CN109970843A - 一种人源抗炎症多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

一种人源抗炎症多肽及其应用，属于抗炎药物领域。为了解决传统抗炎药物的安全性低的问题，本发明提供了一种人源抗炎症多肽以及编码该多肽的核苷酸序列，所述人源抗炎症多肽可用于制备抗细菌、病毒或真菌感染药物、抗自身免疫性疾病炎症药物、抗肿瘤生长及其治疗过程中产生的炎症等药物，相比抗生素药物或传统抗菌肽具有非常高的安全性，可用于抗炎药物的开发。

Description

一种人源抗炎症多肽及其应用

技术领域

本发明涉及抗炎药物领域，具体涉及一种人源抗炎症多肽及其应用。

背景技术

炎症(inflammation)是机体受致炎因子损伤后所发生的一种以防御反应为主的重要的病理过程。致炎因子可造成机体组织和细胞的损伤，使机体出现变质、渗出和增生，给机体带来不同程度的危害。慢性炎症参与人体多种疾病的发生发展，是多种疾病的致病基础。衬于心、血管和淋巴管内表面的单层扁平上皮细胞即血管内皮细胞在血管生物学中起着至关重要的作用，如调节血管紧张度、止血、嗜中性粒细胞募集、激素运输和液体过滤等。血管炎症是导致内皮功能失调的关键性因素之一，与多种疾病密切相关，包括动脉粥样硬化、糖尿病、冠状动脉疾病、高血压和高胆固醇血症。目前，临床上针对炎症的治疗药物主要包括甾体类、激素类、免疫抑制剂等，这些药物均有一定的副作用，不易长期使用。近年来随着对一些慢性炎症疾病病理机制的了解，一些新型免疫抑制剂如钙调神经磷酸酶抑制剂，以及针对特异性炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF，tumor necrosis factor)和白介素1(IL-1,interleukin1)的生物抑制剂也用于疾病的治疗。尽管一些生物抑制剂带来一些治疗的优势，但这些药物制造成本上都非常昂贵，应用受限。

发明内容

为了解决传统抗炎药物的安全性低的问题，本发明提供了一种人源抗炎症多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1中所示。

本发明还提供了一种人源抗炎症基因，其编码SEQ ID No：1中所示的人源抗炎症多肽。

进一步地限定，所述人源抗炎症基因，核苷酸序列如SEQ ID No：2中所示。

本发明还提供了含有上述人源抗炎症基因的重组载体。

进一步地限定，所述重组载体为pGEM-T Easy载体或pTWIN1载体。

本发明还提供了上述人源抗炎症多肽在制备抗细菌、病毒或真菌感染药物中的应用。

本发明还提供了上述人源抗炎症多肽在制备抗自身免疫性疾病炎症药物中的应用。

本发明还提供了上述人源抗炎症多肽在制备抗肿瘤生长及其治疗过程中产生的炎症药物中的应用。

有益效果

本发明制备的人源抗炎症多肽DEFB118截短体蛋白，经研究具有功能如下：

1、抑制生物性致炎因子的生长，通过抑制细菌、真菌和病毒等致炎因子，消灭病原微生物，减轻它们对机体的损伤，抑制它们在机体内释放炎症因子，清除坏死组织，促进局部修复，抑制炎症的发生或者减轻炎症的症状，增强机体的抵抗力，使机体的结构和功能得到恢复。

2、通过调节炎症相关信号通路及其转录因子的表达抑制炎症。当细胞受到应激刺激后，本发明所制备的人源抗炎症多肽DEFB118截短体蛋白通过炎症相关信号通路和转录因子，调节炎性细胞因子TNF-α、IL-12、IL-6等基因的转录、表达和分泌，从而对炎症反应进行调控，发挥抗炎作用。

3、免疫调节活性。炎症过程中，伴随着各种炎细胞的渗出，炎细胞浸润是炎症反应的重要形态学特征，也是构成炎症防御反应的主要环节。本发明所制备的人源抗炎症多肽DEFB118截短体蛋白能够调节炎细胞，促使炎细胞通过游出、趋化和吞噬等作用，在炎症局部发挥重要的防御作用。

4、通过中和LPS抑制炎症，内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，称为脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后释放出LPS能激活免疫系统引起炎症反应。各种细菌产生的LPS的毒性作用较弱，大致相同，可引起发热、内毒素休克、微循环障碍及播散性血管内凝血等。本发明制备的人源抗炎症多肽DEFB118截短体蛋白可以结合LPS，抑制炎症的发生。

综上所述：本申请所述的人源抗炎症多肽来源人类自身基因序列的重组表达，相比抗生素药物或传统抗菌肽具有非常高的安全性，无免疫原性，不容易产生过敏反应。

本申请所述的人源抗炎症多肽属于多肽类物质，一种人防御素来源的多肽，除了能够有抑制炎症反应，还能够对细菌、病毒等病原微生物的感染有杀死作用，对感染性炎症的抑制效果更佳，相比传统抗生素，易降解、不会在环境中蓄积，对环境造成污染和危害，也克服了传统抗生素滥用导致的医疗问题。

本申请通过基因重组技术生产的多肽解决了无法通过提取获得的来源问题，所述的生产方法生产出抗炎多肽具有良好抗炎活性。

附图说明

图1.构建重组表达载体pTWIN 1-DEFB118的示意图；

图2.DEFB118截短体蛋白通过AKTA FPLC系统出峰图，横坐标为洗脱体积(ml)，纵坐标为紫外吸收值(mAU)；

图3.DEFB118截短体蛋白的表达和纯化。M孔道为蛋白分子量对照品；118孔道为纯化后的DEFB118截短体蛋白；

图4.DEFB118的分子量大小鉴定结果，横坐标为质荷比(m/z)，纵坐标为吸收峰相对强度(％)；

图5.表征DEFB118截短体蛋白二级结构的圆二色谱结果，横坐标为波长(nm)，纵坐标为毫度(mdeg)；

图6.在mRNA水平检测人源抗炎症多肽DEFB118截短体蛋白对细胞分泌的炎症因子的抑制作用；其中“-”代表未被诱导或不含有，“+”代表被诱导或含有；LPS代表脂多糖，DEFB118代表DEFB118截短体蛋白；a所示的检测指标为TNF-αmRNA表达量，b为IL-6mRNA表达量，c为IL-1αmRNA表达量，d为IL-1βmRNA表达量；

图7.在蛋白水平检测人源抗炎症多肽DEFB118截短体蛋白对炎症因子释放的抑制作用，其中“-”代表未被诱导或不含有，“+”代表被诱导或含有；LPS代表脂多糖，DEFB118代表DEFB118截短体蛋白；a所示的检测指标为TNF-α蛋白表达量，b为IL-1β蛋白表达量；

图8.在蛋白水平检测人源抗炎症多肽DEFB118截短体蛋白与阳参hBD2蛋白对炎症因子释放的抑制作用，其中“con”代表未被诱导或不含有；LPS代表脂多糖，peptides代表DEFB118截短体蛋白与阳参hBD2蛋白；LPS+peptides代表DEFB118截短体蛋白与阳参hBD2蛋白分别加入脂多糖；a所示的检测指标为TNF-α蛋白表达量，b为IL-1β蛋白表达量；

图9.抗炎症DEFB118截短体蛋白抗菌作用的结果图。其中横坐标代表DEFB118截短体蛋白加入的浓度(μg/ml)，纵坐标代表细菌的生存率(％)；a所示的指标为DEFB118对大肠杆菌(E.coli)的抑制率；b所示的指标为DEFB118对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抑制率；c所示的指标为DEFB118对白色念珠菌(C.albicans)的抑制率。

具体实施方式

本发明中所述的RAW264.7细胞购买自北纳生物，货号：BNCC101020；

LL37：为一种抗菌肽，购买自GL Biochem，货号:54949；

hBD2：为一种抗菌肽，购买自北京四正柏生物，货号：ABIN2877494；

其余所用试剂、药品、仪器或设备如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得。

实施例1.人源抗炎症多肽的制备。

本实施例所述的人源抗炎症多肽，其氨基酸序列如SEQ ID No：1中所示，为DEFB118成熟肽的截短体，下面具体描述人源抗炎症多肽的制备。

1.人源抗炎症多肽DEFB118基因的扩增、回收。

根据DEFB118成熟肽基因序列(该序列记载在Yenugu S,Hamil K G,Radhakrishnan Y,et al.The Androgen-Regulated Epididymal Sperm-BindingProtein,Humanβ-Defensin 118(DEFB118)(Formerly ESC42),Is an Antimicrobialβ-Defensin[J].Endocrinology,2004,145(7):3165-3173.)，设计上游引物、下游引物，在上游引物5’端引入酶切位点Nco I，下游引物5’端引入酶切位点Bam H I，由上海Invitrogen公司合成。

上游引物序列DEFB118-F：GTCCATGGCCTATAGTG；

下游引物序列DEFB118-R：CACGGATCCTTAGTGGTCTTCATTGGATG成熟肽DEFB118基因序列已经克隆并保存在pGEM-T Easy载体中。本发明以DEFB118基因序列为模板进行菌落PCR扩增，获得DEFB118基因截短体，即人源抗炎症多肽基因，PCR反应体系如下：

所采用的反应条件如下：

扩增反应结束后，取5μL PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测分子量大小正确后，用PCR清洁试剂盒纯化。纯化方法如下：

1)在PCR产物中加入3倍反应液体积的buffer PCR-A，混匀后转移到PCR制备管中，将PCR制备管置于2mL离心管中，12000×g离心1min，弃滤液。

2)将PCR制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12000×g离心1min，弃滤液。

3)将PCR制备管置于离心管中，将制备管置回2mL离心管，加400μL Buffer W2，12000×g离心1min。

4)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加入25-30μL去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。然后将纯化的PCR产物于-20℃保存。经测序确定为所述人源抗炎症多肽基因，核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。

2.pTWIN 1载体扩增、抽提。

接种带有pTWIN 1空载体的菌种于5mL培养液，摇菌过夜后抽提质粒。采用质粒DNA小量试剂盒快速提取目的质粒。操作步骤如下：

1)取1-4mL过夜培养的菌液加入离心管中，12000×g离心1min，弃尽上清。

2)加250μL Buffer S1(已加入RNaseA)悬浮菌液沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。

3)加250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。作用时间不要超过5min。

4)加350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转6-8次，充分混匀，12000×g离心10min；

5)吸取上述的离心上清并转移到制备管中，12000×g离心1min，弃滤液。

6)将制备管置回离心管，加500μL Buffer W1，12000×g离心1min，弃滤液。

7)将制备管置回离心管，加700μL Buffer W2，12000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μL Buffer W2洗涤一次，弃滤液。

8)将制备管置回2mL离心管，12000×g离心1min。

9)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加入60-80μL去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。产物于-20℃保存。

3.酶切及回收。

抽提得到的质粒被用于酶切，工具酶为Nco I和Bam H I。参照NEB双酶切说明进行质粒的酶切。

酶切后的质粒用1％琼脂糖凝胶电泳跑胶，根据割胶回收试剂盒纯化质粒：

1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽表面液体并切碎。计算凝胶质量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg＝100μL体积)；

2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合(每2-3min)，直至凝胶块完全融化(约6-8min)；

3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇；

4)吸取上述混合液，转移到DNA制备管中，12000×g离心1min，弃滤液；

5)将制备管置回2mL离心管，加500μL Buffer W1，12000×g离心30s，弃滤液；

6)将制备管置回2mL离心管，加700μL Buffer W2，12000×g离心30s，弃滤液；以同样的方法再用700μL Buffer W2，12000×g离心1min；

7)将制备管置回2mL离心管，12000×g离心1min；

8)将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加入25-30μL去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。产物于-20℃保存。

4.酶连反应。

按照说明书方法以25μL体系混合均匀下列物质后，并于16℃孵育静置过夜：

连接产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验，验证是否已成功连接目的产物片段，连接后获得的重组载体命名为pTWIN 1-DEFB118，载体图谱如图1所示。

5.感受态细胞的制备。

1)挑取E.coli BL21单克隆到5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；

2)取2mL菌液至100mL LB液体培养基中37℃振荡培养4h，测OD_600nm＝0.3-0.5(以LB液体培养基对照)，停止摇菌；

3)在超净台操作，将培养液转移至预冷的离心管中，4℃，4500r/min，5min，收集菌体，弃上清；

4)加5mL的冰冷的CaCl₂溶液(100mM)重悬混匀，冰浴30min，4℃，4500r/min离心5min，弃上清；

5)加4mL冰冷的CaCl₂溶液(100mM)重悬细胞，轻轻混匀，加入10％甘油于-80℃保存。

6.重组质粒的转化。

1)将感受态细胞从冰箱中取出置于冰上，在超净台加入5μl质粒，即步骤4)中的连接产物，混匀，冰浴30min。

2)将EP管转移至42℃水浴中热激90s，并迅速转移至冰浴放置2-3min。

3)加入500μl LB培养基，37℃振荡培养1h，取100μl涂布于带有Amp抗性(100μg/mL)的培养板，37℃培养过夜。可通过菌落PCR鉴定阳性克隆。

7.DEFB118蛋白的大量表达及纯化。

将培养体系扩增至200mL，优化可溶蛋白的纯化条件：

1)挑取转化有重组载体pTWIN 1-DEFB118的E.coli BL21单克隆，转接至5mL LB培养基，37℃振荡过夜。

2)次日菌液以1:100比例(体积比)接种到200mL新鲜培养基，37℃培养至OD_600nm达到0.8后，加入0.3mM IPTG，16℃诱导过夜。

3)5000×g，4℃离心10min收集菌体，5mL lysis buffer重悬后于冰浴超声破菌(300W，10s/pulse，50个循环)，12000×g，4℃离心30min，收集上清。

4)将上清加入lysis buffer平衡好的1mL chitin beads置冰浴缓慢震荡30min。

5)用20倍柱胶体积的lysis buffer冲洗柱胶后，将结合了融合蛋白的柱胶平均分配到1.5mL EP管中，每管分别加入1.0mL pH为6.0的cleavage buffer，25℃孵育过夜。

6)离心去上清后，柱胶用PH 6.0的cleavage buffer洗涤2次，弃尽上清。

7)柱胶样品准备好用于15％SDS-PAGE分析。

之后将培养体系再次扩大至1L，按照上述表达纯化方法，收集切割后的蛋白上清，并通过AKTA FPLC系统进一步纯化，得到纯度更高、均一性更好的目的蛋白。图2显示DEFB118截短体的FPLC蛋白纯化结果，可见截短体的谱峰均一，没有杂峰。用截留分子量为3KDa的超滤管离心浓缩蛋白(4000×g)，测定蛋白浓度后通过质谱方法鉴定重组的DEFB蛋白分子量，结果表明，构建好的载体pTWIN1-DEFB118转到大肠杆菌E.coli BL21细胞进行蛋白表达。15％SDS-PAGE跑胶结果(图3)显示，16℃诱导下的重组融合蛋白大部分均在上清中表达。

8.MALDI-TOF-MS鉴定DEFB118蛋白的分子量。

通过基质辅助激光解析电离化/飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)方法鉴定切割后的目的蛋白的分子量。用MALDI-TOF-MS测定纯化多肽的分子量，采用的基质为2，5－二羟基苯甲酸。该仪器在阳离子/线型模式下运行，加速电压为20kV。DEFB118的分子量大小通过MALDI-TOF-MS来鉴定。DEFB118截短体实际测得的分子量大小为5279.49Da，结果与其理论分子量(5279.99Da)一致(图4)。

9.圆二色谱(CD)鉴定DEFB118肽段的二级结构。

在室温环境下用JASCO J-810型圆二色谱仪测量蛋白质在远紫外区(190-250nm)的谱学特征。DEFB118截短体蛋白样品溶于10mM phosphate buffer(pH 7.4)中，分别加入0-90％的三氟代乙醇(TFE,v/v)，蛋白浓度为0.2mg/ml。样品池光径为0.1cm，扫描速度为100nm/min，并取连续三次扫描的平均值并扣除样品缓冲液的影响。DEFB118截短体蛋白的CD谱(图5)通过Model JWSSE-480软件预测DEFB118的二级结构含41.1％β-sheet，50.9％无规卷曲，8.0％β-turn，而α-helix为0％，说明重组的DEFB118截短体二级构象良好。

实施例2.抗炎多肽在抑制炎症因子的释放中的应用。

LPS可以活化RAW264.7细胞释放IL-6和TNF-α等细胞因子，为了研究所述的抗炎症多肽(DEFB118截短体)对炎症因子的影响，本发明建立LPS诱导细胞因子模型，采用该多肽和LPS共同处理RAW264.7细胞，并从mRNA水平和蛋白水平两方面观察细胞分泌的炎症因子变化。

1.细胞处理。

将RAW264.7细胞铺于6孔板中，密度调整至5×10⁵cells/well，37℃过夜培养。每孔细胞分别加入0，3，10，20μM的DEFB118(质量分数0.9％NaCl稀释)共孵育30min后，再用500ng/mL的LPS(质量分数0.9％NaCl稀释)处理细胞。共培养5h后收集细胞上清液以及细胞，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光定量PCR(Q-PCR)方法来检测细胞产生的细胞因子。

人β－防御素属于哺乳动物抗菌肽，主要有4种(hBD-1～hBD-4)，表达于上皮组织中。hBD-1是从肾衰患者血液透析液中分离获得，主要表达于呼吸道上皮、尿道组织、鼻泪管、乳腺、肾脏、泌尿生殖道和其他上皮细胞中，也可在齿龈、颌下腺、腮腺、房水和玻璃体等部位表达；hBD-2是Harder等(1997)首先发现的，其主要在受损的皮肤、口腔黏膜、鼻黏膜、被感染的上皮细胞和单核巨噬细胞中表达；Harder等(2001)又从鳞癣皮肤中分离获得hBD-3，其主要在上皮细胞和内皮细胞中表达，也可在成年人的心脏、骨骼肌、胎盘等中表达，还可在肿瘤组织中显著表达。为了比较DEFB118截短体的免疫调节效果，10μM hBD2也用同样的方法处理RAW264.7细胞，然后检测其对细胞分泌的炎症因子的作用。

2.细胞总RNA的提取。

1)将6孔板中收集的细胞用冷的PBS反复润洗2次后，按800μL/孔的比例加入TRIZOL总RNA提取液，作用2-3min后，反复吹打，使贴壁的细胞裂解下来。

2)将悬液移入1.5mL EP管中，加入160μL氯仿，剧烈振荡15s，室温(20-24℃)放置5min，使核酸蛋白质复合物完全分离。

3)然后于4℃、12000×g离心15min，样品分为3层，底层为黄色的有机相，上层为无色的水相和1个中间相。

4)RNA主要存在于水相中，将水相转移到新的EP管中，用异丙醇(与水相按体积比1∶1加入)沉淀水相中的RNA，并于室温放置10min。

5)4℃、12000×g离心10min，离心管底部会出现胶状RNA沉淀。

6)弃上清液，加75％乙醇(用DEPC处理的水配制)1mL洗涤沉淀，于4℃，12000×g离心5min后，尽可能将乙醇吸净，室温下干燥5-10min，用20μL DEPC水溶解RNA沉淀。

7)将RNA样品按体积比1：20稀释后，用微量核酸蛋白检测仪ASP-3700在260nm处测定其浓度及A260/A280值。提取的细胞总RNA于-70℃保存待用。

8)取5μL RNA样品用2.0％琼脂糖凝胶进行电泳，观察RNA的完整性。

3.反转录。

取1μg总RNA使用Promega A3500反转录试剂盒按照操作说明进行反转录反应。反应体系为：5×AMV Buffer 4μL、10mmol/L dNTP 2μL、RNase inhibitor 1μL(10U/μL)、OligdT1μL(0.5μg)、AMV反转录酶1μL(10U/μL)、模板2μL，加无核酶水至20μL。37℃反应60min，94℃5min灭活，-20℃保存待用。

4.定量PCR反应(Q-PCR)。

RNA反转录成cDNA后，使用Rotor-Gene 3000A PCR仪按照以下条件进行荧光定量PCR，引物序列见表1。

表1定量PCR反应引物序列

反应结束后，用2^-△△CT的方法计算mRNA样本的相对含量，其中GAPDH mRNA为内参。每个样本重复3次，以平均数值来表示结果。通过荧光定量PCR方法检测了DEFB118与LPS共同处理细胞后的细胞因子mRNA水平的表达情况。结果显示，DEFB118截短体蛋白能够剂量依赖性地抑制LPS诱导的TNF-α(图6中a所示)，IL-6(图6中b所示)，IL-1α(图6中c所示)和IL-1β(图6中d所示)的mRNA表达。

注：数据表示为均值±均数，三次重复。LPS组与人源抗炎症多肽组比较，*差异有显著性(P<0.05)。

20μL反应体系为：

反应条件为：

5.细胞因子检测。

细胞处理后收集的上清，通过ELISA方法来检测人源抗炎症多肽DEFB118截短体蛋白对LPS诱导的IL-6和TNF-α炎症因子释放的抑制效果。检测方法按照Mouse cytokine-specific DuoSet ELISA试剂盒说明进行操作。

1)将Capture Antibody用PBS稀释至工作浓度后包被96孔ELISA板，每孔加入100μL Capture Antibody，然后将96孔板封紧后室温过夜。

2)将Capture Antibody吸走后，每孔加入400μL的PBST分别洗涤3次，最后弃尽PBST。

3)每孔加入300μL的Reagent Diluent封闭平板，室温孵育1h。

4)重复步骤2后，每孔加入100μL用Reagent Diluent稀释的样品和标准品，室温孵育2h。

5)重复步骤2后，每孔加入100μL用Reagent Diluent稀释的Detection Antibody，室温孵育2h。

6)重复步骤2后，每孔加入100μL HRP-标记的二抗工作液，避光，室温孵育30min。

7)重复步骤2后，每孔加入100μL Elisa显色液，避光，室温孵育20min。

每孔加入50μL的Stop Solution，混匀后酶标仪检测波长450nm处的OD值。

在蛋白水平进一步验证人源抗炎症多肽DEFB118截短体蛋白对炎症因子释放的抑制作用。研究发现，LPS并不能诱导蛋白水平IL-1α和IL-1β的表达，只能促进TNF-α和IL-6的分泌。而10μM和20μM的DEFB118截短体蛋白能够显著抑制IL-6的分泌(图7中b所示)，但对TNF-α则没有明显的抑制作用(图7中a所示)，说明DEFB118截短体对IL-6的抑制作用更加显著。结果(图8)显示，DEFB118显著降低了IL-6和TNF-α等细胞因子的释放，减少率与较阳参hBD2效果相当，说明了DEFB118具有较好的炎症抑制作用。

注：数据表示为均值±均数，三次重复。LPS组与人源抗炎症多肽组比较，*差异有显著性(P<0.05)。

实施例3.抗炎多肽的细胞毒性研究。

通过CCK-8检测试剂盒研究DEFB118截短体蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7的影响。RAW264.7细胞用加入了含有体积分数10％FBS的1640培养基于CO₂培养箱37℃，5％CO₂环境下培养。为了检测DEFB118截短体蛋白对RAW264.7细胞的毒性作用，我们将细胞接种至96孔板培养，细胞密度调整至5×10⁴cells/well，分别加入终浓度分别为0,3,5,10,15,20,25,30μM的DEFB118截短体蛋白，37℃培养24h。然后每孔加入10μL的CCK-8溶液继续培养2h，酶标仪检测波长为450nm处的OD值。

表2显示，不同浓度的DEFB118截短体蛋白与细胞孵育24h后，细胞存活率以及细胞形态较对照组没有明显差异，说明DEFB118没有明显的RAW264.7细胞毒性作用。

表2不同浓度DEFB118截短体蛋白对RAW264.7细胞的毒性研究。

实施例4.抗炎症DEFB118蛋白截短体在抗菌、抗病原微生物感染中的研究。

采用计算菌落形成单位(CFU)的方法来检测DEFB118截短体的抗菌活性，考察其对革兰氏阴性菌(E.coli)，革兰氏阳性菌(S.aureus)和真菌(C.albicans)的抑菌作用，抗菌肽LL37作为阳性对照。

1)E.coli K12D31、S.aureus和C.albicans分别培养在LB、Mueller-Hinton和YPD培养基中；

2)待细菌长至对数生长期，分别用预冷的10mM sodium phosphate buffer洗涤并稀释至一定浓度(E.coli和S.aureus：4×10⁶CFU/mL，C.albicans 4×10⁵CFU/mL)。分别根据公式OD600_nm×2.5×10⁸和OD600_nm×8×10⁶计算E.coli/，S.aureus和C.albicans的菌液浓度；

3)不同浓度的DEFB126样品分别与上述菌液在相应温度(E.coli和S.aureus：37℃，C.albicans：30℃)下等体积共孵育3h；

4)孵育后，将培养液作10、10²、10³倍梯度稀释，取100μl涂平板培养(E.coli和S.aureus于37℃过夜培养；C.albicans于30℃培养24h)；

5)手工菌落计数，根据以下公式计算抗菌活性。存活率(％)＝样品处理组单克隆数/空白对照组单克隆数)×100。以10mM sodium phosphate buffer作为空白对照组，合成的抗菌肽LL37作为阳性对照组。

DEFB118截短体蛋白对革兰氏阴性菌(E.coli)、革兰氏阳性菌(S.aureus)和真菌(C.albicans)的抑菌作用结果(图9)显示DEFB118对检测的3株菌均有明显的抑制作用，当DEFB118浓度达到100μg/ml时抑制率细菌抑制率可达到近80％左右。

实施例5.抗炎症DEFB118蛋白截短体对自身免疫性疾病炎症、肿瘤生长抑制作用的研究。

β-防御素与疾病的关系：

一些疾病的发生与β-防御素过表达有关，如人类的自身免疫性疾病银屑病与β-防御素2的过量表达有关。而β-防御素2基因拷贝数过低，将会引起结肠的克罗恩病。说明β-防御素作为重要的细胞调节因子，它的表达对于固有的免疫监视功能是非常重要的，DEFB118截短体蛋白具有良好的炎症抑制作用，提示其对银屑病等自身免疫性疾病也可发挥一定的作用。

β-防御素的抗肿瘤作用

防御素的表达与炎症反应有密不可分的关系，而肿瘤的发展也与炎症有关，炎症反应似乎成为防御素表达与肿瘤发展之间联系的纽带。在口腔癌中，表皮生长因子通过PKC，MEK1/2，p38MAPK以及磷酸肌醇3激酶(PI3K)等一系列信号通路显著地诱导hBD-3的表达，促进了肿瘤相关的巨噬细胞的招募。小鼠β-防御素14招募CCR6⁺B细胞至纤维肉瘤，这将导致血管生成以及肿瘤的发展。β-防御素与许多肿瘤的发生发展过程关系密切，DEFB118截短体蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7显著的炎症抑制效果间接提示其具有阻遏肿瘤发生发展的作用。

序列表

<110> 丽水学院

<120> 一种人源抗炎症多肽及其应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 43

<212> PRT

<213> 人源抗炎症多肽

<400> 1

Ala Tyr Ser Gly Glu Lys Lys Cys Trp Asn Arg Ser Gly His Cys Arg

1 5 10 15

Lys Gln Cys Lys Asp Gly Glu Ala Val Lys Asp Thr Cys Lys Asn Leu

20 25 30

Arg Ala Cys Cys Ile Pro Ser Asn Glu Asp His

35 40

<210> 2

<211> 129

<212> DNA

<213> 人源抗炎症基因

<400> 2

gcctatagtg gtgaaaaaaa atgctggaac agatcagggc actgcaggaa acaatgcaaa 60

gatggagaag cagtgaaaga tacatgcaaa aatcttcgag cttgctgcat tccatccaat 120

gaagaccac 129

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> DEFB118-F

<400> 3

gtccatggcc tatagtg 17

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> DEFB118-R

<400> 4

cacggatcct tagtggtctt cattggatg 29

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> TNF-α上游引物

<400> 5

ccaggttctc ttcaagggac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> TNF-α下游引物

<400> 6

ctcccaggta tatgggctca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> IL-1α上游引物

<400> 7

aagcagcctt atttcgggag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> IL-1α下游引物

<400> 8

tatcatatgt cggggtggct 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> IL-1β上游引物

<400> 9

gcaactgttc ctgaactcaa ct 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> IL-1β下游引物

<400> 10

atcttttggg gtccgtcaac t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> IL-6上游引物

<400> 11

ggccttccct acttcacaag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> IL-6下游引物

<400> 12

gcaagtgcat catcgttgtt 20

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> GAPDH上游引物

<400> 13

tccaaggagt aagaaaccct ggac 24

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> GAPDH下游引物

<400> 14

gttattatgg gggtctggga tgg 23

Claims (8)

1.一种人源抗炎症多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No：1中所示。

2.一种人源抗炎症基因，其特征在于，编码权利要求1所述的人源抗炎症多肽。

3.根据权利要求2所述的人源抗炎症基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No：2中所示。

4.含有权利要求2或3所述的人源抗炎症基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pGEM-T Easy载体或pTWIN1载体。

6.权利要求1所述人源抗炎症多肽在制备抗细菌、病毒或真菌感染药物中的应用。

7.权利要求1所述人源抗炎症多肽在制备抗自身免疫性疾病炎症药物中的应用。

8.权利要求1所述人源抗炎症多肽在制备抗肿瘤生长及其治疗过程中产生的炎症药物中的应用。