CN114459857B - 保持动物精子活力和动物精子凋亡测定的前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种保持动物精子活力的处理方法和动物精子凋亡测定的前处理方法。保持动物精子活力的处理方法包括：将剪碎的动物附睾在孵育液中进行孵育；孵育液为0.00125～0.01％牛血清白蛋白液和HEPES/NaOH缓冲液的结合液，pH值为7.2～7.7。动物精子凋亡测定的前处理方法包括：将前述孵育后的悬液过滤，取精子滤液；将精子滤液染色。保持动物精子活力的处理方法将离体的精子在合适的环境之中孵育处理，优化孵育液，减少孵育时间，使精子保持活力。应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定的前处理方法还包括有效缩短流式的前处理时间、不影响后续荧光标记与分析的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种保持动物精子活力的处理方法和应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定的前处理方法。
背景技术
在雄性生殖毒理学研究中，精子的活力是重要的观察指标，流式细胞术工作是在细胞分子水平上对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。利用流式细胞术检测动物精子活力是较为灵敏的检测方法，可以检测到精子的早期凋亡、机械性死亡、晚期凋亡情况，但在流式细胞仪分析的前处理过程中，离体的精子会由于温度、营养等原因迅速失去活力，较易死亡，不能很好作为生殖毒性的检测指标。所以对流式细胞仪分析精子活力的前处理方法优化非常有意义。
现有技术有关流式细胞仪分析精子活力的前处理方法有，Akarca-Dizakar SD,Peker T,et al.Effects of co-administered melatonin,fructose andbisphenol A(BPA)on rat epididymis and sperm characteristics[J].Biotechnic&Histochemistry,2020,95(1):18-26.使用0.5ml胰岛素注射器抽取附睾尾部的内容物，置于1ml洗涤/授精培养基(/> Plus；Fertil-Pro NV，Beernem，比利时)中，并在37℃下孵育20分钟，让精子游出。收集精子并转移到管中。精子用PBS洗涤。然后将精子重新悬浮在膜联蛋白结合缓冲液(eBiosciences，San Diego，CA)中。将5μl等分的FITC(BMS500FI/100；eBioscience)加入到195ml的细胞悬液中。然后涡旋细胞并在室温下孵育10分钟。再次洗涤细胞，重新悬浮在190μl结合缓冲液中，并在流式细胞术分析前立即加入10μl PI。使用FacsCalibur流式细胞仪(Becton-Dickinson,San Jose,CA)使用Cell QuestSoftware(Becton-Dickinson)分析样品，该技术的前处理时间较长，约为40-45min。
发明内容
本发明为克服现有技术中精子离体后在流式细胞仪分析的前处理过程中较为容易死亡，影响精子凋亡分析的缺陷，并且现有技术的前处理方法时间较长，提供一种保持动物精子活力的处理方法和一种应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定的前处理方法。本发明的保持动物精子活力的处理方法，将离体的精子在合适的环境之中孵育处理，优化孵育液，可减少孵育时间，使精子保持活力；本发明的应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定的前处理方法将离体的精子在合适的环境之中孵育处理，优化流式检测前的孵育液；减少前处理时间，在保持精子活力的同时不影响流式细胞仪的荧光标记与分析。
本发明提供一种保持动物精子活力的处理方法，其包括以下步骤：
将剪碎的动物附睾在孵育液中进行孵育即可；
其中，所述孵育液为0.00125％～0.01％牛血清白蛋白液和HEPES/NaOH缓冲液的结合液，pH值为7.2～7.7。
本发明中所述剪碎的动物附睾可通过本领域常规方法获得，较佳地通过下述步骤制得：将动物附睾解剖取出后，剪掉附睾尾后将其置于所述孵育液中，用提前预热的剪刀深入其中剪碎即可。
本发明中，所述孵育的条件可为本领域，较佳地为在37℃±1℃的环境中孵育2-5分钟。
本发明中，所述孵育液中的所述牛血清白蛋白液浓度较佳地为0.005％～0.009％。
本发明中，所述HEPES/NaOH的浓度较佳地为95～105mmol/L，例如100mmol/L。
本发明中，所述孵育液中的所述HEPES/NaOH缓冲液中，较佳地包含1.4mol/L NaCl与25mmol/L CaCl2。
本发明中，所述孵育液的pH值较佳地为7.3～7.6，更佳地为7.5。
本领域技术人员知晓，HEPES是一种非离子两性缓冲液,其在pH7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力。所以可专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。
本发明中，HEPES/NaOH缓冲液的主要成分为HEPES和NaOH的结合液。
本发明还公开了一种应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定的前处理方法其包括下述步骤：
S1将剪碎的动物附睾在孵育液中进行孵育；其中，所述孵育液为0.00125％～0.01％牛血清白蛋白液和HEPES/NaOH缓冲液的结合液，pH值为7.2～7.7；
S2将所述孵育后所得的悬液过滤，取精子滤液；
S3将过滤后的精子滤液染色即可。
S1中，所述剪碎的动物附睾可通过本领域常规方法获得，较佳地通过下述步骤制得：将动物附睾解剖取出后，剪掉附睾尾后将其置于所述孵育液中，用提前预热的剪刀深入其中剪碎即可。
S1中，所述孵育的条件可为本领域，较佳地为在37℃±1℃的环境中孵育2-5分钟。
S1中，所述孵育液中的所述牛血清白蛋白液浓度较佳地为0.005％～0.009％。
S1中，所述HEPES/NaOH的浓度较佳地为95～105mmol/L，例如100mmol/L。
S1中，所述孵育液中的所述HEPES/NaOH缓冲液中，较佳地包含1.4mol/L NaCl与25mmol/L CaCl2。
S1中，所述孵育液的pH值较佳地为7.3～7.6，更佳地为7.5。
本领域技术人员知晓，HEPES是一种非离子两性缓冲液,其在pH7.2-7.4范围内具有较好的缓冲能力。所以可专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。
S1中，HEPES/NaOH缓冲液的主要成分为HEPES和NaOH的结合液。
S2中，所述过滤的方式可为本领域常规。所述过滤时所采用的滤网的尺寸一般可使精子通过，并可最大程度过滤掉组织碎片即可，过滤时所采用的滤网的尺寸较佳地为40目。
S3中，所述染色的目的是为了后续在流式细胞仪中区分正常精子、凋亡早晚期精子和死精子。
S3中，所述染色的染料可为本领域常规，较佳地为FITC与PI。
S3中，所述染色的环境可为本领域常规，较佳地为37±1℃的避光环境。
S3中，所述染色时间可为本领域常规，较佳地为8～12分钟，例如10分钟。
S3中，所述染色后的所述精子滤液可应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定。
本领域技术人员知晓，所述FITC为异硫氰酸荧光素，所述PI是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明提供一种保持动物精子活力的处理方法，该方法将离体的精子在合适的环境之中孵育处理，优化孵育液，可减少孵育时间18-15min，使精子保持活力。
本发明提供一种应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定的前处理方法，该方法将离体的精子在合适的环境之中孵育处理，优化流式检测前的孵育液；本发明的前处理时间大概为20-25min，和背景技术中的前处理时间相比，有效缩短流式的前处理时间大约为15-20min，其中包括：1、减少孵育时间约为18-15min，2、可无离心步骤，减少离心时间约为5min-10min；本发明使精子在保持活力的同时不影响后续流式细胞仪的荧光标记与分析，综合形成一套应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定的前处理方法。
附图说明
图1空白组大鼠精子样本散点图。
图2 FITC单染组大鼠精子样本散点图。
图3 PI单染组大鼠精子样本散点图。
图4对比例1大鼠精子样本散点图。
图5实施例1大鼠精子样本散点图。
图6实施例2大鼠精子样本散点图。
图7实施例3大鼠精子样本散点图。
图8对比例2大鼠精子样本散点图。
图9对比例3大鼠精子样本散点图。
图10对比例4大鼠精子样本散点图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实验仪器
贝克曼流式细胞仪(贝克曼库尔特公司)
制备实施例
按照如下配比配置实施例1～3和对比例1～4的孵育液
实施例1的孵育液：0.01％牛血清白蛋白液，100mmol/L HEPES/NaOH,包含1.4mmol/L NaCl与25mmol/L CaCl2，PH7.5。
实施例2的孵育液：0.00125％牛血清白蛋白液，100mmol/L HEPES/NaOH,包含1.4mmol/L NaCl与25mmol/L CaCl2，PH7.5。
实施例3的孵育液：0.005％牛血清白蛋白液,100mmol/L HEPES/NaOH,包含1.4mmol/L NaCl与25mmol/L CaCl2，PH7.5。
对比例1的孵育液：100mmol/L HEPES/NaOH,包含1.4mol/L NaCl与25mmol/LCaCl2，PH7.5。
对比例2的孵育液：0.05％牛血清白蛋白液,100mmol/L HEPES/NaOH,包含1.4mmol/L NaCl与25mmol/L CaCl2，PH7.5。
对比例3的孵育液：0.5％牛血清白蛋白液,100mmol/L HEPES/NaOH,包含1.4mmol/L NaCl与25mmol/L CaCl2，PH7.5。
对比例4的孵育液：0.75％牛血清白蛋白液,100mmol/L HEPES/NaOH,包含1.4mmol/L NaCl与25mmol/L CaCl2，PH7.5。
按照以下步骤进行应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定前处理:
1.将大鼠附睾解剖取出后，剪掉附睾尾后将附睾尾一分为二分别置于实施例1～3的孵育液和对比例1～4的孵育液中，用提前预热的剪刀分别深入其中剪碎，将7种精子悬液孵在37℃的环境中孵育2-5分钟。
孵育完成后分别将精子悬液用40微米(目)的滤网过滤；
在实施例1的孵育液中孵育过滤得到的精子滤液作为样本1。在实施例2的孵育液中孵育过滤得到的精子滤液作为样本2。在实施例3的孵育液中孵育过滤得到的精子滤液作为样本3。在对比例1的孵育液中孵育过滤得到的精子滤液作为样本4，在对比例2的孵育液中孵育过滤得到的精子滤液作为样本5。在对比例3的孵育液中孵育过滤得到的精子滤液作为样本6。在对比例4的孵育液中孵育过滤得到的精子滤液作为样本7。
2.设置空白组、FITC单染组、PI单染组、实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4进行流式细胞仪分析(其中设置空白组、FITC单染组、PI单染组，用于调节荧光补偿，目的是保证样本图的准确)：
空白组：取样本1中的200μL精子滤液加入到贝克曼流式细胞仪的流式管中。
FITC单染组：取样本1中的200μL精子滤液加入到贝克曼流式细胞仪的流式管中，加入2ul FITC。
PI单染组：取样本1中的200μL精子悬液加入到贝克曼流式细胞仪的流式管中，加入4ul PI。
实施例1：取样本1中的200μL精子滤液，加入2ulFITC和4ulPI染料，在37℃下染色10分钟，并避光；再加入到贝克曼流式细胞仪的流式管中进行分析。
实施例2：取样本2中的200μL精子滤液，加入2ulFITC和4ulPI染料，在37℃下染色10分钟，并避光；再加入到贝克曼流式细胞仪的流式管中进行分析。
实施例3：取样本3中的200μL精子滤液，加入2ulFITC和4ulPI染料，在37℃下染色10分钟，并避光；再加入到贝克曼流式细胞仪的流式管中进行分析。
对比例1：取样本4中的200μL精子滤液，加入2ulFITC和4ulPI染料，在37℃下染色10分钟，并避光；再加入到贝克曼流式细胞仪的流式管中进行分析。
对比例2：取样本5中的200μL精子滤液，加入2ulFITC和4ulPI染料，在37℃下染色10分钟，并避光；再加入到贝克曼流式细胞仪的流式管中进行分析。
对比例3：取样本6中的200μL精子滤液，加入2ulFITC和4ulPI染料，在37℃下染色10分钟，并避光；再加入到贝克曼流式细胞仪的流式管中进行分析。
对比例4：取样本7中的200μL精子滤液，加入2ulFITC和4ulPI染料，在37℃下染色10分钟，并避光；再加入到贝克曼流式细胞仪的流式管中进行分析。
效果实施例
建立散点图(FSC\SSC)与四象限图(FL1H和FL2H)，调节电压与荧光补偿，至少分析10,000个细胞。
其中，FSC代表前向散射光，SSC代表侧向散射光。
其中，FL1-H代表染剂FITC所染到的细胞；FL2-H则代表PI染剂所染到的细胞。
空白组：该空白组未经过染色的步骤，调节各个荧光通道的电压，使精子都位于散点图的左下象限，其精子样本散点图见图1。
FITC单染组：调节各个荧光通道的电压，使精子都位于散点图的左下象限和右下象限，其精子样本散点图见图2。
PI单染组：调节各个荧光通道的电压，使精子都位于散点图的左上象限和左下象限，其精子样本散点图见图3。
对比例1：图4为对比例1的精子样本散点图，结果显示空白大鼠的正常精子较少，只有23％左右。横坐标FITC-A代表FITC通道，纵坐标PE-A代表PE通道，实际PI和PE公用一个通道，仪器只有PE选项，实际代表是PI染料。
实施例1：图5为实施例1的精子样本散点图，结果显示空白大鼠的正常精子达到了53％左右。横坐标FITC-A代表FITC通道，纵坐标PE-A代表PE通道，实际PI和PE公用一个通道，仪器只有PE选项，实际代表是PI染料。
实施例2：图6为实施例2的精子样本散点图，结果显示空白大鼠的正常精子达到了52％左右。横坐标FITC-A代表FITC通道，纵坐标PE-A代表PE通道，实际PI和PE公用一个通道，仪器只有PE选项，实际代表是PI染料。
实施例3：图7为实施例3的精子样本散点图，结果显示空白大鼠的正常精子达到了63％左右。横坐标FITC-A代表FITC通道，纵坐标PE-A代表PE通道，实际PI和PE公用一个通道，仪器只有PE选项，实际代表是PI染料。
对比例2：图8为对比例2的精子样本散点图，结果显示空白大鼠的正常精子仅有25％左右。横坐标FITC-A代表FITC通道，纵坐标PE-A代表PE通道，实际PI和PE公用一个通道，仪器只有PE选项，实际代表是PI染料。
对比例3：图9为对比例3的精子样本散点图，结果显示空白大鼠的正常精子仅有18％左右。横坐标FITC-A代表FITC通道，纵坐标PE-A代表PE通道，实际PI和PE公用一个通道，仪器只有PE选项，实际代表是PI染料。
对比例4：图10为对比例4的精子样本散点图，结果显示空白大鼠的正常精子仅有19％左右。横坐标FITC-A代表FITC通道，纵坐标PE-A代表PE通道，实际PI和PE公用一个通道，仪器只有PE选项，实际代表是PI染料。
Claims (10)
1.一种保持动物精子活力的处理方法，其特征在于，其包括以下步骤：
将剪碎的动物附睾在孵育液中进行孵育即可；
其中，所述孵育液为0.00125%~0.01%牛血清白蛋白液和HEPES/NaOH缓冲液的结合液，pH值为7.2~7.7；
所述孵育液中的所述HEPES/NaOH的浓度为95~105 mmol/L；所述HEPES/NaOH缓冲液包含1.4mol/L NaCl与25mmo/L CaCl2；
其中，所述的孵育的条件为在37℃±1℃的环境中孵育2-5分钟。
2.如权利要求1所述的保持动物精子活力的处理方法，其特征在于，所述剪碎的步骤为：将动物附睾解剖取出后，剪掉附睾尾后将其置于所述孵育液中，用提前预热的剪刀深入其中剪碎即可。
3.如权利要求1所述的保持动物精子活力的处理方法，其特征在于，所述孵育液中的所述牛血清白蛋白液浓度为0.005%~0.009%。
4. 如权利要求1所述的保持动物精子活力的处理方法，其特征在于，所述孵育液中的所述HEPES/NaOH的浓度为100 mmol/L。
5.如权利要求1所述的保持动物精子活力的处理方法，其特征在于，所述孵育液的pH值为7.3~7.6。
6.如权利要求5所述的保持动物精子活力的处理方法，其特征在于，所述孵育液的pH值为7.5。
7.一种应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定的前处理方法，其特征在于，其包括以下步骤：
S1 采用如权利要求1~6任一项所述的保持动物精子活力的处理方法制得孵育后悬液；
S2 将所述孵育后的悬液过滤，取精子滤液；
S3 将所述的精子滤液染色。
8.如权利要求7所述的应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定的前处理方法，其特征在于，所述过滤时采用的滤网的尺寸为40目。
9.如权利要求7所述的应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定的前处理方法，其特征在于，所述染色的环境为37±1℃的避光环境；所述染色的时间为8~12分钟。
10.如权利要求9所述的应用于流式细胞仪的动物精子凋亡测定的前处理方法，其特征在于，所述染色的时间为10分钟。
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| 利用流式细胞仪评价不同防冻液对猪冻融精子成活率及凋亡状况的影响;李新红等;《上海交通大学学报(农业科学版)》(第5期);第468-473页 * |
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