deseja-se evidentemente a produção de um animal do sexo desejado. Este animal deve ser produzido de acordo com os sistemas anteriormente discutidos por meio da utilização do espécime de espermatozóides sexuados. Deve igualmente ficar claro que as técnicas da presente invenção podem ser aplicadas noutras técnicas tais como a inseminação laparoscópica, inseminação oviductal ou semelhantes. A título de exemplo, foram realizadas as seguintes experiências. Embora nem todas utilizem todos os aspectos das invenções presentemente descritas e nem todas apresentem todos os 48 aperfeiçoamentos do desempenho da invenção, mostra alguns aperfeiçoamentos possíveis através de diferentes aspectos da invenção.

Foram utilizadas éguas, sessenta e uma éguas em ciclo normais em termos reprodutivos de raças de cavalos ligeiros, com idades dos 3 aos 15. Administrou-se às éguas cloprostenol (250 μg i.m.) para induzir a luteólise e examinou-se por palpação e ultrassonografia do tracto reprodutor por via rectal, dia sim, dia não até ser detectado um folículo >30 mm e depois diariamente até se detectar a ovulação Assim que a égua desenvolveu um folículo >35 mm foi administrado subcutaneamente um implante de hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) (acetato de deslorelina 2,2 mg, Ovuplant®, Fort Dodge, IA) e a égua foi atribuída a 1 de 3 grupos de tratamento.

Grupo de tratamento I - as éguas foram inseminadas numa única ocasião com 500 x 106 epm num volume de 20 ml (25 x 106 epm/ml), 40 h (n=9) ou 34 h (n=ll) depois da administração de GnRH. O sémen foi depositado no corpo uterino utilizando uma pipeta de inseminação artificial (IA) em plástico flexível (IMV, França).

Grupo de tratamento 2 - as éguas foram inseminadas numa única ocasião com 25 x 106 epm num volume de 1 ml (25 x 106 epm/ml), 40 h (n=13) ou 34 h (n=8) depois da administração de GnRH. O sémen foi depositado na ponta do corno uterino, ipsilateralmente em relação ao folículo pré-ovulatório, utilizando uma pipeta IA em plástico flexível. A localização das pipetas no interior do útero foi confirmada por ultrassonografia transrectal antes da aplicação do sémen.

Grupo de tratamento 3 - as éguas foram inseminadas numa única ocasião com 5 x 106 epm num volume de 1 ml (25 x 106 49 epm/ml) , 40 h (n=10) ou 0,2 ml (25 x 106 spm/ml), 34 h (n=10) depois da administração de GnRH. As éguas que receberam 1 ml foram inseminadas com uma pipeta de IA de plástico flexível enquanto as éguas que receberam 0,2 ml foram inseminadas com uma pistola descartável (Veterinary Concepts, Green Valley, Wl) com uma bainha de plástico de 0,5 ml. Foram utilizadas pipetas de inseminação diferentes para optimizar a aplicação dos dois volumes diferentes. O sémen foi depositado na ponta do corno uterino, ipsilateralmente em relação ao folículo pré-ovulatório. A localização das pipetas no interior do útero foi confirmada por ultrassonografia transrectal antes da aplicação do sémen.

Depois da inseminação, as éguas foram examinadas diariamente para determinar o dia da ovulação. Os exames de gravidez foram executados por ultrassonografia nos dias 12, 14 e 16 pós-ovulação. As taxas de gravidez não diferiram entre garanhões de raça árabe (garanhão A = 22/31, 71 %; garanhão B = 15/30, 50%) (P>0,1) ou entre éguas acasaladas 34 contra 40 horas depois da administração de GnRH (19/29, 65% e 18/32, 56% respectivamente) (P>0,1) portanto os conjuntos de dados foram combinados. Como se mostra no quadro 1, as éguas acasaladas com 500 x 106 epm num volume de 2 0 ml apresentaram uma taxa de gravidez significativamente mais elevada (P<0,05) do que as éguas acasaladas apenas com 25 ou 5 x 106 epm (quadro 1). Não se verificou uma diferença significativa (P>0,05) entre as taxas de gravidez entre éguas acasaladas com 25 x 106 epm e éguas acasaladas com 5 x 106 epm num volume de 1 ou 0,2 mis. Embora a fertilidade fosse significativamente mais elevada com 500 x 106 epm em comparação com o grupo 2 (25 x 106 epm) alcançou-se uma taxa inicial de 57% com uma única 50 inseminação. Este não divergiu das taxas de gravidez atingidas com o grupo 3 (5 x 106 epm), 7/20 (35%).

Quadro 1 Taxas de Gravidez de uma Única Inseminação

Quadro 1 N° de espermatozóides progressivamente móveis % de gravidezes no dia 16 500 x 106 em 20 ml 18/20 (90%) a 25 x 106 em 1 ml 12/21 (57%)b 5 x 106 em 1 ml 3/10 (30%)b 5 x 106 v 0,2 ml 4/10 (40%)b a,b valores com expoentes quadrado) diferentes divergem (P<0.05), (Chi A programação da inseminação relativamente à administração de GnRH foi alterada de 40 para 34 h pós GnRH durante a experiência porque muitas éguas ovularam antes da inseminação prevista e portanto não foram inseminadas. Os dados dos ciclos de 22 éguas (26,5%) foram excluídos porque ou ovularam antes da inseminação planeada (n=ll), não ovularam (n=3) ou ovularam >4 dias depois da administração de GnRH (n=8) . O número óptimo de espermatozóides geralmente recomendado por dose de inseminação é 500 x 106 epm dia sim, dia não, durante o estro da égua. No entanto, como anteriormente mencionado, têm surgido estudos que demonstram não existir qualquer diminuição da fertilidade com a inseminação de 100 x 106 espermatozóides móveis em comparação com 500 x 106 espermatozóides móveis. Estudos 51 com 50 x 106 espermatozóides móveis demonstraram uma diminuição da fertilidade em comparação com 100 e 500 x 106. Outros estudos demonstraram que à medida que aumenta o número de inseminações diminui a fertilidade, infelizmente, os resultados destes estudos revelaram ser algo inconsistentes. Por conseguinte, a presente invenção está orientada no sentido de alcançar o menor número de espermatozóides necessários para proporcionar taxas de gravidez razoáveis quando administradas numa única ocasião, próximo da ovulação.

No grupo 3, 20 éguas foram inseminadas com 5 x 106 epm num volume de 1 ml (25 x 106 epm/ml) (n=10) ou num volume de 0,2 ml (25 x 106 epm/ml) (n=10) . As taxas de gravidez entre os dois subgrupos foram comparadas porque se tem descrito a diminuição das taxas de gravidez quando se dilui o sémen até uma concentração de espermatozóides < 25 x 106/ml. No entanto, nesta experiência não houve diferença entre a fertilidade das duas concentrações de espermatozóides.

Se uma égua já tinha ovulado com base na apalpação rectal e exame com ultra-sons na manhã do dia previsto para a inseminação, não era inseminada. Em vez disso, foi administrado cloprostenol (250 pg) durante 5 dias pós-ovulação para induzir a luteólise a fim de se poder reutilizar a égua. As gravidezes foram interrompidas no dia 16 mediante localização por ultrassonografia transrectal e ruptura da vesícula embriónica. Foi administrado cloprostenol (250 pg i.m.) para induzir a luteólise a fim de se poder reutilizar a égua. O sémen foi depositado na ponta do corno uterino, para as duas doses menores desta experiência. A deposição seminal profundamente no corno uterino é particularmente 52 útil quando se utiliza um baixo número de espermatozóides num pequeno volume. A pipeta de inseminação flexível foi colocada no útero através da vagina e depois foi lentamente guiada para a ponta do corno uterino desejado por meio de manipulação suave per rectum. A localização da pipeta foi confirmada por apalpação transrectal e exame com ultrassons.

Foi conduzido um pequeno estudo adicional no final da época de acasalamento com cinco éguas e um dos mesmos dois garanhões. 0 objectivo deste estudo consistia em determinar as taxas de gravidez com 25 x 106 epm depositados no corpo uterino. Três em cinco éguas (60%) inseminadas numa única ocasião com 25 x 106 epm 40 após administração de GnRH estavam grávidas no dia 16.

Em resumo, os resultados destas experiências revelaram ter-se alcançado uma taxa de gravidez a fim de 16 dias de 57% com uma única inseminação, próxima da ovulação, com 25 x 106 epm quando depositados profundamente no corno uterino.

Os objectivos das experiências seguintes consistiam em 1) determinar as taxas de gravidez na sequência de inseminação com 25 χ 106 espermatozóides sexuados, separados vivos, depositados na ponta do corno uterino ipsilateralmente em relação ao folículo pré-ovulatório e 2) comparar as taxas de gravidez do sémen separado num diluente de leite desnatado, com ou sem gema de ovo. Éguas, foram utilizadas dezassete éguas em ciclo normais em termos reprodutivos de raças de cavalos ligeiros, com idades dos 5 aos 12 anos. Administrou-se às éguas cloprostenol (250 μρ i.m.) para induzir a luteólise e examinou-se por palpação e ultrassonografia do tracto reprodutor por via rectal, dia sim, dia não até ser 53 detectado um folículo >30 mm e depois diariamente até se detectar a ovulação Assim que a égua desenvolveu um folículo >35 mm foi-lhe administrado subcutaneamente um implante de hormona libertadora de gonadotropina (GnRH) (acetato de deslorelina 2,2 mg, Ovuplant®, Fort Dodge, IA) e a égua foi atribuída aleatoriamente a 1 de 2 grupos de tratamento.

Grupo de tratamento A - as éguas (n=ll) foram inseminadas numa única ocasião com -25 x 106 espermatozóides separados vivos num volume de 1 ml (25 milhões/ml), 34 h depois da administraçao de GnRH. Os espermatozóides foram separados num diluente seminal de leite desnatado comercial (EZ-Mixin, OF, Animal Reproduction Systems, Chino, CA), e foi adicionado o mesmo diluente após centrifugação com tampão pós-centrifugação, para ajustar a concentração de espermatozóides a 25 x 106 ml. O sémen foi depositado na ponta do corno uterino, ipsilateralmente em relação ao folículo pré-ovulatório, utilizando uma pipeta IA em plástico flexível (IMV, França). A localização das pipetas no interior do útero foi confirmada por ultrassonografia transrectal antes da aplicação do sémen. Onze éguas foram inseminadas com 20 x 106 espermatozóides separados vivos com citómetro de fluxo devido às restrições de tempo. Uma égua não ovolou e foi excluída do estudo.

Grupo de tratamento B - as éguas (n=10) foram inseminadas numa única ocasião com -25 x 106 espermatozóides separados vivos num volume de 1 ml (25 milhões/ml), 34 h depois da administração de GnRH. Onze éguas foram inseminadas com 20 x 106 espermatozóides separados vivos com citómetro de fluxo devido às restrições de tempo. Os espermatozóides foram separados no mesmo 54 diluente seminal comercial adicionado com 4% de gema de ovo e foi adicionado do mesmo diluente após centrifugação como tampão pós-centrifugação para ajustar a concentração de espermatozóides. Os espermatozóides foram depositados na ponta do corno uterino, ipsilateralmente em relação ao foliculo pré-ovulatório, utilizando uma pipeta IA em plástico flexível. A localização das pipetas no interior do útero foi confirmada por ultrassonografia transrectal antes da aplicação do sémen.

Depois da inseminação, as éguas foram examinadas diariamente para determinar o dia da ovulação. Os exames de gravidez foram executados por ultrassonografia nos dias 12, 14, 16 e 30 e pós-ovulação e determinou-se o sexo dos fetos no dia 60.

Recolha e Preparação do Sémen - Nesta experiência foram utilizados dois garanhões de raça árabe e reconhecida fertilidade, um destes (garanhão A) foi utilizado na experiência 1. O sémen foi recolhido na manhã prevista para a inseminação com uma vagina artificial modelo Colorado (Animal Reproduction Systems, Chino, CA), equipada com um filtro de gel em linha. Os ejaculados foram avaliados no que toca ao volume isento de gel, mobilidade e concentração de espermatozóides. O sémen foi diluído 1:1 em HBGM-3 com BSA e no espaço de minutos foi transportado à temperatura ambiente para o laboratório para prosseguir o processamento. O sémen foi centrifugado durante 10 minutos a 400 x 22° C para concentrar bastante os espermatozóides. Depois da centrifugação, o sobrenadante foi aspirado, deixando um aglomerado macio de espermatozóides. A concentração de espermatozóides foi determinada com um densímetro (Animal Reproduction Systems, Chino, CA) e os espermatozóides foram posteriormente diluídos até 400 x 55 106/ml em HBGM-3, num volume total de 1 ml e coloridos com 25 μΐ de 33342 Hoechst (5 mg/ml de água). Foram preparados no total oito tubos de amostras e foram incubados a 34° C durante 1 hora. Em seguida, as amostras coloridas foram diluidas até 100 x 106/ml com 3 ml de HBGM-3. Adicionou-se corante alimentar (2 μΐ/ml de 1 % FD&C #40 em HBGM-3) a cada um dos oito tubos de amostras, resultando num volume total de 4 ml. As amostras foram então filtradas através de um aparelho de filtração de 1 ml, 40 micrones, em tubos de polipropileno de 6 ml e mantidas à temperatura ambiente até aproximadamente 25 x 106 espermatozóides vivos serem separados por citometria de fluxo de ADN. Um laser de árgon emissor de 150 mW a 351 e 364 foi utilizado em cada um dos dois citómetros de fluxo/separadores celulares MoFlo®, modificados para a separação de espermatozóides, a funcionar a 50 psi com HBGM-3 sem BSA como fluido de envolvimento. Os espermatozóides foram colhidos a aproximadamente 900 espermatozóides vivos/seg. para um total de 6 tubos de polipropileno (14 ml cada) contendo cada 4 ml de fluido de captura antes do inicio da separação de EZ-Mixin® ou 4% de gema de ovo em EZ-Mixin® . Quando duas éguas estavam prontas para inseminação no mesmo dia foram recolhidos espermatozóide enriquecidos com cromossoma X e cromossoma Y. Os conteúdos dos tubos foram misturados a cada 30 minutos durante a separação. Depois da separação, os espermatozóide foram reunidos dos dois citómetros de fluxo, colocados em tubos de 50 ml de centrifugadora e centrifugados durante 20 minutos a 1200 x g a 22° C. O sobrenadante foi depois aspirado até ficar um aglomerado de 200 μΐ de espermatozóides e adicionou-se 100 μΐ de tampão pós-centrifugação de EZ-Mixin® CST (Animal Reproduction Systems, Chino CA) ou 4 % leite desnatado-gema de ovo ao aglomerado e transferido para um tubo Falcon previamente 56 pesado de 50 ml. Foi executada uma contagem hemacitómetro para determinar a concentração final de espermatozóides/ml. O volume de espermatozóides no tubo Falcon x concentração de espermatozóides/ml igualou o número total de espermatozóides recuperados. As amostras foram depois diluídas até um total de 25 x 106 espermatozóides separados vivos num volume de 1 ml que foi utilizado para inseminação.

Repetição da Análise do Conteúdo de ADN dos Espermatozóides - O conteúdo relativo de adn dos espermatozóides intactos separados, utilizados para inseminação foi determinado por análise com citómetro de fluxo dos núcleos dos espermatozóide de uma amostra contendo <0,5 ml de cada dos lotes respectivos recolhidos no final do dia. Os núcleos dos espermatozóides foram preparados a partir de uma aliquota de espermatozóides intactos separados por sonicação durante 3 segundos, com um Ultrasonic Dismembrator 60 (Fisher Scientific) regulado para o n° 2 (aproximadamente 1 watt) . A proporção de espermatozóide com o cromossoma X e Y foi determinada adaptando um par de distribuições de Gauss aos histogramas do detector 0o (Johnos et al., 1987b). A repetição da análise do ADN indicou uma pureza média de separação de 90% para espermatozóides com o cromossoma X e 84% para espermatozóides com o cromossoma Y para as 17 separações.

Determinação do Sexo Fetal - O sexo dos fetos das éguas grávidas 60 a 70 dias após a ovulação foi determinado por ultrassonografia transrectal sem conhecimento do sexo do esperma separado inseminado. Foi utilizado para a determinação do sexo um detector de ultra-sons em tempo real (Aloka 500®) equipado com uma série linear de transdutores 5 MHz. O género dos fetos pode ser determinado 57 com precisão em cavalos e gado mediante identificação e localização do tubérculo genital (Curran, 1998).

Análises estatística - Os dados foram analisados utilizando o Teste Exacto de Fisher

As taxas de gravidez ao dia 16 encontram-se no quadro 2. As taxas de gravidez não revelaram diferenças entre os garanhões (garanhão A = 3/10, 30%; garanhão B = 5/10, 50%) (P>0,1) pelo que os conjuntos de dados foram combinados. Não se detectou qualquer diferença estatística quanto às taxas de gravidez entre os tratamentos seminais (EZ-Mixin = 3/10, 30% vs. 4% EY+ EZ-Mixin = S/10, 50%) (P>0,1) embora este resultado nem sempre é verdadeiro. A proporção de sexo fenotípica foi prevista com exactidão perfeita, cinco em cinco.

Três éguas perderam a gravidez entre os dias 16 e 60 pós-ovulação, pelo que não foi possível determinar o sexo do feto. Uma égua inseminada com espermatozóides com cromossoma X foi eutanasiada ao dia 66 de gestação devido a um problema gastrointestinal. Detectou-se na necropsia um feto fêmea fenotipicamente normal (do sexo correcto).

Quadro 2 Taxas de Gravidez na Sequência da Inseminação com 25 x 106 Espermatozóides Sexuados

Quadro 2

Grupo de tratamento N° de éguas N° de N° de inseminadas éguas éguas grávidas grávidas ao dia ao dia 60 o o

Prevista*

Real? d1 c? 16 58 ? EZ-Mixin 10 3o 1 78 89 ** 1/1 4% GO + EZ-Mixin 10 5o 4 84 87 3/3 1/1 0 Sem diferença significativa (P>0,1). * Resultados da repetição da análise do conteúdo de ADN das aliquotas de populações de espermatozóides com X e Y. ** Gravidezes perdidas antes da determinação do sexo RESULTADOS: Têm sido feitas muitas tentativas de separação dos espermatozóides com cromossoma X dos com cromossoma Y nos últimos 80 anos. O único método não destrutivo com um registo comprovado de identificação precisa dos espermatozóides com cromossoma X e Y é a citometria de fluxo/separação celular, tornando assim possivel alterar facultativamente a proporção de sexos. Os espermatozóides foram separados por citometria de fluxo/separação celular para obter uma gravidez na sequência da inseminação cirúrgica nas seguintes espécies: coelhos, suinos e cavalos. A inseminação cirúrgica foi eleita nestas experiências devido à necessidade de minimizar os números de espermatozóides devido á fraca taxa de separação (-100 espermatozóides/seg.) dos espermatozóides com X e Y e aparente necessidade de grandes números de espermatozóides para estabelecer a gravidez. A produção de espermatozóides com x e Y por unidade de tempo, por meio de uma separação rápida e um bocal orientador recém-desenvolvido aumentou as taxas de separação 10 a 12 59 vezes relativamente às taxas anteriores. Esta tecnologia aumentou o número de espermatozóides separados por unidade de tempo e permitiu aos investigadores obter gravidezes resultantes de inseminação não-cirúrgica, intra-uterina em ovelhas e bovinos. 0 presente estudo foi o primeiro a obter gravidezes viáveis no cavalo na sequência de inseminação não-cirúrgica, intra-uterina com sémen sexado. A taxa de gravidez ao dia 16 após a inseminação de 25 x 106 espermatozóides sexuados (40%) não foi estatisticamente diferente (P>0,1) da em éguas da experiência 1, inseminadas com 25 x 106 espermatozóides não separados, progressivamente móveis (57%) . A técnica de inseminação foi a mesma em ambas as experiências. Foram empregues as mesmas éguas e os mesmos técnicos em ambas as experiências. Igualmente, ambas as experiências foram conduzidas durante a mesma época de acasalamento, na mesma altura do ano.

As taxas de gravidez experimentais iniciais foram ligeiramente inferiores com sémen sexado provavelmente devido à quantidade de tempo que demora a separar 25 x 106 espermatozóides e possíveis danos nos espermatozóides durante o processo. Nas experiências, o tempo médio desde a recolha do sémen até à inseminação foi de 7 horas. Nesta primeira experiência, as éguas foram inseminadas quase imediatamente após a recolha do sémen. A mobilidade média total e progressiva dos espermatozóides sexuados foi 69 e 38% respectivamente e recolheram-se um total de apenas 25 x 106 espermatozóides separados vivos para a inseminação. O processo de separação é um procedimento muito desgastante dos espermatozóides. Um arco de espermatozóides bombeado por um fino tubo a alta pressão Faz com que saiam a -100 km/h e são guardados à temperatura ambiente durante várias 60 horas até terem sido recolhidos os números adequados de espermatozóides. Os espermatozóides são incubados durante uma hora a 35 °C com 33342 da Hoechst, que possui uma elevada afinidade para regiões ricas em AT do adn e são depois expostos a uma luz laser ultravioleta a 351 e 364 mn. Ao contrário de muitas colorações específicas do ADN, o 33342 da Hoechst não se intercala na hélice de ADN- Embora nenhum destes processos promova a saúde dos espermatozóides, não se descreveu uma maior incidência de anomalias genéticas nas centenas de descendentes que foram produzidos com esta tecnologia.

Reveste-se de interesse adicional o facto de outros terem proposto outra explicação possível para as baixas taxas de gravidez com sémen sexado. Constatou-se que o primeiro ciclo celular foi atrasado em embriões de coelho fertilizados com espermatozóides tratados com 33342 da Hoechst. Infelizmente, é desconhecido o mecanismo mas poderia dever-se a interferências das moléculas corantes à medida que o ADN é replicado ou transcrito. Foi também documentada uma menor sobrevivência do embrião em espermatozóides separados por citometria de fluxo.

Três de oito éguas (38%) inseminadas com sémen sexado perderam os fetos entre os dias 16 a 60. Duas destas éguas desenvolveram vesículas embriónicas aparentemente normais até ao dia 16. As vesiculas diminuiram depois de tamanho até já não se encontrarem presentes. Uma das três éguas desenvolveu uma gravidez viável com um feto visível Adth batimento cardíaco. Observou-se que o feto estava vivo no dia 35 mas no dia 50 tinha sido perdido. Com sémen fresco, não separado, constatou-se que as perdas embriónicas eram em média 9% no dia 14 e até 16% entre os dias 20 e 50. Utilizou-se uma coloração dos espermatozóides e 61 procedimento de separação nestas experiências. É possível que o esperma equino seja mais sensível à coloração e procedimentos de separação do que o esperma de bovino.

Em resumo, a presente invenção demonstrou pela primeira vez que a qravidez na égua pode ser alcançada e é possível conseguir potros com sexo pré-determinado mediante a deposição de um baixo número de espermatozóides na ponta do corno uterino da égua. A determinação do sexo em espermatozóides de mamíferos está a passar de uma técnica de pesquisa e pode agora ficar disponível para programas IA de equídeos comerciais. Além disso, como anteriormente mencionado e como se pode observar das várias experiências, o campo baseia-se em estatísticas permitindo a condução de uma variedade de experiências adicionais para comprovar mais aprofundadamente as estratégias de combinação e de limitação adequadas. A discussão incluída no presente pedido de patente destina-se a servir de descrição básica. 0 leitor deverá estar consciente que a discussão específica poderá não descrever explicitamente todas as formas de realização possíveis, estão implícitas muitas alternativas.

Finalmente, ao longo da presente especificação, em especial nas reivindicações, excepto se o contexto exigir o contrário, a palavra "compreender" ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo", pressupões a inclusão de um elemento ou grupo de elementos indicado mas não a inclusão de qualquer outro elemento ou grupo de elementos.

As concretizações preferidas da presente invenção são descritas nas reivindicações. 62

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista das referências citadas pelo requerente serve apenas para conveniência do leitor. Esta lista não faz parte do documento da patente europeia. Apesar da compilação cuidadosa das referências, os erros ou as omissões não podem ser excluídos e o IEP rejeita toda a responsabilidade a este respeito.

Documentos de patente citados na descrição:

• US 4276139 A

• US 5514537 A

• US 3894529 A

• US 32350 A

• US 4092229 A

• US 4067965 A

• US 4155831 A

• US 4083957 A

• US 4225405 A

• US 4698142 A

• US 4749458 A

• US 4009260 A

• US 4339434 A

• US 4511661 A

• US 4999283 A

• US 5021244 A

• US 5346990 A

US 5439362 A 63

• US 5660997 A

• US 3687803 A

• US 4191749 A

• US 4448767 A

• US 4680258 A

• US 4085205 A

• US 4362246 A • US 5135759 A, Lawrence Johnson

• US 5150313 A

• US 5602039 A

• US 5602349 A

• US 5643796 A

• WO 9612171 A

• US 60094720 B

• US 60113143 B

Literatura, não relacionada com patentes, citada na descrição: • J. J. Parrish. Capacitation of Bovine Sperm by Heparin. Biology of Reproduction, 1988, vol. 38, 1171 • Rupert P. Amman; George E. Seidel, Jr. Prospects for Sorting Mammalian Sperm. Colorado Associated University Press, 1982

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de produção prática de um mamífero equino compreendendo as seguintes fases: a. determinação de um período estimado do estro de um mamífero equino fêmea, possuindo a referida fêmea dois cornos uterinos, possuindo cada corno uterino uma ponta e um folículo; b. recolha de espermatozóides equinos de um mamífero equino macho; c. orientação dos referidos espermatozóides recolhidos num citómetro de fluxo para detectar sinais fluorescentes emitidos dos referidos espermatozóides no referido citómetro de fluxo; d. seleccionar (gating) de modo electrónico os referidos sinais fluorescentes emitidos pelos referidos espermatozóides no referido citómetro de fluxo; e. determinação das características sexuais de vários referidos espermatozóides equinos no referido citómetro de fluxo; f. separação dos espermatozóides equinos referidos a uma velocidade superior a 900 separações por segundo utilizando o referido citómetro de fluxo de acordo com a determinação das respectivas características sexuais; g. selecção de especificamente um fluido de envolvimento, de forma a poder servir de forma coordenada com o ambiente do fluido celular pré-separação e o ambiente do fluido celular pós-separação para as referidas células no referido citómetro de fluxo; 2 h. estabelecimento de uma amostra de inseminação equina contendo pelo menos alguns dos referidos espermatozóides equinos separados do referido mamifero equino macho; i. inserção não cirúrgica de pelo menos uma porção da referida amostra de inseminação equina no referido mamifero equino fêmea; j. inseminação artificial do referido mamifero equino fêmea; k. fertilização de pelo menos um óvulo equino no referido mamifero equino fêmea e l. produção de um mamifero descendente equino do sexo desejado.

2. Método de produção prática de um mamifero equino de acordo com o descrito na reivindicação 1, em que as referidas fases de determinação das caracteristicas sexuais de vários espermatozóides equinos e separação dos referidos espermatozóides de acordo com a determinação das respectivas caracteristicas sexuais compreendem ainda as fases de: a. coloração dos referidos espermatozóides equinos; b. concentração dos referidos espermatozóides equinos separados.

3. Método de produção prática de um mamifero equino de acordo com o descrito na reivindicação 2, em que a referida fase de separação conforme o referido sexo dos referidos espermatozóides equinos compreende a fase de accionar um separador celular de alta velocidade a uma pressão de pelo menos cerca de 50 libras por polegada quadrada (cerca de 3,5 kg-força por centímetro quadrado). 3

4. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 2, em que a referida fase de separação de acordo com o referido sexo dos referidos espermatozóides equinos compreende a fase de recolha dos espermatozóides equinos com as características sexuais desejadas numa solução de leite desnatado.

5. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 1, em que a fase de estabelecimento de uma amostra de inseminação equina contendo pelo menos alguns dos referidos espermatozóides equinos do referido mamífero equino macho compreende a fase de estabelecer uma amostra de inseminação de equino contendo pelo menos alguns dos referidos espermatozóides equinos do referido mamífero equino e possuindo um baixo número dos referidos espermatozóides relativamente à dose de inseminação artificial típica seleccionada do grupo constituído por: uma amostra de inseminação equina com não mais de cerca de cinco milhões de espermatozóides e uma amostra de inseminação equina com não mais de cerca de vinte cinco milhões de espermatozóides.

6. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 5, em que a fase de estabelecimento de uma amostra de inseminação equina contendo pelo menos alguns dos espermatozóides equinos referidos do referido mamífero equino macho compreende a fase de estabelecimento de uma amostra de inseminação equina com um volume seleccionado do grupo: 0,2 ml ou 1 ml. 4

7. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 1, em que a referida fase de inserção não cirúrgica de pelo menos uma porção da referida amostra de inseminação equina no referido mamífero equino fêmea compreende a fase de inserção de pelo menos uma porção da referida amostra de inseminação equina profundamente em pelo menos um dos referidos cornos uterinos da referida fêmea, próximo da ponta do referido corno uterino.

8. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 2, em que a referida fase de inserção não cirúrgica de pelo menos uma porção da referida amostra de inseminação equina no referido mamífero equino fêmea compreende a fase de inserção de pelo menos uma porção da referida amostra de inseminação equina profundamente em pelo menos um dos referidos cornos uterinos da referida fêmea, próximo da ponta do referido corno uterino.

9. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 7, em que a referida fase de inseminação artificial do referido mamífero equino fêmea compreende a fase de inseminação artificial do referido equino fêmea numa única ocasião próximo da ovulação.

10. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 8, em que a referida fase de inseminação artificial do referido mamífero equino fêmea compreende a fase de inseminação artificial do referido equino fêmea numa única ocasião próximo da ovulação. 5

11. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 9, que compreende ainda a fase de manipulação da ovulação do referido mamífero equino fêmea antes da realização da fase de inseminação artificial do referido mamífero equino fêmea.

12. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 10, que compreende ainda a fase de manipulação da ovulação do referido mamífero equino fêmea antes da realização da fase de inseminação artificial do referido mamífero equino fêmea.

13. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 11, em que a fase de manipulação da ovulação do referido mamífero equino fêmea antes da realização da fase de inseminação artificial do referido mamífero equino fêmea compreende a fase de administração de uma hormona libertadora de gonadotropina ao referido mamífero equino fêmea.

14. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 12, em que a fase de manipulação da ovulação do referido mamífero equino fêmea antes da realização da fase de inseminação artificial do referido mamífero equino fêmea compreende a fase de administração de uma hormona libertadora de gonadotropina ao referido mamífero equino fêmea.

15. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 13, em que a 6 referida fase de inseminação artificial do referido mamífero equino fêmea é realizada no momento seleccionado a partir do grupo constituído por: cerca de trinta e quatro horas depois da referida fase de administração da referida hormona libertadora de gonadotropina ao referido mamífero equino fêmea, cerca de quarenta horas depois da referida fase de administração da referida hormona libertadora de gonadotropina ao referido mamífero equino fêmea e entre cerca de trinta e quatro horas a cerca de quarenta horas depois da fase de administração da referida hormona libertadora de gonadotropina ao referido mamífero equino fêmea.

16. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 14, em que a referida fase de inseminação artificial do referido mamífero equino fêmea é realizada no momento seleccionado a partir do grupo constituído por: cerca de trinta e quatro horas depois da referida fase de administração da referida hormona libertadora de gonadotropina ao referido mamífero equino fêmea, cerca de quarenta horas depois da referida fase de administração da referida hormona libertadora de gonadotropina ao referido mamífero equino fêmea e entre cerca de trinta e quatro horas a cerca de quarenta horas depois da referida fase de administração da referida hormona libertadora de gonadotropina ao referido mamífero equino fêmea.

17. Método de produção prática de um mamífero equino de acordo com o descrito na reivindicação 13, em que a referida fase de inserção de pelo menos uma porção da 7 referida amostra de inseminação equina profundamente em pelo menos um dos cornos uterinos da referida fêmea, próximo da ponta do referido corno uterino compreende as fases de: a. estabelecimento de uma sonda flexivel com um contentor para o esperma; b. colocação da referida sonda flexivel na vagina do referido mamífero equino fêmea; c. manipulação da referida sonda flexivel no referido útero do referido mamífero equino fêmea; d. orientação da referida sonda flexivel até um corno uterino do referido mamífero equino fêmea e e. manipulação delicada da referida sonda flexivel per rectum à medida que é guiada profundamente no referido corno uterino do referido mamifero equino fêmea até uma localização profunda no referido corno uterino da referida fêmea próximo da ponta do referido corno uterino.

18. Método de produção prática de um mamifero equino de acordo com o descrito na reivindicação 14, em que a referida fase de inserção de pelo menos uma porção da referida amostra de inseminação equina profundamente em pelo menos um dos referidos cornos uterinos da referida fêmea, próximo da ponta do referido corno uterino compreende as fases de: a. estabelecimento de uma sonda flexivel com um contentor para o esperma; b. colocação da referida sonda flexivel na vagina do referido mamifero equino fêmea; c. manipulação da referida sonda flexivel no referido útero do referido mamifero equino fêmea; 8 d. orientação da referida sonda flexível até um corno uterino do referido mamífero equino fêmea e e. manipulação delicada da referida sonda flexível per rectum à medida que é guiada profundamente no referido corno uterino do referido mamífero equino fêmea até uma localização profunda no referido corno uterino da referida fêmea próximo da ponta do referido corno uterino. 1/2

2/2

Fig.2