MXPA06011346A

MXPA06011346A - Uso de una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion intracelular y/o extracelularmente en un procedimiento de tincion o de separacion de espermatozoides.

Info

Publication number: MXPA06011346A
Application number: MXPA06011346A
Authority: MX
Inventors: Muhammad Anzar; Cindy L Ludwig; Jeffrey A Graham; Kathleen S Crowley
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2005-03-29
Publication date: 2006-12-15
Also published as: CN101238369A; EP1730523A1; EP1730523B1; AU2005228046B2; CN101238369B; DE602005018907D1; AU2005228046A2; US20050282245A1; NZ550197A; DK1730523T3; BRPI0509466A; ZA200608449B; CA2561681A1; WO2005095960A1; ZA200808640B; AR048674A1; JP2007531880A; US7998700B2; CA2561681C; ATE455291T1

Abstract

Se describen mezclas de tincion que contienen espermatozoides viables, una composicion que regula las reacciones de oxidacion/reduccion intracelular o extracelularmente y un pigmento selectivo para AADN; las celulas contenidas en dichas suspensiones tienden a tener una mayor capacidad para soportar los diversos pasos del procedimiento que se asocian habitualmente con la clasificacion de celulas espermatozoides en poblaciones enriquecidas por sexo y por lo tanto dan como resultado preparaciones post clasificacion con un numero mayor de espermatozoides viables o moviles; tambien se describen procedimientos para tenir celulas espermatozoides que comprenden la formacion de una mezcla de tincion.

Description

producción de las vacas lecheras. La separación de los espermatozoides en poblaciones enriquecidas de células con cromosomas X e Y, conocida como semen enriquecido por sexo o espermatozoides enriquecidos por sexo, es un método de lograr la descendencia preseleccionada. Para obtener semen enriquecido por sexo, se deben teñir las células espermatozoides con un pigmento y posteriormente clasificarlos en células con cromosomas X e Y. Cada uno de los procedimientos de tinción y de clasificación pone a las células espermatozoides bajo una situación adversa que disminuye la viabilidad o la motilidad de las células espermatozoides, en particular la motilidad progresiva. El procedimiento de tinción de los espermatozoides resulta especialmente adverso, el cual requiere poner las células en contacto con un pigmento durante cierto periodo, a menudo a una temperatura y un pH que no son comunes en el ambiente habitual de las células espermatozoides.

BREVE DESCRICPION DE LA INVENCION Entre los diversos aspectos de la presente invención se encuentran las suspensiones de espermatozoides que tienen una utilidad, por ejemplo, en los procedimientos usados para clasificar espermatozoides en poblaciones enriquecidas por espermatozoides de cromosomas X o Y. Por lo tanto, en resumen, la presente invención está dirigida a una mezcla de tinción que contiene espermatozoides viables, una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente, y un pigmento selectivo para ADN, donde la concentración de la composición en la mezcla de tinción debe ser mayor que 50 µ? cuando la composición es piruvato. La presente invención está además dirigida a un procedimiento para teñir células espermatozoides, donde dicho procedimiento comprende formar una mezcla de tinción que contenga células espermatozoides viables intactas, una composición que regule las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente, y un pigmento selectivo para ADN, donde la concentración de la composición en la mezcla de tinción debe ser mayor que 50 µ? cuando la composición es piruvato.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 1 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 400 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en un regulador de pH TCA o un regulador de pH TCA que contiene 10 mM de piruvato. La figura 2 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 2 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 400 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en un regulador de pH TCA o un regulador de pH TCA que contiene 10 pM de vitamina K. La figura 3 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 3 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 400 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en un regulador de pH TCA o un regulador de pH TCA que contiene 100 pM de vitamina K. La figura 4 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 4 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 400 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en un regulador de pH TCA o un regulador de pH TCA que contiene 1 mM de ácido lipoico. La figura 5 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 5 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 600 pM de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en un regulador de pH TCA o un regulador de pH TCA que contiene 10 mM de piruvato. La figura 6 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 6 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en un regulador de pH TCA o un regulador de pH TCA que contiene 100 pM de vitamina K.

La figura 7 ¡lustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 7 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 600 pM de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en un regulador de pH TCA o un regulador de pH TCA que contiene 1 mM de ácido lipoico. La figura 8 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 8 en el cual que se mide la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en un regulador de pH TCA, un regulador de pH TCA que contiene 2.5 mM de piruvato, un regulador de pH TCA que contiene 10 mM de piruvato, un regulador de pH TCA que contiene 25 mM de piruvato y un regulador de pH TCA que contiene 50 mM de piruvato. La figura 9 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 9 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 20 µ? de pigmento SYBR-14 a 28°C en un regulador de pH TCA o un regulador de pH TCA que contiene 0 mM de piruvato. La figura 10 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 10 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 100 µ? de pigmento BBC a 28°C en un regulador de pH TCA o un regulador de pH TCA que contiene 10 mM de piruvato.

La figura 11 ¡lustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 11 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de los espermatozoides para los espermatozoides teñidos con 200 pM de pigmento BBC a 28°C en un regulador de pH TCA o un regulador de pH TCA que contiene 10 mM de piruvato. La figura 12 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 12 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de las células espermatozoides para las células espermatozoides teñidas con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en TCA que contiene 10 mM de piruvato o en TCA en atmósfera de dióxido de carbono que contiene 10 mM de piruvato. La figura 13 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 12 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de las células espermatozoides para las células espermatozoides teñidas con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en TCA que contiene 10 mM de piruvato o en un regulador de pH inhibidor con base de carbonato a pH 7.3. La figura 14 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 12 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de loas células espermatozoides para las células espermatozoides teñidas con 600 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en TCA que contiene 10 mM de piruvato o en un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2.

La figura 15 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 13 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de las células espermatozoides para las células espermatozoides teñidas con 1000 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en TCA que contiene 10 mM de piruvato y luego diluido 1 a 3 con TCA que contenga 10 mM de piruvato o con un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2. La figura 16 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 13 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de las células espermatozoides para las células espermatozoides teñidas con 1000 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en (1) TCA que contiene 10 mM de piruvato y diluido 1 a 3 con el mismo o (2) un regulador de pH con base de carbonato a pH 7.3 y diluido 1 a 3 con un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2. La figura 17 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 13 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de las células espermatozoides para loas células espermatozoides teñidas con 1000 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 28°C en TCA que contiene 10 mM de piruvato o en un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2. La figura 18 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 14 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de las células espermatozoides para las células espermatozoides teñidas con 300 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en TCA que contiene 10 mM de piruvato y luego diluido 1 a 3 con TCA que contiene 10 mM de piruvato o un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2. La figura 19 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 14 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de las células espermatozoides para las células espermatozoides teñidas con 300 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en (1) TCA que contiene 10 mM de piruvato y diluido 1 a 3 con el mismo o (2) un regulador de pH con base de carbonato a pH 7.3 y diluido 1 a 3 con un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2. La figura 20 ilustra gráficamente los resultados del estudio llevado a cabo en el ejemplo 14 en el cual se mide la motilidad progresiva porcentual de loas células espermatozoides para las células espermatozoides teñidas con 300 µ? de pigmento Hoechst 33342 a 41 °C en TCA que contiene 10 mM de piruvato o en un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se ha determinado, con sorpresa, que los espermatozoides en contacto con una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción ¡ntracelular y/o extracelularmente tienden a tener una mayor capacidad para resistir los diversos pasos del procedimiento, habitualmente asociados a la clasificación de células espermatozoides en una población enriquecida de espermatozoides con cromosomas X o Y. Por lo tanto, en una modalidad preferida, las poblaciones de espermatozoides enriquecidas por sexo que tienen una mayor cantidad de células viables o una mayor cantidad de espermatozoides móviles, en particular espermatozoides progresivamente móviles, en una composición después de la tinción o después de la clasificación, pueden estar preparadas para la inseminación artificial. En general, una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente es una composición que contiene un componente que puede transferir electrones de una sustancia a otra. Tal composición puede contener un componente que gana o atrapa electrones (un agente oxidante o aceptor de electrones) o un componente que dona los electrones (un agente reductor o donador de electrones). En lo que se refiere a los sistemas biológicos, una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente se entiende más fácilmente como una composición que agrega o elimina un oxígeno o hidrógeno de un compuesto. Por consiguiente, en general tal composición puede contener, por ejemplo, piruvato, vitamina K, ácido lipoico, glutatión, flavinas, quinonas, superóxido dismutasa (SOD) y modelos de SOD. Tal composición puede estar presente en la suspensión de espermatozoides en una concentración suficiente para efectuar el efecto protector sin afectar perjudicialmente la salud de los espermatozoides. Las escalas de concentración de ejemplo incluyen de aproximadamente 10µ? a aproximadamente 50 mM según factores como la composición particular que se esté usando o la concentración de espermatozoides en la suspensión. Por ejemplo, si se incluye piruvato en la composición, puede estar presente en la suspensión de espermatozoides en una concentración entre aproximadamente 0.5µ? y aproximadamente 50 mM, preferentemente entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 40 mM, más preferentemente entre aproximadamente 2.5 mM y aproximadamente 25 mM, aun más preferentemente entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 20 mM, incluso aun más preferentemente de aproximadamente 15 mM y mejor aun aproximadamente 10 mM. Si se incluye vitamina K en la composición, puede estar presente en la suspensión de espermatozoides en una concentración entre aproximadamente 1 µ? y aproximadamente 100 µ?, preferentemente entre aproximadamente 10 µ? y aproximadamente 100 µ?, más preferentemente entre aproximadamente 50 µ? y aproximadamente 100 µ? y mejor aun de aproximadamente 100 µ?. Si se incluye ácido lipoico en la composición, puede estar presente en la suspensión de espermatozoides en una concentración entre aproximadamente 0.1 mM y aproximadamente 1 mM, preferentemente entre aproximadamente 0.5 mM y aproximadamente 1 mM, más preferentemente de aproximadamente 0.5 mM y mejor aun de aproximadamente 1 mM. La suspensión de espermatozoides puede contener cualquiera de las modalidades de la composición arriba enumeradas o cualquier combinación de las mismas en las concentraciones arriba enumeradas. Por ejemplo, la suspensión de espermatozoides puede contener una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente que contenga piruvato en una concentración de aproximadamente 10 mM y vitamina k en una concentración de aproximadamente 100 µ?. De modo alternativo, la suspensión de espermatozoides puede contener una composición que contenga piruvato en una concentración de aproximadamente 10 mM y ácido lipoico en una concentración de aproximadamente 1 mM. Otro ejemplo incluye una suspensión de espermatozoides que contenga una composición que contenga piruvato en una concentración de aproximadamente 10 mM, vitamina K en una concentración de aproximadamente 100 µ? y ácido lipoico en una concentración de aproximadamente 1 mM. En general, una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente puede proporcionar un efecto protector tal como un aumento en la cantidad de células viables o un aumento en la cantidad de células móviles, en particular de células progresivamente móviles, en la suspensión de espermatozoides que contiene la composición. Mientras tal composición proporciona un efecto protector a cualquier suspensión formada en el procedimiento de clasificación de células espermatozoides, el beneficio es de valor particular durante el paso de tinción, donde tal composición puede ayudar a mantener la viabilidad de los espermatozoides a temperaturas elevadas de tinción, a concentraciones elevadas de tinción, a mayores periodos de tinción, o cualquier combinación de los mismos.

En general, el procedimiento de clasificación de células comprende una serie de pasos discretos, es decir, la recolección de una muestra de células, la tinción de las células, la clasificación de las células, la recolección de las células separadas y, opcionalmente, la crioextensión de las células clasificadas. Resulta ventajoso que la composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente se pueda incluir en las suspensiones de espermatozoides formadas o empleadas en uno o más de estos pasos.

Recolección de la muestra de células Las células espermatozoides intactas y viables de bovinos, porcinos, equinos o de otro mamífero, se pueden recoger y poner en contacto con el inhibidor de motilidad. Se conocen diversos métodos de recolección de espermatozoides viables e incluyen, por ejemplo, el método de mano enguantada, el uso de una vagina artificial y la electroeyaculación. Como ejemplo, una muestra de semen bovino, que normalmente contiene aproximadamente entre 0.5 y 10 mil millones de espermatozoides por mililitro, se puede recoger directamente del mamífero fuente en un recipiente que contenga una composición que regule las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente para formar una suspensión de espermatozoides. De modo alternativo, la muestra de semen puede recogerse en un recipiente vacío y posteriormente ponerse en contacto con dicha composición hasta varias horas después de la recolección para formar la suspensión de espermatozoides. La muestra de espermatozoides también puede combinarse con un regulador de pH (en forma de sólido o en solución) para formar una suspensión de espermatozoides regulada. Entre otras cosas, el regulador de pH puede mejorar la viabilidad de los espermatozoides al regular la suspensión contra los cambios significativos en el pH o la presión osmótica. En general, un regulador de pH no es tóxico para las células y es compatible con el pigmento usado para teñir las células. Los reguladores de pH de ejemplo incluyen fosfatos, difosfatos, citratos, acetatos, lactatos y combinaciones de éstos. Los reguladores de pH actualmente preferidos incluyen TCA, TEST, citrato de sodio, HEPES, TL, TES, ácido cítrico monohidratado, HEPEST (Gradipore, St. Louis, MO), PBS (Jonson et al., Gamete Research, 17:203-212 (1987)), y PBS de Dulbecco (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Se puede combinar uno o más reguladores de pH juntos o con aditivos según se trata más adelante para formar una solución regulada, y la solución regulada combinada con la muestra de espermatozoides para formar una suspensión de espermatozoides regulada. Una solución regulada también puede contener uno o más aditivos, según se describe en detalle más adelante, o una composición que regule las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente. Las soluciones reguladas de ejemplo se describen en el cuadro I. Las soluciones reguladas preferidas incluyen una solución que contiene 3% de base de TRIS, 2% de ácido cítrico monohidratado y 1 % de fructosa (p/v) en agua a un pH de aproximadamente 7.0, una solución designada como TCA N°1 en el cuadro I y una solución designada como TCA N°2 en el cuadro I.

CUADRO I Soluciones reguladas La cantidad de regulador de pH empleado depende en general de varias consideraciones, por ejemplo, el regulador de pH particular y la concentración de espermatozoides deseada (cantidad de espermatozoides/ml) en la suspensión de espermatozoides regulada. Por consiguiente, se usará una cantidad suficiente de regulador de pH de manera tal que se logre la concentración de espermatozoides/ml deseada. Se puede agregar un regulador de pH para lograr una suspensión de espermatozoides que contenga entre aproximadamente 1 X 103 espermatozoides/ml a aproximadamente 5 X 1010 espermatozoides/ml. Por ejemplo, en una modalidad se puede agregar un regulador de pH para lograr una concentración "relativamente baja" de espermatozoides en la suspensión de espermatozoides, es decir, el regulador de pH se agrega para lograr una suspensión de espermatozoides que contenga menos de aproximadamente 1 X 107 espermatozoides/ml, preferentemente menos de aproximadamente 1 X 106 espermatozoides/ml, más preferentemente entre aproximadamente 1 X 03 y aproximadamente 5 X 06 espermatozoides/ml, aun más preferentemente entre aproximadamente 1 X 103 y aproximadamente 1 X 106 espermatozoides/ml, aun más preferentemente entre aproximadamente 1 X 104 y aproximadamente 1 X 105 espermatozoides/ml, y mejor aun de aproximadamente 1 X 105 espermatozoides/ml. En una modalidad alternativa, se puede agregar el regulador de pH para lograr una concentración "intermedia" de espermatozoides en la suspensión de espermatozoides, es decir, el regulador de pH se agrega para lograr una suspensión de espermatozoides que contenga entre aproximadamente 1 X 107 y aproximadamente 1 X 108 espermatozoides/ml. En otra modalidad alternativa, se puede agregar el regulador de pH para lograr una concentración "relativamente alta" de espermatozoides en la suspensión de espermatozoides, es decir, el regulador de pH se agrega para lograr una suspensión de espermatozoides que contenga más de aproximadamente 1 X 108 espermatozoides/ml, preferentemente entre aproximadamente 1 X 108 y aproximadamente 5 X 1010 espermatozoides/ml, más preferentemente entre aproximadamente 1.5 X 108 y aproximadamente 2 X 1010 espermatozoides/ml, aun más preferentemente entre aproximadamente 1.5 X 08 y aproximadamente 2 X 108 espermatozoides/ml, y mejor aun de aproximadamente 1.5 X 08 espermatozoides/ml. Una consideración adicional para determinar la cantidad de regulador de pH a emplear, es decir, si la suspensión de espermatozoides regulada tendrá una concentración de espermatozoides "relativamente baja,", "intermedia," o "relativamente alta" en la suspensión de espermatozoides, incluye el método mediante el cual posteriormente se clasificarán o enriquecerán los espermatozoides. Por ejemplo, se puede clasificar las células espermatozoides mediante citometría de flujo según se describe más detalladamente a continuación. En tal caso, la suspensión de espermatozoides regulada puede tener habitualmente una concentración de espermatozoides/ml "intermedia" o "relativamente alta". Otras técnicas de clasificación o de enriquecimiento pueden aprovechar una concentración menor de células espermatozoides, tal como una concentración de células espermatozoides "relativamente baja", etiquetadas con un marcador, como por ejemplo los pigmentos y las etiquetas descritas aquí. De modo alternativo, los espermatozoides pueden combinarse con un regulador de pH inhibitorio para formar una suspensión de espermatozoides inhibidos. Los reguladores de pH inhibitorios hacen que las células espermatozoides emulen células espermatozoides del epidídimo de un mamífero, como por ejemplo un toro, al simular el ambiente del líquido del epidídimo o conducto epididimario del mamífero. Tal regulador de pH reduciría o inhibiría la motilidad o la actividad metabólica del espermatozoide. Entre los ejemplos de reguladores de pH de esta clase se incluyen reguladores de pH con base de carbonato, tales como por ejemplo los descritos en Saiisbury & Graves, J. Reprod. Fértil., 6:351-359 (1963). Un regulador de pH de elección de este tipo contiene 0.204 g de NaHC03, 0.433 g de KHC03 y 0.473 g de C6H807 H20 cada 25 mi de agua purificada (0.097 moles/1 de NaHC03i 0.173 moles/l de KHC03, 0.090 moles/l C6H807 H20 en agua). Además, la suspensión de espermatozoides inhibida también puede contener una composición que regule las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente. Además de un regulador de pH, la suspensión de espermatozoides también puede contener diversos aditivos para mejorar la viabilidad o motilidad de los espermatozoides o para proporcionar otros beneficios. Los ejemplos de aditivos incluyen fuentes de energía, fuentes de las proteínas y antibióticos. Uno o más de estos aditivos pueden introducirse en el regulador de pH o en la solución regulada antes de la formación de la suspensión de espermatozoides regulada o, de modo alternativo, pueden introducirse por separado en la suspensión de espermatozoides. Se pueden agregar una o más fuentes de energía para reducir al mínimo o inhibir que las células espermatozoides oxiden los fosfolípidos intracelulares y otros componentes celulares. Los ejemplos de fuentes de energía incluyen monosacáridos, como la fructosa, glucosa, galactosa y mañosa, y disacáridos, como la sacarosa, lactosa, maltosa y trehalosa, así como otros polisacáridos. Por ejemplo, la suspensión de espermatozoides resultante puede incluir de aproximadamente 1 % (p/v) a aproximadamente 4% (p/v) de la(s) fuente(s) de energía. Si se incluye, la fuente de energía preferentemente es fructosa y la suspensión de espermatozoides contiene aproximadamente 2.5% (p/v). Para reducir al mínimo el choque de dilución, proporcionar soporte a las células, o dispersar las células en toda la suspensión, también se puede incluir una fuente de proteínas en el regulador de pH, solución regulada, suspensión de espermatozoides, o suspensión de espermatozoides regulada. Las fuentes de proteínas ejemplares incluyen yema de huevo, extracto de yema de huevo, leche (incluida homogeneizada por calor y descremada), extracto de leche, proteína de soja, extracto proteico de soja, albúmina sérica, albúmina sérica bovina, suplemento sustituto de suero humano y combinaciones de estos. La albúmina, y particularmente la albúmina sérica bovina (BSA), es una fuente de proteínas preferida. Por ejemplo, sí se incluye, la BSA puede estar presente en la suspensión de espermatozoides en una cantidad de menos de aproximadamente un 5.0% (p/v), preferentemente menos de aproximadamente un 2% (p/v), más preferentemente menos de aproximadamente un 1 % (p/v), y mejor aun en una cantidad de aproximadamente un 0.1 % (p/v). El uso de una fuente de proteínas, tal como la BSA, puede iniciar por sí misma el procedimiento d capacitación en un porcentaje de las células espermatozoides en la suspensión. Es preferible que este procedimiento tenga lugar en el conducto reproductor femenino. Por consiguiente, para inhibir la iniciación de la capacitación durante la dilución, así como durante la tinción y clasificación posterior, se puede incluir una fuente de proteínas alternativa o un sustituto proteico en la suspensión de espermatozoides. La fuente de proteínas o el sustituto proteico alternativo poseen los efectos ventajosos de una fuente de proteínas característica, tal como la BSA, además de la capacidad para inhibir el inicio de la capacitación en un porcentaje mayor de las células en la suspensión de espermatozoides. Los ejemplos de fuentes alternativas de proteínas incluyen suplemento sustituto de suero humano (SSS) (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) y BSA mejorada con colesterol, mientras que un ejemplo de sustitutos proteicos incluye un alcohol polivinílico, como por ejemplo, un alcohol polivinílico de viscosidad baja a media, en general de un peso molecular de entre aproximadamente 30,000 y aproximadamente 60,000. En general, si se incluyen, estas composiciones estarán presentes en las mismas cantidades antes descritas respecto a la BSA, con el contenido total de albúmina del regulador de pH o de la solución regulada generalmente por debajo de aproximadamente 5.0% (p/v). Se puede agregar un antibiótico a la suspensión de espermatozoides o a la suspensión de espermatozoides regulada para inhibir el crecimiento bacteriano. Los ejemplos de antibióticos incluyen, por ejemplo, tilosina, gentamicina, lincomicina, espectinomicina, Linco-Spectin® (clorhidrato de lincomicina-espectinomicina), penicilina, estreptomicina, ticarcilina, o cualquier combinación de estos. Los antibióticos pueden estar presentes en una concentración de entre aproximadamente 50 pg y aproximadamente 800 pg por mi de semen, independientemente de si el semen está puro, regulado o contiene sustancias adicionales, como por ejemplo, cualquiera de los aditivos mencionados aquí. Los Servicios de Semen Certificados (CSS) y la Asociación Nacional de Criadores de Animales (NAAB) han promulgado las pautas con respecto al uso de antibióticos en lo que se refiere a la recolección y el uso de espermatozoides.

Tinción de las células Se puede usar una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente en el procedimiento de tinción de las células. En general, un procedimiento de tinción de células espermatozoides puede comprender la formación de una mezcla de tinción, a veces denominada mezcla de etiquetado, que contiene células espermatozoides viables e intactas, una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente y un pigmento, a veces denominado etiqueta. En este aspecto de la invención, la composición puede ponerse en contacto con las células espermatozoides para formar una suspensión de espermatozoides, y luego se pone la suspensión en contacto con un pigmento selectivo para ADN. En esta modalidad, la fuente de espermatozoides puede ser el semen puro, o de modo alternativo, un derivado de semen que contenga espermatozoides obtenido mediante centrifugación o el uso de otros medios para separar el semen en fracciones. Una vez obtenidas, las células espermatozoides se pueden introducir en la mezcla de tinción en forma de semen puro o en forma de una suspensión derivada, por ejemplo, una suspensión de espermatozoides o una suspensión de espermatozoides regulada como ya se discutió respecto a la recolección de la muestra de células. El pigmento puede estar en forma de un sólido puro o una composición líquida. El pigmento también puede estar disuelto o disperso en un líquido no regulado para formar una solución de pigmento. De modo alternativo, el pigmento puede estar en forma de suspensión de pigmento que contenga un pigmento y un regulador de pH o solución regulada que sea biológicamente compatible con las células espermatozoides. Ya se discutió previamente una variedad de ejemplos de regulador de pH y soluciones reguladas en lo que refiere a la recolección de muestras. Por ejemplo, entre los reguladores de pH que pueden usarse se encuentra una solución regulada TCA que contiene 3% de TRIS base, 2% de ácido cítrico monohidratado y 1 % de fructosa en agua a un pH de aproximadamente 7.0, o una solución regulada con base en carbonato que contiene 0.204 g de NaHC03, 0.433 g de KHC03, y 0.473 g de C6H807 H20 cada 25 mi del agua purificada (0.097 moles/l de NaHCO3, 0.173 moles/l de KHCO3, 0.090 moles/l C6H8O7 H20 en agua). Por lo tanto, por ejemplo, una mezcla de tinción puede formarse al combinar el semen limpio con un pigmento y una composición que regule las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente. De manera alternativa, la mezcla de tinción puede formarse al combinar el semen puro con un regulador de pH o solución regulada, un pigmento y una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente. Además, la mezcla de tinción puede formarse al combinar una suspensión de espermatozoides con un pigmento. La mezcla de tinción puede formarse mediante uno o más pigmentos excitables con luz ultravioleta o visible, selectivos para ADN como se describieron previamente en la patente de los Estados Unidos No. 5,135,759 y WO 02/41906. Los ejemplos de pigmentos excitables con luz ultravioleta selectivos incluyen Hoechst 33342 y Hoechst 33258, cada uno de los cuales se puede comprar en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Los ejemplos de pigmentos excitables con luz visible incluyen SYBR-14, que se puede comprar en Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) y bisbenzimide-BODIPY® conjugado 6-{[3-((2Z)-2-{[1-(difluoroboril)-3,5-dimet¡l-1 H-pirrol-2-il]met¡len}-2H-pirrol-5-il)propanoil]amino}-A/-[3-(metil{3-[({4-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1 H,3'H-2,5,-bibencimidazol-2'-il]fenoxi}acetil)amino]propil}amino)propil]hexanamida ("BBC") descrito en WO 02/41906. Cada uno de estos pigmentos puede usarse solo o combinado; de modo alternativo, se pueden usar otros pigmentos excitables con luz ultravioleta y visible que penetren en la célula, solo o en combinación con los pigmentos ya mencionados, siempre que el pigmento no afecte perjudicialmente la viabilidad de las células espermatozoides a un grado inadmisible cuando se use en las concentraciones que permiten la separación según se describe en otro sitio. De manera alternativa, la mezcla de tinción puede formarse usando poliamidas fluorescentes, y más específicamente poliamidas con una etiqueta fluorescente o un indicador conjugado con ellas. Tales etiquetas emitirán fluorescencias cuando estén unidas a ácidos nucleicos. Los ejemplos de poliamidas con etiquetas fluorescentes o indicadores unidos a ellas incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en Best et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 100(21): 12063-12068 (2003); Gygi, et al., Nucleic Acids Res., 30(13): 2790-2799 (2002); patente de los EE.UU. N° 5,998,140; patente de los EE.UU. N° 6,143,901 ; y patente de los EE.UU. N° 6,090,947, cuyo contenido se incorpora aquí por referencia. También se pueden usar secuencias de nucleótidos fluorescentes para etiquetar las células espermatozoides. Dichas secuencias de nucleótidos emiten fluorescencia cuando se hibridan en un ácido nucleico que contenga una secuencia objetivo o complementaria, pero de lo contrario no son fluorescentes cuando se encuentran en un estado no hibridado. Tales oligonucléotidos se describen, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patentes de los Estados Unidos No. 2003/0113765 (por la presente incorporada aquí por referencia). Los anticuerpos específicos para sexo también se pueden usar para etiquetar los espermatozoides en una mezcla de tinción. En esta modalidad, por ejemplo, un anticuerpo específico para sexo puede conjugarse con una fracción fluorescente (o molécula reportera equivalente). Dado que el anticuerpo se une a los antígenos presentes sólo en una célula con cromosoma X o, de modo alternativo, con cromosoma Y, dichas células se pueden identificar de manera selectiva según su fluorescencia (frente a la no fluorescencia de una célula no etiquetada). Además, se pueden utilizar simultáneamente más de un anticuerpo específico para sexo, donde cada anticuerpo tiene una fracción fluorescente distinta unida. Esto permite diferenciar las células con cromosomas X y con cromosomas Y según la distinta fluorescencia de cada una. También se puede utilizar nanocristales luminiscentes selectivos al color para etiquetar las células espermatozoides en una mezcla de tinción. También llamadas puntos cuánticos, estas partículas son bien conocidas en la técnica como lo demuestran la patente de los Estados Unidos No. 6,322,901 y la patente de los Estados Unidos No. 6,576,291 , cada una de las cuales queda incorporada aquí por referencia. Estos nanocristales se han conjugado en varios materiales biológicos, incluyendo por ejemplo, péptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos, estreptavidina y polisacáridos, {ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N° 6,207,392; 6,423,551 ; 5,990,479. y 6,326,144, cada una de las cuales queda incorporada aquí por referencia) y se han usado para detectar blancos biológicos (ver, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N° 6,207,392 y 6,247,323, cada una de las cuales queda incorporada aquí por referencia). La concentración preferida de pigmento selectivo para ADN en la mezcla de tinción depende de una cantidad de variables que incluyen la permeabilidad de las células al pigmento seleccionado, la temperatura de la mezcla de tinción, el tiempo que se deja para la tinción y el grado de enriquecimiento deseado en el posterior paso de separación. En general, la concentración de pigmento debe ser preferentemente suficiente para lograr el grado deseado de tinción en un periodo razonablemente corto sin afectar sustancialmente de modo perjudicial la viabilidad de los espermatozoides. Por ejemplo, la concentración de Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR- 4, o BBC en la mezcla de tinción en general estará entre aproximadamente 0.1 µ? y aproximadamente 1.0 M, preferentemente entre aproximadamente 0.1 µ? y aproximadamente 700 µ? y más preferentemente entre aproximadamente 100 µ? y aproximadamente 200 µ?. En una modalidad particularmente preferida, la concentración de Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14, o BBC en la combinación de tinción en general estará entre aproximadamente 400 µ? y aproximadamente 500 pM y más preferentemente en aproximadamente 450 µ?. En consecuencia, en un conjunto de condiciones de tinción, la concentración de Hoechst 33342 es preferentemente de aproximadamente 100 pM. En otro conjunto de condiciones de tinción, la concentración de Hoechst 33342 es de aproximadamente 150 pM. En aun otro conjunto de condiciones de tinción, la concentración es preferentemente de aproximadamente 200 µ?. Bajo otro conjunto de condiciones de tinción, la concentración de Hoechst 33342 es más preferentemente de aproximadamente 450 µ?. Como otro ejemplo, la concentración de una poliamida fluorescente, como por ejemplo las descritas en la publicación de solicitud de los Estados Unidos N° 2001/0002314, se encontrará entre aproximadamente 0.1 µ? y aproximadamente 1 mM, preferentemente entre aproximadamente 1 pM y aproximadamente 1 mM, más preferentemente entre aproximadamente 5 µ? y aproximadamente 100 pM, e incluso más preferentemente en aproximadamente 10 pM. Además del regulador de pH, se pueden incluir otros aditivos en la mezcla de tinción para mejorar la viabilidad o motilidad de los espermatozoides; estos aditivos se pueden proporcionar como parte de la fuente de espermatozoides, la fuente de pigmento, o por separado a la mezcla de tinción. Tales aditivos incluyen fuentes de energía, antibióticos y plasma seminal, los primeros dos ya se trataron respecto a la recolección de la muestra de células, y el último se trata a continuación en lo que refiere a la recolección de las células separadas. Dichos aditivos se pueden agregar durante las técnicas de tinción en conformidad con éstas. La mezcla de tinción puede mantenerse a cualquiera de una variedad de temperaturas; habitualmente, estará entre aproximadamente 4°C y aproximadamente 50°C. Por ejemplo, la mezcla de tinción puede mantenerse a una temperatura "relativamente baja", es decir, a una temperatura entre aproximadamente 4°C y aproximadamente 30°C; en esta modalidad, la temperatura se encuentra preferentemente entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 30°C, más preferentemente entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 30°C y mejor aun a aproximadamente 28°C. De modo alternativo, la mezcla de tinción puede mantenerse en una escala de temperatura "intermedia", es decir, a una temperatura entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 39°C; en esta modalidad, la temperatura se encuentra preferentemente entre aproximadamente 34°C y aproximadamente 39°C y mejor aun a aproximadamente 37°C. Además, la mezcla de tinción puede mantenerse en una escala de temperatura "relativamente alta", es decir, una temperatura entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 50°C; en esta modalidad, la temperatura se encuentra preferentemente entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 45°C, más preferentemente entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 43°C y mejor aun a aproximadamente 41 °C. La selección de una temperatura preferida depende en general de una cantidad de variables, incluyendo por ejemplo, la permeabilidad de las células al o a los pigmentos usados, la concentración del o de los colorantes en la mezcla de tinción, el tiempo que se mantendrán las células en la mezcla de tinción y el grado de enriquecimiento deseado en el paso de separación. Se deja que las células espermatozoides incorporen el pigmento en la mezcla de tinción durante un periodo suficiente para obtener el grado deseado de tinción de ADN. Ese periodo es normalmente un periodo suficiente para que el colorante se una al ADN de las células espermatozoides de tal manera que loas células espermatozoides con cromosomas X e Y puedan clasificarse según la intensidad de fluorescencia diferente y medible entre ambos. En general, esto no será más de aproximadamente 160 minutos, preferentemente no más de aproximadamente 90 minutos, más preferentemente aun no más de aproximadamente 60 minutos y mejor aun entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 40 minutos. En consecuencia, en una modalidad, se forma una mezcla de tinción de manera que contenga células espermatozoides, un pigmento en una concentración entre aproximadamente 100 µ? y aproximadamente 200 µ y una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente, y la mezcla de tinción se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 41 °C. En otra modalidad, la composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente contiene piruvato en una concentración de aproximadamente 10 mM, vitamina K en una concentración de aproximadamente 100 µ , o ácido lipoico en una concentración de aproximadamente 1 mM. En otra modalidad, una mezcla de tinción se forma de manera que contenga células espermatozoides, un pigmento en una concentración entre aproximadamente 100 µ? y aproximadamente 200 µ? y una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente, y la mezcla de tinción se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 28°C. En otra modalidad, la composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente contiene piruvato en una concentración de aproximadamente 10 mM, vitamina K en una concentración de aproximadamente 100 µ?, o ácido lipoico en una concentración de aproximadamente 1 mM. En otro ejemplo, una mezcla de tinción se forma de manera que contiene células espermatozoides, un regulador de pH que contiene 0.204 g de NaHC03, 0.433 g de KHC03 y 0.473 g de C6H807-H20 por 25 mi del agua purificada (0.097 moles/1 de NaHC03, 0.173 moles/l de KHC03, 0.090 moles/l de C6H807-H20 en agua), un pigmento en una concentración entre aproximadamente 100 µ? y aproximadamente 200 µ? y una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente, y la mezcla de tinción se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 28°C. En otra modalidad, la mezcla de tinción se mantiene durante un periodo de tiempo a una temperatura de aproximadamente 41 °C. En otra modalidad adicional, la composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente contiene piruvato en una concentración de aproximadamente 10 mM, vitamina K en una concentración de aproximadamente 100 µ?, o ácido lipoico en una concentración de aproximadamente 1 mM.

Separación También se puede usar una composición que regula las reacciones de oxidación y reducción intracelular y/o extracelularmente durante la clasificación de las células espermatozoides. Por lo general, una vez que los espermatozoides se tiñen de acuerdo con la presente invención, se pueden clasificar mediante métodos conocidos que permitan la separación con base en la fluorescencia. Entre los métodos comúnmente usados y más conocidos están los sistemas de citometría de flujo, que se ejemplifican y describen en las patentes de los Estados Unidos N° 5,135,759, 5,985,216, 6,071 ,689, 6,149,867 y 6,263,745, publicaciones de patentes internacionales WO 99/33956 y WO 01/37655, la solicitud de patente de los Estados Unidos N° de serie 10/812,351 y la publicación de patente internacional correspondiente WO 2004/088283. De acuerdo con los métodos de citometría de flujo antes mencionados, las células teñidas se introducen como un fluido de muestra a la boquilla de un citómetro de flujo como se describe en la ilustración A. Por lo tanto, en una modalidad, el fluido de muestra puede contener las células espermatozoides teñidas y una composición que regula las reacciones de oxidación y reducción intracelular y/o extracelularmente. El fluido de muestra habitualmente está rodeado por un fluido envolvente. El fluido envolvente permite que las células espermatozoides que están en el fluido de muestra se dispongan en una fila única. El fluido envolvente se recoge junto con las células espermatozoides mediante el sistema de recolección del citómetro de flujo y por lo tanto forma parte del ambiente posterior a la clasificación de las células espermatozoides. De manera que, resulta deseable que el fluido envolvente proporcione un efecto protector para las células cuando las células estén en contacto con el fluido envolvente. En consecuencia, el fluido envolvente por lo general comprende un regulador de pH o solución regulada y una composición que regula las reacciones de oxidación y reducción intracelular y/o extracelularmente. Los ejemplos de reguladores de pH y soluciones reguladas y las concentraciones de ejemplo de las mismas que se pueden utilizar en el fluido envolvente ya se describieron respecto a la recolección y dilución de la muestra. En una modalidad particular, el fluido envolvente comprende 0.96% (p/v) de solución salina regulada con fosfato de Dulbecco; 0.1% (p/v) de BSA, en agua a un pH de aproximadamente 7.0. De forma opcional, el fluido envolvente puede también contener una gama de aditivos beneficiosos para la viabilidad y motilidad de los espermatozoides. Dichos aditivos incluyen, por ejemplo, una fuente de energía, una fuente de proteínas, un antibiótico y un alcohol polivinílico. Cada uno de esos aditivos y ejemplos de los mismos ya se discutieron respecto a la recolección de la muestra de células. Dichos aditivos se pueden agregar al fluido envolvente de acuerdo con eso. De manera opcional, el fluido envolvente se puede filtrar antes del paso de clasificación. Los contaminantes que pueden estar en el fluido envolvente, tales como partículas insolubles, pueden interferir con la clasificación. Por lo tanto, el fluido envolvente se puede filtrar antes de introducirlo en un citómetro de flujo. Dichos filtros y métodos para usarlos son bien conocidos en la técnica. Por lo general, el filtro es una membrana de entre aproximadamente 0.1 micrómetros y aproximadamente 0.5 micrómetros, preferentemente entre aproximadamente 0.2 micrómetros y aproximadamente 0.3 micrómetros más preferentemente aproximadamente 0.2 micrómetros. Las células teñidas se pueden introducir al fluido envolvente en cualquier momento después de la tinción. Habitualmente, se inyecta una corriente de células teñidas en el fluido de muestra en una corriente de fluido envolvente dentro de la boquilla del citómetro de flujo. Al inicio prácticamente no hay contacto entre el fluido de muestra y el fluido envolvente debido al flujo laminar de los fluidos como se discute más adelante con mayor detalle. Resulta deseable que el fluido de muestra y el fluido envolvente permanezcan en corrientes de flujo prácticamente separadas hasta después de que las partículas (por ejemplo, las células espermatozoides teñidas) que están en el fluido de muestra hayan sido analizadas. Sin embargo, en algún punto, el fluido envolvente y las células del fluido de muestra entran en contacto. Por ejemplo, en un citómetro de flujo que clasifica gotas (se discute más adelante), el fluido envolvente y el fluido de muestra comienzan a entrar en contacto entre sí a medida que se forman las gotas corriente abajo del sitio de interrogación. En el momento de introducir las células teñidas y el fluido envolvente, tanto las células teñidas como el fluido envolvente pueden estar a una temperatura entre aproximadamente 4°C y aproximadamente 50°C. El fluido envolvente y las células teñidas pueden estar a la misma temperatura o a temperaturas diferentes y cualquiera de las dos puede ser la temperatura mayor. En consecuencia, en una modalidad, al momento de introducir las células teñidas y el fluido envolvente, tanto las células como el fluido envolvente están a la misma temperatura; por ejemplo, a una temperatura "relativamente baja", tal como por ejemplo entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 8°C; a una temperatura "intermedia", tal como por ejemplo entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 30°C; o a una temperatura "relativamente alta", tal como por ejemplo, entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 43°C. En otra modalidad, las células teñidas están a una temperatura mayor que el fluido envolvente, tal como por ejemplo, las células están entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 43°C y el fluido envolvente está aproximadamente a temperatura ambiente o a aproximadamente 5°C. En otra modalidad adicional, las células teñidas están a una temperatura menor que el fluido envolvente.

Recolección de las células separadas Una vez clasificadas, las células separadas se recogen en un recipiente que contiene el fluido de recolección. En general, la finalidad del fluido de recolección incluye amortiguar el impacto de las células espermatozoides con el recipiente de recolección o proporcionar un soporte líquido para las células. En consecuencia, el fluido de recolección comprende una composición que regula las reacciones de oxidación y reducción intracelular y/o extracelularmente, un regulador de pH o solución regulada y una fuente de proteínas. Si se incluyen, los ejemplos de reguladores de pH y soluciones reguladas que se pueden utilizar en el fluido de recolección ya se describieron respecto a la recolección de las células de la muestra. Habitualmente, estos reguladores de pH o soluciones reguladas tendrán una concentración de entre aproximadamente 0.001 M y aproximadamente 1.0 M y tienen un pH entre aproximadamente 4.5 y aproximadamente 8.5, preferentemente entre aproximadamente 5.0 y aproximadamente 8.0, más preferentemente entre aproximadamente 5.5 y aproximadamente 7.5, aún más preferentemente entre aproximadamente 6.0 y aproximadamente 7.0, y mejor aun de aproximadamente 6.5. En una modalidad, el fluido de recolección contiene un regulador de pH que contiene una solución regulada PBS de Dulbecco a 0.96% (p/v) a un pH de aproximadamente 7.0. En otra modalidad, el fluido de recolección contiene un regulador de pH que contiene una solución regulada PBS de Dulbecco a 0.96% (p/v) a un pH de aproximadamente 6.5. En otra modalidad, el fluido de recolección contiene una solución regulada que contiene 0.204 g de NaHC03, 0.433 g de KHC03 y 0.473 g de C6W7 H20 cada 25 mi agua purificada (0.097 moles/1 de NaHC03, 0.173 moles/l de KHC03, 0.090 moles/l C6H807 H20 en agua). Si se incluye, la fuente de proteínas puede ser cualquier fuente de proteínas que no interfiera con la viabilidad de las células espermatozoides y que sea compatible con el regulador de pH o solución regulada particular que se haya usado. Son ejemplos de fuentes de proteínas la leche (incluida la homogeneizada por calor y descremada), el extracto de leche, la yema de huevo, el extracto de yema de huevo, la proteína de soja y el extracto de proteína de soja. Dichas proteínas se pueden usar en una concentración de entre aproximadamente 1% (v/v) y aproximadamente 30% (v/v), preferentemente entre aproximadamente 10% (v/v) y aproximadamente 20% (v/v), y más preferentemente de aproximadamente 10% (v/v). Aunque la leche se puede usar combinada con un regulador de pH o solución regulada, por lo general la leche se usa en ausencia de la misma ya que la leche es por sí misma una solución que puede cumplir los mismos fines que un regulador de pH y solución regulada. En tales ejemplos, el fluido de recolección puede contener entre aproximadamente 80% (v/v) y aproximadamente 90% (v/v) de leche.

Además de o en lugar de la fuente de proteínas, el fluido de recolección puede contener también plasma seminal. El plasma seminal tiene las dos ventajas de mejorar la viabilidad y motilidad de los espermatozoides y de estabilizar la membrana de los espermatozoides (y por ende evitar la capacitación durante la recolección y el almacenamiento de los espermatozoides). Maxwell et al., Reprod. Fert. Dev. (1998) 10: 433-440. El plasma seminal puede provenir del mismo mamífero de cual se obtuvo la muestra de semen, de otro mamífero de la misma especie o de un mamífero de otra especie. Si se incluye en el fluido de recolección, habitualmente el porcentaje de plasma seminal puede estar en la escala de entre aproximadamente 0.5% (v/v) y aproximadamente 10% (v/v). Si se usa combinado con una fuente de proteínas, como por ejemplo yema de huevo o leche, el porcentaje total de plasma seminal y la fuente de proteínas estará en la escala de entre aproximadamente 1 % (v/v) y aproximadamente 30% (v/v). En tales casos, el porcentaje de plasma seminal será inversamente proporcional al porcentaje de la fuente de proteínas. En consecuencia, en una modalidad, el fluido de recolección comprende plasma seminal. En otra modalidad, el fluido de recolección contiene plasma seminal en una cantidad de entre aproximadamente 0.5% (v/v) y aproximadamente 10% (v/v), preferentemente entre aproximadamente 4% (v/v) y aproximadamente 6% (v/v), y más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 5% (v/v). En otra modalidad, el fluido de recolección contiene una fuente de proteínas y plasma seminal. En otra modalidad adicional, el fluido de recolección comprende plasma seminal y yema de huevo, y el porcentaje total de ambos está entre aproximadamente 1 % (v/v) y aproximadamente 30% (v/v). De forma opcional, el fluido de recolección puede también contener una gama de aditivos beneficiosos para la viabilidad y motilidad de los espermatozoides. Entre los ejemplos de dichos aditivos se incluyen una fuente de energía y un antibiótico, cada uno de los cuales ya se discutió respecto a la recolección de las células de muestra. Dichos aditivos se pueden agregar al fluido de recolección de acuerdo con eso. En consecuencia, en cierta modalidad, el fluido de recolección comprende una composición que regula las reacciones de oxidación y reducción intracelular y/o extracelularmente, 0.96% (p/v) de solución salina regulada con fosfato de Dulbecco; 1 % (p/v) de fructosa, 10% (p/v) de yema de huevo en agua, a un pH de aproximadamente 7.0. En otra modalidad, la composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente comprende 10 mM de piruvato, 100 µ? de vitamina K, 1 mM de ácido lipoico, o cualquier combinación de ellos. De manera alternativa y en lugar de utilizar un fluido de recolección, las células clasificadas se pueden recoger en un recipiente que contenga o esté recubierto con un criodiluyente que se utilice en los pasos siguientes de crioconservación y que se describe en detalle más adelante. En consecuencia, en una modalidad particular, las células clasificadas se recogen en un criodiluyente. Por ejemplo, el criodiluyente puede contener agua, Triladyl (Minitube, Verona, Wl, que contiene glicerol, tris, ácido cítrico, fructosa, 5 mg/100 mi de tilosina, 25 mg/100 mi de gentamicina, 30 mg/100 mi de espectinomicina y 15 mg/100 mi de lincomicina), yema de huevo y una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente. En otra modalidad adicional, el criodiluyente comprende 25 g de Triladyl®, y 25 g de yema de huevo por cada 75 mi de agua y una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente. Se debe comprender que las concentraciones porcentuales de proteína en el fluido de recolección aquí descritas son las previas a la adición de células clasificadas mediante flujo. La adición de las células clasificadas por flujo puede diluir la concentración final del fluido de recolección hasta aproximadamente 1/20 de lo que eran antes de la adición de las células clasificadas por flujo. Por lo tanto, por ejemplo, el fluido de recolección puede contener inicialmente aproximadamente 10% (v/v) de yema de huevo. Después de recoger las células clasificadas por flujo en el recipiente de recolección que contiene el fluido de recolección, la concentración de yema de huevo se reducirá hasta aproximadamente 0.5% (v/v). De manera alternativa, la adición de las células clasificadas por flujo puede diluir la concentración final del fluido de recolección hasta aproximadamente 1/15 de lo que eran antes de la adición de las células clasificadas por flujo. Por lo tanto, por ejemplo, el fluido de recolección puede contener inicialmente aproximadamente 20% (v/v) de yema de huevo.

Después de recoger las células clasificadas por flujo en el recipiente de recolección que contiene el fluido de recolección, la concentración de yema de huevo se reducirá hasta aproximadamente 1.3% (v/v).

Crioextensión de las células separadas Una vez que los espermatozoides se han clasificado y recolectado en los recipientes de recolección, se pueden utilizar para inseminar hembras de mamíferos. Esto puede ocurrir casi de inmediato, lo que requiere poco tratamiento adicional para los espermatozoides. De la misma forma, los espermatozoides también pueden enfriarse o congelares para utilizarlos posteriormente. En tales casos, resulta ventajoso para los espermatozoides un tratamiento adicional para reducir al mínimo el impacto que podría tener el enfriado y congelado sobre la viabilidad o la motilidad posterior al descongelado. Por lo general, un criodiluyente contiene un regulador de pH o solución regulada, una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente, una fuente de proteínas y un crioprotector. Los ejemplos de reguladores de pH y soluciones reguladas que se pueden usar en el criodiluyente ya se describieron respecto a la recolección y dilución de la muestra. Habitualmente, estos reguladores de pH estarán en una concentración de entre aproximadamente 0.001 M y aproximadamente 1.0 y tendrán un pH de entre aproximadamente 4.5 y aproximadamente 8.5, preferentemente de aproximadamente 7.0.

En caso de incluirse, se puede agregar una fuente de proteínas, para proporcionar soporte a las células. La fuente de proteínas puede ser cualquier fuente de proteínas que no interfiera con la viabilidad de las células espermatozoides y que sea compatible con el regulador de pH o solución regulada particular que se haya usado. Son ejemplos de fuentes de proteínas la leche (incluida la homogeneizada por calor y descremada), el extracto de leche, la yema de huevo, el extracto de yema de huevo, la proteína de soja y el extracto de proteína de soja. Dichas proteínas pueden estar en una concentración de entre aproximadamente 10% (v/v) y aproximadamente 30% (v/v), preferentemente entre aproximadamente 10% (v/v) y aproximadamente 20% (v/v), y más preferentemente de aproximadamente 20% (v/v). Aunque la leche se puede usar combinada con un regulador de pH o solución regulada, por lo general la leche se usa en ausencia de la misma ya que la leche es por sí misma una solución que puede cumplir los mismos fines que una solución regulada. En tales ejemplos, el criodiluyente puede contener entre aproximadamente 80% (v/v) y aproximadamente 90% (v/v) de leche. Es preferible incluir un crioprotector en el criodiluyente para disminuir o evitar el choque de frío o para mantener la fertilidad de los espermatozoides. Se conocen muchos crioprotectores en el área. La selección de un crioprotector adecuado para usar con un diluyente dado puede variar y depende de la especie de la cual se obtuvieron los espermatozoides que se van a congelar. Son ejemplos de crioprotectores adecuados, por ejemplo, el glicerol, el dimetil sulfóxido, el etilenglicol el propilenglicol, la trehalosa, el Triladyl® y combinaciones de ellos. Si se incluyen, por lo general, estos crioprotectores están presentes en una cantidad de entre aproximadamente 1 % (v/v) y aproximadamente 15% (v/v), preferentemente en una cantidad entre aproximadamente 5% (v/v) y aproximadamente 10% (v/v), más preferentemente en una cantidad de aproximadamente 7% (v/v), y más preferentemente aun en una cantidad de aproximadamente 6% (v/v). En una modalidad particular, el criodiluyente contiene agua, Triladyl®, yema de huevo y una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente. En otra modalidad adicional, el criodiluyente contiene 25 g de Triladyl®, y 25 g de yema de huevo por cada 75 mi de agua, y una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente. De forma opcional, el criodiluyente puede también contener una gama de aditivos beneficiosos para la viabilidad y motilidad de los espermatozoides y que evitan o disminuyen los efectos secundarios perjudiciales de la criop reservación. Dichos aditivos pueden incluir, por ejemplo, una fuente de energía o un antibiótico, cada uno de los cuales ya se discutió respecto a la recolección y dilución de la muestra. Dichos aditivos se pueden agregar al criodiluyente de acuerdo con eso.

Una vez descrita la invención en detalle, resultará evidente que las modificaciones y variaciones son posibles sin apartarse del alcance de la invención definido en las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan para ilustrar la invención actual.

EJEMPL0 1 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y la muestra se diluyó en 2 partes de regulador de pH de carbonato para transportar a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la motilidad y la motilidad progresiva mediante el analizador de motilidad de Hamilton-Thom (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración de semen se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 106 espermatozoides/ml mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión de la pella en regulador de pH TCA, pH 7.3 a 41 °C. Se preparó 1 mi adicional de 150 X 106 espermatozoides/ml mediante la suspensión de una alícuota de semen en regulador de pH TCA a 41 °C que contenía piruvato 10 mM a pH 7.3. A las suspensiones de espermatozoides se agregaron alícuotas de una solución 0 mM de Hoechst en agua para dar una concentración de pigmento de 400 µ? Hoechst. Las suspensiones de espermatozoides se mantuvieron a 41 °C en un baño de agua durante todo el periodo de tinción. Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 µL· de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 µ? del mismo regulador de pH a la misma temperatura y analizando mediante el IVOS para medir el % de motilidad progresiva (% Prog Mot). Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la figura 1.

EJEMPLO 2 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el ejemplo 1 con la siguiente excepción. El regulador de pH utilizado para suspender los espermatozoides para teñir y analizar con el IVOS fue TCA y TCA con 10 µ? de vitamina K. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la figura 2.

EJEMPLO 3 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el ejemplo 1 con la siguiente excepción. El regulador de pH utilizado para suspender los espermatozoides para teñir y analizar con el IVOS fue TCA y TCA con 10 µ? de vitamina K. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la figura 3.

EJEMPLO 4 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el ejemplo 1 con la siguiente excepción. Los reguladores de pH utilizados para suspender los espermatozoides para teñir y analizar con el IVOS fueron TCA y TCA con 1 mM de ácido lipoico. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la figura 4.

EJEMPLO 5 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y la muestra se diluyó en 2 partes de regulador de pH de carbonato para transportar a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la motilidad y la motilidad progresiva mediante el analizador de motilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración de semen se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 06 espermatozoides/ml mediante centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión del precipitado en regulador de pH TCA, pH 7.3 a 28°C. Se preparó 1 mi adicional de 150 X 106 espermatozoides/ml mediante la suspensión de una alícuota de semen en regulador de pH TCA a 28°C que contenía piruvato 0 mM a pH 7.3. A las suspensiones de espermatozoides se agregaron alícuotas de una solución 10 mM de Hoechst en agua para dar una concentración de pigmento de 600 µ? Hoechst. Las suspensiones de espermatozoides se mantuvieron a 28°C en un baño de agua durante todo el periodo de tinción. Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 µ? de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 ? del mismo regulador de pH a la misma temperatura y analizando mediante el IVOS para medir la motilidad progresiva porcentual (% Prog Mot). Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la figura 5.

EJEMPLO 6 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el Ejemplo 5 con la siguiente excepción. El regulador de pH utilizado para suspender los espermatozoides para teñir y analizar con el IVOS fue TCA y TCA con 100 µ? de vitamina K. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la figura 6.

EJEMPLO 7 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el ejemplo 5 con la siguiente excepción. Los reguladores de pH utilizados para suspender los espermatozoides para teñir y analizar con el IVOS fueron TCA y TCA con 1 mM de ácido lipoico. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la figura 7.

EJEMPLO 8 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y la muestra se diluyó en 2 partes de regulador de pH de carbonato para transportar a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la motilidad y la motilidad progresiva mediante el analizador de motilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración de semen se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 106 espermatozoides/ml mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión del precipitado en 1 mi de regulador de pH TCA o en 1 mi de regulador de pH TCA con 2.5 mM, 10 mM, 25 mM o 50 mM piruvato. A las muestras se agregó una solución de MON33342 para dar concentraciones finales de pigmento de 600 µ?. Las suspensiones se incubaron a 28°C en un baño de agua. Las suspensiones de espermatozoides teñidos se analizaron retirando una alícuota de 50 µL· de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 µ? del mismo regulador de pH a la misma temperatura y analizando mediante el IVOS para medir la motilidad progresiva porcentual (% Prog Mot). Los resultados de IVOS de % Prog Mot se muestran en la figura 8.

EJEMPLO 9 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y la muestra se diluyó en 2 partes de regulador de pH de carbonato para transportar a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la motilidad y la motilidad progresiva mediante el analizador de motilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración de semen se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 106 espermatozoides/ml en regulador de pH TCA mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión de la pella en 1 mi de regulador de pH TCA. Se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 106 espermatozoides/ml en 10 mM piruvato en TCA mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión de la pella en 1 mi de piruvato 10 mM en regulador de pH TCA. A las muestras se agregó una solución de pigmento SYBR 14 para dar concentraciones finales de pigmento de 20 µ?. Las suspensiones se incubaron a 28°C en un baño de agua. Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 µ? de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 µL· del mismo regulador de pH a la misma temperatura y analizando mediante el IVOS para medir la motilidad progresiva porcentual (% Prog Mot). .Los resultados de IVOS de % Prog Mot se muestran en la figura 9.

EJEMPLO 10 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y la muestra se diluyó en 2 partes de regulador de pH de carbonato para transportar a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la motilidad y la motilidad progresiva mediante el analizador de motilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración de semen se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 106 espermatozoides/ml en regulador de pH TCA mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión de la pella en 1 mi de regulador de pH TCA. Se preparó 1 mi de una suspensión 150 X 06 espermatozoides/ml en 10 mM piruvato en TCA mediante la toma de una alícuota de la suspensión de espermatozoides en carbonato, centrifugación de la suspensión de espermatozoides a 500 X g durante 5 minutos, remoción del sobrenadante y resuspensión del precipitado en 1 mi de piruvato 10 mM en regulador de pH TCA. A las muestras se agregó una solución de BBC para dar concentraciones finales de pigmento de 100 µ?. Las suspensiones se incubaron a 28°C en un baño de agua. Las suspensiones de espermatozoides teñidos se analizaron retirando una alícuota de 50 µ? de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 pL del mismo regulador de pH a la misma temperatura y analizando mediante el IVOS para medir la motilidad progresiva porcentual (% Prog Mot). Los resultados de IVOS de % Prog Mot se muestran en la figura 10.

EJEMPLO 11 Las muestras de espermatozoides se obtuvieron y prepararon de la misma manera que en el ejemplo 10 con la siguiente excepción. La concentración de tinción fue 200 µ BBC. Los resultados del análisis mediante el IVOS se resumen en la figura 11.

EJEMPLO 12 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y se transportó a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la motilidad y la motilidad progresiva mediante el analizador de motilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theríogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración del semen se prepararon varios tubos de suspensiones de 150 X 106 espermatozoides/ml mediante la suspensión del semen en un regulador de pH TCA o en un inhibidor con base de carbonato. El cuadro I a continuación ilustra las composiciones y condiciones de teñido empleadas.

CUADRO I A las suspensiones de espermatozoides se agregaron alícuotas de una solución 10 mM de Hoechst en agua para dar una concentración de 600 µ? Hoechst. Las suspensiones de espermatozoides se mantuvieron a 28°C en un baño de agua durante todo el periodo de tinción (aproximadamente 1 hora). Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 µ? de la suspensión de teñido de espermatozoides, agregando 200 µ? piruvato 10 mM en TCA a pH 7.3 y 25°C para iniciar la reversión de la latencia, se dejaron al menos cinco minutos de tiempo de equilibrio y se analizaron mediante IVOS para medir la motilidad progresiva porcentual (% Prog Mot). Las comparaciones de las motilidades progresivas porcentuales se observan en las figuras 12-14.

EJEMPLO 13 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y se transportó a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la motilidad y la motilidad progresiva mediante el analizador de motilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración del semen se prepararon varios tubos de suspensiones de 450 X 106 espermatozoides/ml medíante la suspensión del semen en un regulador de pH TCA o bien en un inhibidor con base de carbonato. El cuadro II a continuación ilustra las composiciones y condiciones de teñido empleadas.

CUADRO II Nombre de la Composición pH Conc. De Temperatura muestra Hoechst (u ) <°C) 10 m pyr TCA 10 mM piruvato 7.3 1000 pM 28°C en TCA Carbonato 6.2 Inhibidor con 6.2 1000 pM 28°C base de carbonato, pH 6.2 Carbonato 7.3 Inhibidor con 7.3 000 pM 28°C base de carbonato, pH 7.3 A las suspensiones de espermatozoides se agregaron alícuotas de una solución 10 mM de Hoechst en agua para dar una concentración de 1000 µ? Hoechst. Las suspensiones de espermatozoides se mantuvieron en un baño de agua a 28°C durante 1 hora y luego se diluyeron hasta una concentración de 150X106 espermatozoides/ml con piruvato 10 mM en TCA o un inhibidor con base de carbonato a un pH 6.2 como se indica específicamente en cada figura para diluir hasta una concentración típica para clasificar. Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 pL de la suspensión de espermatozoides teñidos y diluidos al momento designado en cada figura y se agregaron 200 pL de piruvato 10 mM en TCA a pH 7.3 y 25°C para iniciar la reversión de la latencia, se dejaron al menos cinco minutos de tiempo de equilibrio y se analizaron mediante IVOS para medir la motilidad progresiva porcentual. Las comparaciones de las motilidades progresivas porcentuales se observan en las figuras 15-17.

EJEMPLO 14 Se recogió semen de toro de un toro sexualmente maduro mediante una vagina artificial y se transportó a 25°C en un recipiente de temperatura controlada hasta la instalación de teñido. Al recibir el semen, se le analizaron la concentración, la motilidad y la motilidad progresiva mediante el analizador de motilidad de Hamilton-Thorn (IVOS), de acuerdo con procedimientos estándar y bien conocidos (Farrell et al. Theriogenology, 49(4): 871-9 (Mar 1998)). Con base en la concentración del semen se prepararon varios tubos de suspensiones de 450 X 106 espermatozoides/ml mediante la suspensión del semen en un regulador de pH TCA o bien en un inhibidor con base de carbonato. El cuadro III a continuación ilustra las composiciones y condiciones de teñido empleadas.

CUADRO III A las suspensiones de espermatozoides se agregaron alícuotas de una solución 10 mM de Hoechst en agua para dar una concentración de 300 µ? Hoechst. Las suspensiones de espermatozoides se mantuvieron en un baño de agua a 41 °C durante 30 minutos y luego se diluyeron hasta una concentración de 150 X 106 espermatozoides/ml con piruvato 10 mM en TCA o un inhibidor con base de carbonato a pH 6.2 como se indica específicamente en cada figura para diluir hasta una concentración típica para clasificar. Las suspensiones de espermatozoides se analizaron retirando una alícuota de 50 pL de la suspensión de espermatozoides teñidos y diluidos al momento designado en cada figura y se agregaron 200 pL de piruvato 10 mM en TCA a pH 7.3 y 25°C para iniciar la reversión de la latencia, se dejaron al menos cinco minutos de tiempo de equilibrio y las alícuotas se analizaron mediante IVOS para medir la motilidad progresiva porcentual. Las comparaciones de las motilidades progresivas porcentuales se observan en las figuras 18-20.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una mezcla de tinción que contiene espermatozoides viables, una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente y un pigmento selectivo para ADN, la concentración de la composición en la mezcla de tinción siendo mayor que 50 µ? cuando la composición es piruvato. 2.- La mezcla de tinción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición se escoge del grupo compuesto por piruvato, vitamina K, ácido lipoico, glutatión, flavinas, quinonas, superóxido dismutasa, modelos de superóxido dismutasa y combinaciones de ellos. 3. - La mezcla de tinción de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la composición se escoge del grupo compuesto por piruvato, vitamina K, ácido lipoico y combinaciones de ellos. 4. - La mezcla de tinción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición contiene piruvato a una concentración que se escoge del grupo compuesto por aproximadamente 2.5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 25 mM y aproximadamente 50 mM. 5. - La mezcla de tinción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición contiene vitamina K a una concentración que se escoge del grupo compuesto por aproximadamente 10 µ?, aproximadamente 50 µ?, aproximadamente 75 µ? y aproximadamente 100 µ?. 6.- La mezcla de tinción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición contiene ácido lipoico a una concentración que se escoge del grupo compuesto por aproximadamente 0.1 mM, aproximadamente 0.5 mM, aproximadamente 0.75 mM, aproximadamente 1.0 mM y aproximadamente 1.5 mM. 7 - La mezcla de tinción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el pigmento selectivo para ADN es un pigmento fluorescente selectivo para ADN. 8.- La mezcla de tinción de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el pigmento selectivo para ADN es un pigmento fluorescente selectivo para ADN. 9.- La mezcla de tinción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el pigmento se puede excitar mediante luz UV o mediante luz visible. 10. - La mezcla de tinción de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el pigmento se puede excitar mediante luz UV o mediante luz visible. 1 1. - La mezcla de tinción de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el pigmento se elige del grupo compuesto por Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14 y bisbenzimide-BODIPY® conjugado 6-{[3-((2Z)-2-{[1 -(dif luoroboril)-3,5-dimetil-1 H-pirrol-2-il]metilen}-2H-pirrol-5-il)propanoil]amino}-A/-[3-(metil{3-[({4-[6-(4-metilp¡perazin-1-il)-1 H,3' -/- 2,5'-bibencimidazol-2'-il]fenox¡}acetil)amino]prop¡l}amino)propil]hexanamida. 12.- La mezcla de tinción de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el pigmento se elige del grupo compuesto por Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14 y bisbenzimide-BODIPY® conjugado 6-{[3-((2Z)-2-{[1-(difluoroboril)-3,5-dimetil- H-pirrol-2-il]metilen}-2/-/-pirrol-5-il)propanoil]amino}-N-[3-(metil{3-[({4-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1 H,3'H-2,5'-bibencimidazol-2,-¡l]fenoxi}acetil)amino]propil}amino)propil]hexanam¡da. 13.- Un procedimiento para teñir células espermatozoides, donde dicho procedimiento comprende formar una mezcla de tinción que contiene células espermatozoides viables intactas, una composición que regula las reacciones de oxidación/reducción intracelular y/o extracelularmente y un pigmento selectivo para ADN, la concentración de la composición en la mezcla de tinción siendo mayor que 50 µ? cuando la composición es piruvato. 14.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el pigmento selectivo para ADN se elige del grupo compuesto por Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14 y bisbenzimide-BODIPY® conjugado 6-{[3-((2Z)-2-{[1-(difluoroboril)-3,5-dimetil-1 H-pirrol-2-il]metilen}-2H-pirrol-5-il)propanoil]amino}-/V-[3-(metil{3-[({4-[6-(4-metilpiperazin-1-il)-1H,3'H-2,5'-bibencimidazol-2'-il]fenoxi}acetil)amino]prop¡I}amino)propil]hexanamida. 15. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la mezcla de tinción se somete a una temperatura de entre aproximadamente 4°C y aproximadamente 30C. 16. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la mezcla de tinción se somete a una temperatura de entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 39°C. 17. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la mezcla de tinción se somete a una temperatura de entre aproximadamente 40°C y aproximadamente 50°C. 18. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la composición contiene piruvato a una concentración que se escoge del grupo compuesto por aproximadamente 2.5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 25 mM y aproximadamente 50 mM. 19. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la composición contiene vitamina K a una concentración que se escoge del grupo compuesto por aproximadamente 10 µ?, aproximadamente 50 µ?, aproximadamente 75 µ? y aproximadamente 100 µ?. 20. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque la composición contiene ácido lipoico a una concentración que se escoge del grupo compuesto por aproximadamente 0.1 mM, aproximadamente 0.5 mM, aproximadamente aproximadamente 1.0 mM y aproximadamente 1.5 mM.