DE69938000T2

DE69938000T2 - System zur künstlichen nicht-chirurgischen besamung von pferden

Info

Publication number: DE69938000T2
Application number: DE69938000T
Authority: DE
Inventors: Edward L. Fort Collins SQUIRES; Patrick M. Fort Collins McCUE; George E. LaPorte SEIDEL
Original assignee: XY LLC
Current assignee: XY LLC
Priority date: 1998-07-30
Filing date: 1999-07-29
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2019-07-30
Also published as: EP2283848A1; US7772005B1; ATE488247T1; WO2000006193A1; DE69938000D1; NZ527659A; EP1917974B1; AR018234A1; EP1917974A1; AU5240899A; JP2002521043A; NZ509434A; ATE383869T1; BR9912539A; DK1100534T3; PT1100534E; DE69942959D1; EP1100534B1; HUP0103126A3; ES2296398T3

Description

I. TECHNISCHER BEREICH
Diese Erfindung bezieht allgemein auf den Bereich der künstlichen Besamung von Pferden (Equidae). Sie umfasst auch die künstliche Besamung von Pferden, wenn eine Geschlechtsauswahl bei den Spermien vorgenommen worden ist, um eine Pferdenachkommenschaft mit dem gewünschten Geschlecht herzustellen. Sie ist besonders in Situationen relevant, wo eine nicht chirurgische künstliche Besamung eines Pferds gewünscht ist und auch dort, wo eine künstliche Besamung eines Pferds mit einer geringen Dosis von praktischer Wichtigkeit ist.
II. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die künstliche Besamung von Pferdestuten ist seit vielen Jahren wichtig. Häufig ist sie chirurgisch bewerkstelligt worden. Bei Routinevorgängen, bei denen keine kleineren Spermadosierungen benötigt worden sind, wurde sie mittels künstlicher Besamung ohne eine Operation bewerkstelligt, wobei dies jedoch relativ hoher Spermienzahlen bedarf. Für die routinemäßige künstliche Besamung der Stute werden gewöhnlich 250–500 × 10⁶ progressiv motile Spermien (pms) empfohlen, mit denen eine Stute während des Östrus jeden zweiten Tag besamt wird, um eine maximale Fertilität zu erreichen. Unglücklicherweise, wenn Stuten mit dem Samen von einem hoch fertilen Hengst besamt werden, hat die Fertilität mit der Verminderung der Zahl der motilen Spermien abgenommen. Unter idealen Bedingungen ist eine Stute erfolgreich mit der geringen Zahl von 100 × 10⁶ pms, ohne das die Fertilität vermindert wurde, besamt worden, jedoch auch diese Zahl stellt eine Herausforderung dar. Die Besamung mit einer kleineren Spermienzahl ist notwendig, wenn nach dem Geschlecht sortierte Spermien und gefrorene und wieder aufgetaute Spermien mit einer beschränkten Quantität verwendet werden.
Die Vorauswahl des Geschlechts bei den Nachkommen von einem Pferd ist natürlich von Interesse. Die Geschlechtsvorauswahl, gefolgt von der künstlichen Besamung (AI) mit einer geringen Zahl von getrennten, angereicherten Populationen von X- und Y-chromosomtragenden Spermien, die auf der Basis des DNA-Gehalts getrennt worden sind, ist derzeitig in anderen Spezies möglich, Pferde haben sich jedoch in mancher Hinsicht als schwieriger erwiesen. Während die Geburt einer Nachkommenschaft mit dem gewünschten Geschlecht in Folge einer intrauterinen Besamung bei Rindern und Schafen die Geschlechtsbestimmungstechnologie bestätigt hat, ist sie bis zur vorliegenden Erfindung nicht praktisch auf Pferde angewendet worden.
Die Geschlechtsvorauswahl zu erreichen beinhaltet die Trennung der X- und Y-chromosomtragenden Spermien, gefolgt von der Verwendung für eine künstliche Besamung (AI) oder eine in vitro Befruchtung (IVF) und einen anschließenden Embryotransfer. Die derzeitige Hochgeschwindigkeitsdurchflusszytometrie erlaubt Forschern > 1000 lebende-geschlechtsbestimmte Spermien/Sekunde zu sortieren. Das Sortieren allein ist jedoch nicht genug. Um die Spermiengeschlechtsbestimmung zu einer praktikablen Technik für ein kommerzielles Pferde-AI-Programm zu machen, ist eine geringere Zahl von motilen Spermien für eine Besamungsdosis notwendig. Bei einer Stute, wenn frischer Samen für eine AI verwendet wird, würde eine typische Besamungsdosis zwischen 250–500 × 10⁶ motilen Spermien enthalten. Bei der derzeitigen Sortiergeschwindigkeit von ~1000 lebenden Spermien/Sekunde würde es fast sechs Tage dauern um eine Besamungsdosis zu sortieren! Deshalb wird eine geringere Zahl an motilen Spermien benötigt, um in der Praxis eine angemessene Fertilität zu erreichen. Wenn dies einmal erreicht ist wird auch eine gesteigerte Fertilität mit einer nicht chirurgischen Besamung von Stuten mit geschlechtsbestimmten Spermien als in der Praxis notwendig betrachtet.
Wie erwähnt beinhaltet die Geschlechtsvorauswahl die Verwendung des DNA-Gehalts und die Trennung von Spermien in X- und Y-chromosomtragende Populationen. Die Verwendung der derzeitigen Hochgeschwindigkeitsdurchflusszytometrie erlaubt Forschern bis zu 1000 lebende Spermien/sek mit dem gewünschten Geschlecht mit einer Genauigkeit von 90% zu sortieren, was angemessene Spermienzahlen in einer angemessenen Zeit für viele Spezien außer für Pferde bereitstellt. Zum Beispiel hat diese neue Technologie zur Geschlechtsbestimmung von Spermien dies zu einer zweckmäßigen Technik für die künstliche Besamung von Rindern gemacht. Da es zweckmäßig ist nur eine geringe Zahl von Spermatozoen zu sortieren und dennoch die Lebensfähigkeit der Spermien aufrecht zu erhalten, bezieht sich ein Aspekt dieser Erfindung auf erhöhte Schwangerschaftsraten in Folge einer Besamung mit 25 × 10⁶ nicht sortierten, progressiv motilen Spermatozoen (pms). Dies ist etwa ein Zehntel von dem was zuvor für routinemäßige Vorgänge als optimal angenommen worden ist. Andere Aspekte beziehen sich sogar auf geringere Zahlen. Diese Aspekte können signifikante ökonomische Konsequenzen haben, wenn man annimmt, dass sie auf gefeierte, siegreiche Tiere wie Pferde und dergleichen angewendet werden.
Wie erwähnt ist eine der grundlegenden Herausforderungen, mit der man beim Sortieren der X- und Y-Pferdespermien konfrontiert ist, die große Zahl der beteiligten Spermien. Bei der natürlichen Besamung werden nahezu eine Milliarde Pferdespermien hergestellt; bei einer künstlichen Besamung weniger, aber dennoch werden gewöhnlich signifikant große Zahlen an Pferdespermien verwendet. zum Beispiel verwenden künstliche Pferdebesamungstechniken routinemäßig zweihundertfünfzigmillionen bis fünfhundertmillionen Spermien. Folglich wird eine signifikante Zahl an Spermien in dem Umfeld einer künstlichen Besamung bei Pferden als notwendig vorausgesetzt.
Während sich die Erfindung auf eine geschlechtsausgewählte künstliche Besamung bezieht, sind viele Verfahren versucht worden, um die Trennung von X- und Y-chromosomtragenden Spermien von anderen Tieren zu erreichen. Keines dieser Verfahren hat sich jedoch besonders mit oder mit dem spezifischen Sortieren von Pferdespermienzellen befasst. Die allgemeinen Sortierverfahren reichen von magnetischen Techniken, wie sie aus der Offenbarung des U.S. Patents Nr. 4276139 hervor gehen, über Säulentechniken, wie sie aus der Offenbarung des U.S. Patents Nr. 5514537 hervor gehen, bis zu gravimetrischen Techniken, wie sie in den U.S. Patenten Nr. 3894529 , dem wieder veröffentlichten Patent Nr. 32350 und den U.S. Patenten Nrn. 4092229 4067965 und 4155831 diskutiert sind. Es sind auch mit den elektrischen Eigenschaften versucht worden, wie in dem U.S. 4083957 gezeigt ist, sowie eine Kombination aus elektrischen und gravimetrischen Eigenschaften, wie sie in den U.S. Patenten Nrn. 4225405 , 4698142 und 4749458 diskutiert sind. Motilitätsversuche wurden auch gemacht, wie in den U.S. Patenten Nrn. 4009260 und 4339434 gezeigt ist. Chemische Techniken, wie jene, die in den U.S. Patenten Nrn. 4511661 und 4999283 (umfasst monoklonale Antikörper) und den U.S. Patenten Nrn. 5021244 , 5346990 , 5439362 und 5660997 (umfasst Membranproteine) und den U.S. Patenten Nrn. 3687803 , 4191749 , 4448767 und 4680258 (umfasst Antikörper) gezeigt sind, sowie die Zugabe von Serumbestandteilen, wie es in dem U.S. Patent Nr. 4085205 gezeigt ist. Während jede dieser Techniken als hoch wirksam vorgestellt worden ist, hat derzeit in Wirklichkeit keine dieser Techniken die gewünschten Level für die Geschlechtsvorauswahl ergeben und keine hat einen Erfolg bei dem Level für die künstliche Besamung mit Pferdespermien gezeigt. Ungeachtet der Trennungstechnik jedoch, die schließlich verwendet wird, haben es die konkurrierenden Kombinationen aus hohen Pferdespermienzahlen, die natürlicherweise vorhanden sind, und aus dem Versuch einer Trennung von X- und Y-chromosomtragenden Spermien erstrebenswert gemacht eine Fähigkeit zu entwickeln eine Pferdbesamung mit geringeren Spermienzahlen zu erreichen.
Die quantitative Technik, das verwendet wurde, um die Trennung von X- und Y-chromosomtragenden Spermien für die künstliche Besamung (von irgendeiner Spezies) zu erreichen, war jene, die die Durchflusszytometrietechnik mit einbezog. Diese Technik erschien als ein Ergebnis von Fortschritten und Entdeckungen möglich, die eine unterschiedliche Farbstoffabsorption von X- und Y-chromsomtragenden Spermien mit einbezogen. Dies wurde früh in dem U.S. Patent Nr. 4362246 diskutiert und wurde signifikant bis zu den Techniken ausgedehnt, die von Lawrence Johnson in dem U.S. Patent Nr. 5135759 offenbart sind. Die Johnson-Technik, die die Durchflusszytometrie verwendet, um X- und Y-chromsomtragende Spermien zu trennen, war eine so signifikante Verbesserung, dass sie zum ersten Mal die kommerzielle Trennung solcher Spermien realisierbar machte. Ferner wurde die Trennung signifikant durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeitsdurchflusszytometern verbessert, wie dem MoFlo^® Durchflusszytometer, hergestellt von Cytomation, Inc., und sie wurde in vielen anderen Patenten diskutiert, einschließlich den U.S. Patenten Nrn. 5150313 , 5602039 , 5602349 und 5643796 sowie in einer internationalen PCT Patentveröffentlichung WO 96/12171 . Während die Verwendung der Cytomation MoFlo^® Zytometers große Geschwindigkeitszunahmen erlaubte und während diese Geschwindigkeitszunahmen insbesondere in Anbetracht der oft verwendeten hohen Zahlen an Pferdespermien relevant waren, sind bestimmte Probleme dennoch erhalten geblieben. Trotz der fast zehnfachen Verbesserung in der Geschwindigkeit, die durch das MoFlo^® Zytometer möglich war, sind aus mehreren Gründen immer kürzere Sortierzeiten erwünscht worden. Erstens, es wurde entdeckt, dass die Pferdespermien als ein angewandtes Material zeitkritische Zellen waren. Sie verlieren Ihre Wirksamkeit je länger sie nicht verwendet werden. Zweitens, das Timing für das Sammeln, Sortieren und die Besamung haben die Geschwindigkeit zu einem Gegenstand von großer kommerzieller Wichtigkeit gemacht. Folglich hat die zeitkritische Natur der Pferdespermienzellen und das Verfahren die Geschwindigkeit zu einem wesentlichen Element beim Erreichen einer hohen Effizienz und großer Erfolgsraten bei der künstlichen Besamung gemacht.
Trotz einiger Erfolge beim Sortieren und dann der künstlichen Besamung von Tieren von anderen Spezies, hat sich die Bestrebung bei Pferden als besonders schwer erwiesen. Weil es für die vorliegende Erfindung relevant ist können die Anwendungen bei Pferden insbesondere eine Herausforderung sein, entweder weil der Empfängnisvorgang bei Pferden schwierig ist und/oder die Pferdespermienzellen selbst schwieriger sind als jene von anderen Spezien – vornehmlich Rindern. Aus diesem Grund kann es sogar sein, dass jene, die Fachleute auf dem Gebiet sind, keine Techniken oder Systeme, die für andere Spezien entwickelt worden sind, als auf Pferde anwendbar betrachten. In einigen Fällen liefern beinahe identische Verfahren von einer Nicht-Pferd-Spezies nicht denselben Ergebnistyp für Pferde. Dies hat möglicherweise die Trennung bei den Forschungsbemühungen und bei den entwickelten Techniken und Substanzen gefördert.
Es existieren auch andere Probleme, die von praktischen zu theoretischen Problemen reichen. Auf der praktischen Seite war es wünschenswert eine künstliche Besamung bei Pferden auf eine Weise zu erreichen, die vielmehr in einer Außenumgebung als in einer Laborumgebung durchgeführt werden kann. Folglich können für die kommerzielle Produktion und den Außenerfolg Verbesserungen nach wie vor signifikant sein, die einzig eine Zunahme bei der Effizienz oder der Praktizierbarkeit darstellen. Verbunden mit dem praktischen Aspekt ist der Aspekt der Empfindlichkeit und Anfälligkeit des gesamten Verfahrens. In Hinsicht darauf ist es erwünscht das Verfahren zu vereinfachen und es verfahrenstechnisch so widerstandsfähig wie möglich zu machen, sodass der Benutzerfehler oder die Benutzerfähigkeit eine immer geringere Rolle spielen kann. Dieses Ziel hat auch in sich vereint die Besamung mit geringeren Dosierungen noch mehr erstrebenswert zu machen.
Zusätzliche zu der Empfindlichkeit des Verfahrens ist immer bekannt gewesen, dass Spermien im Allgemeinen sehr empfindliche Zellen sind. Während dieser Faktor beim ersten Blick so erscheint, als könnte er leicht verstanden werden, ist in Wirklichkeit das volle Ausmaß der Zellempfindlichkeiten noch nicht vollständig erforscht worden. Darüber hinaus scheinen Pferdespermienzellen besonders empfindlich zu sein. Im Gegensatz zu Rinderspermien sind sie auf verschiedene Weisen vom Blickwinkel einer erfolgreichen künstlichen Besamung aus empfindlicher. Es treten verschiedene Empfindlichkeiten auf und folglich hat es im gewissen Maße die Auffassung gegeben, dass die Systeme, Techniken und Substanzen, die in anderen Tieren verwendet wurden (wie Rindern), nicht immer auf Pferde anwendbar sind. Dies hat sich tatsächlich als wahr erwiesen.
Im Kontext der Durchflusszytometrie im Allgemeinen sind die meisten sortierten Zellen oder Partikel physisch in der Lage einer Vielzahl von Misshandlungen stand zu halten. Dies ist nicht Fall für Pferdespermienzellen. Vielmehr kann die Verarbeitung mit den normalen Durchflusszytometrietechniken, wie in der vorliegenden Erfindung offenbart ist, für das zytometrische Sortieren von Pferdespermienzellen bei bestimmen Anwendungen inakzeptabel sein. Die Empfindlichkeiten reichen von Verdünnungsproblemen und der dem Durchflusszytometer zueigenen Notwendigkeit, jede Zelle individuell zu isolieren und zu unterscheiden, sowie zu Druck und anderen Stressfaktoren, die typischerweise eine Flusszytometrie (vor der vorliegenden Erfindung) den Pferdezellen, die durch sie sortiert werden, auferlegt. Dies kann auch einen einzigartigen Faktor für Pferdespermienzellen darstellen, weil es den Anschein hat, dass, auch wenn die Pferdespermienzelle scheinbar das Durchflusszytometer passiert und ohne visuell erkennbare Nebenwirkungen sortiert wird, die Zellen in Wirklichkeit selbst bis zu dem Punkt gestresst worden sein können, dass sie alles andere als optimal bei dem Besamungsverfahren arbeiten. Folglich scheint ein Wechselspiel von Faktoren involviert zu sein und es hat ungewöhnliche Probleme von Blickwinkel des Pferdespermienzellsortierens und der endgültigen Verwendung für die künstliche Besamung von Pferden aufgeworfen.
Ein weiteres Problem, dass zurückgeblieben ist – trotz der großen Fortschritte, die durch das Patent von Johnson und der verwandten Technologie erreicht worden sind – ist die Tatsache, dass vor der vorliegenden Erfindung es extrem schwierig gewesen ist geringere Dosierungen für die Besamung mit geschlechtsbestimmten Pferdespermien zu erreichen, ungeachtet der verwendeten Trennungstechnologie. Während historisch ein gewisser Erfolg bei der Besamung mit einer geringen Dosis stattgefunden hat, ist er in vielmehr in einer theoretischen oder Laborumgebung aufgetreten als in Umgebungen, die vorrausichtlich vorgefunden werden oder für eine kommerzielle Anwendung verwendbar sind. Er ist auch durch chirurgische Techniken aufgetreten. In dieser Hinsicht ist es nicht lediglich der Wunsch gewesen geringe Besamungsdosen zu erreichen, sondern auch eine nicht chirurgische Besamung in einer Außenumgebung zu erreichen. Eine Niederdosisbesamung mit Schwangerschaftserfolgsraten zu erreichen, die mit den Existierenden, nicht geschlechtsbestimmten, künstlichen Besamungsleistungen vergleichbar sind, ist folglich ziemlich signifikant. Die erreichten Fortschritte durch die vorliegenden Erfinder stellen sowohl bei der geschlechtsbestimmten, nicht geschlechtsbestimmten sowie bei der Niederdosisbesamung signifikante Fortschritte dar, die zum ersten Mal kommerzielle Einsatzmöglichkeiten für Pferde realisierbar machen.
Ein weiteres Problem, dem Leute in der Industrie gegenüberstehen – wiederum trotz der großen Fortschritte, die durch das Patent von Johnson und der verwandten Technologie erreicht worden sind – ist die Tatsache, dass das Problem selbst, nämlich die künstliche Besamung von Pferden mit einer hohen Erfolgsrate, ein Problem statistischer Natur ist, bei dem eine Vielzahl von Faktoren im Wechselspiel zueinander stehen. Folglich können die vorgeschlagenen Lösungen zu einem gewissen Grad eine Kombination von Faktoren einbeziehen, die, wenn sie sorgfältig statistisch untersucht worden sind, sich als notwendig herausstellen werden, bei entweder der Isolation oder in Kombination mit anderen Faktoren. Solch eine Bestimmung ist ferner mit die Tatsache verbunden, dass die Ergebnisse selbst mit der Spezies variieren und auf Grund der Tatsache, dass das Testen und die statistische Probennahme auf einer Datengrundlage mit ausreichender Größe wahrscheinlich den Aufwand in den Anfangsstadien nicht wert ist, schwierig bestimmt werden können. Aus diesen Gründen kann die Erfindung auch eine Kombination aus Faktoren umfassen, die einzeln oder in Kombination die zweckmäßigen Lösungen für eine gegebene Anwendung repräsentieren können. Diese Offenbarung wird folglich als weit genug angesehen, so dass die verschiedenen Kombinationen und Durchdringungen der offenbarten Techniken erreicht werden können. Es können Synergien mit anderen Faktoren existieren. Solche Faktoren können von Faktoren innerhalb der Sortierschritte oder vielleicht den Durchflusszytometerschritten bis zu jenen bei den Sammel- sowie den Besamungsschritten reichen. Folglich, während es ein lange gefühltes aber unbefriedigtes Bedürfnis nach Hochgeschwindigkeit und geschlechtsbestimmter Niederdosisbesamung für Pferde gab, und während bestimmte Techniken und Elemente für die Umsetzung lange verfügbar gewesen sind, sind die Fortschritte oder vielleicht die Kombinationen der Fortschritte vor der vorliegenden Erfindung von jenen Fachleuten auf dem Gebiet scheinbar übersehen worden. Es kann sogar sein, dass die passende Kombination von bekannten Elementen einfach nicht umgesetzt wurde. Zu einem gewissen Grad mögen wohl jene Fachleute auf dem Gebiet versagt haben wahrzunehmen, dass das Problem in diesem Bereich ein Wechselspiel von Faktoren beinhaltet sowie besondere Notwendigkeiten für Pferdespermienzellen. Interessanterweise, wie die Liste der Bemühungen später in dieser Diskussion zeigt, sind beachtliche Versuche gemacht worden, aber sie haben scheinbar versagt das Problem zu verstehen, das einem Bereich wie der geschlechtsbestimmten Niederdosisbesamung von Pferden innewohnt, und sie haben wohl angenommen, dass, weil das natürliche Ereignis etwa eine Milliarde Spermien umfasst, es physikalische Beschränkungen für das Erzielen einer künstlichen Besamung mit Zahlen gibt, die in der Zahl drei Zehnerpotenzen geringer sind. Folglich mag es nicht überraschend sein, dass es zu einem gewissen Ausmaß eine tatsächliche Lehre gab, weg von der technischen Richtung, in die die vorliegenden Erfinder gingen. Diese Ergebnisse können zu einem gewissen Grad auch als unerwartet angesehen werden, weil sie gezeigt haben, dass eine künstliche, geschlechtsbestimmte Niederdosisbesamung eines Pferden – wenn sie richtig gemacht wird – mit Erfolgsraten ausgeführt werden kann, die mit jenen einer künstlichen, nicht geschlechtsbestimmten Hochdosisbesamung eines Pferdes vergleichbar sind. Es mag auch für Einige überraschend sein, dass die Techniken und Fortschritte der vorliegenden Erfindung in Wirklichkeit kombinieren, um die großartigen gezeigten Ergebnisse zu erlangen. Während jede Technik einzeln betrachtet von Manchen als unbeachtlich angesehen werden mag, scheinen die feinen Veränderungen oder Kombinationen mit anderen Techniken signifikante Fortschritte bei dem Endergebnis hervorzurufen.
Folglich war in einer Hinsicht bis zur vorliegenden Erfindung das Erzielen einer nicht chirurgischen, praxisnahen, künstlichen, geschlechtsbestimmten Besamung eines Pferdes mit einer geringen Besamungsdosis mit Leistungsleveln oder vereinfachten Verfahren nicht möglich gewesen, die wahrscheinlich, um eine kommerzielle Anwendung zu erreichen, nötig sind. Über die geschlechtsbestimmte Niederdosisbesamung auf einer kommerziellen Ebene hinaus, wie auch immer sie erreicht wurde, offenbart die vorliegende Erfindung auch Techniken, die das Erreichen von verbesserten Leistungen erlauben und folglich das gewünschte Endergebnis fördern, nämlich eine geschlechtsbestimmte und nicht geschlechtsbestimmte, nicht chirurgische, künstliche Niederdosisbesamung eines Pferdes auf einer kommerziellen Grundlage.
III. OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend offenbart die Erfindung den Erfolg von Systemen für die nicht chirurgische künstliche Besamung von Pferdestuten. Diese Techniken sind auf die Verwendung von geringen Pferdespermadosierungen anwendbar und sind so gestaltet, dass sie in dem Bereich kommerzieller und praxisnaher Ebene verwendet werden können. Ferner sind die Systeme in Verbindung mit – und haben eine besonders wertvolle Verwendungsmöglichkeit für – der künstlichen Besamung mit geschlechtsbestimmten Sperdespermien verwendbar. Die Systeme liefern auch eine verbesserte Fähigkeit Pferdespermienzellen zu sortieren, um deren Geschlecht über die Durchflusszytometrie-Trennungstechniken zu bestimmen. Es werden verschiedene Techniken und Substanzen repräsentiert, aber wie Fachleute leicht zu verstehen werden, können verschiedene Kombinationen und Permutationen auf eine Weise verwendet werden, die für die Leistung, basierend auf den Bedürfnissen, Trennungstechniken, Zielen und anderen Parameter, die bei einer bestimmten Pferdeverfahrensanwendung involviert sind, optimiert sein können.
Weil sich die Erfindung auf eine geschlechtsbestimmte Anwendung für Pferde bezieht, waren die Gegenstände der Erfindung 1) die Schwangerschaftsraten in Stuten zu vergleichen, die durch ein einziges Ereignis nahe dem Eisprung mit 500, 25 oder 5 × 10⁶ progressiv motilen Spermatozoen (pms) besamt wurden, 2) angemessene Schwangerschaftsraten in Folge einer Besamung mit 25 × 10⁶ lebend-sortierten, geschlechtsbestimmten Spermatozoen zu erzielen und 3) und Techniken für das Sortieren von Spermien zu entwickeln.
In einem der Experimente zu Beginn wurden 61 Stuten zufällig 1 von 3 Behandlungen zugeteilt: Gruppe 1 (n = 20) wurde mit 500 × 10⁶ Spermien in den Uteruskörper besamt (Kontrollen). Die Gruppe 2 (n = 21) und Gruppe 3 (n = 20) wurden an der Spitze des cornu uteri ipsilateral zu dem präovularen Follikel mit 25 und 5 × 10⁶ Spermien besamt. Den Stuten wurde Cloprostenol (250 μg i.m.) verabreicht, um die Luteolyse zu induzieren, und sie wurden jeden zweiten Tag mittels einer Ultrasonographie überwacht, bis ein Follikel ≥ 30 mm nachgewiesen worden ist, und dann täglich, bis eine Ovulation erkannt wurde. Es wurde GnRH (Deslorelin 2,2 mg, Ovuplant^®, Fort Doge) verabreicht, wenn das dominante Follikel ≥ 35 mm war. Die Stuten wurden 34 (n = 29) oder 40 (n = 32) Stunden nach dem GnRH besamt. Die Daten von 22 Stutenzyklen wurden ausgeschlossen, weil sie entweder vor der geplanten Besamung ovulierten (n = 1), nicht ovulierten (n = 3) oder > 4 Tage nach der GnRH-Verabreichung (n = 8) ovulierten. Das Sperma wurde gesammelt und sofort danach mit Magermilchstreckmittel (EZ-Mixin, OF, Animal Reproduction Systems, Chino, CA) auf entweder 25 × 10⁶ oder 5 × 10⁶ motile Spermien/ml verdünnt. Die Stuten, die 1 ml erhielten, wurden mit einer flexiblen Plastikpipette zur künstlichen Besamung (IMV, France) besamt, während die Stuten, die 0,2 ml erhielten, unter Verwendung einer Einmal-Implant-Gun (Veterinary Concepts, Green Valley, WI) besamt wurden, die einen 0,5 ml Strohhalm enthielt. Es wurden verschiedene Besamungspipetten verwendet, um die Zuführung der zwei verschiedenen Volumina zu optimieren. Die Platzierung der Pipetten innerhalb des Uterus wurde durch eine transrektale Ultrasonographie vor der Spermadeposition bestätigt.
Eine Schwangerschaft wurde durch Ultrasonographie 16 Tage nach der Ovulation bestimmt. Die Schwangerschaftsraten zwischen den Hengsten (p > 0,05) nicht unterschiedlich, so wurden die Ergebnisse von den zwei Hengsten kombiniert. Es gab einen Unterschied zwischen den Schwangerschaftsraten von Stuten, die mit 500 × 10⁶ (18/20 = 90%) besamt wurden, gegenüber den Behandlungen mit 25 × 10⁶ (12/21 = 57%) (p < 0,05). Es gab keinen Unterschied zwischen den Stuten, die mit Behandlungen von 25 × 10⁶ besamt wurden, gegenüber den Behandlungen mit 5 × 10⁶ (7/20 = 35%) (p > 0,05). Es gab keinen Unterschied zwischen den Schwangerschaftsraten von Stuten, die 34 Stunden gegenüber 40 Stunden nach der GnRH-Verabreichung 19/29 (65%) beziehungsweise 18/32 (56%) (p > 0,1) besamt wurden. Es gab auch keinen Unterschied zwischen den Schwangerschaftsraten von Stuten, die mit 5 × 10⁶ Spermien in einem Volumen von 1 ml, 3/10 (30%) oder einem Volumen von 0,2 ml, 4/10 (40%) (p > 0,05) besamt wurden. Zusammengefasst nahmen die Schwangerschaftsraten mit der Zahl zur Besamung verwendeten motilen Spermatozoen bei diesem Versuch zu Beginn ab. Es wurde jedoch am Tag 16 mit einer einzigen Besamung nahe der Ovulation mit 25 × 10⁶ pms eine Schwangerschaftsrate von 57% erreicht, wenn sie in der Spitze des cornu uteri deponiert wurden.
In einem weiteren Experiment wurden 17 Stuten zufällig 1 von 2 Gruppen zugeteilt: Die Stuten der Gruppe A (n = 11) wurden mit etwa 25 × 10⁶ lebend sortierten Spermien in einem Volumen von 1 ml besamt. Das Sperma wurde in einem kommerziellem Magermilchsparmastreckmittel (EZ-Mixin, OF, Animal Reproduction Systems, Chino, CA) sortiert. Eine Stute versagte zu ovulieren und sie wurde auf der Studie ausgeschlossen. Die Stuten der Gruppe B (n = 10) wurden mit etwa 25 × 10⁶ lebend sortierten Spermien in einem Volumen von 1 ml besamt. Das Sperma wurde in EZ-Mixin + 4% Eidotter (EY) sortiert. Zwei Stuten (eine aus jeder Gruppe) wurde mit 20 × 10⁶ Spermien besamt, auf Grund der Zeiteinschränkungen bei den Durchflusszytometern. In beiden Gruppen wurden die Besamungen 34 h nach der GnRH-Verabreichung durchgeführt und die Spermien wurden in der Spitze des cornu uteri ipsilateral zu dem präovularen Follikel deponiert, wobei eine flexible Plastik-AI-Pipette verwendet wurde. Die Platzierung der Pipetten innerhalb des Uterus wurde durch eine transrektale Ultrasonographie vor der Spermadeposition bestätigt. Den Stuten wurde Cloprostenol (250 μg i.m.) verabreicht, um die Luteolyse zu induzieren, und sie wurden jeden zweiten Tag mittels einer Ultrasonographie überwacht bis ein Follikel ≥ 30 mm nachgewiesen worden ist, und dann täglich, bis eine Ovulation erkannt wurde. Es wurde GnRH (Deslorelin 2,2 mg, Ovuplant^®, Fort Doge) verabreicht, wenn das dominante Follikel ≥ 35 mm war. In diesem Experiment wurden zwei Hengste verwendet, einer davon (Hengst 1) wurde im Experiment 1 verwendet. Frisch gesammeltes Sperma wurde 1:1 in HBGM-3 gestreckt und für 10 Minuten bei 400 × g bei 22°C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die Spermien in 25 μl Hoechst 33342 bei 400 × 10⁶ Spermien/ml in HBGM-3 für 1 h bei 35°C inkubiert und dann auf 100 × 10⁶ Spermien/ml für das Sortieren verdünnt. Die Spermien wurden nach den Geschlechtschromosomen, basierend auf dem Unterschied im DNA-Gehalt, sortiert. Es wurden zwei MoFlo^® Durchflusszytometer/Cell Sorter für das Sortieren verwendet, die mit einem Argonlaser, der eine 150 mW Leistung bei 352 und 364 nm emittierte, ausgestattet waren, und die bei 50 psi mit HBGM-3 als Mantelfüßigkeit arbeiteten. Es wurden Aliquots der sortierten X- und Y-Populationen in Bezug auf die DNA erneut analysiert und sie ergaben Reinheiten von 90 und 84% für X beziehungsweise Y. Die Spermien wurden mit etwa 900 Spermien/sek in 14 ml Röhrchen gesammelt, die entweder 4 ml EZ-Mixin (Gruppe A) oder 4 ml EZ-Mixin + 4% Eidotter (Gruppe B) enthielten. Die gesammelten Spermien wurden zentrifugiert und auf 25 × 10⁶ Spermien/ml suspendiert und sofort für die Besamung verwendet. Eine Schwangerschaft wurde mittels Ultrasonographie 12, 14, 16 und 30 Tage postovulation bestimmt, und das Geschlecht der Föten wurde 60–70 Tage postovulation ohne ein Wissen über das Geschlecht der zur Besamung verwendeten sortierten Spermien bestimmt. In den Schwangerschaftsraten zwischen den Hengsten gab es keinen Unterschied (Hengst A = 3/10, 30%; Hengst B = 5/10, 50%) (p > 0,1), so dass die Datensets kombiniert wurden. Obwohl es keinen Unterschied in den Schwangerschaftsraten zwischen den Spermabehandlungen gab (EZ-Mixin = 3/10, 30% gegenüber 4% EY + EZ-Mixin = 5/10, 50%) (p > 0,1), muss dies nicht bis zum Schluss der Wahrheit entsprechen. Am Tag 60 waren 5/20 (25%) Stuten schwanger; das Geschlecht der Föten wurde bestimmt und das phänotypische Geschlechtsverhältnis war perfekt vorhergesagt worden, fünf von fünf.
Dieser Versuch hat zum ersten Mal gezeigt, dass in der Stute eine Schwangerschaft erreicht werden kann und Fohlen mit einem vorherbestimmten Geschlecht in Folge einer nicht chirurgischen Besamung mit geschlechtsbestimmten Sperma erhalten werden können. Dies wird in der folgenden Diskussion erklärt.
Folglich ist es ein Gegenstand der Erfindung eine künstliche Besamung von Pferden in einer Außenumgebung zu erreichen ohne die Notwendigkeit auf chirurgische Verfahren zurückzugreifen. Ferner ist es ein Ziel eine Fähigkeit bereitzustellen geringere Dosierungen auf eine Weise zu verwenden, die unter realistischen kommerziellen Umständen funktioniert und die Erfolgswahrscheinlichkeiten für eine Schwangerschaft ergibt, die mit den herkömmlichen Dosiserfolgsraten für Pferde vergleichbar sind. Ein Gegenstand ist es auch eine bessere Sortierung der Pferdespermienzellen zu erreichen. Ein paralleles Ziel ist es Substanzen und Techniken bereit zu stellen, die besonders für Pferdespermienzellen geeignet sind, wenn diese in X und Y-chromosomtragende Bestandteile getrennt sind. Somit ist es ein Ziel ein sortiertes Ergebnis zu erreichen, das mit den nicht sortierten, Hochdosiserwartungen übereinstimmt.
Es ist auch ein Ziel ein Gesamtsystem für die künstliche Besamung von Pferden darzulegen, das seine Ziele auf eine kommerzielle praxisnahe Weise erreichen kann. Das Sortieren auf eine Weise, die bei Pferden sowohl eine Hochgeschwindigkeitssortierung als auch ein Sortieren mit wenig Stress liefert und die besonders an das Sortieren von Pferdespermienzellen in einem Niederdosiskontext angepasst ist, auch ein wichtiges Ziel.
Natürlich werden andere Gegenstände der Erfindung überall in anderen Bereichen der Beschreibung und Ansprüche offenbart.
IV. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm eines Sortiersystems entsprechend einer durchflusszytometrischen Trennungstechnik der vorliegenden Erfindung.
2 ist ein Diagramm der mitgerissenen Zelle in der Düse direkt vor dem Freien-Fall-Bereich in einem typischen Durchflusszytometer.
V. BESTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Wie erkannt werden wird können die Grundkonzepte der vorliegenden Erfindung kombiniert werden und auf vielen verschiedenen Wegen ausgeführt werden. Die Erfindung umfasst eine kommerzielle, praxisnahe, geschlechtsbestimmte, künstliche Niederdosisbesamung von Pferden und die Ergebnisse. Für die Durchflusszytometrie-Trennungstechniken umfasst die Erfindung auch verbesserte Durchflusszytometersysteme sowie Systeme für die Erzeugung von geschlechtsspezifischen Pferdespermaproben, die bei der künstlichen Besamung von Pferden verwendet werden können, und die Pferde, die durch diese Techniken hergestellt werden. Es wird ein Gesamtverfahren offenbart, durch das hohe Erfolgsraten auch in dem kommerziellen Umfeld von Pferden möglich sind. Darüber hinaus sind die Techniken auf eine allgemeine Weise offenbart, so dass sie auf spezifische Systeme und Einsatzmöglichkeiten angewendet werden können, wenn einmal die allgemeinen Prinzipien verstanden worden sind. Während Vorrichtungsverbesserungen offenbart werden sollte es selbstverständlich sein, dass diese Verbesserungen nicht nur bestimmte Verfahren bewerkstelligen, sondern auch auf viele Weisen variiert und kombiniert werden können. Wichtig ist auch für all das Vorhergegangene, dass es für jede dieser Facetten selbstverständlich sein sollte, dass sie durch diese Offenbarung umfasst ist.
Wenn man den Geschlechtsselektionsaspekt der Erfindung betrachtet, ist das grundlegende Ziel das der Trennung der X-trangenden Spermien von den Y-tragenden Spermien auf eine Weise, die für die künstliche Besamung der Stute mit hohen Erfolgsraten verwendet werden kann. Vorzugsweise würde diese Besamung keine Operation benötigen. Die Trennungsphase wird vorzugsweise auf eine Weise gemacht, die die zwei Typen von Pferdespermien isoliert, so dass jeder getrennt verpackt werden kann und mit jedem getrennt gehandelt werden kann. Gegenwärtig wird die Isolation vorzugsweise durch die Verwendung einer Durchflusszytometrie gemacht. Die Durchflusszytometrie ist im Allgemeinen eine Technik, die gut verstanden ist. Zum Beispiel werden die grundlegenden Aspekte davon in vielen Patenten von Cytomation, Inc. gezeigt und diskutiert, wie in den zuvor aufgelisteten U.S. Patenten und den anderen Veröffentlichungen.
Im Allgemeinen sollte es selbstverständlich sein, dass während der Meiose in den Hoden die Geschlechtschromosomen in individuelle Spermatiden und haploide Spermatozoen segregieren, die entweder das X- oder Y-Chromosom tragen. Es gibt ein 50:50 Verhältnis von X- und Y- chromosomtragenden Spermatozoen im Sperma, und die Befruchtung einer X-tragenden, haploiden Oozyte durch entweder ein X- oder Y-tragendes Spermium bestimmt das Geschlecht des Embryos. Es besteht ein 50:50-Verhältnis, weil die X- und Y-tragenden Spermatozoen in gleichen Mengen hergestellt werden und sie phänotypisch identisch sind. Der Wunsch das 50:50 Verhältnis zu verändern und das Geschlecht der Säugetiernachkommenschaft vorherzubestimmen ist für die Öffentlichkeit seit vielen Jahren von großem Interesse gewesen. Es gibt zahlreiche Vorteile durch die Geschlechtsvorauswahl bei pferdeartigen Tieren. Die Geschlechtsvorauswahl ist auch verwendet worden, um weibliche Tiere herzustellen, wenn vererbliche X-chromosomal gekoppelte Krankheiten ein Problem sind. Im Gegensatz zum Menschen oder zu vielen Nutztieren kann der Vorteil der Geschlechtsvorauswahl im Pferd rein eine Präferenz des Züchters/Eigentümers sein und es gibt ein beachtliches Interesse bei Mitgliedern von bestimmten Zuchtregistern.
Seit Jahren sind zahlreiche Versuche gemacht worden X- und Y-chromosomtragende Spermatozoen zu trennen, basierend auf den physikalischen und chemischen Eigenschaften der Spermien. Johnson (oben genannt) hat diese Verfahren getestet und gefunden, dass das einzige Verfahren, das sich als wirksam herausgestellt hat, auf einem Unterschied im DNA-Gehalt der Spermatozoen basiert. Kein anderes Verfahren, basierend auf einem physikalischen Unterschied innerhalb der Spermatozoen oder auf Oberflächeneigenschaften, hat sich als wirksam bei der Trennung von X- und Y-chromosomtragenden Spermatozoen erwiesen. Unter den Pferden weicht der DNA-Gehalt der Säugetier X- und Y-chromosomtragenden Spermien um 4,1% ab. Dieser Unterschied im DNA-Gehalt kann verwendet werden, um die X- und Y-chromosomtragenden Spermatozoen zu trennen, nachdem die Spermien mit einem fluoreszierenden, DNA-bindenden Farbstoff gefärbt wurden, gefolgt von einer Durchflusszytometrie.
Die moderne Durchflusszytometrie/Cell Sorting-Technologie wurde als erstes von Fulwyler 1965 entwickelt. Die Durchflusszytometrie ist hauptsächlich in der medizinischen Forschung und Diagnostik in Bezug auf Blut- und Tumorzellen verwendet worden, sie kann aber auch verwendet werden, um viele Typen von Zellsuspensionen, einschließlich Spermienzellen, auszuwerten. Im Wesentlichen umfasst die Durchflusszytometrie, wie sie hier angewendet wird, das Sortieren von Pferdespermienzellen, die dem Durchflusszytometerinstrument durch irgendeinen Zellquellentyp zur Verfügung gestellt werden. Ein konzeptuelles Instrument ist in der 1 gezeigt. Das Durchflusszytometerinstrument umfasst einen Probeneingang, hier eine Pferdespermazellenquelle (1), die dazu dient Pferdespermienzellen oder irgendeinen anderen Objekttyp, der mittels Durchflusszytometrie analysiert werden soll, einzuführen oder zu liefern. Die Zellen werden innerhalb einer Düse (2) auf eine Weise deponiert, so dass die Zellen von einer Mantelflüssigkeit (3) umgeben sind. Die Mantelflüssigkeit (3) wird gewöhnlich von einer Mantelflüssigkeitsquelle (4) bereitgestellt, so dass, während die Quelle für die Pferdespermienzellen (1) ihre Zellen bereitstellt, die Mantelflüssigkeit (3) gleichzeitig durch die Düse (2) geleitet wird. Auf diese Weise ist es leicht zu verstehen, wie die Mantelflüssigkeit (3) ein Mantelflüssigkeitsumfeld für die Pferdespermienzellen bildet. Da die verschiedenen Flüssigkeiten dem Durchflusszytometer mit etwas Druck bereitgestellt werden, fließen sie aus der Düse (2) und treten an der Düsenausflussöffnung (5) aus. Indem irgendein Oszillatortyp (6) bereitgestellt wird, der sehr genau durch eine Oszillatorsteuerung kontrolliert werden kann, können innerhalb der Düse (2) Druckwellen aufgebaut werden und auf die Flüssigkeiten, die die Düse (2) an der Düsenausflussöffnung (5) verlassen, übertragen werden. Da der Oszillator (6) dadurch auf die Mantelflüssigkeit (3) einwirkt, bildet der Strahl (7), der aus der Düsenausgangsöffnung (5) austritt, letztendlich und regelmäßig Tropfen (8). Weil die Zellen von dem Mantelflüssigkeitsumfeld umgeben sind, können die Tropfen (8) in sich individuell isolierte Zellen oder andere Objekte enthalten.
Weil die Tropfen (8) im Allgemeinen isolierte Pferdespermienzellen enthalten, kann das Durchflusszytometer zwischen den Tröpfchen unterscheiden und diese trennen, basierend darauf, ob oder ob nicht die entsprechende Zelle oder die entsprechenden Zellen innerhalb des Tropfens enthalten ist/sind. Dies wird durch ein Zellwahrnehmungssystem (9) bewerkstelligt. Das Zellwahrnehmungssystem umfasst mindestens irgendeinen Detektortyp (10) (der zwei Detektoren umfasst, die 90 Grad zueinander stehen), der auf die Zellen reagiert, die innerhalb jedes Tropfens (8) enthalten sind, wie es ausführlich in der wegweisenden Arbeit (es ist kein Wortspiel beabsichtigt) von Larry Johnson diskutiert wird, nämlich dem U.S. Patent Nr. 5135759 . Wie es das Patent von Johnson für Spermienzellen erklärt, kann das Zellwahrnehmungssystem (9) eine Wirkung verursachen, abhängig von der relativen An- oder relativen Abwesenheit eines bestimmten Farbstoffs, der durch irgendeinen Stimulus, wie die Erregung durch den Laser (11), angeregt werden kann. Während jeder Spermienzelltyp durch den Farbstoff gefärbt wird, verursachen die unterschiedlichen Längen des X- und Y-Chromosoms verschiedene Färbelevel. Folglich ist es möglich, indem der Grad an Farbstoff, der in den Spermienzellen vorhanden ist wahrgenommen wird, wegen ihren unterschiedlichen Emissionslevel zu unterscheiden zwischen X-tragenden Spermien und Y-tragenden Spermien.
Um die endgültige Trennung und Isolation der entsprechenden Zellen mit einer Durchflusszytometer-Trennungstechnik zu erreichen, werden die Signale, die von dem Detektor (10) erhalten werden, an irgendeinen Typ eines Sortierer-Diskriminierungs-Systems (12) gespeist, das sehr schnell eine Entscheidung trifft und jeden Tropfen (8) unterschiedlich laden kann, basierend darauf, ob es entschieden hat, dass die gewünschte Pferdespermienzelle innerhalb des Tropfens (8) vorhanden ist oder nicht. Auf diese Weise arbeitet das Sortierer-Diskriminierungs-System (12), um der elektrostatischen Ablenkplatte (13) zu erlauben, die Tropfen (8) abzulenken, basierend darauf, ob oder ob sie nicht die entsprechende Zelle oder das entsprechende andere Objekt enthalten. Als ein Ergebnis arbeitet das Durchflusszytometer, um die Zellen zu sortieren, indem es sie veranlasst in einem oder mehreren Sammelbehältern (14) zu landen. Folglich kann das Durchflusszytometer, indem es irgendeine Eigenschaft der Zellen oder von anderen Objekten wahrnimmt, zwischen Pferdespermienzellen unterscheiden, basierend auf einem bestimmten Merkmal, und sie in den entsprechenden Sammelbehälter (14) geben. In dem System, das derzeitig verwendet wird um Pferdespermien zu sortieren, werden die X-tragenden Spermientröpfchen positiv geladen und folglich in eine Richtung abgelenkt, die Y-tragenden Spermientröpfchen werden negativ geladen und folglich auf dem anderen Weg abgelenkt und der ungenutzte Strahl (das heißt nicht sortierbare Zellen) ist ungeladen und folglich wird er in einem nicht abgelenktem Strahl in einem Saugrohr oder dergleichen gesammelt.
Mit Bezug auf 2 kann das Verfahren sogar noch weiter verstanden werden. Wie in dieser Figur gezeigt ist emittiert die Düse (2) einen Strahl (7), der wegen dem Oszillator (6) (nicht in der 2 gezeigt) Tropfen (8) (nicht in der 2 gezeigt) bildet. Da die Pferdespermienzellenquelle (1) (nicht in der 2 gezeigt) Pferdespermienzellen (15) liefern kann, die entsprechend der Technik von Johnson gefärbt worden sind, können die Lichtstimulation durch die Erregung mit dem Laser (11) und das unterschiedlich bestimmte Stadium, wir es durch den Detektor (10) wahrgenommen wird, verwendet werden, um das Vorhandensein oder das nicht Vorhandensein einer Ladung an jedem Tropfen (8) zu erzeugen, während sich dieser von dem Strahl (7) abtrennt. Dies wird alles durch das Durchflusszytometer kontrolliert. Diese Kontrolle führt zu positiv geladenen, negativ geladenen und ungeladenen Tropfen (8), basierend auf ihrem Gehalt. Wie in der 1 gezeigt ist, sind bestimmte Tropfen als abgelenkte Tropfen (16) gezeigt. Diese abgelenkten Tropfen (16) sind jene, die Spermienzellen (15) des einen oder anderen Geschlecht enthalten. Sie werden dann in dem entsprechenden Sammelbehälter (14) für die spätere Verwendung deponiert.
Wie in der 2 gezeigt ist, können die Pferdespermienzellen (15) in die Mantelflüssigkeit (3) hinein mittels einer Nadel oder einem Einspritzrohr (18) injiziert werden. Wie jene verstehen werden, die Fachleute auf dem Gebiet der Durchflusszytometrie sind, kann dieses Einspritzrohr (18) so geformt sein, dass eine hydrodynamische Fokussierung und Orientierung erreicht wird, sodass sowohl der Schwanz und/oder die flachere Seite der Pferdespermienzelle (15) richtig orientiert sind. Es kann, wie gezeigt, auch einen bandförmigen Probenkernstrahl produzieren. Diese kann wichtig sein, weil die Neunzig-GradFluoreszenzintensität als proportional zu der Spermienkopforientierung betrachtet werden kann und die Null-Grad-Fluoreszenzintensität als proportional zu dem Spermium-DNA-Gehalt betrachtet werden kann.
Die hochauflösende durchflusszytometrische DNA-Analyse von Pferdespermien ist verglichen mit anderen Zellen schwierig, weil das hochkompakte Chromatin in dem morphologisch flachen, paddelförmigen Spermienkopf einen hohen Brechungsindex verursacht. Der Unterschied in dem Brechungsindex zwischen dem Spermienkopf und dem umgebenden Medium in Kombination mit der flachen Form des Spermienkopfes führt zu einer größeren Fluoreszenzemission durch die Fläche der Zelle (von der Kante des Spermienkopfes) als durch einen 90° Winkel zu der Fläche. Die richtige Orientierung des Kopfes ist für eine hoch auflösende Sortierung entscheidend. Andere haben Verfahren zur Kontrolle der Orientierung der Spermienköpfe untersucht, die in einem Strahl fließen, und haben herausgefunden, dass ein abgeschrägtes Einspritzrohr (18) wirksam war, die Zellen den planaren hydrophoben Kräften zu unterwerfen, während die Zellen aus dem Ende der Nadel flossen. Der Probenstrahl kann in einen bandförmigen Strahl hineingedrückt werden, der den flachen Kopf des Spermiums auf dieselbe Weise ausrichten kann. Es werden auch oft andere, komplexere, physikalische Prinzipien angewendet, um die Spermien auszurichten.
Wie erwähnt werden die Spermatozoen, die ein Sortierverfahren durchlaufen, mit dem Fluorchromfarbstoff Hoechst 33342 gefärbt, chemisch als Bisbenzimid bekannt. Der Farbstoff wird zu der Probe mit etwa 9 μM in einem 1 ml Volumen, das 400 × 10⁶ Spermien enthält, zugegeben und kann bei 32–35°C inkubiert werden. Hoechst 33342 ist für die Spermien nicht toxisch und verändert die Motilität der Spermien nicht signifikant. Hoechst 33342 bindet an die A-T-Regionen der DNA-Helix. Da das Sortierverfahren produktiver ist, wenn die toten Spermien nicht gesammelt werden, kann zu der gefärbten Probe ein Molekül zugegeben werden, das die Hoechst 33342-Fluoreszenz abfängt und die toten Spermien markiert. Lebensmittelfarbe ist ein Beispiel für ein nicht toxisches Molekül, das verwendet worden ist. Das Verfahren ist dann, dass fluoreszenzgefärbte Spermatozoen in einer flüssigen Suspension unter Druck (z.B. 50 psi) in das Durchflusszytometer eingeführt werden. Die Spermien treten in das Probeneinführungsröhrchen ein und werden auf die eine oder andere ausgerichtet, wohl während sie das abgeschrägte Ende des Röhrchens in die Mantelflüssigkeit hinein verlassen. Der Strahl, der die Spermien enthält, durchkreuzt einen Argonlaserstrahl mit Wellenlängen im ultravioletten Bereich (351 und 364 nm) mit bis zu 200 mW Leistung. Etwa 7% der Tropfen enthalten eine Spermienzelle, wenn die Probe 100 × 10⁶ Spermien/ml enthält. Die fluoreszenzgefärbten Nuklei werden durch den Laserstrahl angeregt, wobei sie Fluoreszenzsignale proportional zu der an den Farbstoff gebundenen DNA-Menge abgeben.
Ein modifiziertes kommerzielles Durchflusssortiersystem wurde verwendet, um Spermatozoen basierend auf DNA-Unterschieden zu analysieren und zu sortieren. Wie erwähnt ist das Fluoreszenzsignal von der Spermiumkante (90° Winkel zum Laseraustritt) heller als das, das von der flachen Seite emittiert wird (0° Vorwärtsdetektor). Die Kantenemission wird verwendet, um die Orientierung der Spermienköpfe während sie den Laserstrahl passieren zu charakterisieren. Das emittierte Licht wird von dem 90°-Detektor eingefangen, und die richtig orientierten Spermien werden erkannt. Spermien, die nicht richtig orientiert sind, geben weniger Licht ab und werden elektronisch aus den Analysen ausgeblendet (gegatet) und oftmals wird die Mehrheit der Spermien, weil sie nicht die richtige Orientierung haben, nicht in X- und Y-angereicherte Populationen getrennt. Auch werden viele Spermienzellen, die richtig orientiert sind, nicht sortiert, weil die Fluoreszenzverteilungen überlappen. Es können ein optischer Detektor und eine Photovervielfacherröhre (PMT) für den 0°-Nachweis der Fluoreszenz verwendet werden, die proportional zu dem DNA-Gehalt von richtig orientierten Spermien ist. Die PMTs fangen die Fluoreszenz ein, die von den Spermien emittiert wird und konvertieren das optische Signal in ein proportionales elektronisches Signal, das von der PMT für die weitere Signalverarbeitung und die graphische Darstellung verstärkt wird. Das elektronische Gaten ermöglicht die Auswahl der Signale von dem 0° Vorwärtsdetektor nur für richtig orientierte Spermien; dies führt zu der Fähigkeit zwischen der DNA von X- und Y-Spermien zu unterscheiden. Indem das elektronische Sortierfenster um die aufgelösten Populationen angelegt wird werden die X- und Y-tragenden Spermien auf zwei Röhrchen aufgeteilt. Zwei optische Detektoren fangen das abgegebene Licht ein und es werden Schaltungen aktiviert, die den Tropfen, die das entsprechende X- oder Y-tragende Spermium enthalten, einen Ladungsimpuls zufügen (+ oder –). Während die einzelnen Spermientröpfchen fallen passieren sie ein elektrostatisches Feld, das die geladenen Tröpfchen, die die Spermien enthalten, in getrennte Röhrchen zieht, die als ein vorübergehendes Haltemedium, bis das Sperma weiter verarbeitet wird, einen „Catch-Flüssigkeits"-Extender enthalten.
Die Spermatozoenproben, die in X- und Y-chromosomangereicherte Proben getrennt worden sind, können hinsichtlich ihrer Reinheit neu bewertet werden, indem die Durchflusszytometrieanalyse für den DNA-Gehalt der einzelnen Spermien verwendet wird. In der Vergangenheit war das einzige erhältliche gültige Verfahren für die Überprüfung der Trennung die Bestimmung des Geschlechtsverhältnisses der Nachkommen, was zum falschen Zeitpunkt und teuer ist. Die erneute Analyse unter Verwendung der Durchflusszytometrie verringert nicht nur die Zeit und die Kosten, sonder erhöht auch die Präzision.
Mit den Fortschritten wird erwartet, dass der Prozentsatz an Spermien, die richtig orientiert sind, während die Tröpfchen den Laser passieren, zunehmen kann, was zu gesteigerten Sortiergeschwindigkeiten von 100 lebenden Spermien/s für jedes Geschlecht bis zu Geschwindigkeiten zwischen 1000 und 1500 lebenden Spermien/s von jedem Geschlecht mit ~90% führt. Diese Zunahme in der Spermiensortiergeschwindigkeit würde hilfreich sein die Verwendung geschlechtssortierten Spermas bei einem künstlichen Besamungsprogramm für Pferde geeigneter zu machen.
Andere haben von der Verwendung der Menge an DNA im Sperma als einen Marker für die Geschlechtsvorauswahl und von der anschließenden Geburt des vorhergesagten Geschlechts in Folge einer chirurgischen Besamung in Kaninchen berichtet. Die Spermatozoen wurden in X- und Y-tragende Populationen mit einem Durchflusszytometer/Cell Sorter getrennt. Die sortierten Spermien wurden chirurgisch in den Uterus besamt. Von jenen, die mit den Fraktionen besamt wurden, die mit Y-tragenden Spermien angereicht waren, waren 81% der geborenen Nachkommenschaft männlich; die Fraktionen, die mit X-tragenden Spermien angereicht wurden, führten zu 94% Weibchen. Folglich war das Geschlechtsverhältnis signifikant von 50:50 verändert. Dieses phänotypische (und genotypische) Verhältnis wurde basierend auf der erneuten Analyse der DNA von den sortierten Populationen genau vorhergesagt, die eine Reinheiten von 81% für Y-tragende Spermien und 86% für X-tragende Spermien zeigten. Diesem folgte eine Veröffentlichung von Experimenten in Schweinen und Rindern. Es wurde eine In-vitro-Fertilisation verwendet, um die Schwangerschaften in Rindern zu erhalten, wobei geschlechtssortiertes Sperma verwendet wurde. Zum Beispiel übertrug ein Forscher Zwillingsembryonen in jede von 9 Färsen. Vier der Färsen wurden schwanger und 6 Kälber geboren, alle mit dem vorhergesagten Geschlecht. Diese Ergebnisse zeigen, dass lebensfähige Spermien in X- und Y-chromosomtragende Populationen getrennt werden können und ihre Fähigkeit zur Befruchtung und Erzeugung einer normalen Nachkommenschaft beibehalten. In Folge einer In-vitro-Fertilisation (IVF) mit X- und Y-tragenden Spermien wurden auch in Schweinen und Kaninchen Schwangerschaften erhalten. Unlängst sind durch IVF mit Hochgeschwindigkeits durchflusszytometrie sortierten Spermien Rinderembryonen erzeugt worden, ein Embryotransfer wurde aber nicht gemacht.
Unter Verwendung von geschlechtssortierten Pferdespermien in einer Laborumgebung hat ein Forscher zwei Experimente durchgeführt, um die Schwangerschaftsraten mit einer intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) in Pferdeoozyten oder einer Eileiterbesamung zu bestimmen. Dreizehn injizierte Oozyten entwickelten sich zu dem 2- bis 3-Zellstadium, 8 zu dem 4- bis 6-Zellstadium, und 2 Oozyten entwickelten sich zu dem 7- bis 8-Zellstadium. Ein Embryo wurde in dem 7- bis 8-Zellstadium übertragen, es ergab sich aber keine Schwangerschaft. In dem Experiment mit der Eileiterbesamung wurden zwei Stuten durch die Cannulation des fransigen Endes des Eileiters mit 50 μl besamt, die 1,5 × 10⁵ sortierte X-tragende Spermien enthielten. Es wurde eine Schwangerschaft nachgewiesen und die Stute brachte ein weibliches Fohlen hervor.
Einer der Aspekte der Durchflusszytometrie, der besonders für die Anwendung der Durchflusszytometrie auf das Sortieren von Pferdesperma wichtig ist, ist das Arbeiten eines Durchflusszytometers bei Hochgeschwindigkeit. Es wurden insbesondere Fortschritte bei den von Cytomation, Inc. unter der Handelsmarke MoFlo^® erhältlichen Durchflusszytometern gemacht. Diese Durchflusszytometer haben ungemein erhöhte Sortiergeschwindigkeiten und dadurch die Durchflusszytometrie zu einer Technik gemacht, die wahrscheinlich die kommerzielle Anwendung der Pferdespermiensorierung realisierbar macht (neben anderen kommerziellen Anwendungen). Sie arbeiten, um eine Sortierhochgeschwindigkeit zu erreichen, was eine Geschwindigkeit ist, die beträchtlich höher als jene Geschwindigkeiten ist, die ansonsten verwendet werden. Speziell arbeiten die MoFlo^® Durchflusszytometer von Cytomation mit Oszillatorfrequenzen von mehr als fünf Kilohertz und besonders speziell können sie in den Bereichen von 10 bis 30 oder sogar den 50 Kilohertzbereichen betrieben werden. Dadurch werden die Tröpfchen mit sehr hohen Frequenzen gebildet und die Zellen, die innerhalb der Mantelfüssigkeitsumgebung enthalten sind, können von der Düse (2) sehr schnell ausgegeben werden. Als ein Ergebnis kann irgendeiner der Bestandteile wie die Düse (2), der Oszillator (6) und dergleichen, die ein Durchflusszytometer ausmachen und ein Teil davon sind, konfiguriert oder ausgewählt werden, um ein Hochgeschwindigkeitsdurchflusszytometer zu ergeben. Bei der Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Cell-Sorters auf das Sortieren von Spermienzellen, werden Sortiergeschwindigkeiten von mehr als 900 Sortierungen pro Sekunde erreicht. Wichtig ist, dass verstanden wird, dass der Begriff „Hochgeschwindigkeit" ein relativer Begriff ist, so dass, während andere Fortschritte bei der Durchflusszytometrie und bei bestimmten Anwendungen erreicht werden, der Aspekt, der als „hoch" erachtet wird, verändert werden oder absolut bleiben kann. In beiden Definitionen ist das allgemeine Prinzip, dass das Sortieren mit Geschwindigkeiten stattfinden kann, bei denen die Parameter und physikalischen Merkmale des Durchflusszytometers signifikant für die Zellen selbst sind, wenn bestimmte Zellen wie Pferdespermienzellen sortiert werden.
Ein Aspekt der Hochgeschwindigkeitssortierung, der ins Spiel zu kommen scheint, wenn Pferdespermienzellen durch eine Durchflusszytometrietechnik sortiert werden, ist der der Drücke und anderer Stressfaktoren, denen die Pferdespermienzellen innerhalb des Durchflusszytometers unterworfen werden. Zum Beispiel wenn mit Hochgeschwindigkeiten (eine alternative Definition von „Hochgeschwindigkeit") gearbeitet wird, können die Durchflusszytometer bei einem Druck von 50 Pfund pro Quadratinch oder sogar höher betätigt werden. Diese Drücke können als hoch betrachtet werden, weil sie Auswirkungen auf die Pferdespermienzellen, die sortiert werden, haben können. Der Schlüssel für diese Facette, wie er in der vorliegenden Erfindung offenbart wird, ist die Tatsache, dass die Stressgrenzwerte für die bestimmten Zellen der bestimmende Faktor sind. Zusätzlich, da weiteres Wissen erlangt worden ist, kann gezeigt werden, dass die Stressgrenzwerte eine Funktion kombinierter Effekte sind, wie die spezifische Spezies oder die spezifische Handhabung davor oder im Anschluss der Pferdespermienzellen. Der Schlüssel in dieser Hinsicht ist, dass der Stress, der den Pferdespermienzellen auferlegt wird, in der Tat ihre Lebensfähigkeit und ihre Fähigkeit, das gewünschte Ergebnis zu erzielen, verändern kann. Dies kann ungewöhnlich stark auf Pferdespezien zutreffen. In dem Fall des Drucks kann es sein, dass lediglich die Unterwerfung der Spermienzellen zu einem höheren Druck, als ein Ergebnis des Arbeitsvorgangs von dem Durchflusszytometer, zu einer verminderten Leistung der Pferdespermienzellen führt. Die vorliegende Erfindung fungiert in einer Hinsicht, um diese Stressfaktoren zu minimieren und führt folglich zu höheren Effizienzen und sowie zu niedrigeren Dosierungen, wie später diskutiert wird.
In Anbetracht des Stressaspekts der Pferdezellen arbeitet die vorliegende Erfindung auf eine Weise, die die Stressfaktoren minimiert. Diese Stressfaktoren können an irgendeinem Punkt in dem Gesamtzyklus oder -verfahren aus Sammeln, Sortieren und sogar dem Besamen des Tieres minimiert werden. Wichtig ist, der Stress, der durch die Handhabung der Zellen innerhalb des Durchflusszytometers eingeführt wird, scheint für die Pferdespezies signifikant zu sein. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Mantelflüssigkeit speziell ausgewählt, so dass sie auf eine koordinierte Weise mit sowohl (oder einem von beiden) der Zellflüssigkeitsumgebung vor dem Sortieren oder der Zellflüssigkeitsumgebung nach dem Sortieren nützen kann. Folglich fungiert die vorliegende Erfindung die Veränderungen durch den Typ des Arbeitsvorgangs oder durch die Auswahl der Substanzen zu minimieren, die als ein Mittel zur Minimierung der Veränderungen fungieren, die von den Pferdespermienzellen erfahren werden. Für die Mantelflüssigkeit wird eine Substanz entsprechend einer Ausführungsform der Erfindung ausgewählt, so dass sie chemisch mit den vorhandenen minimalen Veränderungen koordiniert ist. Folglich können, indem die geeignete Mantelflüssigkeit ausgewählt wird, nicht nur im Kontext der Durchflusszytometrieparameter, sondern vielmehr im Kontext der Parameter für die Pferdespermienzellen und für die künstliche Pferdebesamung selbst, die Veränderungen, die von den Zellen erfahren werden, und das Gesamtergebnis des Sortierens verbessert werden. Interessanterweise wurde für Pferdespermienzellen entdeckt, dass ein hepesgepuffertes Medium wie ein hepes bovines Gametenmedium – insbesondere HBGM3, wie es vorher von J. J. Parrish für Anwendungen bei Rindern erzeugt wurde – gut funktioniert. Dieses Medium wird in dem Artikel „Capactitation of Bovine Sperm by Heparin", 38 Biology of Reproduction 1171 (1988) diskutiert. Dies ist nicht nur überraschend, weil es nicht derselbe Verwendungstyp wie für das Rindersperma ist, sonder auch, weil der eigentliche Puffer ursprünglich für eine Anwendung in Rindern entwickelt worden ist. Folglich wird bei Anwendung in Pferden die Mantelflüssigkeit ausgewählt, die den Hepespuffer enthält.
Ein getrennter Aspekt der Durchflusszytometerverarbeitung, der auch wichtig sein kann, ist die Tatsache der richtigen Behandlung der Zellen sowohl chemisch als auch physikalisch, nachdem sie sortiert worden sind. Wie in der 2 gezeigt landen sie Zellen in den Tropfen (8) in dem Sammelbehälter (14). Die Sammelbehälterflüssigkeit (17) kann auch dazu dienen den Stress auf die Zellen zu minimieren. In einer Hinsicht, da es wichtig sein kann den Zellen sowohl vor als auch nach dem Sortieren einen Nährstoff bereitzustellen, kann die Sammelbehälterflüssigkeit (17) so ausgewählt sein, damit sie auch für eine leichtere Aufnahme sorgt. Für Pferdespermienzellen können die Zellen in einem kommerziellen Magermilchstreckmittel gesammelt werden, wie das von EZ-Mixin, Animal Reproduction Systems, Chino, CA. Obgleich er für einen anderen Zweck beabsichtigt ist, kann dieser Extender als eine Sammelflüssigkeit für Pferdespermienzellen verwendet werden. Darüber hinaus kann diese Sammelflüssigkeit auch 4% Eidotter enthalten.
Ein anderer Aspekt, der mit den verschiedenen Faktoren der vorliegenden Erfindung zusammenspielt, ist der eine Verwendung von niedrigen Dosismengen an Sperma für die künstliche Besamung und dergleichen. Zusätzliche Hintergrundinformation für diesen Aspekt der geschlechtsbestimmten, künstlichen Besamung kann in „Prospects for Sorting Mammalian Sperm" von Rupert P. Amman und George E. Seidel, Jr., Colorado Associates University Press (1982) und in der vorher zitierten PCT-Veröffentlichung gefunden worden. Wie früher erwähnt umfasst die natürliche Besamung bei Pferden Spermienzahlen in der Größenordnung von einer Milliarde Spermien. Die routinemäßige künstliche Besamung wird derzeit mit zweihundertfünzigmillionen oder mehr Spermien für die Pferdespezies durchgeführt. Mit dem Begriff „niedrige Dosis" ist gemeint, dass die Dosierung der für das Besamungsereignis verwendeten Spermien weniger als ein Viertel oder vorzugsweise sogar weniger als etwa 10% oder 5% der typischen Spermienzahl ist, die bei einem typischen Besamungsereignis von Pferden bereit gestellt wird. Folglich muss der Begriff „niedere Dosis" im Kontext der typischen künstlichen Besamungsdosierung oder als eine absolute Zahl betrachtet werden. Die absoluten Zahlen können natürlich von der Spezies abhängen. Für die Pferdespezies werden lediglich weniger als etwa fünfundzwanzig, zehn, fünf oder sogar eine Million Spermien als ein Niederdosisverfahren in Erwägung gezogen.
Noch ein anderer Aspekt, der wichtig sein kann, ist die Tatsache, dass das Sperma, das mittels den Techniken der vorliegenden Erfindung (oder auf eine andere Weise) dem Geschlecht nach bestimmt wurde, in einem System für die künstliche Besamung von Pferden verwendet wird. Folglich können die Techniken der vorliegenden Erfindung besonders relevant sein, wenn für eine Durchflusszytometertechnik der Sammelbehälter (14) verwendet wird, der das Sperma für die künstliche Besamung bereitstellt. Darüber hinaus ist es möglich, dass die Kombination aus sowohl der Verwendung für die künstliche Besamung von Pferden als auch die Verwendung in einer Niederdosisumgebung zusammen Synergien erzeugen können, die die verschiedenen der vorliegenden Erfindung besonders zweckdienlich machen. Selbstverständlich kann das geschlechtsbestimmte Sperma nicht nur in einem Verfahren zur künstlichen Besamung verwendet werden, sondern auch in anderen Techniken wie einer In-vitro-Fertilisation und dergleichen.
Das Verfahren zum Sammeln, Sortieren und schließlich zur Besamung eines Tieres durch die Verwendung einer Sortierung mittels Durchflusszytometrie oder einer anderen Trennungstechnik umfasst viele Schritte. Im Kontext der Besamung von Pferden wird als erstes das Sperma von einem Hengst gesammelt. Das Sperma kann direkt vor der geplanten Besamung von Hengsten gesammelt werden, die für eine hohe Fertilität bekannt sind. Dies kann mit einer künstlichen Vagina des Coloradomodells (Aminal Reproduction Systems, Chino, CA) geschehen, die mit einem in-line Gelfilter ausgestattet ist. Die Ejakulate können dann hinsichtlich des gelfreien Volumens, der Motilität und Spermatozoenkonzentration beurteilt werden. Das Sperma kann dann mit einem kommerziellen Magermilch-Glukose- Streckmittel (EZ-Mixin, OF, Animal Reproduction Systems, Chino, CA) auf entweder 25 × 10⁶ pms/ml (n = 51) oder 5 × 10⁶ pms/ml (n = 10) gestreckt werden. Das Sperma kann bis die Besamungen kurz nach dem Sammeln durchgeführt werden auf Rumtemperatur gehalten werden. Die Färbung kann entsprechend einem Multi- oder Einfachfärbeprotokoll bewerkstelligt werden, das Letztere ist Gegenstand des Johnson Patents und der verwandten Technologie.
Nach der Zugabe des Farbstoffs kann die Verdünnung oder Streckung auf die gewünschte Sortierkonzentration durchgeführt werden. Das Sortieren entsprechend den verschiedenen früher diskutierten Techniken kann dann durchgeführt werden, woraus Spermienzellen in der Sammelphase zurück gewonnen werden.
Eine optimale Zahl motiler Spermatozoen pro Besamungsdosis, um die Fertilität mit früheren Techniken zu maximieren, war vielleicht in Spezien wie Schwein, Schaf und Rind gut etabliert. Mit der vorliegenden Erfindung scheint die minimale Zahl motiler Spermatozoen viel weniger als die 250 bis 500 × 10⁶ progressiv motilen Spermien (pms) zu sein, die gewöhnlich empfohlenen werden. Unter idealen Bedingungen sind Stuten sogar mit der geringen Zahl von 100 × 10⁶ pms besamt worden, ohne die Fertilität zu vermindern. (Forscher haben keinen Unterschied zwischen Stuten gefunden, die über drei Zyklen mit 100 oder 500 × 10⁶ pms besamt worden sind, und sie erreichten Schwangerschaftsraten von 63,9 beziehungsweise 75%.) Die vorliegende Erfindung zeigt, dass jetzt sogar geringere Zahlen möglich sind – und dass die geringeren Zahlen in einer Außenumgebung erreicht werden können.
Obwohl der Unterschied nicht signifikant war, waren in einem Experiment die Schwangerschaftsraten für die 100 und 500 × 10⁶ Behandlungen für die Zyklen 1, 2 und 3 25 gegenüber 39, 33 gegenüber 45 beziehungsweise 28 gegenüber 25%. Bemerkenswert ist, andere haben von einer Zunahme der Fohlungsrate berichtet, wenn die Zahl der motilen Spermatozoen pro Besamung von 40 auf 80 × 10⁶ erhöht wurde, aber es wurde keine weitere Verbesserung beobachtet, wenn die Zahl der Spermatozoen auf 160 × 10⁶ erhöht wurde. In einem Experiment, wobei zwei Gruppen von 14 superfertilen Stuten verwendet wurden, hat ein Forscher keinen Unterscheid zwischen den Behandlungen gefunden, wobei 100 oder 500 × 10⁶ motile Spermatozoen pro Besamung verwendet worden sind (35,7 gegenüber beziehungsweise 42,9%). Später hat derselbe Forscher nach einer Zucht über drei Zyklen von Stuten, die mit 50, 100 und 500 × 10⁶ pms, von Schwangerschaftsraten mit 41,7, 65,6 beziehungsweise 81,3% von Daten berichtet, für die aus mehreren Experimenten der Durchschnittswert ermittelt wurde. Es gab noch andere auf dem Fachgebiet mit 50 und 500 × 10⁶ pms (über drei Zyklen) besamte Stuten und es wurde ein signifikanter Unterschied zwischen den Schwangerschaftsraten von 37,5 beziehungsweise 75% gefunden. In einer neueren Untersuchung hat einer der Erfinder Stuten mit Pferdehypophysenextrakt (EPE) superovuliert und die Stuten einmal mit 50 × 10⁶ pms besamt. Die Schwangerschaftsraten waren zwischen den Stuten, die mit EPE behandelt worden sind, und den Salinekontrollen nicht unterschiedlich (65 beziehungsweise 55%).
Bei der bestehenden routinemäßigen künstlichen Besamung von Pferden werden, obwohl es einen geringen Unterschied in der Fertilität zwischen den 100 und den 500 × 10⁶ Spermatozoen pro Besamungsdosis zu geben scheint, im Allgemeinen 500 × 10⁶ pms empfohlen, um eine maximale Fertilität bereit zu stellen. Wenn jedoch die richtigen Techniken für eine künstliche Besamung verwendet worden sind, hat man auch geglaubt, dass 100 × 10⁶ pms von einem hoch fertilen Hengst das Minimum sind, das für die früheren Techniken angemessen ist. Unter einem allgemein mehr anerkannten Umstand, wenn eine routinemäßige künstliche Besamung (AI) mit fertilen Hengsten und Stuten durchgeführt wurde, wurde berichtet, dass 500 × 10⁶ progressiv motile Spermien/Dosis, mit der jeden zweiten Tag besamt wurde während sich die Stuten im Östrus befinden, zu einer maximalen Fertilität führen. Wie früher erwähnt ist das Problem damit einfach, die Besamung von Stuten mit einer geringen Zahl von Spermatozoen kann notwenig sein, wenn das Sperma begrenzt ist oder wenn geschlechtssortiertes Sperma verwendet wird.
Wie früher erwähnt ist es derzeitig möglich etwa 1000 lebende Pferdespermien/Sekunde (3,6 × 10⁶/h) von jeder geschlechtschromosomalen Zusammensetzung zu erhalten, wenn die Spermatozoen nach den Geschlechtschromosomen mittels Durchflusszytometrie bei einer Genauigkeit von 90% sortiert werden. Demnach wäre es unmöglich 500 × 10⁶ Spermien für eine Besamung zu erhalten, die mit 3,6 × 10⁶ Spermien/Stunde nach den Geschlechtschromosomen sortiert worden sind. Das Ziel war es deshalb geringere Zahlen von Spermatozoen pro Besamungsdosis zu erreichen, während eine annehmbare Fertilität erhalten wird. Es war der Gegenstand Schwangerschaftsraten in Stuten zu erzielen, die bei einer einzigen Gelegenheit mit der geringen Zahl von 25 oder 5 × 10⁶ oder weniger progressiv motilen Spermatozoen (pms) nahe der Ovulation besamt worden sind.
Das normale Hengstejakulat enthält ein durchschnittliches Volumen von 50 ml. Der Hengst deponiert dieses hohe Spermavolumen direkt in den Uterus des Weibchens. In einer anderen Spezies (Eber), die mehrere hundert ml Sperma ejakuliert, dringen nur 0,5–0,1 ml in jeden Eileiter zu Beginn des Östrus ein, um die Befruchtung zu ermöglichen. Dieses große Samenvolumen füllt die Region an der Uterus-Eileiterverbindung auf, bis ein Spermatozoenreservoir in dem Isthmus aufgebaut ist. Deshalb wird ein bestimmtes Spermavolumen in dem Isthmus etabliert und der verbliebene Inhalt wird schnell eliminiert.
Für die künstliche Besamung kann die Zahl der Spermatozoen in einer Besamungsdosis entscheidend sein. Es werden häufig Samenstreckmittel verwendet, um das Rohsperma zu verdünnen und größere und leichter handhabbare Besamungsvolumina bereitzustellen. Im Stand der Technik wird im Allgemeinen ein Volumen empfohlen, das zwischen 10 und 25 ml Sperma liegt, obwohl sich nun, wohl abhängig von der Konzentration der Spermatozoen, kleine Besamungsvolumina als genauso wirksam wie größere Volumina herausstellen können. Obwohl die Konzentration nicht näher angegeben worden ist, haben Besamungsvolumina, die von 0,6–26,8 ml Sperma reichen, die Fertilität nicht nachteilig beeinflusst, wenn die Auswirkungen einer Besamung mit Volumina von 10 oder 50 ml gestrecktem Sperma auf die Embryoausbeuteraten in Stuten untersucht worden sind. Basierend aber auf diesem Experiment gab es eine Verminderung in den Embryoausbeuteraten von Stuten, die mit einem Volumen von 50 ml gestrecktem Sperma besamt worden sind, verglichen mit einem 10 ml Volumen, wenn beide eine gleiche Zahl an pms enthielten. Die verminderte Fertilität kann auf Grund des vergrößerten Besamungsvolumens gewesen sein oder könnte auf Grund der verringerten Spermatozoenkonzentration sein, da sie 1/5 der Konzentration von dem 10 ml Volumen war (5 gegenüber 25 × 10⁶).
Es wurden weitere Experimente durchgeführt, um zu bestimmen: 1) die Embryoausbeuterate, wenn die Stuten mit 100 × 10⁶ pms besamt wurden, die in 10, 100 oder 200 ml getrocknetem Magermilchstreckmittel gestreckt worden sind, und 2) die Embryoausbeuterate, wenn die Stuten mit 250 × 10⁶ pms besamt wurden, die entweder in 10 oder 100 ml von dem Spermastreckmittel aus Experiment 1 gestreckt worden sind. Die Ergebnisse aus dem Experiment 1 zeigten in den Embryoausbeuteraten nur einen Unterschied zwischen den Stuten, die mit 10 (40%) und 200 ml (0%) besamt wurden. In einem dieser Experimente gab es einen signifikanten Unterschied zwischen den Stuten, die mit 10 ml (70,6%) besamt worden sind, verglichen mit 100 ml (13%). Folglich waren die Besamungsvolumina von 100 oder 200 ml mit niedrigeren Embryoausbeuteraten verbunden als ein 10 ml Volumen, wohl auf Grund der geringeren Spermienkonzentration oder des retrograden Verlusts an Spermien in die Vagina.
Sie führten eine Untersuchung durch, um zu testen, ob das Volumen allein die Fertilität beeinflusst, wenn ausreichende Konzentrationen und Zahlen an Spermatozoen vorhanden sind. Sie folgerten, dass es keinen Unterschied zwischen Stuten gab, die mit entweder 30 oder 120 ml gekühltem Sperma mit einer Konzentration von 50 × 10⁶ pms/ml besamt wurden. Dieser Ansatz wird jedoch in der vorliegenden Erfindung zu einem gewissen Grad nicht Folge geleistet.
Das Timing und die Häufigkeit der Besamung kann eine sehr wichtige Rolle bei den meisten Zuchtarbeitsvorgängen spielen, insbesondere wenn gefrorenes oder versandgekühltes Sperma involviert ist. Die Zahl und das Timing der Besamungen kann die Fertilität beeinflussen. Die Durchschnittsstute ovuliert während der physiologischen Fortpflanzungszeit alle 21 Tage und die durchschnittliche Dauer des Östrus während dieser Zeit ist 5–7 Tage. Während des Östrus urinieren die Stuten passiv, heben ihnen Schwanz und präsentieren dem Hengst ihre Hinterviertel. Unter natürlichen Bedingungen, wenn ein Hengst in eine Herde mit 20 Stuten eingeführt worden ist, war die Zahl der Deckungen pro Beobachtungsstunde 2,4 ± 0,2. Die Hengste decken häufig dieselbe Stute mehrere Male pro Tag (unter natürlichen Bedingungen). In einer Studie wurden 20 Stuten synchronisiert und in eine Weide mit einem Hengst gegeben und für 9 Tage beobachtet. Der Hengst paarte sich 9,12-mal pro Tag und deckte 17 von 18 Stuten.
Die Forscher haben auch Daten über mehrere Fortpflanzungszeiten erarbeitet, die die Wirkung der Zahl von Besamungen auf die Schwangerschaftsraten vergleichen. Es wurden mehr Stuten trächtig, wenn sie, während dem Zyklus 1 fünfmal (68%) besamt wurden, als Stuten, die dreimal (35,9%) besamt wurden. Es wurden keine anderen Unterschiede hinsichtlich der Zahl der Besamungen auf die Schwangerschaftsraten während dem Zyklus 1 bemerkt. Es gab bei den Schwangerschaftsraten während den Zyklen 2 und 3 keine Unterschiede, wenn die Stuten ein- bis siebenmal besamt wurden. Es wurden mehr Stuten trächtig, wenn sie 5-mal (60%) besamt wurden, als Stuten, die 1-mal (23,5%), 2-mal (35%) oder 3-mal (35,5%) über 3 Zyklen besamt wurden. Wenn alle 3 Zyklen betrachtet werden, dann wurden die Stuten, die trächtig wurden, durchschnittlich 3,3-mal besamt, was nicht mehr war als der Durchschnitt von 2,8-mal für die Stuten, die nicht trächtig wurden.
Es ist auch bestimmt worden, dass mehrere Besamungen pro Zyklus für die Fertilität nicht von Nachteil waren. In einer Untersuchung wurden die Daten von 257 Stuten über einen Zeitraum von 10 Jahren gesammelt, um die Beziehung zwischen der Zahl der Besamungen pro Zyklus, der Dauer des Östrus und den Schwangerschaftsraten zu ermitteln. Die Stuten wurden mit 100 × 10⁶ Spermatozoen besamt. Die Schwangerschaftsraten des ersten Zyklus mit 22,0, 23,0, 38,6, 52,5, 58,3 und 52,2% wurden erreicht, wenn die Stuten 1-, 2-, 3-, 4-, 5- oder 6-mal oder beziehungsweise öfter mal pro Zyklus besamt wurden. Es wurden weniger Stuten nach drei Zyklen trächtig, wenn sie 1- bis 4-mal pro Zyklus besamt wurden, als die Stuten, die ≥ 12-mal pro Zyklus besamt wurden. Eine weitere Untersuchung besamte 62 Stuten über drei Zyklen alle 48 Stunden während des Östrus mit 200 × 10⁶ pms für ein Maximum von drei Besamungen. Mit den Besamungen wurde begonnen, als ein Follikel mit ≥ 30 mm nachgewiesen wurde und sie wurden bis zur Ovulation fortgesetzt. Die Fertilität pro Zyklus war 45% und nicht unterschiedlich, wenn zwei oder mehr Besamungen pro Zyklus gemacht wurden, verglichen mit einer Besamung pro Zyklus. Sie bestimmten auch, dass die höchsten Schwangerschaftsraten mit Besamungen erreicht wurden, die zwischen 48 und 72 (8/23) oder 72 und 96 Stunden (8/23) vor der Ovulation durchgeführt worden sind, und dass die letzte Besamung wenigstens in 51% der Zeit nicht die befruchtende Besamung war. Insgesamt, wenn eine routinemäßige AI mit fertilen Hengsten und Stuten durchgeführt wurde, führten 500 × 10⁶ pms/Dosis, mit denen jeden zweiten Tag besamt wurde während sich die Stuten im Östrus befanden, zu einer maximalen Fertilität. Mit der vorliegenden Erfindung sind jetzt viel geringere Zahlen möglich.
Die Induktion der Ovulation in der Stute zu einer bestimmten Zeit kann aus den folgenden Gründen vorteilhaft sein: um sicher zu stellen, dass die Ovulation innerhalb von 36–48 Stunden nach der Paarung stattfinden wird, was die Notwendigkeit für eine erneute Deckung beseitigt, (b) bei der Verwendung von gekühlten, gefrorenen oder geschlechtssortiertem Sperma, wenn das Timing für eine maximale Fertilität entscheidend ist, (c) um sicher zu stellen, dass nur eine einzige Besamung nahe der Ovulation nötig ist, wenn superfertile Hengste oder Stuten verwendet werden, (d) um den Transport von Stuten oder Hengsten zu minimieren und (e) um die Ovulationen zu staffeln, wenn mehrere Stuten zur gleichen Zeit im Östrus sind.
Das humane Choriongonadotropin (hCG) wird von dem Zytotrophoblast der Chorionzotten der humanen Plazenta hergestellt. Es ist ein Glykoproteinhormon, das aus zwei Untereinheiten (α und β) zusammengesetzt ist, die nicht kovalent miteinander verbunden sind. Es hat eine Halbwertszeit von 8–12 Stunden im Blut.
Von der Verwendung von hCG für die Induktion einer Ovulation während dem Östruszyklus der Stute wurde das erste Mal 1937 durch Mirskaja und Petropavlovski berichtet. Sie fanden, dass die Ovulation innerhalb von 24 bis 48 Stunden nach der Injektion eines Rohextrakts aus humanem Schwangerschaftsurin (Prolan^®) stattfand, der am ersten Tag des Östrus injiziert wurde. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass wenn hCG (1500–3300 IU) in eine Stute während dem frühen Östrus injiziert wird, es die Aktivität des luteinisierende Hormons (LH) nachahmt und im Allgemeinen innerhalb von 24 bis 48 die Ovulation induziert. Die Verwendung von hCG mit einer Dosis von 2000–3000 IU hat nicht die Fertilität verringert. Einige Forscher haben jedoch gefunden, dass die höheren Dosen (4500–6000 IU) zu Reproduktionsstörungen führten und zu einer verminderten Schwangerschaftsrate. Obwohl die Verwendung von hCG sehr wirksam bei der Induktion der Ovulation sein kann, haben mehrere Forscher gezeigt, dass die Verabreichung von hCG über mehrere aufeinander folgende Östruszyklen zu einer Antikörperbildung führen kann, wobei die mittlere Dauer des Östrus und der Ovulation entweder gleich wie bei den Kontrollstuten oder 2 Tage länger als bei den Kontrollen war.
Das native Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) ist ein Decapeptid, das in dem Hypothalamus synthetisiert wird und in sekretorischen Granula der Median Eminence gelagert wird. Nach der Freisetzung tritt das GnRH in das Portalsystem ein und wird zu dem Hypophysenvorderlappen transportiert und bindet als Rezeptoren auf gonadotrope Zellen, wo es die Synthese und Sekretion des luteinisierende Hormons (LH) und des follikelstimulierenden Hormons (FSH) stimuliert. Es wurden auch Forschungen für die Verwendung von nativem GnRH und GnRH-Analogons, in denen 1 oder 2 Aminosäuren modifiziert worden sind, bei der Induzierung der Ovulation während dem Östrus in der Stute durchgeführt.
Eine stoßartige oder kontinuierliche Verabreichung des nativen GnRH verursacht eine vorhersagbare Ovulation. In einer Studie wurden 11 im Zyklus befindlichen Stuten entweder Saline oder 20 μg GnRH in einem stoßartigen Muster (ein 5-sek. Impuls/h, 2 h oder 4 h) infundiert, beginnend am Tag 16 des Östruszyklus. Die Zahl der Tage vom Beginn der Behandlung an bis zur Ovulation war geringer in den Stuten, denen 20 μg GnRH/h infundiert wurde, verglichen mit den Salinekontrollstuten oder den 20 μg GnRH pro 4 h. Es wurde gefolgert, dass die stoßartige Infusion von GnRH bei der Förderung der Ovulation wirksam ist, die Häufigkeit des Impulses aber eine kritische Variable ist. Es ist auch natives GnRH verwendet worden, um die Follikelentwicklung und die Ovulation in Stuten zu induzieren, die sich in dem saisonbedingten Anöstrus befinden. Ein Kurzzeitimplantat, das 1,5 oder 2,2 mg von dem GnRH-Analogon Deslorelin freisetzt, verursacht innerhalb von 36–48 Stunden die Ovulation, wenn es an Stuten im Östrus mit einem Follikel mit einem Durchmesser von > 30 mm verabreicht wird.
Einer der Erfinder hat die Wirkung von verschiedenen Dosen von einem GnRH-Analogon (Deslorelinacetat)-implantat auf die Induktion der Ovulation von im Zyklus befindlichen Stuten verglichen und gefunden, dass die Ovulation in den meisten Stuten innerhalb von 48 h nach der Injektion induziert worden ist und es keinen Vorteil von Dosen höher als 2,2 mg/Stute gibt. Andere haben die Verwendung von hCG, Buslerelin (ein GnRH- Analogon) und Luprostiol (ein PGF₂α-Analogon) für die Induktion der Ovulation von im Zyklus befindlichen Stuten verglichen. Beide, Buslerelin und hCG, verkürzten den Zeitraum von der Behandlung zur Ovulation, während Luprostiol fehlschlug die Ovulation zu beschleunigen.
Der Pferdehypophysenextrakt (EPE) wird aus den Hypophysenvorderlappendrüsen von Pferden erhalten. Die Herstellung von EPE für die Experimente als ein rohes Gonadotropin ist von Braselton und McShan (1970) und vor kürzerer Zeit von Guillou und Combarnous (1983) beschrieben worden. Der EPE ist in der Stute vornehmlich verwendet worden, um das Wachstum von mehreren Follikeln in im Zyklus oder Anöstrus befindlichen Stuten zu induzieren oder für die Superovulation im Mutterschaf.
Die Verwendung von Pferdehypophysenextrakt als ein Ovulationsmittel in der Stute ist bekannt gewesen. In einigen Studien haben manche das luteinisierende Hormon (eLH) und des follikelstimulierenden Hormons (eFSH) von Pferden durch eine Hydrophobe-Interaktion-Chromatographie (HIC) getrennt und die Experimente durchgeführt. In einem Experiment wurde die LH-Aktivität in rohem Pferdegonadotropin (CEG) mit der LH-Aktivität in der HIC-Fraktion hinsichtlich ihrer Fähigkeit die Ovulation zu induzieren verglichen. Von 25 Kontrollstuten ovulierten 7 innerhalb von 48 h, verglichen mit 24/25 Stuten, die mit CEG behandelt worden sind, und 19/26 Stuten, die mit LH behandelt worden sind. Es wurde ein anderes Experiment aufgestellt, um die Fähigkeit der eFSH-angereicherten Fraktion des Hypophysenextrakts zu testen das Wachstum von mehreren Follikeln zu induzieren, wenn man sie mit CEG vergleicht. Die Zahl der Follikel, die 30 mm erreichte, war in der CEG- gegenüber der FSH-behandelten Gruppe die gleiche und beide Gruppen waren verschieden, wenn man sie mit der Kontrolle verglich. Die Ovulationsraten waren zwischen den zwei Behandlungsgruppen nicht verschieden, sie unterschiedenen sich aber zu der Kontrollgruppe.
Historisch war das geläufige Verfahren zur Induktion der Ovulation eine einzige hCG-Injektion. Die bleibt nach wie vor das am häufigsten gebrauchte Verfahren. Da es jedoch keinen Unterschied in den Schwangerschaftsraten oder dem Timing der Ovulation gibt, wenn entweder GnRH oder hCG an die im Zyklus befindlichen Stuten verabreicht wird, sind beide Behandlungen ein akzeptables Verfahren für die Induktion der Ovulation. EPE ist jedoch kommerziell für einen Fachmann nicht erhältlich und ist deshalb keine praxisnahe Technik für die Induktion der Ovulation.
Unter natürlichen Paarungsbedingungen wird das Ejakulat direkt in den Uterus der Stute deponiert. Spallanzani war der Erste, der über die künstliche Besamung (AI) in Hunden berichtete und dann in Pferden in den späten 1700ern. Die Verwendung einer AI wurde im Rind, Schaf, Schwein und Pferden dokumentiert. Pferde, Rinder und Schweine werden künstlich innerhalb des Uteruskörpers besamt; Schafe, Ziegen und Hunde in die Zervix; und Katzen in der anteriore Vagina. Ebenso für Pferdeartige haben andere die routinemäßige Samensammel- und Handhabungsverfahren im Pferd beschrieben. Für routinemäßige AI-Verfahren wird das Sperma innerhalb des Uteruskörpers deponiert, wobei eine sterile Besamungspipette und -spritze verwendet werden. Es gibt jedoch mehrere Gründe für die Verwendung von alternativen Stellen und Techniken für die künstliche Besamung: a) Besamung mit gefrorenem aufgetautem Sperma von geringer Qualität oder beschränkter Quantität, b) Besamung mit Sperma von einem superfertilen Zuchttier oder c) Besamung mit geschlechtsbestimmten Sperma, von dem es nur eine beschränkte Menge gibt. Einige alternative AI-Techniken schießen ein: intrauterine Besamung (mittels Laparoskopie oder nicht chirurgischen Techniken) in jenen Spezien, in denen zervikale oder vaginale Besamungen routinemäßig durchgeführt werden, oviduktale Besamung (mittels Laparoskopie oder Flankenlaparotomie) oder eine tief-intrauterine nicht chirurgische Besamung.
Die laparoskopische intrauterine Besamung hat sich zu der am wenigsten invasiven Technik für die Spermadeposition direkt in den Uterus von Schafen und Ziegen seit den frühen 1970ern entwickelt, sobald die geeignete Ausrüstung entwickelt worden war. Die laparoskopische Besamung wird routinemäßig im Mutterschaf und der Ziege mit einer hohen Fertilität verglichen mit der traditionellen AI durchgeführt. Von einer laparoskopischen intrauterinen Besamung wurde erfolgreich im Frettchen, der Hauskatze, dem Tiger, dem Gepard und dem Leopard und jüngst dem Opossum und Wallaby berichtet. Einige der Vorteile einer laparoskopischen Besamung umfassen: genetische Verbesserung, wobei gefrorenes Sperma verwendet wird, eine erhöhte Anzahl von Besamungen pro Sammlung, wobei geringe Spermienzahlen verwendet werden, und eine höhere Fertilität. Der Hauptnachteil der laparoskopischen Besamung sind die höheren Kosten für die Ausrüstung und das Verfahren (Fachlabor, Medikamente, Spermaverarbeitung). Dieses Verfahren ist für den Patienten auch relativ invasiv.
Die nicht chirurgische intrauterine Besamung mit Mutterschafen wird in einem Versuch verwendet die Fertilitätsraten in Spezien zu erhöhen, die routinemäßig in die Zervix besamt werden. Ein Forscher erhielt eine Lammungsrate von 75% in Folge einer intrauterinen Besamung, verglichen mit 17% nach einer tiefen zervikalen Besamung und 30% nach einer doppelten caudozervikalen Besamung. In einer anderen Studie deponierte ein Forscher gefrorenes-getautes Widdersperma in drei Regionen des Genitaltrackts von Mutterschafen. In der Gruppe 1 wurde eine einzige intrauterine Besamung vorgenommen, während in der Gruppe 2 die Mutterschafe einmal tief in der Zervix besamt wurden, und in der Gruppe 3 die Mutterschafe zweimal 12 Stunden auseinander in die caudozervikale Region besamt wurden; die Empfängnisraten waren 89, 45 beziehungsweise 57%. Andere haben von ähnlichen Ergebnissen bei einer intrauterinen Besamung berichtet. Es wurde auch eine nicht chirurgische endoskopische Besamung in Hündinnen vorgenommen, die zu hohen Schwangerschaftsraten führte.
Bei der oviduktalen Besamung (OI) wird das Oviduktlumen mit einem kleinen Spermavolumen (gewöhnlich 0,05–0,5 ml) chirurgisch besamt. Eine Studie besamte neun Säue, wobei eine laparoskopische Besamung verwendet wurde. Zwei der neun (22%) Säue wurden von einer einzigen Besamung trächtig. Eine jüngere Untersuchung im Mutterschaf bestimmte die Auswirkungen der Zahl an Spermatozoen, das Timing und die Stelle der Besamung auf die Fertilität. Im Experiment 1 wurden Mutterschafe mit 10⁴, 10⁵, 10⁶ oder 10⁷ Spermatozoen besamt. Die 48 Stunden später eingeholten Ova wurden als befruchtet eingestuft, wenn sie sich geteilt hatten. Die Ergebnisse zeigten, dass mehr Mutterschafe nach der oviduktalen als nach der intrauterinen Besamung (61 gegenüber 39%) und eher mit hohen (10⁶ und 10⁷) als mit niedrigen (10⁴ und 10⁵) Spermatozoendosen für die intrauterinen, aber nicht für die oviduktalen Besamungen, fertil waren. Forscher an unserer Einrichtung haben zum ersten Mal die Anwendbarkeit einer OI erreicht, um Schwangerschaften in der Stute zu erzielen. Es wurden 14 Stuten mittels OI mit 50 × 10³ pms besamt und 15 wurden mittels einer intrauterinen AI mit 500 × 10⁶ pms besamt. Die Schwangerschaftsraten waren zwischen den Gruppen mit 3/14 (21,4%) beziehungsweise 6/15 (40%) nicht unterschiedlich. Die oviduktale Besamung ist auch erfolgreich verwendet worden, um Schwangerschaften in Frauen und Kaninchen zu erzielen.
In den vergangenen vier Jahrzehnten ist in Kühen der Ort für die Samendeposition während der künstlichen Besamung der Uteruskörper gewesen. Dies ist eine akzeptable Technik, wenn große Zahlen an fertilen Spermatozoen für die Besamung verfügbar sind, aber in Pferden – insbesondere wenn beschränkte Zahlen von Spermien verfügbar sind – ist ein alternativer Ansatz entwickelt worden. Die tief-intrauterine Besamung ist eine Technik, die verwendet worden ist, um Schwangerschaften im Rind zu erhalten. Eine Studie verglich die Schwangerschaftsraten für eine AI, wenn das Sperma in den Uteruskörper hinein oder in beiden cornu uteri (cornuale Besamung) deponiert wurde. Die Schwangerschaftsraten waren, wenn das Sperma in den Uteruskörper deponiert wurde, 44,7%, verglichen mit 64,6% bei der cornualen Besamung.
Wie diese Erfindung zeigt kann es eine Kongruenz von den Verfahren zur Geschlechtsbestimmung von Spermien, basierend auf dem DNA-Gehalt, dem Hochgeschwindigkeitsdurchflusszytometer/Cell Sorter und den Verfahren zur Besamung von Pferden mit weniger als fünfundzwanzigmillionen Gesamtspermien geben, ohne die Fertilität zu beeinträchtigen, wodurch sich die Möglichkeit einer nicht chirurgischen praktikablen oder sogar geschlechtsbestimmten Spermaindustrie in Pferden ergibt. Interessanterweise können durch die Besamung tief innerhalb des cornu uteri der Stute bessere Ergebnisse erzielt werden als durch die Besamung in den Uteruskörper hinein, wo solche Besamungen gewöhnlich platziert werden. Unter tief sollte verstanden werden, dass die Insertion weit in das cornu uteri platziert wird. Es kann, muss aber nicht, unter Verwendung der Embryotransferausrüstung durchgeführt werden.
Als ein Ergebnis der Besamung wird selbstverständlich gewünscht, dass ein Tier mit dem gewünschten Geschlecht hergestellt wird. Dieses Tier kann entsprechend den früher diskutierten Systemen durch die Verwendung der geschlechtsbestimmten Spermienproben hergestellt werden. Es sollte selbstverständlich sein, dass die Techniken der vorliegenden Erfindung eine Anwendung in anderen Techniken finden können, wie der laproskopischen Besamung, der oviduktalen Besamung oder dergleichen. Als Beispiele sind die folgenden Experimente durchgeführt worden. Während nicht alle jeden Aspekt der hierin beschriebenen Erfindungen verwenden und nicht alle Leistungssteigerungen der Erfindung aufzeigen, zeigen sie eingeige Verbesserungen, die durch unterschiedliche Aspekte der Erfindung möglich sind.
Stuten – Einundsechzig reproduktionsnormale im Zyklus befindliche Stuten der Light Horse Rasse, deren Alter von 3 bis 15 reichte, wurden verwendet. Den Stuten wurde Cloprostenol (250 μl i.m.) verabreicht, um die Luteolyse zu induzieren, und sie wurden jeden zweiten Tag mittels Palpation und Ultrasolographie des Fortpflanzungtrakts per rectum untersucht, bis ein Follikel > 30 mm nachgewiesen wurde, und dann täglich bis zur Ovulation. Wenn eine Stute einmal ein Follikel ≥ 35 mm entwickelt hat, wurde ein Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH)-implantat (Deslorelinacetat 2,2 mg, Ovuplant^®, Fort Dodge, IA) subkutan verabreicht und sie wurde 1 von 3 Behandlungsgruppen zugeteilt.
Behandlungsgruppe 1 – Die Stuten wurden bei einer einzigen Gelegenheit mit 500 × 10⁶ pms in einem Volumen von 20 ml (25 × 10⁶ pms/ml) entweder 40 h (n = 9) oder 34 h (n = 11) nach der GnRH-Verabreichung besamt. Das Sperma wurde in dem Uteruskörper unter Verwendung einer flexiblen Plastikpipette (IMV, Frankreich) für eine künstliche Besamung (AI) deponiert.
Behandlungsgruppe 2 – Die Stuten wurden bei einer einzigen Gelegenheit mit 25 × 10⁶ pms in einem Volumen von 1 ml (25 × 10⁶ pms/ml) entweder 40 h (n = 13) oder 34 h (n = 8) nach der GnRH-Verabreichung besamt. Das Sperma wurde an der Spitze des cornu uteri ipsilateral zu dem präovularen Follikel deponiert, wobei eine flexible Plastik-AI-Pipette verwendet wurde. Die Platzierung der Pipette innerhalb des Uterus wurde durch eine transrektale Ultrasonographie vor der Spermadeposition bestätigt.
Behandlungsgruppe 3 – Die Stuten wurden bei einer einzigen Gelegenheit mit 5 × 10⁶ pms in einem Volumen von 1 ml (5 × 10⁶ pms/ml) 40 h (n = 13) oder in einem Volumen von 0,2 ml (25 × 10⁶ pms/ml) 34 h (n = 8) nach der GnRH-Verabreichung besamt. Die Stuten, die 1 ml erhielten, wurden mit einer flexiblen Plastik-AI-Pipette besamt, während die Stuten, die 0,2 ml erhielten, unter Verwendung einer Einmal-Implant-Gun (Veterinary Concepts, Green Valley, WI) besamt wurden, die einen 0,5 ml Strohhalm enthielt. Es wurden verschiedene Besamungspipetten verwendet, um die Zuführung von den zwei verschiedenen Volumina zu optimieren. Das Sperma wurde an der Spitze des cornu uteri ipsilateral zu dem präovularen Follikel deponiert. Die Platzierung der Pipetten innerhalb des Uterus wurde durch eine transrektale Ultrasonographie vor der Spermadeposition bestätigt.
Nach der Besamung wurden die Stuten täglich untersucht, um den Tag der Ovulation zu bestimmen. Die Schwangerschaftsprüfungen wurden mittels Ultrasonographie an den Tagen 12, 14 und 16 postovulation durchgeführt. Die Schwangerschaftsraten waren zwischen zwei Hengsten der Araberrasse (Hengst A = 22/31, 71%; Hangst B = 15/30, 50%) (p > 0,1) oder zwischen den Stuten, die 34 Stunden, gegenüber den Stuten, die 40 Stunden nach der GnRH-Verabreichung besamt wurden (19/29, 65% beziehungsweise 18/32, 56%), nicht verschieden, so dass die Datensets kombiniert wurden. Wie in der Tabelle 1 gezeigt hatten die Stuten, die mit 500 × 10⁶ pms in einem 20 ml Volumen besamt worden sind, eine signifikant höhere (p < 0,05) Schwangerschaftsrate als die die Stuten, die mit 25 oder 5 × 10⁶ pms besamt worden sind (Tabelle 1). Es gab keinen signifikanten Unterschied (p > 0,05) in den Schwangerschaftsraten zwischen des Stuten, die mit 25 × 10⁶ pms besamt worden sind, und den Stuten, die mit 5 × 10⁶ pms in einem Volumen von 1 ml oder 0,2 ml besamt worden. Obwohl die Fertilität mit 500 × 10⁶ pms verglichen mit der Gruppe 2 (25 × 10⁶ pms) signifikant höher war, wurde durch eine einzige Besamung eine anfängliche Rate von 57% erzielt. Dies war nicht anders als die Schwangerschaftsraten, die mit der Gruppe 3 (5 × 10⁶ pms), 7/20 (35%), erzielt wurden. Tabelle 1 Schwangerschaftsraten aus einer einzigen Besamung

Zahl progressiv motiler Spermien % trächtig am Tag 16

500 × 10⁶ in 20 ml 18/20 (90%)^a

25 × 10⁶ in 1 ml 12/21 (57%)^b

5 × 10⁶ in 1 ml 3/10 (30%)^b

5 × 10⁶ in 0,2 ml 4/10 (40%)^b ^a,b

Werte mit unterschiedlichem hochgestellten Indizes unterscheiden sich (p < 0,05), (Chi-Quadrat)

Tabelle 1
Das Timing für die Besamung relativ zu der GnRH-Verabreichung wurde von 40 auf 34 h post GnRH während den Experimenten verändert, weil viele Stuten vor der geplanten Besamung ovulierten und deshalb nicht besamt worden sind. Die Daten von 22 Stutenzyklen (26,5%) wurden ausgeschlossen, weil sie entweder vor der geplanten Besamung ovulierten (n = 11), nicht ovulierten (n = 3) oder > 4 Tage nach der GnRH-Verabreichung ovulierten (n = 8).
Die optimale Spermienzahl, die im Allgemeinen pro Besamungsdosis empfohlen wird, ist 500 × 10⁶ pms jeden zweiten Tag während die Stute im Östrus ist. Wie jedoch früher erwähnt hat es Untersuchungen gegeben, die keine Abnahme in der Fertilität gezeigt haben, wenn mit 100 × 10⁶ verglichen mit 500 × 10⁶ motilen Spermien besamt wurde. Untersuchungen mit 50 × 10⁶ motilen Spermien haben eine Verminderung in der Fertilität gezeigt, wenn man sie mit 100 und 500 × 10⁶ verglich. Andere Untersuchungen haben gezeigt, dass mit der Zahl der Besamungen auch die Fertilität zunimmt. Unglücklicherweise sind die Ergebnisse aus diesen Untersuchungen etwa inkonsistent. Deshalb ist die vorliegende Erfindung darauf gerichtet, die geringste Spermienzahl zu erreichen, die notwendig ist, um vernünftige Schwangerschaftsraten bereitzustellen, wenn bei einer einzigen Gelegenheit nahe der Ovulation verabreicht wird.
In der Gruppe 3 wurden 20 Stuten mit 5 × 10⁶ pms in einem Volumen von entweder 1 ml (5 × 10⁶ pms/ml) (n = 10) oder einem Volumen von 0,2 ml (25 × 10⁶ pms/ml) (n = 10) besamt. Die Schwangerschaftsraten zwischen den zwei Untergruppen wurden verglichen, weil berichtet worden ist, dass die Schwangerschaftsraten abnehmen, wenn das Sperma auf eine Konzentration von < 25 × 10⁶/ml verdünnt wird. In dieser Studie gab es jedoch keinen Unterschied in der Fertilität zwischen den zwei Spermakonzentrationen.
Wenn eine Stute basierend auf der rektalen Palpation und Ultraschalluntersuchung am Morgen von dem Tag der geplanten Besamung bereits ovuliert hatte, wurde sie nicht besamt. Anstatt dessen wurde Cloprostenol (250 μg) für 5 Tage postovulation verabreicht, um die Luteolyse zu induzieren, damit sie erneut verwendet werden konnte. Die Schwangerschaften wurden am Tag 16 durch eine transrektale Ultrasonographie und die Zerstörung des embryonalen Vesikels beendet. Dann wurde Cloprostenol (250 μg i.m.) verabreicht, um die Luteolyse zu induzieren, damit sie erneut verwendet werden konnten.
Das Sperma wurde in diesem Experiment für die zwei niedrigeren Dosen an der Spitze des cornu unteri deponiert. Die Samendeposition tief in das cornu uteri ist besonders nützlich, wenn geringe Spermienzahlen in einem geringen Volumen verwendet werden. Die flexibel Besamungspipette wurde in den Uterus per Vagina platziert und langsam zu der Spitze des gewünschten cornu uteri durch eine sanfte Manipulation per rectum geführt. Die Platzierung der Pipette wurde durch eine transrektale Palpation und Ultraschalluntersuchung bestätigt.
Es wurde eine zusätzliche keine Studie am Ende der Fortpflanzungszeit durchgeführt, wobei fünf Stuten und einer der zwei selben Hengste verwendet wurden. Der Gegenstand der Untersuchung war es die Schwangerschaftsraten mit 25 × 10⁶ pms zu bestimmen, die in dem Uteruskörper deponiert wurden. Drei der fünf Stuten (60%), die bei einer einzigen Gelegenheit mit 25 × 10⁶ pms 40 h nach der GnRH-Verabreichung besamt worden sind, waren am 16. Tag trächtig.
Zusammengefasst zeigen diese Experimente, dass eine Tag-16-Schwangerschafstrate von 57% mit einer einzigen Verabreichung nahe der Ovulation mit 25 × 10⁶ pms erreicht worden ist, wenn sie tief in das cornu uteri deponiert worden sind.
Die Gegenstände der folgenden Experimente waren 1) Bestimmung der Schwangerschaftsraten in Folge einer Besamung mit 25 × 10⁶ lebend-sortierten, geschlechtsbestimmten Spermatozoen, die an der Spitze des cornu uteri ipsilateral zu dem präovularem Follikel deponiert wurden und 2) Vergleich der Schwangerschaftsraten für Sperma, das in ein Magermilchstreckmittel mit oder ohne Eidotter sortiert worden ist.
Stuten – Siebzehn reproduktionsnormale im Zyklus befindliche Stuten der Light Horse Rasse, deren Alter von 5 bis 12 Jahren reichte, wurden verwendet. Den Stuten wurde Cloprostenol (250 μl i.m.) verabreicht, um die Luteolyse zu induzieren und sie wurden jeden zweiten Tag mittels Palpation und Ultrasolographie des Fortpflanzungtrakts per rectum untersucht, bis ein Follikel > 30 mm nachgewiesen wurde, und dann täglich bis zur Ovulation. Wenn eine Stute einmal ein Follikel ≥ 35 mm entwickelt hat, wurde ein Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH)-Implantat (Deslorelinacetat 2,2 mg, Ovuplant^®, Fort Dodge, IA) subkutan verabreicht und sie wurden zufällig 1 von 2 Behandlungsgruppen zugeteilt.
Behandlungsgruppe A – Die Stuten (n = 11) wurden bei einer einzigen Gelegenheit mit ~25 × 10⁶ lebend-sortierten Spermatozoen in einem Volumen von 1 ml (25 Milliarden/ml) 34 h nach der GnRH-Verabreichung besamt. Die Spermatozoen wurden in ein kommerzielles Magermilchspermastreckmittel (EZ-Mixin, OF, Animal Reproduction Systems, Chino, CA) sortiert und dasselbe Streckmittel wurde nach der Zentrifugation als ein Postzentrifugationspuffer zugegeben, um die Spermienkonzentration auf 25 × 10⁶ ml einzustellen. Die Spermien wurden in der Spitze des cornu uteri ipsilateral zu dem präovularen Follikel deponiert, wobei eine flexible Plastik- AI-Pipette (IMV, Frankreich) verwendet wurde. Die Platzierung der Pipette innerhalb des Uterus wurde durch eine transrektale Ultrasonographie vor der Spermadeposition bestätigt. Eine Stute wurde mit 20 × 10⁶ lebend-sortierten Spermatozoen wegen der Zeiteinschränkungen bei dem Durchflusszytometer besamt. Eine Stute ovulierte nicht und wurde aus der Studie ausgeschlossen.
Behandlungsgruppe B – Die Stuten (n = 10) wurden bei einer einzigen Gelegenheit mit ~25 × 10⁶ lebend-sortierten Spermatozoen in einem Volumen von 1 ml (25 Milliarden/ml) 34 h nach der GnRH-Verabreichung besamt. Eine Stute wurde mit 20 × 10⁶ lebend-sortierten Spermatozoen wegen der Zeiteinschränkungen bei dem Durchflusszytometer besamt. Die Spermatozoen wurden in demselben kommerziellen Magermilchspermastreckmittel plus 4% Eidotter sortiert und dasselbe Streckmittel wurde nach der Zentrifugation als ein Postzentrifugationspuffer zugegeben, um die Spermienkonzentration einzustellen. Die Spermien wurden in der Spitze des cornu uteri ipsilateral zu dem präovularen Follikel deponiert, wobei eine flexible Plastik-AI-Pipette verwendet wurde. Die Platzierung der Pipette innerhalb des Uterus wurde durch eine transrektale Ultrasonographie vor der Spermadeposition bestätigt.
Nach der Besamung wurden die Stuten täglich untersucht, um den Tag der Ovulation zu bestimmen. Die Schwangerschaftsprüfungen wurden mittels Ultrasonographie an den Tagen 12, 14, 16 und 30 und nach der Ovulation durchgeführt und das Geschlecht der Föten wurde am Tag 60 bestimmt.
Spermasammlung und -herstellung – Es wurden zwei Hengste der Arabarasse, von denen eine hohe Fertilität bekannt war, in diesem Experiment verwendet, einer davon (Hengst A) wurde in dem Experiment 1 verwendet. Das Sperma wurde am morgen der geplanten Besamung mit einer künstlichen Vagina des Coloradomodells (Aminal Reproduction Systems, Chino, CA) gesammelt, die mit einem in-line Gelfilter ausgestattet war. Die Ejakulate wurden hinsichtlich des gelfreien Volumens, der Motilität und Spermatozoenkonzentration beurteilt. Das Sperma wurde 1:1 in HBGM-3 mit BSA gestreckt und innerhalb von Minuten bei Raumtemperatur zu dem Labor für die weitere Verarbeitung zu dem Labor transportiert. Das Sperma wurde für 10 Minuten bei 400 × g bei 22°C zentrifugiert, um die Spermien hoch aufzukonzentrieren. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand abgesaugt, was ein weiches Spermienpellet zurückließ. Die Konzentration der Spermatozoen wurde mittels eines Densimeters (Animal Reproduction Systems, Chino, CA) bestimmt und die Spermatozoen anschließend auf 400 × 10⁶/ml in HBGM-3 in einem Gesamtvolumen von 1 ml verdünnt und mit 25 μl Hoechst 33342 (5 mg/ml Wasser) verdünnt. Es wurde eine Gesamtheit von acht Probenröhrchen hergestellt und bei 34°C für 1 Stunde inkubiert. Als nächstes wurden die gefärbten Proben auf 100 × 10⁶/ml mit 3 ml HBGM-3 verdünnt. Es wurde zu jedem der acht Probenröhrchen eine Lebensmittelfarbe (2 μl/ml einer 1% FD&C #40 in HBGM-3) zugegeben, was ein Gesamtvolumen von 4 ml ergab. Die Proben wurden dann durch einen 1 ml 40 Mikron Filterapparat in 6 ml Polypropylenröhrchen gefiltert und auf Raumtemperatur gehalten, bis etwa 25 × 10⁶ lebende Spermatozoen mittels Durchflusszytometrie der DNA nach sortiert worden sind. Ein Argonlaser, der 150 mW bei 351 und 364 nm emittierte, wurde bei jedem der zwei MoFlow^® Durchflusszytometer/Cell Sorter verwendet, die für die Spermiensortierung modifiziert worden sind und die bei 50 psi mit HBGM-3 ohne BSA als Mantelflüssigkeit arbeiteten. Die Spermatozoen wurden mit etwa 900 lebenden Zellen/sek in einer Gesamtheit von 6 Polypropylenröhrchen (jeweils 14 ml) gesammelt, die 4 ml Catch-Flüssigkeit vor dem Sortierbeginn aus entweder EZ-Mixin^® oder 4% Eidotter in EZ-Mixin^® enthielten. Wenn zwei Stuten für die Besamung an demselben Tag verfügbar waren, wurden sowohl X- als auch Y-angereicherte Spermien gesammelt. Der Röhrcheninhalt wurde alle 30 Minuten während des Sortierens gemischt. Nach dem Sortieren wurden die Spermien von den zwei Durchflusszytometern zusammengegeben, in 50 ml Zentrifugationsröhrchen gegeben und für 20 Minuten bei 1200 × g bei 22°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dann auf ein 200 μl Spermienpellet abgenommen und es wurden 100 μl Postzentrifugationspuffer aus entweder EZ-Mixin^® CST (Animal Reproduction Systems, Chino, CA) oder 4% Magermilch-Eidotter zu dem Pellet zugegeben und in ein zuvor abgewogenes 50 ml Falconröhrchen übertragen. Es wurde eine Zählung mit einem Hämozytometer durchgeführt, um die Spermienkonzentration/ml zu bestimmten. Das Spermienvolumen in dem Falconröhrchen × Spermienkonzentration/ml war gleich der Gesamtzahl an eingeholten Spermien. Die Proben wurden dann auf eine Gesamtheit von 25 × 10⁶ lebend sortierten Spermatozoen in einem Volumen von 1 ml verdünnt, was für die Besamung verwendet wurde.
Erneute Analyse der Spermien auf ihren DNA-Gehalt – Der relative DNA-Gehalt der sortierten intakten Spermien, die für die Besamung verwendet worden waren, wurde mittels einer durchflusszytometrischen Analyse der Spermiennuklei von einer Probe bestimmt, die < 0,5 ml von jeder der einzelnen Chargen enthielt, die am Ende des Tages gesammelt worden sind. Die Spermiennuklei wurden aus einem Aliquot intakter sortierter Spermien durch Sonifikation für 3 Sekunden mit einem Ultrasonic Dismembrator 60 (Fisher Scientific) hergestellt, der auf die Einstellung Nr. 2 eingestellt wurde (etwa 1 Watt). Der Anteil von X- und Y-tragenden Spermien wurde bestimmt, indem ein Paar von Gaußschen Verteilungen an die Histogramme von dem 0°-Detektor angepasst wurde (Johnson et al., 1987b). Die erneute Analyse der DNA zeigte eine durchschnittliche Sortierreinheit von 90% für X- und von 84% für Y-chromosomtragende Spermien für die 17 Sortierungen an.
Geschlechtsbestimmung des Fötus – Das Geschlecht der Föten von Stuten, die 60–70 Tage postovulation trächtig waren, wurde mittels einer transrektalen Ultrasonographie bestimmt, ohne dass das Geschlecht der für die Besamung verwendeten Spermien bekannt war. Es wurde ein Real-Time Ultraschallscanner (Aloka 500^®), der mit einem Linear-Array 5 MHz Wandler ausgestattet war, für die Geschlechtsbestimmung verwendet. Das Fötusgeschlecht kann in Pferden und Rindern genau (bis zu 99%) durch die Identifikation und Ortung der Genitalhöcker bestimmt werden (Curran, 1998).
Statistische Analyse – Die Daten wurden unter Verwendung des Fishers Exact Test analysiert
Die Schwangerschaftsraten am Tag 16 sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Schwangerschaftsraten waren zwischen den Hengsten (Hengst A = 3/10, 30%; Hengst B = 5/10, 50%) (p > 0,1) nicht verschieden, sodass die Datensets kombiniert wurden. Es gab keinen statistischen Unterschied bei den Schwangerschaftsraten zwischen den Spermienbehandlungen (EZ-Mixin = 3/10, 30% gegenüber 4% EY + EZ-Mixin = 5/10, 50%) (p > 0,1), obwohl dieses Ergebnis nicht immer wahr sein muss. Das phänotypische Geschlechtsverhältnis wurde mit einer perfekten Genauigkeit mit fünf aus fünf vorhergesagt.

Drei Stuten verloren ihre Schwangerschaften irgendwann zwischen den Tagen 16–60 postovulation, sodass das Fötusgeschlecht nicht bestimmt werden konnte. Eine Stute, die mit X-trangenden Spermatozoen besamt worden war, wurde am Tag 66 wegen gastrointestinalen Problemen eingeschläfert. Es wurde ein phänotypisch normaler weiblicher Fötus (das richtige Geschlecht) bei einer Nekropsie entdeckt. Tabelle 2 Schwangerschaftsraten in Folge einer Besamung mit 25 × 10⁶ geschlechtsbestimmten Spermatozoen

Behandlungsgruppe	Zahl der besamten Stuten	Zahl der trächtigen Stuten am Tag 16	Zahl der trächtigen Stuten am Tag 60	Vorhergesagt* %	tatsächlich
Behandlungsgruppe	Zahl der besamten Stuten	Zahl der trächtigen Stuten am Tag 16	Zahl der trächtigen Stuten am Tag 60	♂	♀	♂	♀
EZ-Mixin	10	3^a	1	78	89	**	1/1
4% EY + EZ-Mixin	10	5^a	4	84	87	3/3	1/1

^a kein signifikanter Unterschied (p > 0,1).
* Ergebnisse der neuen Analyse für den relativen DNA-Gehalt der Aliquots der sortierten X- und Y-tragenden Spermienpopulationen.
** verlorene Schwangerschaft vor der Geschlechtsbestimmung.

Tabelle 2
ERGEBNISSE: Es wurden während der letzen 80 Jahre viele Versuche unternommen X- und Y-chromosomtragende Spermien zu trennen. Das einzige nicht destruktive Verfahren, das einen belegten Bericht über die korrekte Identifizierung von X- und Y-chromosomtragenden Spermien bietet, ist die Durchflusszytometrie/Cell Sorting, die es folglich ermöglicht das Geschlechtsverhältnis nach Wunsch zu verändern. Die Spermien wurden mittels Durchflusszytometrie/Cell Sorting getrennt, um eine Schwangerschaft in Folge einer chirurgischen Besamung in den folgenden Spezien zu erhalten: Kaninchen, Schweinen und Pferden. Die chirurgische Besamung wurde in diesen Experimenten auf Grund der Notwendigkeit für die Minimierung der Spermienzahlen wegen der langsamen Durchflussortiergeschwindigkeiten (~100 Spermien/sek) der X- und Y-tragenden Spermien und dem scheinbaren Bedarf an großen Spermienzahlen gewählt, um eine Schwangerschaft zu etablieren. Die Herstellung von X- und Y-tragenden Spermien pro Zeiteinheit mittels einer Hochgeschwindigkeitssortierung und einer neu entwickelten orientierenden Düse haben die Sortiergeschwindigkeiten auf das 10–12-fache der früheren Geschwindigkeiten gesteigert. Diese Technologie hat die Zahl der sortierten Spermien pro Zeiteinheit erhöht und erlaubt den Forschern Schwangerschaften zu erhalten, die sich aus einer nichtchirurgischen, intrauterinen Besamung in Schafen und Rindern ergeben.
Die vorliegende Untersuchung war die Erste, um existenzfähige Schwangerschaften im Pferd in Folge einer nicht cirurgischen intrauterinen Besamung mit geschlechtsbestimmtem Sperma zu erhalten. Die Schwangerschaftsrate am Tag 16 in Folge einer Besamung mit 25 × 10⁶ geschlechtsbestimmten Spermatozoen (40%) war statistisch nicht unterschiedlich (p > 0,1) als die von Stuten in dem Experiment 1, die mit 25 × 10⁶ nicht sortierten progressiv motilen Spermatozoen besamt worden sind (57%). Die Besamungstechnik war in beiden Experimenten dieselbe. In beiden Experimenten wurden dieselben Stuten und die gleichen technischen Assistenten verwendet. Auch wurden beide Experimente während der gleichen Fortpflanzungszeit zur gleichen Zeit im Jahr durchgeführt.
Die anfänglichen experimentellen Schwangerschaftsraten waren mit dem geschlechtsbestimmten Sperma leicht niedriger, wohl auf Grund der Menge an Zeit, die es braucht, um 25 × 10⁶ Spermien zu sortieren, und der möglichen Schädigung der Spermien durch dieses Verfahren. In den Experimenten war die durchschnittliche Zeit von der Spermasammlung bis zur Besamung 7 Stunden. In dem ersten Experiment wurden die Stuten nahezu unverzüglich nach der Spermasammlung besamt. Die durchschnittliche Gesamt- und progressive Motilität für die geschlechtsbestimmten Spermatozoen war 69 beziehungsweise 38% und eine Gesamtheit von nur 25 × 10⁶ lebend-sortierten Spermienzellen wurde für die Besamung gesammelt. Das Sortierverfahren ist für die Spermien ein sehr stressiges Verfahren. Die Spermien werden mit einem hohen Druck durch dünne Rohrleitungen gepumpt, was sie veranlasst mit ~100 km/h auszutreten, und sie werden für Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis ausreichende Spermienzahlen gesammelt sind. Die Spermien werden für eine Stunde bei 35°C mit Hoechst 33342 inkubiert, was eine hohe Affinität für AT-reiche Regionen auf der DNA hat, und dann werden sie einem ultravioletten Laserlicht mit 351 und 364 nm ausgesetzt. Anders als viele DNA-spezifische Farbstoffe interkaliert Hoechst 33342 nicht in die DNA-Helix. Während keines dieser Verfahren für die Spermiengesundheit förderlich ist, ist über keine erhöhte Häufigkeit von genetischen Anomalien in den Hunderten von Nachkommen berichtet worden, die unter Verwendung dieser Technologie hergestellt worden sind.
Ein untergeordnetes Interesse ist die Tatsache, dass andere eine andere mögliche Erklärung für die niedrigen Schwangerschaftsraten mit geschlechtsbestimmtem Sperma vorgeschlagen haben. Sie haben gefunden, dass der erste Zellzyklus in Kaninchenembryonen verzögert war, die mit Sperma fertilisiert worden waren, das mit Hoechst 33342 behandelt worden ist. Unglücklicherweise ist der Mechanismus nicht bekannt, es könnte aber auf Grund einer Beeinträchtigung durch die Farbstoffmoleküle sein, während die DNA repliziert oder transkribiert wird. Es ist auch ein verringertes Überleben der Embryonen bei durchflussortienrten Spermien belegt.
Drei der acht Stuten (38%), die mit geschlechtsbestimmten Spermien besamt worden sind, verloren ihre Schwangerschaften zwischen den Tagen 16–60. Zwei dieser Stuten entwickelten embryonale Vesikel, die bis zum Tag 16 normal erschienen. Diese Vesikel nahmen dann in der Größe ab bis sie nicht länger vorhanden waren. Eine dieser drei Stuten entwickelte eine existenzfähige Schwangerschaft mit einem sichtbaren Fötus mit einem Herzschlag. Der Fötus wurde am Tag 35 beobachtet und war am Leben, ging aber bis zum Tag 50 verloren. Mit frischen nicht sortierten Spermien ist bis Tag 14 ein Embryoverlust von 9% beobachtet worden und bis zu 16% durchschnittlich zwischen den Tagen 20 und 50. Es wurde in den vorliegenden Experimenten ein Spermienfärbungs- und Sortierungsverfahren verwendet. Es ist möglich, dass die Pferdespermien empfindlicher gegenüber den Färbe- und Sortierverfahren sind als es Rinderspermien sind.
Zusammengefasst hat diese Erfindung zum ersten Mal gezeigt, dass eine Schwangerschaft in der Stute erreicht werden kann und Fohlen mit einem vorherbestimmten Geschlecht erhalten werden können, indem eine geringe Spermatozoenzahl an der Spitze des cornu uteri der Stute deponiert wird. Die Geschlechtsbestimmung von Säugerspermien bewegt sich nun von einer Forschungstechnik weg und ist nun für kommerzielle AI-Programme in Pferden erhältlich. Ferner ist, wie erwähnt und wie aus den verschiedenen Experimenten gesehen werden kann, der Bereich statistisch basiert und folglich können viele zusätzliche Experimente durchgeführt werden, um die geeigneten Kombinations- und Beschränkungsstrategien weiter zu belegen.
Zum Schuss ist das Wort „umfassen" oder die Variationen davon wie „umfasst" oder „umfassend" durchwegs durch diese Beschreibung hindurch – insbesondere in den Ansprüchen –, außer der Kontext verlangt es anders, so zu verstehen, dass es den Einschluss eines angegebenen Elements oder einer Gruppe von Elementen, aber nicht den Ausschluss von irgendeinem anderen Element oder irgendeiner anderen Gruppe von Elementen, beinhaltet.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Pferds, umfassend die Schritte: a. Bestimmen einer voraussichtlichen Zeit für den Östrus eines weiblichen Pferds, wobei das besagte weibliche Pferd zwei cornu uteri, wobei jedes cornu uteri eine Spitze und ein Follikel hat, und eine Vagina, einen Uterus und ein Rectum hat; b. Sammeln von Pferdespermienzellen von einem männlichen Pferd; c. Etablieren einer Pferdebesamungsprobe, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält; d. Etablieren einer flexiblen Sonde, die einen Spermienbehälter hat; e. Einbringen der besagten flexiblen Sonde in die Vagina des besagten weiblichen Pferds; f. Manipulieren der besagten flexiblen Sonde in dem besagten Uterus des besagten weiblichen Pferds; g. Einführen der besagten flexiblen Sonde in ein cornu uteri des besagten weiblichen Pferds; und h. sanftes Manipulieren der besagten flexiblen Sonde per rectum, während sie innerhalb des besagten cornu uteri des besagten weiblichen Pferds an einen Ort tief innerhalb des besagten cornu uteri des besagten weiblichen Pferds nahe der Spitze des besagten cornu uteri eingeführt wird; i. künstliche Besamung des besagten weiblichen Pferds; j. Fertilisieren von mindestens einem Pferdeei innerhalb des besagten weiblichen Pferds; und k. Herstellen eines Pferdenachkommen.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 1, worin der besagte Schritt zum Etablieren einer Pferdebesamungsprobe, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von der besagten männlichen Spezies des besagten Pferds enthält, die Schritte umfasst: a. Bestimmung des Geschlechtsmerkmals von einer Vielzahl der besagten Pferdespermienzellen; und b. Sortieren der besagten Pferdespermienzellen entsprechend der Bestimmung ihres Geschlechtsmerkmals; und worin der besagte Schritt zur Herstellung eines Pferdenachkommensäugetiers den Schritt umfasst, einen Pferdenachkommen mit dem gewünschten Geschlecht herzustellen.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 2, worin der besagte Schritt zum Etablieren einer Pferdebesamungsprobe, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält, den Schritt der Etablierung einer Pferdebesamungsprobe umfasst, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält und die eine geringe Zahl der besagten Pferdespermienzellen relativ zu der typischen Dosierung für eine künstliche Besamung hat.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 3, worin der besagte Schritt zum Etablieren einer Pferdebesamungsprobe, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält und die eine geringe Zahl der besagten Pferdespermienzellen relativ zu der typischen Dosierung für eine künstliche Besamung hat, den Schritt der Etablierung einer Pferdebesamungsprobe umfasst, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält und die eine geringe Zahl der besagten Pferdespermienzellen relativ zu der typischen Dosierung für eine künstliche Besamung hat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einer Pferdebesamungsprobe mit nicht mehr als etwa fünf Millionen Spermienzellen und einer Pferdebesamungsprobe mit nicht mehr als etwa fünfundzwanzig Millionen Spermienzellen.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 4, worin der besagte Schritt zur Fertilisierung von mindestens einem Pferdeei innerhalb des besagten weiblichen Pferds den Schritt der Fertilisierung von mindestens einem Pferdeei innerhalb des besagten weiblichen Pferds mit einem Erfolgslevel umfasst, der statistisch mit denen vergleichbar sind, die für die Dosierung bei einer künstliche Besamung typisch sind.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 5, worin der besagte Schritt zum Etablieren einer Pferdebesamungsprobe, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält und die eine geringe Zahl der besagten Pferdespermienzellen relativ zu der typischen Dosierung für eine künstliche Besamung hat, die Schritte umfasst: a. Färben der besagten Pferdespermienzellen; b. Sortieren entsprechend des besagten Geschlechts der besagten Pferdespermienzellen durch die Verwendung einer Hochgeschwindigkeitsdurchflusszytometrie; und c. Konzentrieren der sortierten Pferdespermienzellen.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 6, worin der besagte Schritt zum Sortieren entsprechend des besagten Geschlechts der besagten Pferdespermienzellen durch die Verwendung der Hochgeschwindigkeitsdurchflusszytometrie den Schritt umfasst, lebende Spermien des gewünschten Geschlechts mit einer Geschwindigkeit von mindestens neunhundert lebenden Spermien pro Sekunde zu sammeln.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 6, worin der besagte Schritt zum Sortieren entsprechend des besagten Geschlechts der besagten Pferdespermienzellen durch die Verwendung der Hochgeschwindigkeitsdurchflusszytometrie den Schritt umfasst, einen Hochgeschwindigkeits-Cell-Sorter bei einem Druck von mindestens etwa fünfzig Pfund pro Quadratinch zu betätigen.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 1, worin der besagte Schritt zum Etablieren einer Pferdebesamungsprobe, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält, den Schritt der Etablierung einer Pferdebesamungsprobe umfasst, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält und die eine geringe Zahl der besagten Pferdespermienzellen relativ zu der typischen Dosierung für eine künstliche Besamung hat.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 9, worin der besagte Schritt zum Etablieren einer Pferdebesamungsprobe, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält und die eine geringe Zahl der besagten Pferdespermienzellen relativ zu der typischen Dosierung für eine künstliche Besamung hat, den Schritt der Etablierung einer Pferdebesamungsprobe umfasst, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält und die eine geringe Zahl der besagten Pferdespermienzellen relativ zu der typischen Dosierung für eine künstliche Besamung hat, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einer Pferdebesamungsprobe mit nicht mehr als etwa fünf Millionen Spermienzellen und einer Pferdebesamungsprobe mit nicht mehr als etwa fünfundzwanzig Millionen Spermienzellen.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 4, worin der besagte Schritt zum Etablieren einer Pferdebesamungsprobe, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält, den Schritt der Etablierung einer Pferdebesamungsprobe umfasst, die ein Volumen hat, ausgewählt aus der Gruppe: 0,2 ml oder 1 ml.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 7, worin der besagte Schritt zum Etablieren einer Pferdebesamungsprobe, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält, den Schritt der Etablierung einer Pferdebesamungsprobe umfasst, die ein Volumen hat, ausgewählt aus der Gruppe: 0,2 ml oder 1 ml.
Verfahren zur Herstellung eines Pferds nach Anspruch 10, worin der besagte Schritt zum Etablieren einer Pferdebesamungsprobe, die mindestens einige der besagten Pferdespermienzellen von dem besagten männlichen Pferd enthält, den Schritt der Etablierung einer Pferdebesamungsprobe umfasst, die ein Volumen hat, ausgewählt aus der Gruppe: 0,2 ml oder 1 ml.